Гомотипические слияния ранних эндосом: роль белка слияний ЕЕА1 и цитоскелета тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Злобина, Мария Владимировна

• Злобина, Мария Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Злобина, Мария Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Везикулярный транспорт

2.2. Регуляторные компоненты основных стадий транспортного процесса

2.2.1. Малые ГТФазы и их эффекторы

2.2.2. Окаймления

2.2.3. ЯаЬ-белки и их эффекторы

2.2.4. Б^ЛЯЕ-система

2.3. Общая характеристика эндоцитозного пути

2.3.1. Типы эндоцитоза, пути интернализации, основные компартменты эндоцитозного пути

2.3.2. Основные гипотезы организации эндоцитозного пути

2.4. Основные механизмы и белки, организующие эндоцитозный путь

2.4.1. Механизм слияния ранних эндосом

2.4.2. Белки и белковые комплексы, определяющие вступление грузов на путь деградации (ЕБСЯТ). Физиологический смысл формирования внутренних пузырьков МВ

2.5. Участие цитоскелета в эндоцитозе

2.5.1. Типы цитоскелета

2.5.1.1. Актиновыемикрофиламенты (МФ)

2.5.1.2. Промежуточные филаменты (ПФ)

2.5.1.3. Микротрубочки

2.5.1.3.1. Белки, ассоциированные с МТ

2.5.1.3.2. Посттрансляционные модификации тубулина

2.5.2. Роль цитоскелета в позиционировании органелл

2.5.3. Роль цитоскелета как средства перемещения. Моторы, ассоциированные с МТ

2.5.3.1. Кинезины

2.5.3.2. Динеины

2.5.3.3. Подходы, используемые для определения скоростей

моторных белков

2.6. Регуляция эндоцитоза ЕСЕ-рецепторных комплексов

2.6.1. Рецептор ЕСР, структура, функция

2.6.2. Механизмы регуляции эндоцитоза рецепторов ЕСР

2.7. Эндоцитоз и сигнализация

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культивирование клеток

3.2. Лиганды и их производные

3.3. Антитела

3.4. Стимуляция эндоцитоза

3.5. Обработка клеток ингибиторами и агентами, воздействующими на цитоскелет

3.6. Электрофорез и иммуноблотинг

3.7. Фракционирование в градиенте Перколла

3.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

3.9. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

3.10. Анализ и обработка изображений

3.11. Математическая обработка данных по перемещению эндосом

3.12. Статистическая обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1.ЕЕА1 везикулы выявляются в клетках до стимуляции эндоцитоза

4.2. Поведение рецептор-содержащих эндосом и ЕЕА1-везикул при стимуляции эндоцитоза скоординировано

4.3. ЕЕА1-везикулы колокализуются с эндосомами на определённых стадиях эндоцитоза, формируя «гибридные» везикулы

4.4. На стадии максимальной колокализации ЕЕА1 и ЕСЕЫ происходит формирование агрегатов эндосом

4.5. Характеристика ЕЕА1-позитивных везикул

4.6. Роль цитоскелета в процессе эдоцитоза

4.7. Микротрубочки как платформа для слияний ранних эндосом

4.8. Роль ацетилирования МТ в процессе эндоцитоза

3

4.9. Участие актиновых филаментов в процессах слияния в ходе эндоцитоза 80 4.11 Разработка методов прижизненного наблюдения

4.10. Прижизненные исследования процесса эндоцитоза в клетках

4.10.1. Анализ перемещения эндосом по МТ

4.10.2. Прижизненные наблюдения за слияниями эндосом

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращений

АО -аминокислотные остатки AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

МВТ - мультивезикулярное тело

МВЭ - мультивезикулярные эндосомы

МТ - микротрубочки

МФ - актиновые микрофиламенты

ОЯ - окаймленная ямка

ОЯО - околоядерная область

ПМ - плазматическая мембрана

ПФ - промежуточные филаменты

РЭ - ранние эндосомы

ЦОМТ - центр организации микротрубочек

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

AAA-domein - ATPases Associated with cell Activities

AP - Adaptor Proteins

COP - coat protein

ECL - Enhanced Chemiluminescence

ECV - endocomal carrier vesicles

EEA1 - Early Endosome Antigen

EGF - Epidermal Growth Factor (эпидермальный фактор роста)

EGFR - EGF Receptor (рецептор ЭФР)

ER - endoplasmic reticulum

ERGIC - ER-Golgi intermediate compartment

ESCRT - endosomal sorting complex required for transport

FYVE - Fab 1, YOTB, Vac 1 and EEA1 (zinc finger domain)

GAP - GTPase-activating protein

GEF - Guanin-nucleotide Exchange Factor

GFP - green fluoresceTe protein

GGA - Golgi-associated, gamma adaptin

MAP - microtubule associated protein

NSF - N-ethylmaleimide-sensitive factor

РАЕ - Porcine aortic endothelial cells

PH - Pleckstrin Homology

PRD - Proline Rich Domain

PX - rhox Homology

RBD - Raf-like Ras-binding domain

SH - Src Homology

SNAP - soluble NSF attachment protein SNARE - SNAP receptor SNX - Sorting nexins

TGN - trans Golgi network (транс-Гольджи-сеть)

TK - тирозин-киназа

UIM - ubiquitin interacting motif

DMEM - Dulbecco modified medium

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

QDs - квантовые точки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гомотипические слияния ранних эндосом: роль белка слияний ЕЕА1 и цитоскелета»

1. ВВЕДЕНИЕ

Эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста (EGF) вовлечён в регуляцию множества клеточных событий, включая передачу сигнала, клеточную миграцию, апоптоз и др. Нарушения процесса эндоцитоза способны приводить к развитию тяжелых патологий (Coursodon, Dvorak, 2012; Wolff et al., 2011). Именно поэтому на протяжении нескольких десятилетий рецептор-опосредованный эндоцитоз EGF привлекает внимание множества исследователей. В общем виде этот процесс начинается на цитоплазматической мембране, где происходит связывание лиганда с его рецептором, димеризация EGF-рецепторных комплексов и активация тирозинкиназы (ТК), локализованной в цитоплазматическом домене рецептора.

Активированные EGF-рецепторные комплексы скапливаются в окаймлённых клатрином ямках, которые после отшнуровывания от мембраны превращаются в так называемые ранние эндосомы. В большинстве случаев рецептор вступает на путь лизосомной деградации. Считается общепринятым, что EGF-рецепторные комплексы доставляются в лизосомы и в конечном итоге там деградируют (Huotari, Helenius, 2011). Необходимым условием взаимодействия с лизосомами является попадание грузов в поздние эндосомы - крупные пузырьки мультивезикулярной морфологии, или мультивезикулярные тела (МВТ). Поздние эндосомы возникают из ранних в ходе процесса, названного созреванием и связанного с постепенным изменением липидно-белкового состава эндосом. Это происходит как за счет рециклирования части эндосомной мембраны обратно в плазматическую, так и слияния эндосомы с везикулами, несущими вновь синтезированные грузы из транссети аппарата Гольджи. Доказано, что грузы, направляемые на деградацию, скапливаются в доменах эндосомы, обогащенных липидом Р1(3)Р, на основе которого далее формируются инвагинации, приводящие к формированию внутренних пузырьков (Hurley et al., 2010).

Для формирования зрелых МВТ с множеством внутренних пузырьков требуется существенное увеличение площади поверхности мембраны, что происходит благодаря многочисленным слияниям ранних эндосом друг с другом. Такие слияния одинаковых по мембранному составу везикул называются гомотипическими, в отличие от гетеротипических, в которых участвуют везикулы, происходящие из разных компартментов. В результате зрелые поздние эндосомы взаимодействуют с лизосомами, а груз, попавший во внутренние пузырьки МВТ, деградирует (Luzio et al., 2000). Очевидно, процесс слияния эндосом чрезвычайно важен для правильного хода всего процесса. Кроме того, характерной чертой эндоцитозного пути является перемещение эндосом с периферии в околоядерную область, где локализовано большинство лизосом (Gao et al., 2010).

Таким образом, основными визуализируемыми событиями, происходящими в ходе эндоцитоза, являются слияния и перемещение эндосом. В настоящее время выявлено множество компонентов, регулирующих эти процессы. По современным представлениям вновь сформированные эндосомы сливаются напрямую друг с другом. В начале процесса на эндосому из цитоплазмы рекрутируются факторы дистанционного взаимодействия (tethers), которые узнают мембрану-мишень и заякоривают везикулы на расстоянии около 25 нм друг от друга (Gillingham, Munro, 2003). Это заякоривание в свою очередь позволяет вступить в игру входящим в состав мембраны белкам комплекса SNARE, которые сближают контактирующие

везикулы до 5-10 нм, что в результате приводит к реорганизации бислоёв и, следовательно, слиянию везикул (Jahn, Scheller, 2006). Ключевым участником этого процесса является малая ГТФаза Rab5. Интересно, что Rab5 переходит в ГТФ-связанную форму при активации рецептора EGF. Активированная таким образом Rab5 рекрутирует Р13-киназу Vps34, которая формирует в мембране эндосомы Р1(3)Р-обогащенный участок (Platta, Stenmark, 2011). Полагают, что наличие этих двух компонентов создаёт основу для рекрутирования из цитоплазмы белка дистанционного взаимодействия ЕЕА1 (Early Endosomal Autoantigen 1), имеющего на С-терминальном конце домен связывания с Rab5 и FYVE-домен, который обеспечивает присоединение ЕЕА1 к Р1(3)Р-обогащённому участку мембраны (Simonsen et al., 1998).

Параллельно со слияниями везикул в ходе эндоцитоза происходит их перемещение в околоядерную область. После формирования ранние эндосомы переносятся с помощью «+»-концевых белков на динеин-динактиновый комплекс, связанный с микротрубочками (МТ) (Valetti et al., 1999). Снабжённые мотором эндосомы получают возможность перемещаться по МТ, организованным в большинстве типов клеток в радиальную систему с центром схождения в околоядерной области. Широко распространены представления о том, что эндосомы, используя МТ как рельсы, могут равномерно и однонаправленно перемещаться в эту область. Основные данные, позволившие сформировать такие представления, получены с помощью подходов, в которых анализировали иммунофлуоресцентные изображения фиксированных клеток на разных стадиях эндоцитоза (Karylowski et al., 2004). Однако следует иметь в виду, что при этом мы наблюдаем лишь результирующую всех событий, которые происходили до момента фиксации.

Несмотря на обилие исследований в области регуляции эндоцитоза, существует ряд парадоксов, которые невозможно объяснить с точки зрения господствующих ныне представлений. Так, например, если эндосома действительно перемещается равномерно по МТ в направлении околоядерной области с помощью мотора динеина, то, даже учитывая его низкую процессивность, время перемещения должно занимать 5-10 мин (Kural et al., 2005), однако в реальности этот процесс занимает 30-60 мин. Неизвестно, с чем связано подобное замедление. Кроме того, анализ динамики количества эндосом на фиксированных препаратах показывает, что если, как это принято считать, слияния идут попарно, в ходе эндоцитоза за 60 мин происходит лишь 5-6 раундов слияний. Однако считается, что практически сразу после формирования ранних эндосом на них рекрутируются все вспомогательные белки, регулирующие слияния (Binder, Holzhiitter, 2012). Остается неясным, с чем связано такое малое количество слияний и какого рода может быть сигнал, который заставляет эндосомы сливаться только в «разрешенные» моменты времени? Непонятно также, как скоординированы процессы слияния и перемещения в ходе эндоцитоза.

Основным постулатом теории слияния ранних эндосом является представление о том, что ключевой белок, обеспечивающий специфичность слияния ранних эндосом, ЕЕА1, ассоциируется с вновь сформированной эндосомой за счет рекрутирования из цитоплазмы. Однако как наши собственные, так и данные некоторых групп показывают, что вопреки существующим представлениям белок ЕЕА1 даже в условиях дефицита сывороточных факторов, стимулирующих эндоцитоз, выявляется в интактных клетках не в цитоплазме, а в составе везикул

(Wilson et al., 2000). Многие авторы рассматривают их как эндосомы, сформировавшиеся до стимуляции эндоцитоза рецептора EGF или других используемых ими лигандов (Lawe et al., 2002), и продолжают считать, что именно цитоплазматический ЕЕА1 играет ключевую роль в новых раундах эндоцитоза. Все эти противоречия не находят до сих пор адекватного объяснения и позволяют предполагать, что организация и координация процессов слияния и перемещения эндосом в клетке в ходе эндоцитоза осуществляются способом, отличным от общепринятых представлений.

Целью данной работы являлось выяснение механизмов слияния ранних эндосом и определение роли белка ЕЕА1 и цитоскелета в этом процессе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Описать поведение везикул, обогащенных аутоантигеном ранних эндосом ЕЕА1, при стимуляции эндоцитоза EGF-рецепторных комплексов и исследовать динамику взаимодействия ЕЕА1 -везикул и рецептор-содержащих эндосом.

2. Охарактеризовать популяцию везикул, содержащих ЕЕА1.

3. Выявить роль цитоскелета в процессе ЕЕА1-зависимого слияния ранних эндосом.

4. Проанализировать в режиме реального времени процесс перемещения эндосом по МТ и их слияний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гомотипические слияния ранних эндосом происходят не напрямую, а опосредуются везикулами, обогащенными белком ЕЕА1.

2. ЕЕА1-зависимые слияния включают несколько последовательных стадий, связанных с формированием гибридных органелл со сложной доменной организацией, причём заключительной стадией является выделение (сегрегация) ЕЕ AI -обогащенных доменов из гибридной эндосомы, содержащей рецептор EGF, и восстановление исходного пула ЕЕА1-везикул.

3. Одновременно с процессом ЕЕА1-зависимого укрупнения происходит и созревание эндосом (формирование мультивезикулярных тел).

4. Микротрубочки представляют собой необходимую платформу для слияний эндосом, тогда как актиновые структуры вовлечены в процесс сегрегации доменов гибридных везикул на более поздних стадиях эндоцитоза.

5. Микротрубочки в клетке представляют собой лабильную густую сеть, которая может как выполнять роль рельсов при мотор-зависимом перемещении эндосом, так и, напротив, затруднять это движение в силу пространственных ограничений. Характер перемещения эндосом и процессы их взаимодействий и слияний существенно отличаются от представлений, составленных на основе анализа изображений фиксированных клеток. Можно говорить о том, что микротрубочки играют модулирующую роль в регуляции процессов эндоцитоза.

I

Научная новизна работы

Данные, полученные в нашей работе, показывают, что гомотипическое слияние ранних эндосом происходит не напрямую за счет рекрутирования из

цитоплазмы белка ЕЕА1, а опосредуются пред существующими везикулами, обогащенными ЕЕА1. Таким образом, впервые сформулирована гипотеза о формировании гибридных ранних эндосом, что позволяет по-новому взглянуть на процесс биогенеза эндосомных компартментов. Впервые охарактеризованы субпопуляции ЕЕА1-положительных везикул. Впервые описаны стадии формирования гибридных органелл и продемонстрирована ведущая роль микротрубочек в оркестровке процессов слияния и сегрегации гибридных эндосом. Прижизненный анализ слияний и перемещений эндосом также значительно обновляет существующие в настоящее время представления о механизмах, обеспечивающих временную и пространственную динамику эндоцитоза.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Везикулярный транспорт.

Основным предметом настоящего исследования являются некоторые аспекты регуляции везикулярного транспорта, процесса, привлекавшего пристальное внимание исследователей в течение последних 30 лет. В результате в этой области уже к концу 90-х годов сложились основные представления относительно механизмов формирования транспортных пузырьков, регуляции слияния мембран, переноса пузырьков от одного компартмента к другому. Однако в последние годы интерес к этим проблемам вновь возрождается, поскольку достижения клеточной биологии позволяют говорить о том, что везикулярный транспорт в гораздо большей степени вовлечён в процессы регуляции и интеграции внутриклеточных событий, чем представлялось ранее.

В связи с этим мы сочли необходимым дать краткий обзор существующих представлений о том, как регулируется везикулярный транспорт и каковы основные проблемы, связанные, в частности, с таким транспортным путём, как эндоцитозный.

Под везикулярным транспортом подразумевают перенос макромолекул от одного компартмента к другому с помощью мембранных везикул. Молекулами-грузами (или карго) могут быть мембранные или мембранно-связанные белки и липиды, тогда как белки и липиды, характерные для определенного компартмента, называются резидентными.

Основные функции везикулярного транспорта состоят в высокоточной доставке грузов в пункты их конечного назначения. Механизмы регуляции везикулярного транспорта достаточно консервативны у всех эукариот, поскольку этот процесс является одним из базовых, необходимых для биогенеза внутриклеточных компартментов и поддержания постоянного специфического для каждого компартмента состава мембран, делающего возможным выполнение функций, свойственных каждому компартменту. Кроме того, везикулярный транспорт является критичным для реализации ряда функций организма в целом, поскольку участвует в коммуникациях между клетками, внутриклеточной сигнализации и т.д. Такие важные процессы, как синаптическая передача или фагоцитоз, были бы невозможны без везикулярного транспорта. К настоящему времени накопилось множество данных о связи тяжелых патологий, в том числе наследственных, с нарушениями работы того или иного «звена» определенного транспортного процесса (Jentsch et al., 2005; Hollingsworth, Gross, 2012; Khoriaty et al., 2012; Kumar et al., 2012).

Почти все клеточные органеллы способны общаться друг с другом посредством везикулярного транспорта, однако два пути занимают особое положение вследствие их важности для жизнедеятельности клетки.

I I

Одним из них является антероградный транспорт (биосинтетический или экзоцитозный путь), с помощью которого осуществляется доставка вновь синтезированных белков и липидов из ЭПР через цистерны аппарата Гольджи в

сеть, ассоциированную с транс-частью аппарата Гольджи (для краткости часто именуемую транс-Гольджи, TGN). Зрелые белки подвергаются здесь сортировке и, после упаковки в транспортные везикулы, снабженные соответствующими «адресами», отправляются в пункты кончного назначения. Так, часть вновь синтезированных белков переносится в составе секреторных пузырьков к плазматической мембране (ПМ) и поступает в межклеточное пространство или встраивается в мембрану после слияния секреторной везикулы и ПМ (секреторный, или экзоцитозный, путь). Другая часть, например, гидролитические ферменты и белки лизосомной мембраны, транспортируется в лизосомы, в основном через поздние эндосомы, хотя существует и доставка напрямую в лизосомы (Pfeffer, 2011).

Вторым транспортным потоком, противоположным биосинтетическому, является ретроградный транспорт, или эндоцитоз - путь поступления в клетку макромолекул из окружающей среды (Roth, Porter, 1964) в составе мембранных пузырьков, в общем случае называемых эндосомами. Сложность изучения этого транспортного пути состоит в том, что, если среди структур, вовлечённых в ретроградный транспорт, можно чётко различить по морфологическим признакам его основные компартменты, то компартменты антероградного пути представлены исключительно везикулами, отличающимися лишь размером и белковым составом. Именно этот момент до сих пор вызывает затруднения при попытке чётко охарактеризовать как этапы эндоцитоза, так и определить сами эндоцитозные компартменты, в том числе и терминологически. В общем случае предполагается, что только что отпочковавшиеся первичные эндосомы сливаются с так называемыми ранними эндосомами, откуда грузы могут возвратиться обратно на плазматическую мембрану через рециклирующие эндосомы, или попасть в поздние эндосомы, рассматриваемые как предлизосомный компармент, из которого возможен только один путь - в лизосомы, заканчивающийся деградацией молекул-грузов. Более подробно эта проблематика будет рассмотрена в главе «Общая характеристика эндоцитозного пути».

2.2. Регуляторные компоненты основных стадий транспортного процесса.

Схематично основные стадии транспортного процесса можно представить следующим образом. На первом этапе на мембране-доноре образуется выпуклость, или «почка» (bud), которая затем превращается в транспортный пузырек, содержащий молекулы «груза», а также набор регуляторных белков, обеспечивающих правильную доставку везикулы. После отпочкования (budding) везикула переносится к акцепторной мембране. Считают, что этот процесс поддерживается цитоскелетом, в основном микротрубочками (МТ), хотя ряд транспортных процессов, по-видимому, может осуществляться независимо от цитоскелета (Dinter, Berger, 1998). Затем происходит «узнавание» мембраны транспортного пузырька с мембраной-мишенью и их заякоривание, завершающееся слиянием этих мембран и доставкой груза в акцепторный компартмент. После слияния с акцепторной мембраной регуляторные белки отсортировываются в ту область мембраны акцепторного компартмента, где формируются пузырьки, направляемые в «обратный путь», или путь рециклирования. Таким образом транспортный путь замыкается.

Каждая из этих стадий контролируется специфическим набором белков. Так, основную роль в формировании транспортной везикулы играют белки окаймления, за точность нацеливания на компартмент-мишень и слияние с ним отвечают Rab-белки и «фьюзогенная» система NSF-SNAP-SNARE. Перемещение везикул регулируется моторными и другими белками, связанными с цитоскелетом. Кроме того, все яснее становится роль самих молекул-грузов и их рецепторов, в определении всей дальнейшей судьбы везикулы.

2.2.1. Малые ГТФазы и их эффекторы.

В ходе дальнейшего изложения мы будем постоянно сталкиваться с различными типами так называемых малых ГТФаз (20-30 кДа), играющих очень большую роль в транспортных процессах. В связи с этим мы сочли необходимым описать здесь принцип их действия, который является универсальным для всех типов малых ГТФаз. Их объединяют в суперсемейство Ras-подобных белков, участвующих в регуляции сигнализации (Ras), процессах везикулярного транспорта (семейство Arf и гомологичная им Sarlp и Rab-семейство), транспорта через ядерную пору (Ran) и реорганизациях цитоскелета (Rho, Rae, Cdc42). Все они обладают одинаковой структурой. В составе консервативного домена, составляющего основную часть белка, имеется три последовательности, которые после формирования третичной структуры образуют гуанин-нуклеотид-связывающий карман. Ближе к С-концу расположен относительно небольшой (не более 100 АО) гипервариабельный домен, именно за его счёт обеспечивается разнообразие малых ГТФаз. С-конец молекулы посттрансляционно модифицируется присоединением изопреноида к остаткам цистеина. Rab-белки

модифицируются посредством изопреноида геранилгеранила (Newman, Magee, 1993). Для остальных семейств изопреноид может быть другим.

Основным свойством малых ГТФаз является очень низкая ГТФазная активность. В результате функциональная активность ГТФазы связана не с её гидролитической способностью, а определяется тем, с каким нуклеотидом, ГТФ или ГДФ, она связана. В первом случае белок неактивен («выключен») и может быть локализован в цитоплазме или на мембране, во втором - исключительно на мембране. Связь с нуклеотидом определяется активностью двух основных эффекторов ГТФаз. Гидролиз ГТФ на белке осуществляется с помощью GAP (GTPase-Activating Protein). В свою очередь обратный обмен ГДФ на ГТФ происходит под действием обменного фактора GEF (Guanin-nucleotide Exchange Factor) и переводит белок в активное, или «включенное» состояние. Сами факторы GEF и GAP могут регулироваться различными сигнальными каскадами, таким образом координируя работу малых ГТФаз. ГТФаза в «активном» состоянии способна взаимодействовать со специфическим для каждого белка спектром партнёров с самыми разными функциями. Гидролиз ГТФ на малой ГТФазе приводит к прекращению этих взаимодействий. В связи с этим малые ГТФазы рассматривают в качестве внутриклеточных таймеров определённых процессов.

Как уже упоминалось, в процессах везикулярного транспорта принимают участие малые ГТФазы семейств Arf и Sarlp и Rab-белки. Arfl-6 и Sarlp являются инициирующими ГТФазами при сборке окаймлений (Chavrier, Goud, 1999), тогда как роль Rab-белков гораздо шире. Они образуют функциональные домены на компартментах, регулируют транспорт по МТ и процесс слияния мембран.

2.2.2. Окаймления.

В настоящее время известно несколько видов окаймлений (coats), каждое из которых обслуживает определённый транспортный участок. Так, транспорт между ЭПР и аппаратом Гольджи опосредуют СОР-I и СОР-II окаймления, получившие названия от английского слова «coat proteins». На плазматической мембране и в TGN функционируют окаймления, основным компонентом которых в общем случае является клатрин и гетеромерные (АР 1-4) или мономерные (GGA1-3) адаптеры (McMahon, Mills, 2004, Faini et al., 2013). Несмотря на достаточно высокую специфичность этих окаймлений с точки зрения обслуживания транспортных путей, принципы их сборки достаточно сходны. Как правило, формирование окаймления начинается с активации инициирующей малой ГТФазы, которая далее рекрутирует регуляторные компоненты, необходимые для заякоривания и слияния везикулы с мембраной мишенью, и белковые комплексы, собственно и образующие окаймления. В некоторых случаях рекрутируются белки липидного обмена, способствующие искривлению мембраны. За счёт взаимодействия с компонентами окаймления в везикулу рекрутируется груз. После завершения сборки на малой ГТФазе происходит гидролиз ГТФ, в результате чего везикула отделяется от мембраны, а окаймление разбирается.

Одно из наиболее изученных окаймление COP-I участвует в транспорте между цистернами аппарата Гольджи (Balch et al., 1984) и из Гольджи в ЭПР. Минимальными требованиями для формирования COP-I-окаймленного пузырька является наличие малой ГТФазы Arfl и мультимерного комплекса, состоящего из 7 субъединиц, так называемого коутомера (coatomer, Wieland, Harter, 1999). Далее происходит деформация мембраны, однако механизм ее до конца неясен (Ktistakis et al., 1996). В ходе формирования везикулы происходит также селективное накопление груза (т. е. молекул, подлежащих транспортировке) и включение молекул, обеспечивающих точную доставку транспортной везикулы (так называемые v- SNARE и в некоторых случаях Rab-белки).

После отпочкования везикулы происходит сбрасывание окаймления в результате активации Arfl GAP и рециклирование Arfl-ГДФ в цитозоль (Donaldson, Jackson, 2000).

Селекция груза в COP-I-везикулах осуществляется, как предполагают, с помощью трансмембранных рецепторов, способных узнавать белки груза, содержащие специфические аминокислотные последовательности (Cosson, Letourneur, 1994; Lewis, Pelham, 1992). Эти рецепторы способны регулировать процесс сборки везикулы, обеспечивая связь между накоплением груза и сборкой окаймления (Popoff et al., 2011).

В отличие от COP-I, место работы СОР-II окаймления установлено точно: оно опосредует формирование транспортных везикул, доставляемых из ЭПР в Гольджи, вернее, в ERGIC (ER-Golgi intermediate compartment) (Barlowe et al., 1994). Принцип формирования СОРИ-покрытых везикул совпадает с описанным для COP-I. Так, основную роль в инициации сборки окаймления играет малая ГТФаза Sarlp. В роли GEF в этом случае выступает интегральный мембранный белок Secl2p, рекрутирующий Sarlp из цитозоля. Sarlp-ГТФ, в свою очередь, взаимодействует с гетеромерными цитозольными комплексами Sec23p/Sec24p (400 кДа) и Secl3p/Sec31p (700 кДа), которые и формируют окаймление (Barlowe et al., 1994). После того, как везикула будет полностью укомплектована молекулами груза, Secl3p/Sec31p полимеризуется, мембрана искривляется и везикула

/-ЧТ"ГТ/-ЧТТТ7,/-ЧТ»Т TT» О ОТЛ ГТ TTTTAnna» iaiTTTA Л -ЛТТ1» К ТТМАТТЛ VA ТТТТТ» о ТЛТ"Т JT1 ОТТТЖГТ Л D ТСАТАПТ т»/ л

иiiivjiA.UDDiDaw 1 wn. ДпчлэрwivAwnnv^ w jimvi ирип^лиДт aiva.jtajdицх±л vjru 5 AVJiupDim d

данном случае является белок Sec23p, гидролиз ГТФ на Sarlp и разборка окаймления (см. обзор Kaiser, Ferro-Novick, 1998). Сортировка груза основана на том же принципе, что и в случае COP-I. Так, целый ряд транспортирующихся из ЭПР трансмембранных белков содержит аминокислотную последовательность, мутация в которой значительно снижает эффективность их транспорта (Nishimura, Balch, 1997; Lord et al., 2013).

Другим типом окаймления являются клатриновые окаймления. Они были открыты более 30 лет назад (см. обзор Hirst, Robinson, 1998) и биохимически охарактеризованы в 1975 (Pearse, 1975). Основными компонентами клатринового окаймления являются собственно клатрин, организованный в так называемые

трискелионы, и гетеротетрамерные комплексы АР, получившие обозначение (adaptor proteins), или мономерные GGA.

Трискелион состоит из Зх тяжелых (180 кДа) и Зх легких (33 или 36 кДа) цепей клатрина. Каждая тяжелая цепь взаимодействует с легкой через свою С-концевую часть, и 3 С-терминальные конца тяжелых цепей взаимодействуют друг с другом. Трискелионы обладают способностью к самосборке in vitro и образуют полигональные решетки на цитоплазматической стороне мембран in vivo (Kirchhausen, Harrison, 1981). Клатрин также способен образовывать плоские решётки из гексагонов, которые ассоциируются с мебраной через белки семейства SNX, предполагают, что такие решётки работают в качестве сортирующих платформ (Shi et al., 2009).

При сборке окаймлений связь между клатриновой решеткой и мембраной осуществляют адаптерные комплексы АР или GGA. API и GGA1-3 опосредуют транспорт между транс-Гольджи и поздними эндосомами, перенося модифицированные маннозо-6-фосфатом лизосомные ферменты в комплексе с рецептором маннозо-6-фосфата (Nakayama, Wakatsuki, 2003). Инициирующей малой ГТФазой при сборке этих окаймлений, также как и в случае АРЗ и АР4, является Arfl. АРЗ локализуются на мембранах транс-Гольджи и опосредуют прямой путь из транс-Гольджи в лизосомы, при этом его особенностью является то, что он работает без клатрина (Robinson, 2004). Точная локализация (и функция) АР4 неизвестны (Jarousse, Kelly, 2000).

АР2 участвуют в регуляции интернализации рецепторов на плазматической мембране, его компоненты состоят из двух больших у и ß2 (-100 кДа), средней |i2 (-50 кДа), и маленькой о2 (-20кДа) субъединиц (Jarousse, Kelly, 2000). Большие субъединицы комплексов называют адаптинами. Интересно, что субъединицы АР-комплексов и компоненты COP-1-окаймления имеют общее происхождение (Takatsu et al., 2001). Многочисленные исследования позволили определить роль каждой субъединицы. Так, большие вариабельные субъединицы существенны для правильной локализации каждого AP-комплекса на соответствующей мембране, а также способны связывать клатрин; большие невариабельные субъединицы

обеспечивают взаимосвязь с клатриком, с одной стороны, и рецепторами-грузами, с другой. Основная функция средних субъединиц заключается в селективном взаимодействии с рецепторами-грузами. Роль маленьких субъединиц до конца неясна, но существуют предположения об их участии в определении локализации данного адапторного комплекса (Hirst, Robinson, 1998; Jarousse, Kelly, 2000). Инициирующая ГТФаза для АР2 неизвестна, и, хотя её наличие было косвенно подтверждено рядом экспериментальных данных (Traub et al., 1996), в настоящее время, считается, что АР-2 активируется не ГТФазой, а фосфолипидом Р1(4,5)Р2 (Canagarajah et al., 2013).

АР2-окаймление опосредует интернализацию большого количества разнообразных рецепторов, локализующихся на плазматической мембране, формируя так называемые окаймленные ямки (ОЯ). Формирование окаймлённых

15

ямок инициируется в определённых участках плазматической мембраны, число которых ограничено (Moore et al., 1987; Santini et al., 2002). Участки, «разрешенные» для формирования ОЯ, по всей видимости, определяются структурой сети кортикального актина, поскольку при действии латринкулина «запрещенные» зоны исчезают, а латеральная подвижность окаймлённых ямок возрастает (Gaidarov et al., 1999).

Фактор, инициирующий сборку АР2-окаймления на плазматической мембране, до сих пор неизвестен. С одной стороны, на роль рецептора для АР2-комплекса претендуют мембранные белки семейства синаптотагминов (synaptotagmin), являющиеся Са2+-связывающими мембранными белками, взаимодействующими с адаптинами и узнающими фосфолипид PI(4,5)P2 (Zhang et al., 1994; Haucke et al., 2000). С другой стороны, высказывалось предположение о том, что сами трансмембранные рецепторы-грузы, поступающие в клетку с помощью АР2-окаймления и напрямую взаимодействующие с адаптинами, могли бы служить сайтами инициации его сборки (Corvera, 1990; Grimes et al., 1996). Однако есть много аргументов против такой точки зрения. Так, существуют многочисленные исследования, которые не подтверждают связи между уровнем экспрессии или активацией рецепторов и количеством формируемых ОЯ (Santini, Keen, 1996; Warren et al., 1997; Santini et al., 1998; Gaidarov et al., 1999). Во-вторых, сила взаимодействия цитоплазматических доменов рецепторов с адаптинами недостаточно велика, чтобы отвечать за ту прочную связь АР-комплексов с мембраной, которая имеет место in vivo. Более того, многие рециклирующие рецепторы содержатся в гораздо больших концентрациях в эндосомах, чем в ПМ, не вызывая при этом связывания АР2 с эндосомными мембранами (Schmid, 1997). Тем не менее, этот вопрос еще далек от решения.

Кроме клатрина и АР2-комплексов, третьим ключевым белком-регулятором сборки ОЯ является динамин, называемый «атипичной» ГТФазой (Kosaka, Ikeda, 1983; Herskovits et al., 1993). Этот относительно крупный (100 кДа) белок обладает ГТФазной активностью, при этом, в отличие от Ras-подобных ГТФаз, динамин имеет высокую скорость гидролиза ГТФ, как базальную, так и стимулированную. Кроме того, динамин несёт собственный ГТФазный домен, GED, способный активировать гидролиз ГТФ на соседней молекуле динамина, взаимодействующей с GED латерально, но со сдвигом, в результате чего несколько молекул динамина способны формировать спираль, шаг которой определяется нуклеотидом, с которым связан динамин. Динамин содержит также РН-домен, обеспечивающий его взаимодействие с Р1(4,5)Р2 и ответственный за нацеливание на мембрану (Achiriloaie et al., 1999), и PRD-домен, отвечающий за взаимодействие с SH3-содержащими белками, основным из которых является амфифизин. Амфифизин служит адаптором между динамином, t клатрином и АР2-комплексами, хотя этим его роль в эндоцитозе, по всей видимости, не ограничивается (Takei et al., 1999).

Основные этапы формирования везикулы таковы: после ассоциации АР2-комплексов с мембранными рецепторами из цитоплазмы рекрутируется клатрин,

16

образующий «корзинку». Динамин через амфифизин связывается с клатриновой решеткой нуклеотид-зависимым образом: первоначально он в ГДФ-связанной форме распределен случайным образом по всей поверхности формирующейся везикулы, затем неизвестный механизм «выключает» взаимодействие между амфифизином и динамином, в результате чего последний освобождается для самосборки (Bauerfeind et al., 1997). После обмена на ГТФ динамин перераспределяется к горлышку пузырька, образуя там спиральный «воротник» (Praefcke, McMahon, 2004). Гидролиз ГТФ вызывает конформационные изменения динамина, приводящие к замыканию горлышка. Существует несколько моделей механизма действия динамина на этой стадии, однако единого мнения среди исследователей до сих пор не сформировалось (Sever et al., 2000). Одна из наиболее привлекательных гипотез состоит в следующем: при быстром гидролизе ГТФ шаг спирали динамина резко увеличивается, что приводит к разрыву мембраны «горлышка» и отрыву везикулы от мембраны-донора. В то же время, медленный гидролиз ГТФ дает возможность достаточно текучей мембране перестроиться без нарушения ее целостности, в результате чего происходит тубуляция мембраны. По-видимому, такая регуляция скорости гидролиза ГТФ динамином действительно реализуется в клетке, поскольку показано участие динамина в формировании тубулярных частей эндосом (Mesaki et al., 2011).

После отделения пузырька происходит его «раздевание», т. е. высвобождение клатрина и адапторов в цитозоль. Этот процесс, как полагают, регулируется АТФазой HSP70 (Schmid, 1997).

Основной функцией AP-2-окаймления является рецептор-специфическая интернализация. Действительно, было обнаружено, что рецептор EGF содержит ряд интернализационных кодов, расположенных в участке с 973-его по 1022-й АО (Chen et al., 1989). Кроме того, средняя субъединица АР-2 способна связываться с фосфорилированным тирозин-киназным (ТК) доменом рецептора EGF (Boll et al., 1995; Sorkin et al., 1996). По всей видимости, именно ТК-специфический механизм регуляции интернализации, стимулируемый связыванием рецептора с лигандом и опосредуемый фосфорилированием рецептора и его убиквитинированием, является основным (Kazazic et al., 2009).

Главным кандидатом на узнавание убиквитинированного рецептора является конститутивно ассоциированный с АР2 белок epsl5, являющийся субстратом рецептора EGF, что отражено в самом его названии (EGF receptor Phosphorylation Substrate). Электронно-микроскопические исследования показали, что молекулы epsl5 располагаются по краю ОЯ (Tebar et al., 1996), а их взаимодействие с АР-2 существенно на ранних стадиях формирования везикулы (Benmerah et al., 1998).

Как организована работа всей совокупности ОЯ на клеточной поверхности? По данным одной группы авторов целый ряд рецепторов с различными механизмами взаимодействия с элементами АР2-окаймления, такие как рецепторы трансферрина, липопротеинов низкой плотности и рецепторы EGF локализуются в одних и тех же ОЯ (Carpentier et al., 1982), демонстрируя при этом совершенно

17

различные характеристики насыщения связывания. Можно предполагать, что специфическая чувствительность одной и той же ОЯ к разным рецепторам-грузам обеспечивается как различающимся набором адапторных белков, так и тем, что в состав ОЯ могут включаться неодинаковые AP-2-комплексы, составленные из субъединиц, представленных разными изоформами (Jarousse, Kelly, 2000). По другим данным разные трансмембранные рецепторы, например рецептор трансферрина и рецептор EGF исходно попадают в разные ямки (Leonard et al., 2008).

Кроме ПМ и транс-Гольджи, клатриновое окаймление было зафиксировано также на эндосомах. Выяснилось, что клатрин может связываться с эндосомой через белок Hrs, считающийся основным компонентом ESCRT-0 комплекса, обеспечивающего сортировку грузов на путь лизосомной деградации (Raiborg et al., 2006).

ч 2.2.3. Rab-белки и их эффекторы.

К настоящему моменту идентифицировано более 60 малых ГТФаз семейства Rab. Наиболее ранние данные позволили сформировать представление о Rab-белках как об основных регуляторах слияния мембран в ходе транспортных процессов (Zerial, Stenmark, 1993). Однако в дальнейшем выяснилось, что функции Rab-белков гораздо шире. В активном состоянии они локализованы на внутриклеточных мембранах. Каждый компартмент имеет свой набор Rab-белков. Так, например, Rab5a,b,c, Rab4a,b, Rabil ассоциированы с разными субкомпартментами ранних эндосом, Rab 7 и Rab9 были идентифицированы на поздних эндосомах, Rabí, Rab6, Rab2, Rab 10, Rab 12, Rab30 и Rab33b локализованы на мембранах ЭПР и аппарата Гольджи; Rab3 экспрессируется только в нервных тканях, и т.д. (Martinez, Goud, 1998, Segev, 2001).

Интересно отметить, что ряд Rab-белков представлены набором изоформ, степень гомологии которых достигает 90%. Это может свидетельствовать о том, что изоформы способны выполнять частично перекрывающиеся функции. Так, например, три изоформы Rab5, локализованные на одном и том же эндосомальном компартменте, увеличивают скорость эндоцитоза в одинаковой степени. Однако ч существуют свидетельства тому, что функциональное сходство не является общим

правилом для всех изоформ Rab-белков. Во-первых, Rab4a может быть фосфорилирован сёс2-киназой, в то время как Rab4b не содержит сайта фосфорилирования (van der Sluijs et al., 1992). Rab5a является субстратом фосфорилирования Erkl (но не Erk2), тогда как cdc2-KHHa3a предпочтительно фосфорилирует Rab5b, хотя эти изоформы имеют одинаковый ^ консервативный сайт фосфорилирования Ser-123 (Chiariello et al., 1999). Возможно,

благодаря этим различиям осуществляется более тонкая регуляция транспортных процессов. Во-вторых, экспрессия некоторых членов подгруппы Rab3 является тканеспецифической и зависит от стадии дифференцировки клеток внутри одной ткани (Baldini et al., 1998).

Представление о ключевой роли Rab-белков о ключевой роли в регуляции мембран было впервые получены при исследовании точечных мутантов белка Rab5, способных связывать только один из нуклеотидов. Так выяснилось, что конститутивно активный ГТФ-ЯаЬ5 приводит к появлению аномально крупных эндосом, тогда как конститутивно неактивный белок вызывает фрагментацию таких везикул (Stenmark et al., 1994). Однако конкретный механизм регуляции слиянии мембран Rab-белками долгое время оставался загадкой. Ситуация стала проясняться благодаря идентификации целого ряда белков, способных взаимодействовать с активированным Rab5. Например, оказалось, что Rab5, основная малая ГТФаза ранних эндосом, может в активированном состоянии взаимодействовать с 25 белками. Интересно, что никаких общих доменов или последовательностей в белках-мишенях обнаружено не было. Среди таких партнеров были SNARE, ферменты липидного обмена, моторные цитоскелетные белки. Наибольший интерес привлекли белки, обладающие длинными линейными суперскрученными участками (например рабаптин-5, ЕЕА1). Впоследствии для других Rab-белков также были выявлены подобные мономерные белки (гольджин) или белковые комплексы (HOPS, TRAPP, Exocyst и др.) (Brocker et al., 2010). В англоязычной литературе они получили название "tethers" («привязь», «коновязь», англ.). В дальнейшем мы будем называть их факторами дистанционного взаимодействия. Как оказалось, их функция заключается в специфическом узнавании и заякоривании везикулы с мембраной-мишенью. Эти белки и белковые комплексы обеспечивают сближение двух мембран на расстояние -25 нм, тем самым реализуя первую стадию их слияния. Гидролиз ГТФ на Rab-белке приводит к прекращению слияний.

2.2.4. SNA RE-система.

В 1990-х годах были идентифицированы компоненты другой системы, также участвующей в регуляции специфических слияний мембран. Это система получила название NSF-SNAP-SNARE (Sollner, 1995). NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) является гексамерным белком, относящимся к АТФазам типа AAA. SNAP (soluble NSF attachment protein) способен рекрутировать NSF к мембране. Ключевым компонентом системы являются мембранные белки SNARE (SNAP receptors).

Первоначально белки семейства SNARE были разделены на основании их локализации либо на транспортной везикуле (vesicle - v) или на мембране-мишени (target -t) на V-SNARE (включающие белки, гомологичные синаптобревину) и t-SNARE (включающие белки, гомологичные синтаксину-1 и SNAP-25). Было показано, что комплементарные v- и t-SNARE могут формировать чрезвычайно устойчивые пары, что дало основания рассматривать их в качестве ключевых белков, специфичность направленного слияния мембран. Однако, вскоре выяснилось, что в таком комплексе участвует не два, а более белка SNARE. Более того, при гомотопических слияниях, то есть слияниях между функционально и

структурно одинаковыми везикулами, мембраны обеих сливающихся везикул содержат оба типа SNARE. Позднее была предложена другая классификация этих белков, основанная на способе формирования комплекса. Для всех белков SNARE характерно наличие суперскрученного линейного мотива из 60-70 АО, при этом для формирования устойчивого комплекса необходимо участие 4х таких мотивов, образующих вместе подобие «пучка» параллельно расположенных линейных доменов (Chen, Scheller, 2001; Fasshauer, 2003). В связывающем сайте один из доменов должен иметь аргинин (R), а три других - глютамин (Q). Это дало основание для разделения SNARE на Q- и R-SNARE. Интересно, что все известные на сегодняшний момент v- SNARE принадлежат к типу R-SNARE, поэтому старая классификация продолжает употребляться. Таким образом, в формировании комплекса v-/t- рецепторов участвуют представители всех групп, причем необходимое количество Q-доменов может обеспечиваться как отдельными белками, так и белками, содержащими несколько таких доменов (Hay, 2001). Функционально активный SNARE комплекс, который осуществляет слияние мембран, формируется, как правило, из четырёх SNARE, членов подсемейств Qa-, Qb-, Qc- и R-SNARE (Fasshauer et al., 1998). Такой «подход» позволяет, заменяя на каждом отдельной этапе транспортного пути лишь один из SNARE, обеспечить не только специфичность, но взаимную последовательность этапов, контролируя весь путь целиком. (Brandhorst et al., 2006).

Во избежании несанкционированных слияний один из t-SNARE, как правило, синтаксин, ассоциирован с ингибирующим белком, принадлежащим к семейству nSecl. Перед формированием комплекса nSecl удаляется в ходе Rab-опосредованного процесса. (Nichols et al., 1998).

Первоначально предполагали, что сборка NSF-SNAP-v-, t-SNARE комплекса необходима для заякоривания сливающихся бислоев; а само слияние обеспечивает энергия гидролиза АТФ на NSF. Однако дальнейшие исследования позволили прийти к выводу, что энергия гидролиза АТФ на NSF используется уже после того, как слияние произошло и V- и t-SNARE, ранее находившиеся на разных мембранах (транс-комплекс), оказываются уже в составе одной и той же (цис-комплекс), осуществляя диссоциацию этого комплекса. Эта проблема довольно долго вызывала бурные дискуссии, поскольку если в случае гетеротипического слияния начало и результат процесса слияния достаточно очевидны, то при гомотопических слияниях, трудно выделить начальную стадию. В первом случае, когда взаимодействуют везикула, несущая v-SNARE, и мембрана иного состава, содержащая комплементарные t-SNAREs (например, секреторная везикула и плазматическая мембрана), v-SNARE, как белок, чуждый ПМ, после слияния должен быть удалён и возвращён обратно в транс-Гольджи, иначе количество таких белков на мембране быстро уменьшится и дальнейшие слияния станут невозможными. Очевидно, что разборка комплекса с помощью NSF будет происходить именно на ПМ, т.е. уже после слияния. Однако, когда сливаются гомотипичные везикулы одинакового происхождения, (например, ранние

20

эндосомы с ранними или поздние с поздними), обе содержат абсолютно одинаковый набор белков, и, в частности, v- и t-SNARE, в том числе и в виде cis-комплекса, возникшего в результате предыдущего цикла слияний. Чтобы дальнейшее слияние стало возможным, он должен быть диссоциирован и активирован до начала нового акта слияния. В этом случае конец предыдущего цикла можно рассматривать как начало следующего. Эта коллизия долго не находила решения, поскольку анализ SNARE-опосредуемых слияний превоначально проводили в системе in vitro, используя эндосомы или фрагментированные вакуоли дрожжей (т.е. гомотипичные органеллы) (Ungermann et al., 1998).

Таким образом, образование NSF-SNAP-SNARE и гидролиз АТФ требуются для того, чтобы v-SNARE, освободившись из диссоциировавшего комплекса, мог рециклировать обратно в мембрану-донор.

Хотя SNARE-комплексы могут обеспечить сближение мембран на расстояние около 4 нм, оставалось неясным, как же именно происходит само слияние (т.е. реорганизация липидных бислоев контактирующих мембран) и насколько оно зависит от SNARE. Данные на этот счет имелись достаточно противоречивые, однако в последние годы появилась некая ясность относительно последней стадии слияния. Биохимические исследования, проведенные на дрожжах, показали, что ключевую роль в слиянии играет VO-субкомплекс вакуолярной АТФазы (Klenchin, Martin, 2000). Когда V0, имеющий форму гексамерного тороида и образующий канал, по которому транспортируются протоны, связан с субкомплексом VI, гидролизующим АТФ, эта структура работает в качестве АТФазы, обеспечивающей закисление люмена эндосом. Напротив, V0 в свободном состоянии способствует слиянию мембран. Транс-SNARE комплексы образуются таким образом, что между ними оказываются

расположенные друг напротив друга два комплекса V0, внутренние стороны мономеров которых формируют гидрофобный интефейс, обеспечивающий перетекание липидов между мембранами, приводящее к их слиянию (Aimers, 2001).

Таким образом можно выделить три стадии слияния. На первой стадии Rab-белки с помощью факторов дистанционного взаимодействия узнают мишень и сближают мембраны, позволяя формировать SNARE-комплексы на второй стадии.

I t-SNARE

Фактор дистанционного

Рис. 1. Стадии слияния. I - заякоривание мембран с помошью факторов Rab-зависимых дистанционного взаимодействия: II - сближение мебран посредством формирования транс-комплекса SNARE: III - непосредственно слияние, т. е. реорганизация липидных слоев (по Vazquez-Martinez, Malagon, 2011).

Третья стадия заключается в реорганизации липидных бислоёв двух мембран, приводящих к их объединению (рис. 1).

Считается, что полному слиянию предшествует стадия «полуслияния» и пора слияния стабилизируется не сразу, поэтому вышеописанный трёхстадийный механизм не обязательно приводит к объединению мембран. Действительно, в некоторых случаях наблюдают кратковременные контакты между двумя мембранами, завершающимися расхождением везикул, а не полным слиянием. Такой феномен получил название «kiss-and-run» (Segovia et al., 2010; Alabi, Tsien, 2013).

2.3. Общая характеристика эидоцитозного пути.

2.3.1. Типы эндоцитоза, пути интернализации, основные

компартменты эндоцитозного пути.

В животных клетках клеточная мембрана постоянно интернализуется с участием разнообразных мембранных структур и способы интернализации, с помощью которых объекты эндоцитоза поступают в клетку, весьма разнообразны. Так, различают широко изученный клатрин-зависимый и гораздо менее изученный клатрин-независимый эндоцитоз, который включает в себя множество вариантов поступления объектов в клетку. Так, пиноцитоз и макропиноцитоз, называемые еще жидкофазным эндоцитозом, являются наименее специфическим путем входа, поскольку основым грузом в данном случае являются все вещества, растворенные в экстраклеточной жидкости. Более 90% материала, попавшего в пиносомы, быстро рециклирует. Это говорит о том, что пиноцитоз в основном поддерживает гомеостаз поверхностной мембраны (Damke et al., 1995). Макропиноцитоз может происходить на участках мембраны, обогащенных раффлами. Выступы раффлов замыкаются, затем происходит интернализация этого участка мембраны вместе с внеклеточной жидкостью (Shao et al., 2002). Фагоцитоз и путь через кавеолы осуществляется только в клетках определённого типа. Кавеолин- и флотиллин-зависимые пути являются наиболее известными разновидностями рафт-опосредованнлого эндоцитоза, обладающего некоторой специфичностью, меньшей, однако, чем специфичность клатрин-зависимого рецептор-опосредованного пути (Rothberg et al., 1992; Frick et al., 2007). Путь через кавеолы, флаконообразные инвагинации ПМ (Parton, Simons, 2007), отличается от остальных более определенными пунктами конечного назначения. Если судьбой поглощенных внеклеточных грузов может быть выбор между рециклированием на ПМ, трансцитозом, доставкой в транс-Гольджи или вступлением на путь лизосомной деградации, связанные с эндосомами, то часть кавеол могут замыкаться, и, отрываясь от мембраны, образовывать кавеосомы. Таким путём в клетку могут попадать вирусы. В дальнейшем они отсортировываются в тубулярную часть кавеосомы, отпочковываются от неё и доставляются в ЭПР, при этом везикулярная часть кавеосомы, которая обогащена холестерином, направляется к аппарату Гольджи. (Cheng et al., 2006). Фагоцитоз осуществляется в основном специализированными клетками и характерен тем, что этим способом клетки поглощают крупные частицы (Carón, Hall, 1998).

Различные молекулы-грузы, попадают в клетку через разные порталы и оказываются в первичных эндоцитозных пузырьках определенного размера (95120 нм в диаметре). Можно с уверенностью утверждать, что эти первичные эндосомы укрупняются за счёт слияний. Хотя существуют данные о том, что разные грузы, исходно упаковываясь в> различные ОЯ, и далее существуют в независимых везикулах (Leonard et al., 2008), в соответствии с наиболее распространенным мнением эти первичные эндосомы укрупняются за счёт

слияний, а их содержимое перемешивается (Mayor et al., 1993, Gruenberg et al., 1989). Такие укрупнённые эндосомы принято называть ранними (РЭ). Их также часто называют сортирующими, поскольку именно в них происходит сегрегация грузов, после чего эти грузы направляются в рециклирующие эндосомы или в поздние эндосомы (ПЭ). Поздние эндосомы называют еще предлизосомным компартментом, так как попадание в них связано с доставкой в лизосомы. Строго говоря, из ранних эндосом берут начало пути, ведущие ко многим компартментам. Через ранние эндосомы идет трансцитозный путь, доставка грузов к транс-Гольджи и ЭПР. Основными, однако, являются пути рециклирования на плазматическую мембрану и путь лизосомной деградации. (Jovic et al., 2010).

Следует отметить, что основные морфологические характеристики компартментов, как на светооптическом, так и на электронно-микроскопическом уровне, также как и динамика эндоцитоза, были в основном описаны еще в 1990х годах. Тем не менее, в вопросах организации эндоцитозного пути до сих пор остаётся много неясного. Уже само название его основных компартментов — «ранних» и «поздних» эндосом, основано на времени попадания в них интернализованных белков-грузов, а не на каких-то характерных морфологических особенностях или наличии маркеров, характерных только для определенного компартмента, как это имеет место в случае ЭПР или аппарата Гольжди. Стоит отметить, что и этот «кинетический» показатель весьма относителен. Так, в ранних эндосомах грузы выявляются уже через 5-20 мин после начала эндоцитоза, а в поздних могут обнаруживаться через 15-60 мин, то есть временные границы существования ранних и поздних эндосом неопределённы (Tjelle et al., 1996). Кроме того, неясно с точки зрения самого механизма этого процесса, что понимать под термином «переход из ранних эндосом в поздние», «доставка в лизосомы». Несмотря на такую неопределенность, существует ряд несомненных характеристик эндоцитозного пути. Во-первых, поскольку процесс начинается на ПМ, а заканчивается в ОЯО, где концентрируется основная масса лизосом (Bright et al., 2005), то считалось, что ранние эндосомы локализуются на периферии клетки, тогда как поздние - в ОЯО. Установлено, что такая «векторность» пути обеспечивается микротрубочками, поскольку при их разрушении различными агентами перераспределения в ОЯО не происходило, также как и деградации грузов. В-третьих, принято говорить о существовании градиента рН вдоль эндоцитозного пути: если в ранних уровень рН около 7.0-6.0 , то в поздних он опускается до 5.5-5.0, а в лизосомах может достигать и 4.5-4.0 (Yamashiro, Maxfield, 1987). Это происходит за счёт работы протонной вакуолярной помпы V1/V0, встроенной в мембрану эндосом (Jefferies et al., 2008).

Морфологически на эндоцитозном пути выявляли различные структуры. Так, ранние эндосомы первоначально описывали как весьма гетерогенную популяцию везикул, которая была представлена пузырьками диаметром до 200^00 нм, тубуло-везикулярными структурами диаметром до 600 нм (в таких структурах можно обнаружить недлинные «рукоподобные» (arm-like) тубулярные выросты

24

(диаметром около 60 нм) от основной везикулярной части), несвязанные друг с другом (Gruenberg, 2001). Однако, компьютерная реконструкция серийных срезов в ряде случаев позволяла предполагать наличие довольно протяженной тубуло-везикулярнуй сети (Mayor et al., 1993). Следует подчеркнуть, что при использовании меченых молекул-грузов, во всех случаях визуализируется только набор везикул разных размеров и форм, и очень редко - контакты между ними.

Считалось, что морфология тубуло-везикулярных эндосом связана с их сортирующей функцией. Действительно, если учесть, что соотношение поверхности к объему в везикулярной части эндосомы существенно меньше, чем в тубулярной, то очевидно, что и соотношение рецептор/лиганд в этих частях также будет различаться. Это справедливо даже при условии равномерного распределения как рецепторов в мембране, так и лигандов, диссоциировавших с ними за счёт снижения рН, в люмене (внутреннем пространстве) эндосомы. В результате основная часть рецепторов окажется в тубулярной части, а лиганда - в везикулярной. Такой пассивный механизм сортировки, несомненно может работать в случае метаболических рецепторов, используемых во многих циклах доставки лиганда внутрь клетки, но в случае сигнальных рецепторов, направляемых в лизосомы, работают другие, активные механизмы, такие как убиквитинирование груза (Haglund, Dikic, 2012). Тубулярные выросты отсоединяются от ранних эндосом и возвращаются обратно на плазматическую мембрану, поддерживая, таким образом, относительное постоянство её состава (Mellman, 1996).

Очень характерной везикулярной структурой являются так называемые мультивезикулярные тела, (МВТ), - достаточно крупные образования, диаметром до 1 мкм, которые содержат разное количество внутренних везикул диаметром 50100 нм (Sotelo, Porter, 1959), обнаруживаемые во всех клетках от дрожжей до млекопитающих. То, что эндоцитированные рецепторы, направляемые в лизосомы, выявляются в МВТ, в частности, в мембранах внутренних пузырьков, позволило связать МВТ с эндоцитозным путем, после чего их стали называть мультивезикулярными эндосомами (МВЭ), хотя до сих пор употребляется и первоначальное название. Более того, эти органеллы всегда выявлялись в клетках после стимуляции пути, ведущего к лизосомной деградации (Miller et al., 1986).

Вопрос о том, каково их место и роль в эндоцитозном пути, долго оставался предметом дискуссий. Даже лизосомы, конечный пункт деградационного пути, не вносили дополнительной ясности в определение границ компартментов и в механизмы переноса грузов между ними, поскольку выяснилось, что ряд лизосомных ферментов может выявляться и в поздних эндосомах, отличающихся от лизосом по плавучей плотности (Bright et al., 1997; Меликова и др., 2002).

2.3.2. Основные гипотезы организации эндоцитозного пути.

Все эти данные и связанные с ними проблемы были* предметом острых дискуссий и породили несколько интерпретаций организации эндоцитозного пути (Murthy, 1991; Beguinot et al., 1984; Marsh et al., 1986). В качестве основных гипотез

можно назвать две: гипотезу «эндосомальных везикул-переносчиков», или endocomal carrier vesicles (ECV), принадлежащую коллективу ученых, работавших в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL) в Гейдельберге, и гипотезу «созревания» (maturation), сформулированную д-ром Мэрфи (Murthy, 1991) и рядом других исследователей. Хочется отметить, что значительную путаницу в проблему биогенеза эндосом вносило и само понимание термина «компартмент».

Так, представители первой точки зрения исходили из того, что существует общий принцип организации транспортных путей. Наиболее ярко он проявляется на биосинтетическом пути, где, как считалось, есть стабильные, «предсуществующие», компратменты с постоянными составом резидентных белков и липидов и четко выраженной морфологией - ЭПР и аппарат Гольджи, а перемещение грузов (т.е. вновь синтезированных мембранных белков) между ними осуществляется транспортными везикулами-переносчиками. Таким образом, основное различие между компартментом и везикулой в том, что «компартмент» существует всегда, а «везикула» возникает из одного компартмента и исчезает после слияния с другим.

Поскольку, по логике авторов, эндоцитозный путь нисколько «не хуже» биосинтетического, то на нём также должны существовать предсуществующие стабильные компартменты, сообщающиеся с помощью транспортных пузырьков. В качестве таких компартментов были предложены периферические тубуло-везикулярные ранние эндосомы и околоядерные поздние эндосомы. Считалось, что поздние эндосомы ограничены единой мембраной, наподобие вакуоли в дрожжах, и именно этот поздний компартмент и является основным, осуществляющим деградацию попавших в него грузов, тогда как классические везикулярные лизосомы являются простыми депо лизосомных ферментов и отчасти переваренных грузов. В соответствии с этой гипотезой первичные эндосомы, содержащие как мембранные белки, так и белки жидкой фазы, отпочковавшись от ПМ, сливаются с ранними, или сортирующими эндосомами (РЭ), представленными сетью тубуловезикулярных органелл. Белки, которые должны попасть в поздние эндосомы, скапливаются в везикулярных доменах эндосом, из которых в дальнейшем формируются везикулы-переносчики. Роль везикул-переносчиков (ECVs) по этой гипотезе отводили МВТ. При этом предполагалось, что снижение уровня рН в эндосомах требовалось именно для формирования везикул-переносчиков и их отщепления от РЭ. В дальнейшем ECVs по микротрубочкам перемещались в околоядерную область, где происходило их слияние с так называемым позднеэндосомным компартментом, представленным, по мнению авторов, одной общей структурой (Gruenberg et al., 1989). Основой этой гитотезы, кроме уже упоминавшихся, служили также и наблюдения на уровне световой микроскопии с использованием флуоресцентно-меченых грузов. Несовершенство оптических свойств микроскопов, использовавшихся в 1990х годах, приводило к тому, что скопление везикул в околоядерной области выглядело как единая

26

структура. Однако, даже собственные исследования авторов этой гипотезы, выполненные на уровне электронной микроскопии, не позволили им выявить наличие такого компартмента в околоядерной области (Gruenberg et al., 1989).

Самым сильным аргументом в пользу этой теории были эксперименты по возможности слияния между эндосомами, выделенными через разные периоды времени после стимуляции эндоцитоза: если разница во времени образования эндосом не превышала 10-15 мин, они эффективно сливались, тогда как при увеличении интервала до 30 мин частота слияний стремилась к нулю. (Gruenberg et al., 1989; см. также обзор Rink, 2005). Тем самым авторы утверждали, что мембраны ранних и поздних эндосом совершенно различны по составу, т.е. гетеротипичны, а, следовательно, принадлежат разным компартментами и перенос грузов между ними требует везикулярного посредника (Griffiths, Gruenberg, 1991). Действительно, в соответствии с логикой авторов должен существовать небольшой временной отрезок, в течение которого происходит отделение везикулы-переносчика от ранней эндосомы, после чего такие эндосомы не могут сливаться с эндосомами, изолированными до этого временного отрезка.

Несмотря на привлекательность этой гипотезы, она имеет целый ряд существенных недостатков. Так, не только «конкурирующим» исследовательским группам, но и самим авторам не удалось выявить в культивируемых клетках млекопитающих большого околоядерного компартмента, окруженного единой мембраной (Gruenberg et al., 1989). Кроме того, им потребовалось придумывать ничем не подтвержденный механизм формирования и структуры МВЭ для того, чтобы объяснить отсутствие в предполагаемом позднем эндосомом конпартменте внутренних пузырьков, которые должны были бы там появляться после слияния МВТ с ПЭ. Однако активная «пиар-компания» этой гипотезы сделала ее на многое годы основной. Так, некоторые исследователи до сих пор говорят о предсуществующих ранних сортирующих эндосомах (Mesaki et al., 2011; Platta, Stenmark, 2011).

Проводимые в то же время несколькими группами ученых эксперименты показали отсутствие жестких запретов на слияние эндосом, возникших с увеличивающимся интервалом (Dunn et al., 1989). Они показали, что вероятность слияния эндосом действительно падает с увеличением промежутка времени, после которого получали фракцию поздних эндосом, но падение частоты слияний сходно с динамикой уменьшения вероятности рециклирования (Salzman, Maxfïeld, 1989) , и изменения эти идут постепенно.

Более того, детальные исследования с помощью разных подходов позволили сформировать следующие представления о ходе эндоцитоза: первичные эндосомы укрупнялись после слияний друг с другом и формировали периферические тубуло-везикулярные изолированные структуры. Вскоре после этого за счёт инвагинаций некоторых участков мембраны такой укрупнённой ранней эндосомы начинали формироваться внутренние пузырьки, а сами везикулы перемещались в околоядерную область, при этом параллельно увеличивая количество внутренних

27

пузырьков и уменьшая количество тубулярных выростов. В результате формировались плотно упакованные МВЭ, образующие кластер в околоядерной области. После этого во внеклеточной среде начинали появляться продукты расщепления белков-грузов, что свидетельствовало о всаимодействии таких «созревших» МВЭ с лизосомами. Очевидно, что с точки зрения груза, направляемого на деградацию, все события происходят в одной и той же везикуле, постепенно приобретающей мультивезикулярную морфологию причем каждый раз эндосомы возникали de novo и претерпевали созревание из ранних в поздние. При этом МВЭ и являются поздними эндосомами. Такая последовательность развития событий, имеющая гораздо более надёжное экспериментальное обоснование в работах разных исследовательских групп, первой из которых стала группа Мёрфи (Murthy, 1991; Stoorvogel et al., 1991; Dunn, Maxfield, 1992), получила название «гипотезы созревания эндосом» и в настоящее время она является наиболее распространённой. Её преимуществами является во-первых, отсутствие необходимости поиска дополнительных структур, соответствие динамики падения вероятности слияний между «ранними» и «поздними» эндосомами экспериментально наблюдаемой. Поскольку свойства мембраны созревающей эндосомы постепенно изменяются за счет постоянно идущего процесса рециклирования на ПМ, ухода части мембраны внутрь МВЭ, а также привлечения везикул, содержащих лизосомные ферменты, из транс-Гольджи (этот процесс усиливается на поздних стдиях эндоцитоза), то логично как отсутствие четких границ между РЭ и ПЭ, так и падение эффективности слияния РЭ и ПЭ с увеличением интервала времени между началом их формирования. Кроме того, размеры МВЭ и лизосом лежат в одном диапазоне, что снимает вопрос об их взаимодействии. Кроме того, переход мембранных грузов во внутренние пузырьки также позволяет представить, каким образом подвергаются деградации грузы, локализованные первоначально во внешней мембране эндосомы.

2.4. Основные механизмы и белки, организующие эндоцитозный путь.

Одной из наиболее острых проблем, создававших трудности интерпретации относительно идентификации и генезиса эндосомных структур, являлось отсутствие данных о резидентных белках эндосом, которые могли бы служить надежными маркерами для исследователя. Однако с течением времени такие данные стали появляться, и к настоящему времени картина выглядит следующим образом. Ключевыми белками, участвующими в организации эндоцитозного пути, можно назвать малые ГТФазы Rab семейства, Р13-киназа Vps34. Основные Rab белки, присутствующие на ранних эндосомах - это Rab5, Rab4 и Rabil. При этом Rab4 координирует процессы, связанные с «быстрым» рециклированием, a Rabil вовлечён в «медленное» рециклирование из эндосом, уже переместившихся в околоядерную область (Woodman, 2000; Baetz, Goldenring, 2013), тогда как Rab5 рекрутируется на эндосомы сразу после их формирования и оркеструет все дальнейшие события. Насколько важен Rab5 для организации эндоцитозного пути демонстрирует работа группы Зериала, в которой последовательно истощали все изоформы Rab5. В результате в клетках исчезали не только эндосомы, но и лизосомы (Zeigerer et al., 2012) На поздних стадиях созревания эндосом на них выявляется Rab7. При этом Rab5 постепенно заменяется на Rab7 в ходе процесса, известного как Rab5/Rab7 конверсия (Rink et al., 2005).

Малая ГТФаза Rab5 - один из наиболее изученных белков ранних эндосом. Считается, что он регулирует вход груза с плазматической мембраны в ранние эндосомы, образование фосфоинозитол-3-фосфат-обогащённых участков, гомотопические слияния и передвижение эндосом по микротрубочкам (МТ) и актиновым филаментам (Christoforidis et al., 1999; Pal et al., 2006).Также он участвует в активации сигнальных каскадов с ранних эндосом (Miaczynska et al., 2004). Активация Rab5, то есть переход его в ГТФ-связанную форму, происходит с участием GEF Rabex-5. Затем на этот белок рекрутируется Rabaptin-5, который связывается с ГТФ-связанным Rab5 и вновь рекрутирует Rabex-5, вследствие чего формируется положительная обратная связь, которая поддерживает и стабилизирует активированное состояние Rab5 на ранних эндосомах (Lippe et al., 2001). Это временное, но значительное повышение уровня активации Rab5, необходимо для рекрутирования на ранние эндосомы эффекторов, участвующих в организации эндоцитозного пути. Известен также ещё один GEF для Rab5 - RIN1 (Balaji et al., 2012). Его рекрутирование на эндосомы было выявлено при стимуляции эндоцитоза рецептора EGF. Предполагают, что рецептор EGF через RIN1 организует не только свой собственный эндоцитозный путь, но и ранний сигналинг, поскольку необходим для ассоциации сигнального белка APPL с первичной эндосомой. До сих пор неясно, какие взаимоотношения существуют между Rabex-5 и RIN1.

Одним из основных партнёров активированного Rab 5 является фосфатидилинозитол-3-киназа Vps34, известная также как hVps34/pl50. Её роль заключается в генерировании PI3P, липида, продуцируемого на мембране ранних

29

эндосом. Единственная каталитическая субъединица Vps34 образует комплекс с серин-треониновой протеинкиназой р150, которая миристилирована, и тем самым способствует заякориванию Vps34 в мембране. Rab5 сначала привлекает субъединицу р150, которая, в свою очередь, рекрутирует Vps34 (Christoforidis, 1999). По существующим представлениям, совместное присутствие активированного Rab5 и PI3P является сигналом для привлечения на мембрану ранних эндосом таких белков как ЕЕА1, Rabenosyn-5, белков семейства SNX (Lawe et al., 2002; Nielsen et al., 2000; Cozier et al., 2002). Механизм рекрутирования этих белков связан с наличием в их структуре доменов, узнающих PI3P, Наиболее специфичным доменом является FYVE-домен, обнаруженный в белках ЕЕА1, Rabenosyn-5 и Hrs. Менее специфичный РХ-домен содержат белки группы сортирующих нексинов SNX, способных связываться с клатрином, и образовывать на эндосоме платформу, позволяющую концентрировать взаимодействующие с SNX рецепторы-грузы (Rangarajan, 2010).

Считают, что наличие ЕЕА1 на мембране может запускать процесс слияния эндосом, поскольку он является фактором дистанционного взаимодействия, опосредующим первую фазу слияния (Mills et äl., 2001). Присутствие на мембране Hrs (узнающего убиквитиновые цепочки на белках-грузах основного компонента первого из четырех так называемых сортирующих комплексов ESCRT0) необходимо для сортировки убиквитинированных рецепторов-грузов в поздние эндосомы и для формирования мультивезикулярных тел (Morino et al., 2004). Таким образом, формирование Р13Р-обогащенных участков мембраны в ранних эндосомах необходимо для регуляции почти всех событий, происходящих в ходе сортировки.

Ещё одним ферментом, рекрутирующимся на мембрану ранних эндосом и осуществляющим фосфорилирование PI3P, в результате чего образуется Р1(3,5)Р2, является киназа PIKFyve. Она рекрутируется за счёт FYVE-домена и чувствительна к обработке вортманнином (Sbrissa et al., 2002). Экспрессия этого белка с конститутивно-неактивным киназным доменом или уменьшение его количества в клетке приводит к появлению крупных везикул в цитоплазме (Rutherford et al., 2006). Считается, что это происходит из-за того, что Р1(3,5)Р2 необходим для отделения рециклирующих везикул. Следует отметить, что Vps34 также чувствительна к вортманнину, в результате действия которого возникают укрупнённые эндосомы без внутренних пузырьков (Железнова и др., 2001). Таким образом, такое укрупнение везикул может происходить как в результате снижения рециклирования из эндосом по причине отсутствия субстрата для PIKFyve, так и за счёт подавления формирования внутренних пузырьков. Однако, по данным Рутерфорда нельзя исключать и непосредственного участия PIKFyve в формировании МВТ.

Другой механизм, за счёт которого уменьшается количество PI3P на мембране ранних эндосом, реализуется за счёт работы фосфатазы МТМ1, члена семейства миотубуларинов. Было продемонстрировано, что МТМ1 локализуется на

30

везикулах, несущих Rab5 и ЕЕА1, и регулирует уровень PI3P на мембране. При этом оверэкспрессия МТМ1 приводила к уменьшению PI3P на ранних эндосомах и мультивезикулярных телах, а истощение клеток по белку МТМ1 - к увеличению уровня PI3P (Cao et al., 2008). Таким образом, МТМ1 участвует в поддержании определённой концентрации PI3P на ранних эндосомах, что необходимо для правильной организации процесса сортировки в ранних эндосомах.

2.4.1. Механизм слияния ранних эндосом.

Как упоминалось выше, слияния гомотипических эндосом - один из основных процессов, идущих на эндоцитозном пути. Такие слияния на ранних стадиях создают «избыток» мембраны, которая используется для формирования внутренних пузырьков созревающих эндосом. Ключевыми регуляторами подобных слияний является активированный Rab, и факторы дистанционного взаимодействия (tethers), осуществляющие заякоривание мембран. Такие факторы могут быть представлены как белковыми комплексами, так и длинными линейными молекулами, причём последние являются факторами, работающими на эндоцитозном пути. Общей чертой таких белков является наличие длинного суперскрученного и глобулярного концевого участка. В длинных суперскрученных участках могут быть вставки гибких последовательностей, которые способны изгибаться, позволяя сближаться заякоренным мембранам (Gillingham et al., 2003).

Среди белков дистанционного взаимодействия, участвующих в слияниях на эндоцитозном пути, выделяют ЕЕА1, Rabaptin-5 и Rabip4 (Brocker et al., 2010J. Rabip4 является эффектором Rab4. Он обладает двумя су перекрученными доменами, N-концевым RUN доменом, за счёт которого связывается с эндосомой, а на С-конце несёт FYVE домен. По-видимому, этот белок играет роль в возвращении груза из рециклирующих обратно в ранние эндосомы, так как при его оверэкспрессии рециклирующие белки накапливаются в ранних эндосомах (Cormont et al., 2001).

Белок ЕЕА1 (Early Endosomal Autoantigen 1) участвует в слияниях ранних эндосом. В его составе выделяют несколько доменов: на N-концевой части белка Zn-finger домен, в С-концевой части - кальмодулин-связывающий домен, Rab5-связывающая последовательность (RBD-домен), и на терминальном участке -FYVE-домен, обеспечивающий взаимодействие с Р1(3)Р на мембране эндосомы (Patki, 1998). Оказалось, что связывание ЕЕА1 с ранней эндосомой может осуществляться и при наличии мутации в RBD-домене, то есть взаимодействие через FYVE-домен является основным. ЕЕА1 при этом выявляется на мембране везикул, однако слияния их не происходит. В этом случае наблюдается множество мелких везикул, заякоренных друг с другом (Lawe et al., 2002). Таким образом, RBD-домен требуется на этапе слияния эндосом. Интересно, что Zn-finger домен на N-концевом участке также может обеспечивать связывание ЕЕА1 с белком Rab5 (Merithew et al., 2003), за счёт чего, по-видимому, взаимодействуют две мембраны, содержащие Rab5. ЕЕА1 существует в форме димеров, при этом С-концевые

домены формируют высокоорганизованную жесткую четвертичную структуру из параллельных

А

Tandem

lns<l.3)P, L™"« lns(l.3)P2

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Злобина, Мария Владимировна

6. выводы

1. ЕЕА1, белок, регулирующий первую стадию гомотипического слияния эндосом (заякоривание, или tethering), не рекрутируется из цитоплазмы на мембрану эндосом, формирующихся при стимуляции эндоцитоза, а локализован преимущественно на мембране предсуществующих в клетке везикул.

2. Ранние эндосомы, содержащие рецептор EGF, сливаются не напрямую, а опосредованно через формирование гибридных органелл с ЕЕА1-везикулами. Гибридные органеллы поддерживают доменную структуру.

3. Формирование гибридных эндосом проходит через ряд последовательных стадий, завершающихся сегрегацией ЕЕА1-содержащих везикул и мультивезикулярных рецептор-содержащих эндосом. В результате исходный пул ЕЕА1-везикул восстанавливается. Процесс слияний, опосредуемых ЕЕА1-везикулами, и последующая сегрегация необходимы для созревания эндосом.

4. Несмотря на снижение ассоциации ЕЕА1 с мембраной и уменьшение размеров ЕЕА1-везикул при подавлении активности Р13-киназы под действием вортманнина, ЕЕА1-везикулы сохраняют способность формировать гибридные органеллы.

5. Микротрубочки не только обеспечивают перемещения эндосом, но и поддерживают слияния гибридных органелл, тогда как актиновые микрофиламенты необходимы для их сегрегации.

6. Густая подвижная сеть МТ может как обеспечивать, так и затруднять линейные перемещения эндосом. Эндосома в результате перемещается с периферии в околоядерную область, т.к. общий суммарный вектор динеин-зависимых перемещений направлен к центру организации МТ, однако время, затрачиваемое на этот процесс, оказывается весьма значительным. В целом, роль микротрубочек в организации перемещений эндосом можно охарактеризовать как модулирующую.

7. Контакты между везикулами происходят постоянно, однако наиболее часто они оказываются безрезультатными, но могут также заканчиваться частичным обменом материала. Полное слияние является более редким событием.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Злобина, Мария Владимировна, 2013 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Бураков А.В., Надеждина Е.С. (2006). Динеин и динактин как организаторы системы клеточных микротрубочек. Онтогенез. 37(5): 1-17.

Железнова Н.Н., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. (2001). Влияние вортманнина на эндоцитоз рецепторов эпидермального фактора роста. Цитология. 43(2): 156—165

Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. (1987). Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 44(7): 904-910.

Меликова, М.С., Благовещенская А.Д., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. (2002). Влияние ингибитора вакуолярой протонной помпы бафиломицина А1 на внутриклеточный процессинг маркеров рецептор-опосредованного и жидкофазного эндоцитоза. Цитология. 44(8): 807-816.

Минин А. А., Кулик А.В. (2004). Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции. Успехи биологической химии. 44: 225-262.

Минин А.А., Молдавер М.В. (2008). Виментиновые промежуточные филаменты и их роль во внутриклеточном распределении органелл. Успехи биологической химии. 48: 221252.

Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. (1987). Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

Соколова И.П., Арнаутов A.M., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. (1998). Исследование ассоциации малой ГТФазы Rab7 с эндосомами клеток, экспрессирующих нормальный и мутантные формы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 40(9): 862-868.

Achiriloaie, М., Barylko, В., Albanesi, J. P. (1999). Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in receptor-mediated endocytosis. Molecular and cellular biology, 19(2), 1410-1415.

Aderem, A. (1992). Signal transduction and the actin cytoskeleton: the roles of MARCKS and profilin. Trends in biochemical sciences, 17(10), 438^13.

Akella JS, Wloga D, Kim J, Starostina NG, Lyons-Abbott S, Morrissette NS, Dougan ST, Kipreos ET Gaertig J. (2010). MEC 17 is an a-tubulin acetyltransferase. Nature. 467:218-222.

Aimers, W. (2001). Fusion needs more than SNAREs. Nature, 409(6820), 567-568.

Andrews, R., Ahringer, J. (2007). Asymmetry of early endosome distribution in C. elegans embryos. PloS one, 2(6), e493.

Baas PW, Karabay A, Qiang L. (2005). Microtubules cut and run. Trends in Cell Biology. 15(10):518-24.

Babst, M. (2011). MVB vesicle formation: ESCRT-aependerri, ESCRT-indepcndent and everything in between. Current opinion in cell biology, 23(4), 452-7.

Baetz, N. W., Goldenring, J. R. (2013). Rabl 1-Family Interacting Proteins define spatially and temporally distinct regions within the dynamic Rabl la-dependent recycling system. Molecular biology of the cell.

Balaji, K., Mooser, C., Janson, С. M., Bliss, J. M., Hojjat, H., Colicelli, J. (2012). RIN1 orchestrates the activation of RAB5 GTPases and ABL tyrosine kinases to determine the fate of EGFR. Journal of cell science, 125(Pt 23), 5887-96.

Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. (1984). Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell, 39(3 Pt 2), 525-536

Baldini, G., Wang, G., Weber, M., Zweyer, M., Bareggi,' R., Witkin, J. W., Martelli, A. M. (1998). Expression of Rab3D N1351 inhibits regulated secretion of ACTH in AtT-20 cells. The Journal of cell biology, 140(2), 305-313.

Barlowe, C., Orci, L., Yeung, T., Hosobuchi, M., Hamamoto, S., Salama, N., Rexach, M. F., Ravazzola M, Amherdt M, Schekman R. (1994). COPII: a membrane coat formed by Sec proteins that drive vesicle budding from the endoplasmic reticulum. Cell, 77(6), 895-907.

Bauerfeind, R., Takei, K., De Camilli, P. (1997). Amphiphysin I is associated with coated endocytic intermediates and undergoes stimulation-dependent dephosphorylation in nerve terminals. The Journal of biological chemistry, 272(49), 30984-30992.

Beguinot, L., Lyall, R. M., Willingham, M. C., Pastan, I. (1984). Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(8), 2384-8.

Belmont L, Mitchison T, Deacon HW. (1996). Catastrophic revelations about Opl8/stathmin. Trends in Biochemical Sciences. 21:197-8.

Benmerah, A., Lamaze, C., Bègue, B., Schmid, S. L., Dautry-Varsat, A., Cerf-Bensussan, N. (1998). AP-2/Epsl5 interaction is required for receptor-mediated endocytosis. The Journal of cell biology, 140(5), 1055-1062.

Binder, B., Holzhutter, H.-G. (2012). A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell biochemistry and biophysics, 63(1), 59-71.

Boll, W., Gallusser, A., Kirchhausen, T. (1995). Role of the regulatory domain of the EGF-receptor cytoplasmic tail in selective binding of the clathrin-associated complex AP-2. Current biology: CB, 5(10), 1168-1178.

Boite, S., Cordelières, F. P. (2006). A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of microscopy, 224 (Pt 3), 213-232.

Brandhorst, D., Zwilling, D., Rizzoli, S. O., Lippert, U., Lang, T., Jahn, R. (2006). Homotypic fusion of early endosomes: SNAREs do not determine fusion specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(8), 2701-2706.

Bright, N. A, Reaves, B. J., Mullock, B. M., Luzio, J. P. (1997). Dense core lysosomes can fuse with late endosomes and are re-formed from the resultant hybrid organelles. Journal of cell science, 110 ( Pt 1), 2027-2040.

Bright, N. A., Gratian, M. J., Luzio, J. P. (2005). Endocytic Delivery to Lysosomes Mediated by Concurrent Fusion and Kissing Events in Living Cells, 15, 360-365.

Brôcker, C., Engelbrecht-Vandré, S., Ungermann, C. (2010). Multisubunit tethering complexes and their role in membrane fusion. Current biology : CB, 20(21), R943-52.

Brouhard GJ, Stear JH, Noetzel TL, Al-Bassam J, Kinoshita K, Harrison SC, Howard J, Hyman AA. (2008). XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132:79-88.

Butler KV, Kalin J, Brochier C, Vistoli G, Langley B, Kozikowski AP. (2010). Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J AmChemSoc. 132(31):10842-6.

Cai D, McEwen DP, Martens JR, Meyhofer E, Verhey KJ. (2009). Single molecule imaging reveals differences in microtubule track selection between Kinesin motors. PLoS Biol.; 7:el000216.

Canagarajah, B. J., Ren, X., Bonifacino, J. S., Hurley, J. H. (2013). The clathrin adaptor complexes as a paradigm for membrane-associated allostery. Protein science: a publication of the Protein Society. [Epub ahead of print].

Cao, C., Backer, J. M., Laporte, J., Bedrick, E. J., Wandinger-Ness, A. (2008). Sequential actions of myotubularin lipid phosphatases regulate endosomal PI(3)P and growth factor receptor trafficking. Molecular biology of the cell, 19(8), 3334-46.

Caron, E., Hall, A. (1998). Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science (New York, N.Y.), 282(5394), 1717-21.

Carpentier, J. L., Gorden, P., Anderson, R. G., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Cohen, S., Orci, L. (1982). Co-localization of 1251-epidermal growth factor and ferritin-low density lipoprotein in coated pits: a quantitative electron microscopic study in normal and mutant human fibroblasts. The Journal of cell biology, 95(1), 73-77.

Chang, L., Goldman, R. D. (2004). Intermediate filaments mediate cytoskeletal crosstalk. Nature reviews. Molecular cell biology, 5(8), 601-13.

Chavrier, P., Goud, B. (1999). The role of ARF and Rab GTPases in membrane transport. Current opinion in cell biology, 11(4), 466-475.

Chazaud, B., Muriel, M. P., Aubery, M., Cassio, D. (1998). Atypical microtubule organization in undifferentiated human colon cancer cells. Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série III, Sciences de la vie, 321(1), 11-8.

Chen, W. S., Lazar, C. S., Lund, K. A., Welsh, J. B., Chang, C. P., Walton, G. M., Der, C. J., Wiley HS, Gill GN, Rosenfeld MG. (1989). Functional independence of the epidermal growth factor receptor from a domain required for ligand-induced internalization and calcium regulation. Cell, 59(1), 33^3.

Chen, Y. A., Scheller, R. H. (2001). SNARE-mediated membrane fusion. Nature reviews. Molecular cell biology, 2(2), 98-106.

Cheng, Z.-J., Singh, R. D., Marks, D. L., Pagano, R. E. (2006). Membrane microdomains, caveolae, and caveolar endocytosis of sphingolipids. Molecular membrane biology, 23(1), 10110.

Chiariello, M., Bruni, C. B., Bucci, C. (1999). The small GTPases Rab5a, Rab5b and Rab5c are differentially phosphorylated in vitro. FEBS letters, 453(1-2), 20-24.

Chibalina, M. V, Seaman, M. N. J., Miller, C. C., Kendrick-Jones, J., Buss, F. (2007). Myosin VI and its interacting protein LMTK2 regulate tubule formation and transport to the endocytic recycling compartment. Journal of cell science, 120 (Pt 24), 4278-88.

Chrétien, D., Metoz, F., Verde, F., Karsenti, E., Wade, R. H. (1992). Lattice defects in microtubules: protofilament numbers vary within individual microtubules. The Journal of cell biology, 117(5), 1031^0.

Christoforidis, S., McBride, H. M., Burgoyne, R. D., Zerial, M. (1999). The Rab5 effector EEA1 is a core component of endosome docking. Nature, 397(6720), 621-5.

Chu CW, Hou F, Zhang J, Phu L, Loktev AV, Kirkpatrick DS, Jackson PK, Zhao Y, Zou H. (2011). A Novel acetylation of P-tubulin by San modulates microtubule polymerization via down-regulating tubulin incorporation. Mol. Biol. Cell. 22:448—456.

Collins, A., Warrington, A., Taylor, K. A., Svitkina, T. (2011). Structural organization of the actin cytoskeleton at sites of clathrin-mediated endocytosis. Current biology : CB, 21(14), 1167-75

Conde, C., Câceres, A. (2009). Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature reviews. Neuroscience, 10(5), 319-32.

Cormont, M., Mari, M., Galmiche, A., Hofman, P., Le Marchand-Brustel, Y. (2001). A FYVE-finger-containing protein, Rabip4, is a Rab4 effector involved in early endosomal traffic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(4), 163742.

Corvera, S. (1990). Insulin stimulates the assembly of cytosolic clathrin onto adipocyte plasma membranes. The Journal of biological chemistry, 265(5), 2413-2416.

Cosson, P., Letourneur, F. (1994). Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs. Science (New York, N.Y.), 263(5153), 1629-1631.

Coursodon, C. F., Dvorak, B. (2012). Epidermal growth factor and necrotizing enterocolitis. Current opinion in pediatrics, 24(2), 160-164.

Cozier, G. E., Carlton, J., McGregor, A. H., Gleeson, P. A., Teasdale, R. D., Mellor, H., Cullen, P. J. (2002). The phox homology (PX) domain-dependent, 3-phosphoinositide-mediated association of sorting nexin-1 with an early sorting endosomal compartment is required for its ability to regulate epidermal growth factor receptor degradation. The Journal of biological chemistry, 277(50), 48730-6.

Creppe C, Malinouskaya L, Volvert ML, Gillard M, Close P, Malaise O, Laguesse S, Cornez I, Rahmouni S, Ormenese S, Belachew S, Malgrange B, Chapelle JP, Siebenlist U, Moonen G, Chariot A, Nguyen L. (2009). Elongator controls the migration and differentiation of cortical neurons through acetylation of a-tubulin. Cell. 136:551-564.

Damke, H., Baba, T., Van der Bliek, A. M., Schmid, S. L. (1995). Clathrin-independent pinocytosis is induced in cells overexpressing a temperature-sensitive mutant of dynamin. The Journal of cell biology, 131(1), 69-80.

De La Cruz, E. M., Ostap, E. M., Sweeney, H. L. (2001). Kinetic mechanism and regulation of myosin VI. The Journal of biological chemistry, 276(34), 32373-81.

de Ruijter AJ, van Gennip AH, Caron HN, Kemp S, van Kuilenburg AB. (2003). Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochemical Journal; 370 (Pt 3):737-49.

Deribe, Y. L., Wild, P., Chandrashaker, A., Curak, J., Schmidt, M. H. H., Kalaidzidis, Y., Milutinovic, N., Kratchmarova I, Buerkle L, Fetchko MJ, Schmidt P, Kittanakom S, Brown KR, Jurisica I, Blagoev B, Zerial M, Stagljar I, Dikic 1.(2009). Regulation of epidermal growth factor receptor trafficking by lysine deacetylase HDAC6. Science signaling, 2(102), ra84.

Derivery, E., Sousa, C., Gautier, J. J., Lombard, B., Loew, D., Gautreau, A. (2009). The Arp2/3 activator WASH controls the fission of endosomes through a large multiprotein complex. Developmental cell, 17(5), 712-23.

Dimitrov, A., Quesnoit, M., Moutel, S., Cantaloube, I., Poiis, C., Perez, F. (2008). Detection of GTP-tubulin conformation in vivo reveals a role for GTP remnants in microtubule rescues. Science (New York, N.Y.), 322(5906), 1353-6.

Dinter, A., Berger, E. G. (n.d.). (1998). Golgi-disturbing agents. Histochemistry and cell biology, 109(5-6), 571-590.

Dominguez K, Holmes KC (2011). Actin structure and function. Annual Review Biophysics; 40:169-86

Donaldson, J. G., Jackson, C. L. (2000). Regulators and effectors of the ARF GTPases. Current opinion in cell biology, 12(4), 475-482.

Dunn, K. W., Maxfield, F. R. (1992). Delivery of ligands from sorting endosomes to late endosomes occurs by maturation of sorting endosomes. The Journal of cell biology, 117(2), 30110.

Dunn, K. W., McGraw, T. E., Maxfield, F. R. (1989). Iterative fractionation of recycling receptors from lysosomally destined ligands in an early sorting endosome. The Journal of cell biology, 109 (6 Pt 2), 3303-14.

Durrbach, A., Louvard, D., Coudrier, E. (1996). Actin filaments facilitate two steps of endocytosis. Journal of cell science, 109 (Pt 2), 457-465.

Ebner R., Derynck R. (1991). Epidermal growth factor and transforming growth factor-a: differential intracellular routing and processing of ligand-recptor complexes. Cell Regulation. 2: 599-612.

Etienne-Manneville S. (2010). From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology; 22:104—111.

Faini, M., Beck, R., Wieland, F. T., Briggs, J. A. G. (2013). Vesicle coats: structure, function, and general principles of assembly. Trends in cell biology, pii: S0962-8924(l 3)00007-X [Epub ahead of print].

Fasshauer, D. (2003). Structural insights into the SNARE mechanism. Biochimica et biophysica acta, 1641(2-3), 87-97.

Fasshauer, D., Sutton, R. B., Brunger, A. T., Jahn, R. (1998). Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(26), 15781-15786.

Felder, S., Miller, K., Moehren, G., Ullrich, A., Schlessinger, J., Hopkins, C. R. (1990). Kinase activity controls the sorting of the epidermal growth factor receptor within the multivesicular body. Cell, 61(4), 623-34.

Fosket D.E., Morejohn L.C. (1992). Structural and functional organization of tubulin. Annual Review Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43: 201-240.

Frick, M., Bright, N. A., Riento, K., Bray, A., Merrified, C., Nichols, B. J. (2007). Coassembly of flotillins induces formation of membrane microdomains, membrane curvature, and vesicle budding. Current biology : CB, 17(13), 1151-6.

Gaidarov, I., Santini, F., Warren, R. A., Keen, J. H. (1999). Spatial control of coated-pit dynamics in living cells. Nature cell biology, 1(1), 1-7.

Gao, Y., Hubbert, C. C., Lu, J., Lee, Y.-S., Lee, J.-Y., Yao, T.-P. (2007). Histone deacetylase 6 regulates growth factor-induced actin remodeling and endocytosis. Molecular and cellular biology, 27(24), 8637-47.

Gao, Y., Hubbert, C. C., Yao, T.-P. (2010). The microtubule-associated histone deacetylase 6 (HDAC6) regulates epidermal growth factor receptor (EGFR) endocytic trafficking and degradation. The Journal of biological chemistry, 285(15), 11219-11226.

Gillingham, A. K., Munro, S. (2003). Long coiled-coil proteins and membrane traffic. Biochimica et biophysica acta, 1641(2-3), 71-85.

Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N. P., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R (2012). Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. Journal of structural biology, 177(1), 14-23.

Goodwin S.S., Vale RD. (2010). Patronin regulates the microtubule network by protecting minus-ends. Cell. 143(2):263-74.

Grego, S., Cantillana, V., Salmon, E. D. (2001). Microtubule treadmilling in vitro investigated by fluorescence speckle and confocal microscopy. Biophysical journal, 81(1), 6678.

Griffiths, G., Gruenberg, J. (1991). The arguments for pre-existing early and late endosomes. Trends in cell biology, 1(1), 5-9.

Grimes, R. W., Manni, A., Hammond, J. M. (1996). Postsynthetic regulation of insulin-like growth factor-binding protein-3 by MCF-7 human breast cancer cells in culture. Breast cancer research and treatment, 39(2), 187-196.

Gross S.P., Tuma M.C., Deacon S.W., Serpinskaya A.S., Reiiein A.R., Gelfand V.I. (2002). Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell Biol. 156:855-865

Gruenberg, J. (2001). The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nature reviews. Molecular cell biology, 2(10), 721-30.

Gruenberg, J., Griffiths, G., Howell, K. E. (1989). Characterization of the early endosome and putative endocytic carrier vesicles in vivo and with an assay of vesicle fusion in vitro. The Journal of cell biology, 108(4), 1301-16.

Haglund, K., Dikic, I. (2012). The role of ubiquitylation in receptor endocytosis and endosomal sorting. Journal of cell science, 125 (Pt 2), 265-75.

Haucke, V., Wenk, M. R., Chapman, E. R, Farsad, K., De Camilli, P. (2000). Dual interaction of synaptotagmin with mu2- and alpha-adaptin facilitates clathrin-coated pit nucleation. The EMBO journal, 19(22), 6011-6019.

Hay, J. C. (2001). SNARE complex structure and function. Experimental cell research, 271(1), 10-21.

Helfand, B. T., Chang, L., Goldman, R. D. (2003). The dynamic and motile properties of intermediate filaments. Annual review of cell and developmental biology, 19, 445-67.

Herrmann, H., Bar, H., Kreplak, L., Strelkov, S. V, Aebi, U. (2007). Intermediate filaments: from cell architecture to nanomechanics. Nature reviews. Molecular cell biology, 8(7), 562-73.

Herskovits, J. S., Burgess, C. C., Obar, R. A., Vallee, R. B. (1993). Effects of mutant rat dynamin on endocytosis. The Journal of cell biology, 122(3), 565-578.

Hirst, J., Robinson, M. S. (1998). Clathrin and adaptors. Biochimica et biophysica acta, 1404(1-2), 173-193.

Ho, W. C., Allan, V. J., Van Meer, G., Berger, E. G., Kreis, T. E. (1989). Reclustering of scattered Golgi elements occurs along microtubules. European journal of cell biology, 48(2), 250-63.

Hoepfner, S., Severin, F., Cabezas, A., Habermann, B., Runge, A., Gillooly, D., Stenmark, H., Zerial M. (2005). Modulation of receptor recycling and degradation by the endosomal kinesin KIF16B. Cell, 121(3), 437-50.

Hollingsworth, T. J., Gross, A. K. (2012). Defective trafficking of rhodopsin and its role in retinal degenerations. International review of cell and molecular biology, 293, 1-44.

Holzbaur, E. L. F., Yale E., G. (2011). Coordination of Molecular Motors: From in vitro Assays to Intracellular Dynamics, 22(1), 4-13.

Howard J (2001) Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. Sinauer: Sunderland, MA, ISBN 0878933344

Howard, J., Hyman, A. A. (2009). Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nature reviews. Molecular cell biology, 10(8), 569-74.

Huang F, Kirkpatrick D, Jiang X, Gygi S, Sorkin A. Sorkin 2006. Differential regulation of EGF receptor internalization and degradation by multiubiquitination within the kinase domain. Mol Cell. Mar 17;21(6):737-48.).

Huotari, J., Helenius, A. (2011). Endosome maturation. The EMBO journal, 30(17), 34813500.

Hurley, J. H. (2008). ESCRT complexes and the biogenesis of multivesicular bodies. Current opinion in cell biology, 20(1), 4-11.

Hurley, J. H., Emr, S. D. (2006). The ESCRT complexes: structure and mechanism of a membrane-trafficking network. Annual review of biophysics and biomolecular structure, 35, 277-98.

Jahn, R, Scheller, R. H. (2006). SNAREs—engines for membrane fusion. Nature reviews. Molecular cell biology, 7(9), 631-643.

Janke C, Bulinski JC. (2011). Post-translational regulation of the microtubule cytoskeleton: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol.;12(12):773-86.

Jânosi, I. M., Chrétien, D., Flyvbjerg, H. (2002). Structural microtubule cap: stability, catastrophe, rescue, and third state. Biophysical journal, 83(3), 1317-30.

Jarousse, N., Kelly, R. B. (2000). Selective inhibition of adaptor complex-mediated vesiculation. Traffic (Copenhagen, Denmark), 1(5), 378-384.

Jefferies, K. C., Cipriano, D. J., Forgac, M. (2008). Function, structure and regulation of the vacuolar (H+)-ATPases. Archives of biochemistry and biophysics, 476(1), 33^42.

Jentsch, T. J., Maritzen, T., Zdebik, A. A. (2005). Chloride channel diseases resulting from impaired transepithelial transport or vesicular function. The Journal of clinical investigation, 115(8), 2039-2046.

Job, D., Valiron, O., Oakley, B. (2003). Microtubule nucleation. Current opinion in cell biology, 15(1), 111-7.

Jovic, M., Sharma, M., Rahajeng, J, and Caplan, S. (2010). The early endosome: a busy sorting station for proteins at the crossroads, 25(1), 99-112.

Kaiser, C., Ferro-Novick, S. (1998). Transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi. Current opinion in cell biology, 10(4), 477-482.

Karylowski, O., Zeigerer, A., Cohen, A., McGraw, T. E. (2004). GLUT4 is retained by an intracellular cycle of vesicle formation and fusion with endosomes. Molecular biology of the cell, 15(2), 870-882.

Kazazic, M., Bertelsen, V., Pedersen, K. W., Vuong, T. T., Grandal, M. V., Rodland, M. S., Traub, L. M., Stang E, Madshus IH. (2009). Epsin 1 is involved in recruitment of ubiquitinated EGF receptors into clathrin-coated pits. Traffic (Copenhagen, Denmark), 10(2), 235-245.

Khoriaty, R., Vasievich, M. P., Ginsburg, D. (2012). The COPII pathway and hematologic disease. Blood, 120(1), 31-38.

Kirchhausen, T., Harrison, S. C. (1981). Protein organization in clathrin trimers. Cell, 23(3), 755-761.

Klenchin, V. A., Martin, T. F. (2000). Priming in exocytosis: attaining fusion-competence after vesicle docking. Biochimie, 82(5), 399-407.

Komarova Y.A., Akhmanova A.S., Kojima S., Galjart N., Borisy G.G. (2002). Cytoplasmic linker proteins promote microtubule rescue in vivo. J. Cell Biol. 159: 589-599.

Kosaka, T., Ikeda, K. (1983). Possible temperature-dependent blockage of synaptic vesicle recycling induced by a single gene mutation in Drosophila. Journal of neurobiology, 14(3), 207225.

Kroeger, J. H., Daher, F. B., Grant, M., Geitmann, A. (2009). Microfilament orientation constrains vesicle flow and spatial distribution in growing pollen tubes. Biophysical journal, 97(7), 1822-31.

Ktistakis, N. T., Brown, H. A., Waters, M. G., Sternweis, P. C., Roth, M. G. (1996). Evidence that phospholipase D mediates ADP ribosylation factor-dependent formation of Golgi coated vesicles. The Journal of cell biology, 134(2), 295-306.

Kumar, K. R., Lohmann, K., Klein, C. (2012). Genetics of Parkinson disease and other movement disorders. Current opinion in neurology, 25(4), 466-474.

Kural, C., Kim, H., Syed, S., Goshima, G., Gelfand, V. I., Selvin, P. R. (2005). Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement? Science (New York, N.Y.), 308(5727), 1469-1472.

Lakadamyali M.,Rust M.J Zhuang X. (2005). Ligands for Clathrin-Mediated Endocytosis Are Differentially Sorted into Distinct Populations of Early Endosomes 8 Cell 124, 997-1009.

Lanzetti, L., Rybin, V., Malabarba, M. G., Christoforidis, S., Scita, G., Zerial, M., Di Fiore, P. P. (2000). The Eps8 protein coordinates EGF receptor signalling through Rac and trafficking through Rab5. Nature, 408(6810), 374-7.

Lawe, D. C., Chawla, A., Merithew, E., Dumas, J., Carrington, W., Fogarty, K., Lifshitz, L., Lifshitz L, Tuft R, Lambright D, Corvera S. (2002). Sequential roles for phosphatidylinositol 3-phosphate and Rab5 in tethering and fusion of early endosomes via their interaction with EEA1. The Journal of biological chemistry, 277(10), 8611-8617.

Lawe, D. C., Patki, V., Heller-harrison, R., Lambright, D., Corvera, S. (2000). The FYVE Domain of Early Endosome Antigen 1 Is Required for Both Phosphatidylinositol 3-Phosphate and Rab5 Binding, 275(5), 3699-3705.

Lawe, D. C., Sitouah, N.. Hayes, S., Chawla, A., Virbasius, J. V, Tuft, R., Fogarty, K., Lifshitz L, Lambright D, Corvera S. (2003). Essential role of Ca2+/calmodulin in Early Endosome Antigen-1 localization. Molecular biology of the cell, 14(7), 2935-^45.

Lawrence C.J., Dawe R.K., Christie K.R., Cleveland D.W., Dawson S.C., Endow S.A., Goldstein L.S., Goodson H.V., Hirokawa N., Howard J., Malmberg R.L., Mcintosh J.R., Miki H., Mitchison T.J., Okada Y., Reddy A.S., Saxton W.M., Schliwa M., Scholey J.M., Vale R.D., Walczak C.E., Wordeman L. (2004). A standardized kinesin nomenclature. J. Cell Biol. 167: 1922.

Lee, J.-Y., Koga, H., Kawaguchi, Y., Tang, W., Wong, E., Gao, Y.-S., Pandey, U. B., Kaushik S, Tresse E, Lu J, Taylor JP, Cuervo AM, Yao TP. (2010). HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy. The EMBO journal, 29(5), 969-80.

Leonard, D., Hayakawa, A., Lawe, D., Lambright, D., Bellve, K. D., Lifshitz, L. M., Fogarty, K. E., Corvera S. (2008). Sorting of EGF and Transferrin at the plasma membrane and by cargo-specific signaling to EEAl-enriched endosomes, 121 (Pt 20), 3445-3458.

Lewis, M. J., Pelham, H. R. (1992). Ligand-induced redistribution of a human KDEL receptor from the Golgi complex to the endoplasmic reticulum. Cell, 68(2), 353-364.

Lippe, R., Miaczynska, M., Rybin, V., Runge, A., Zerial, M. (2001). Functional synergy between Rab5 effector Rabaptin-5 and exchange factor Rabex-5 when physically associated in a complex. Molecular biology of the cell, 12(7), 2219-28.

Lomakin A.J., Semenova I., Zaliapin I., Kraikivski P., Nadezhdina E., Slepchenko B., Akhmanova A., Rodionov V. (2009). CLIP-170-dependent capture of membrane organelles by microtubules initiates minus-end directed transport. Dev. Cell. 17: 323-333.

Lord, C., Ferro-Novick, S., Miller, E. A. (2013). The Highly Conserved COPII Coat Complex Sorts Cargo from the Endoplasmic Reticulum and Targets It to the Golgi. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 5(2).

Loubery, S., Coudrier, E. (2008). Myosins in the secretory pathway: tethers or transporters? Cellular and molecular life sciences : CMLS, 65(18), 2790-800.

Lu, C., Mi, L.-Z., Schtirpf, T., Walz, T., Springer, T. A. (2012). Mechanisms for kinase-mediated dimerization of the epidermal growth factor receptor. The Journal of biological chemistry, 287(45), 38244-53.

Luzio, J. P., Rous, B., Bright, N, Pryor, P. R., Mullock, B. M., Piper, R. C. (2000). Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. Journal of cell science, 113 (Pt 9), 1515— 1524.

Manders, E.M.M., Verbeek F.J., Aten, J. A. (1993). Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of microscopy, 169 (Pt 3), 375-382.

Marsh, M., Griffiths, G., Dean, G. E., Mellman, I., Helenius, a. (1986). Three-dimensional structure of endosomes in BHK-21 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 83(9), 2899-903.

Martinez, O., Goud, B. (1998). Rab proteins. Biochimica et biophysica acta, 1404(1-2), 101-112.

Matsuyama A, Shimazu T, Sumida Y, Saito A, Yoshimatsu Y, Seigneurin-Berny D, Osada H, Komatsu Y, Nishino N, Khochbin S, Horinouchi S, Yoshida M. (2002). In vivo destabilization of dynamic microtubules by HDAC6-mediated deacetylation. EMBO J. 21:68206831.

Mayor, S., Presley, J. F., Maxfield, F. R. (1993). Sorting of membrane components from endosomes and subsequent recycling to the cell surface occurs by a bulk flow process. The Journal of cell biology, 121(6), 1257-69.

McMahon, H. T., Mills, I. G. (2004). COP and clathrin-coated vesicle budding: different pathways, common approaches. Current opinion in cell biology, 16(4), 379-391.

Melikova, M. S., Kondratov, K. A., Kornilova, E. S. (2006). Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG132. Cell biology international, 30(1), 31^3.

Mellman, I. (1996). Endocytosis and molecular sorting. Annual review of cell and developmental biology, 12, 575-625.

Merithew, E., Stone, C., Eathiraj, S., Lambright, D. G. (2003). Determinants of Rab5 interaction with the N terminus of early endosome antigen 1. The Journal of biological chemistry, 278(10), 8494-500.

Merrifield, C. J., Moss, S. E., Ballestrem, C., Imhof, B. A., Giese, G., Wunderlich, I., Aimers, W. (1999). Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells. Nature cell biology, 1(1), 72-4.

Mesaki, K., Tanabe, K., Obayashi, M., Oe, N., Takei, K. (2011). Fission of tubular endosomes triggers endosomal acidification and movement. PloS one, 6(5), el9764.

Miaczynska, M., Christoforidis, S., Giner, A., Shevchenko, A., Uttenweiler-Joseph, S., Habermann, B., Wilm, M., Parton RG, Zerial M. (2004). APPL proteins link Rab5 to nuclear signal transduction via an endosomal compartment. Cell, 116(3), 445-56.

Miller, K., Beardmore, J., Kanety, H., Schlessinger, J., Hopkins, C. R. (1986). Localization of the epidermal growth factor (EGF) receptor within the endosome of EGF-stimulated epidermoid carcinoma (A431) cells. The Journal of cell biology, 102(2), 500-9.

Mills I.J., Jones A.T., Clague M.J. (1998). Involvement of the endosomal autoantigen EEA1 in homotypic fusion of early endosomes. Current Biology. 8:881-884

Mills, I. G., Urbe, S., Clague, M. J. (2001). Relationships between EEA1 binding partners and their role in endosome fusion. Journal of cell science, 114 (Pt 10), 1959-65.

Mitchison, T., Kirschner, M. (1984). Dynamic instability of microtubule growth. Nature, 312(5991), 237—42.

Moore, M. S., Mahaffey, D. T., Brodsky, F. M., Anderson, R. G. (1987). Assembly of clathrin-coated pits onto purified plasma membranes. Science (New York, N.Y.), 236(4801), 558-563.

Morino, C., Kato, M., Yamamoto, A., Mizuno, E., Hayakawa, A., Komada, M., Kitamura, N. (2004). A role for Hrs in endosomal sorting of ligand-stimulated and unstimulated epidermal growth factor receptor. Experimental cell research, 297(2), 380-91.

Mu, F. T., Callaghan, J. M., Steele-Mortimer, O., Stenmark, H., Parton, R. G., Campbell, P. L., McCluskey, J., Yeo JP, Tock EP, Toh BH. (1995). EEA1, an early endosome-associated protein. EEA1 is a conserved alpha-helical peripheral membrane protein flanked by cysteine "fingers" and contains a calmodulin-binding IQ motif. The Journal of biological chemistry, 270(22), 13503-11.

Muresan, V., Muresan, Z. (2012). Unconventional functions of microtubule motors. Archives of biochemistry and biophysics, 520(1), 17-29. Elsevier Inc.

Murray, J. W., Wolkoff, A. W. (2003). Roles of the cytoskeleton and motor proteins in endocytic sorting. Advanced drug delivery reviews, 55(11), 1385-403.

Murthy R. (1991). Maturation models in endosome and lysosome biogenesis. Trends in Cell Biology. 1:77-82.

Nakayama, K., Wakatsuki, S. (2003). The structure and function of GGAs, the traffic controllers at the TGN sorting crossroads. Cell structure and function, 28(5), 431—442.

Newman, C. M., Magee, A. I. (1993). Posttranslational processing of the ras superfamily of small GTP-binding proteins. Biochimica et biophysica acta, 1155(1), 79-96.

Nichols, B. J., Holthuis, J. C., Pelham, H. R. (1998). The Seclp homologue Vps45p binds to the syntaxin Tlg2p. European journal of cell biology, 77(4), 263-268.

Nielsen, E., Christoforidis, S., Uttenweiler-Joseph, S., Miaczynska, M., Dewitte, F., Wilm, M., Hoflack, B., Zerial M. (2000). Rabenosyn-5, a novel Rab5 effector, is complexed with hVPS45 and recruited to endosomes through a FYVE finger domain. The Journal of cell biology, 151(3), 601-12.

Nishimura, N., Balch, W. E. (1997). A di-acidic signal required for selective export from the endoplasmic reticulum. Science (New York, N.Y.), 277(5325), 556-558.

Ohashi, E., Tanabe, K., Henmi, Y., Mesaki, K., Kobayashi, Y., Takei, K. (2011). Receptor sorting within endosomal trafficking pathway is facilitated by dynamic actin filaments. PloS one, 6(5), el9942.

Padron, D., Sato, M., Shay, J. W., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Roth, M. G. (2010). Epidermal Growth Factor Receptors with Tyrosine Kinase Domain Mutations Exhibit Reduced Cbl Association, Poor Ubiquitylation, and Down-regulation but Are Efficiently Internalized, 67(16), 7695-7702.

Pal, A., Severin, F., Lommer, B., Shevchenko, A., Zerial, M. (2006). Huntingtin-HAP40 complex is a novel Rab5 effector that regulates early endosome motility and is up-regulated in Huntington's disease. The Journal of cell biology, 172(4), 605-18.

Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. (2004). Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science (New York, N.Y.), 303(5659), 836-9.

Parton, R. G., Simons, K. (2007). The multiple faces of caveolae. Nature reviews. Molecular cell biology, 8(3), 185-94.

Patki, V., Lawe, D. C., Corvera, S., Virbasius, J. V, Chawla, A. (1998). A functional PtdIns(3)P-binding motif. Nature, 394(6692), 433^1.

Pearse, B. M. (1975). Coated vesicles from pig brain: purification and biochemical characterization. Journal of molecular biology, 97(1), 93-98.

Perez F., Diamantopoulos G.S., Stalder R., Kreis T.E. (1999). CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96: 517-527.

Peris L, Thery M, Faure J, Saoudi Y, Lafanechere L, Chilton JK, Gordon-Weeks P, Galjart N, Bornens M, Wordeman L, Wehland J, Andrieux A, Job D. (2006). Tubulin tyrosination is a major factor affecting the recruitmentof CAP-Gly proteins at microtubule plus ends. J Cell Biol.; 174:839-849.

Pfeffer, S. R. (2011). Entry at the trans-face of the Golgi. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3(3).

Pierre P, Scheel J, Rickard JE, Kreis TE. (1992). CLIP-170 links endocytic vesicles to niicrotubules.Cell. Sep 18;70(6):887-900.

Platta, H. W., Stenmark, H. (2011). Endocytosis and signaling. Current opinion in cell biology, 23(4), 393^403.

Popoff, V., Adolf, F., Briigger, B., Wieland, F. (2011). COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3(11), a005231.

Praefcke, G. J. K., McMahon, H. T. (2004). The dynamin superfamily: universal membrane tubulation and fission molecules? Nature reviews. Molecular cell biology, 5(2), 133147.

Qualmann, B., Kessels, M. M. (2002). Endocytosis and the cytoskeleton. International review of cytology, 220, 93-144.

Raiborg, C., Wesche, J., Malerod, L., Stenmark, H. (2006). Flat clathrin coats on endosomes mediate degradative protein sorting by scaffolding Hrs in dynamic microdomains. Journal of cell science, 119 (Pt 12), 2414-2424.

Rangarajan, E. S., Park, H., Fortin, E., Sygusch, J., Izard, T. (2010). Mechanism of aldolase control of sorting nexin 9 function in endocytosis. The Journal of biological chemistry, 285(16), 11983-90.

Reed N A, Cai D, Blasius TL, Jih GT, Meyhofer E, Gaertig J, Verhey KJ. (2006). Microtubule acetylation promotes Kinesin 1 binding and transport. Current Biology. 16:21662172.

Rice, L. M., Montabana, E. A., Agard, D. A. (2008). The lattice as allosteric effector: structural studies of alphabeta- and gamma-tubulin clarify the role of GTP in microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(14), 5378-83.

Richter, C. M., West, M., Odorizzi, G. (2013). Doa4 function in ILV budding is restricted through its interaction with the Vps20 subunit of ESCRT-III. Journal of Cell Science.

Rink, J., Ghigo, E., Kalaidzidis, Y., Zerial, M. (2005). Rab conversion as a mechanism of progression from early to late endosomes. Cell, 122(5), 735^19.

Robinson, M. S. (2004). Adaptable adaptors for coated vesicles. Trends in cell biology, 14(4), 167-174.

Rogowski K, Juge F, van Dijk J, Wloga D, Strub JM, Levilliers N, Thomas D, Bre MH, van Dorsselaer, Gaertig J, Janke C. (2009). Evolutionary divergence of enzymatic mechanisms for posttranslational polyglycylation. Cell.; 137:1076-1087.

Roth, T. F., Porter, K. R. (1964). Yolk protein uptake in the oocyte of the mosquito Aedes Aegypti. L. The Journal of cell biology, 20, 313-332.

Rothberg, K. G., Heuser, J. E., Donzell, W. C., Ying, Y. S., Glenney, J. R., Anderson, R. G. (1992). Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell, 68(4), 673-82.

Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. (2001). Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular biology of the cell, 12(4), 971-80.

Rutherford, A. C., Traer, C., Wassmer, T., Pattni, K., Bujny, M. V, Carlton, J. G., Stenmark, H., Cullen PJ. (2006). The mammalian phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase (PIKfyve) regulates endosome-to-TGN retrograde transport. Journal of cell science, 119 (Pt 19), 3944-57.

Salzman, N. H., Maxfield, F. R. (1989). Fusion accessibility of endocytic compartments along the recycling and lysosomal endocytic pathways in intact cells. The Journal of cell biology, 109(5), 2097-104.

Santini, F., Gaidarov, I., Keen, J. H. (2002). G protein-coupled receptor/arrestin3 modulation of the endocytic machinery. The Journal of cell biology, 156(4), 665-676.

Santini, F., Keen, J. H. (1996). Endocytosis of activated receptors and clathrin-coated pit

■formatir\n• AAr»ir\ViArir^rr tViA cV\-\r-\re±r\ nr Arrn r*a1«atir»ncVur> TV*** Tr\iirt^a1 Kirvlrvrrir 1 ^Of

IVllliUHVll^ UVVl^llVl lllg 111W vmvivwil Ul W^ ^ 1 VlUtiUUkllilp. AllV J U Ml llWl VI Wll L/1V ) 1 J^^U y J

1025-1036.

Santini, F., Marks, M. S., Keen, J. H. (1998). Endocytic clathrin-coated pit formation is independent of receptor internalization signal levels. Molecular biology of the cell, 9(5), 1177— 1194.

Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Shisheva, A. (2002). Phosphatidylinositol 3-phosphate-interacting domains in PIKfyve. Binding specificity and role in PIKfyve. Endomenbrane localization. The Journal of biological chemistry, 277(8), 6073-9.

Schafer, D.A., Gill, S.R., Cooper, J.A., Heuser, J.E., and Schroer, T.A. (1994). Ultrastructural analysis of the dynactin complex: an actin-related protein is a component of a filament that resembles f-actin. J. Cell Biol. 126, 403^12.

Schek, H. T., Gardner, M. K., Cheng, J., Odde, D. J., Hunt, A. J. (2007). Microtubule assembly dynamics at the nanoscale. Current biology : CB, 17(17), 1445-55.

Schmid, S. L. (1997). Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process. Annual review of biochemistry, 66, 511-548.

Segev, N. (2001). Ypt and Rab GTPases: insight into functions through novel interactions. Current opinion in cell biology, 13(4), 500-511.

Segovia, M., Ales, E., Montes, M. A., Bonifas, I., Jemal, I., Lindau, M., Maximov, A., Sudhof TC, Alvarez de Toledo G. (2010). Push-and-pull regulation of the fusion pore by synaptotagmin-7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(44), 19032-19037.

Sever, S., Damke, H., Schmid, S. L. (2000). Dynamin:GTP controls the formation of constricted coated pits, the rate limiting step in clathrin-mediated endocytosis. The Journal of cell biology, 150(5), 1137-1148.

Shao, Y., Akmentin, W., Toledo-Aral, J. J., Rosenbaum, J., Valdez, G., Cabot, J. B., Hilbush, B. S., Halegoua S. (2002). Pincher, a pinocytic chaperone for nerve growth factor/TrkA signaling endosomes. The Journal of cell biology, 157(4), 679-91.

Shi, A., Sun, L., Banerjee, R., Tobin, M., Zhang, Y., Grant, B. D. (2009). Regulation of endosomal clathrin and retromer-mediated endosome to Golgi retrograde transport by the J-domain protein RME-8. The EMBO journal, 28(21), 3290-3302.

Simonsen, A., Lippe, R., Christoforidis, S., Gaullier, J. M., Brech, A., Callaghan, J., Toh, B. H., Murphy C, Zerial M, Stenmark H. (1998). EEA1 links PI(3)K function to Rab5 regulation of endosome fusion. Nature, 394(6692), 494-498.

Sollner, T. (1995). SNAREs and targeted membrane fusion. FEBS letters, 369(1), 80-83.

Soppina, V., Herbstman, J. F., Skiniotis, G., Verhey, K. J. (2012). Luminal localization of a-tubulin K40 acetylation by cryo-EM analysis of fab-labeled microtubules. PloS one, 7(10), e48204.

Sorkin A, Goh LK. (2008). Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs. Experimental Cell Research. 314(17): 3093-3106.

Sorkin, A., Mazzotti, M., Sorkina, T., Scotto, L., Beguinot, L. (1996). Epidermal growth factor receptor interaction with clathrin adaptors is mediated by the Tyr974-containing internalization motif. The Journal of biological chemistry, 271(23), 13377-13384.

Sorkin, A., von Zastrow, M. (2009). Endocytosis and signalling: intertwining molecular networks. Nature reviews. Molecular cell biology, 10(9), 609-22.

Sotelo, J. R., Porter, K. R. (1959). An electron microscope study of the rat ovum. The Journal of biophysical and biochemical cytology, 5(2), 327-42.

Stenmark, H., Parton, R. G., Steele-Mortimer, O., Liitcke, A., Gruenberg, J., Zerial, M. (1994). Inhibition ofrab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. The EMBO journal, 13(6), 1287-1296.

Stokin, G.B., Goldstein, L.S.B. (2006). Axonal transport and Alzheimer's disease. Annual review of biochemistry, 75, 607-27.

Stoorvogel, W., Strous, G. J., Geuze, H. J., Oorschot, V., Schwartz, A. L. (1991). Late endosomes derive from early endosomes by maturation. Cell, 65(3), 417-27.

Takatsu, H., Futatsumori, M., Yoshino, K., Yoshida, Y., Shin, H. W., Nakayama, K. (2001). Similar subunit interactions contribute to assembly of clathrin adaptor complexes and COPI complex: analysis using yeast three-hybrid system. Biochemical and biophysical research communications, 284(4), 1083-1089.

Takei, K., Slepnev, V. I., Haucke, V., De Camilli, P. (1999). Functional partnership between amphiphysin and dynamin in clathrin-mediated endocytosis. Nature cell biology, 1(1), 33-39.

.Tebar, F., Sorkina, T., Sorkin, A., Ericsson, M., Kirchhausen, T. (1996). Epsl5 is a component of clathrin-coated pits and vesicles and is located at the rim of coated pits. The Journal of biological chemistry, 271(46), 28727-28730.

Terasaki, M., Reese, T. S. (1994). Interactions among endoplasmic reticulum, microtubules, and retrograde movements of the cell surface. Cell motility and the cytoskeleton, 29(4), 291-300.

Tjelle, T. E., Brech, a, Juvet, L. K., Griffiths, G., Berg, T. (1996). Isolation and characterization of early endosomes, late endosomes and terminal lysosomes: their role in protein degradation. Journal of cell science, 109 ( Pt 1, 2905-14.

Tran AD-A, Marmo TP, Salam AA, Che S, Finkelstein E, Kabarriti R, Xenias HS, Mazitschek R, Hubbert C, Kawaguchi Y, Sheetz MP, Yao TP, Bulinski JC. (2007). HDAC6 deacetylation of tubulin modulates dynamics of cellular adhesions. Journal of Cell Science. 120:1469-79.

Traub, L. M., Bannykh, S. I., Rodel, J. E., Aridor, M., Balch, W. E., Kornfeld, S. (1996). AP-2-containing clathrin coats assemble on mature lysosomes. The Journal of cell biology, 135 (6 Pt 2), 1801-1814.

Ullrich A, Schlessinger J. (1990). Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell.; 61:203-212.

Ungermann, C., Nichols, B. J., Pelham, H. R, Wickner, W. (1998). A vacuolar v-t-SNARE complex, the predominant form in vivo and on isolated vacuoles, is disassembled and activated for docking and fusion. The Journal of cell biology, 140(1), 61-69.

Valderrama, F., Babià, T., Ayala, I., Kok, J. W., Renau-Piqueras, J., Egea, G. (1998). Actin microfilaments are essential for the cytological positioning and morphology of the Golgi complex. European journal of cell biology, 76(1), 9-17.

Valetti, C., Wetzel, D. M., Schrader, M., Hasbani, M. J., Gill, S. R, Kreis, T. E., Schroer, T. A. (1999). Role of dynactin in endocytic traffic: effects of dynamitin overexpression and colocalization with CLIP-170. Molecular biology of the cell, 10(12), 4107-4120.

Valiron, O., Caudron, N., Job, D. (2001). Cellular and Molecular Life Sciences Microtubule dynamics, 58, 2069-2084.

Van der Sluijs, P., Hull, M., Huber, L. A., Mâle, P., Goud, B., Mellman, I. (1992). Reversible phosphorylation—dephosphorylation determines the localization of rab4 during the cell cycle. The EMBO journal, 11(12), 4379-4389.

Vázquez-Martínez, R, Malagón, M. M. (2011). Rab proteins and the secretory pathway: the case of rabl8 in neuroendocrine cells. Frontiers in endocrinology, 2, 1. doi:10.3389/fendo.2011.00001

Verhey K.J., Gaertig J. (2007). The tubulin code. Cell Cycle. 6(17): 2152-2160.

Vinogradova, T., Paul. R.; Grimaldi, A. D.3 Loncarek, J., Miller, P. M., Yampolsky, D., Magidson, V., Khodjakov A, Mogilner A, Kaverina I. (2012). Concerted effort of centrosomal and Golgi-derived microtubules is required for proper Golgi complex assembly but not for maintenance. Molecular biology of the cell, 23(5), 820-33.

Vorobjev I.A., Svitkina T.M., Borisi G.G. (1997).Cytoplasmic assembly of microtubules in cultured cells. J. Cell Csi. 110: 2635-45.

Wang, H.-W., Nogales, E. (2005). Nucleotide-dependent bending flexibility of tubulin regulates microtubule assembly. Nature, 435(7044), 911-5.

Warren, R. A., Green, F. A., Enns, C. A. (1997). Saturation of the endocytic pathway for the transferrin receptor does not affect the endocytosis of the epidermal growth factor receptor. The Journal of biological chemistry, 272(4), 2116-2121.

Wells, A. L., Lin, A. W., Chen, L. Q., Safer, D., Cain, S. M., Hasson, T., Carragher, B.O., Milligan, R A, Sweeney, H Ll. (1999). Myosin VI is an actin-based motor that moves backwards. Nature, 401(6752), 505-8.

Wieland, F., Harter, C. (1999). Mechanisms of vesicle formation: insights from the COP system. Current opinion in cell biology, 11(4), 440-446.

Wilson, J. M., De Hoop, M., Zorzi, N.. Toh, B. H., Dotti, C. G., Parton, R G. (2000). EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Molecular biology of the cell, 11(8), 2657-2671.

Wilson, K. J., Mill, C., Lambert, S., Buchman, J., Wilson, T. R, Hernandez-Gordillo, V., Gallo, R. M., Ades LM, Settleman J, Riese DJ 2nd. (2012). EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth factors (Chur, Switzerland), 30(2), 107-16.

Wolff, M., Tetzlaff, K„ Nivens, M. C., Schneider, F.-J., Jung, B., Hohlfeld, J., Heilker, R. (2011). In vivo inhibition of epidermal growth factor receptor autophosphorylation prevents receptor internalization. Experimental cell research, 317(1), 42-50.

Woodman PG. (2000). Biogenesis of the sorting endosome: the role of Rab5. Traffic. Sep;l(9):695-701.

Yamashiro, D. J., Maxfield, F. R. (1987). Kinetics of endosome acidification in mutant and wild-type Chinese hamster ovary cells. The Journal of cell biology, 105(6 Pt 1), 2713-21.

Zeigerer A, Gilleron J, Bogorad RL, Marsico G, Nonaka H, Seifert S, Epstein-Barash H, Kuchimanchi S, Peng CG, Ruda VM, Del Conte-Zerial P, Hengstler JG, Kalaidzidis Y, Koteliansky V, Zerial M. (2012). Rab5 is necessary for the biogenesis of the endo lysosomal system in vivo. Nature. May 23;485(7399):465-70.

Zerial, M., Stenmark, H. (1993). Rab GTPases in vesicular transport. Current opinion in cell biology, 5(4), 613-620.

Zhang D, Rogers GC, Buster DW, Sharp DJ. (2007).Three microtubule severing enzymes contribute to the Pacman-flux machinery that moves chromosomes. Journal of Cell Biology. 177:231-42.

Zhang Y, Kwon S, Yamaguchi T, Cubizolles F, Rousseaux S, Kneissel M, Cao C, Li N, Cheng HL, Chua K, Lombard D, Mizeracki A, Matthias G, Alt FW, Khochbin S, Matthias P.

(2008). Mice lacking histone deacetylase 6 have hyperacetylated tubulin but are viable and develop normally. Molecular Cell Biology. 28:1688-1701.

Zhang, J. Z., Davletov, B. A., Sûdhof, T. C., Anderson, R. G. (1994). Synaptotagmin I is a high affinity receptor for clathrin AP-2: implications for membrane recycling. Cell, 78(5), 751— 760.

Zilberman, Y., Ballestrem, C., Carramusa, L., Mazitschek, R., Khochbin, S., Bershadsky, A. (2009). Regulation of microtubule dynamics by inhibition of the tubulin deacetylase HDAC6. Journal of Cell Science, 122 (Pt 19), 3531-3541.

Zoncu, R., Perera, R. M., Balkin, D. M., Pirruccello, M., Toomre, D., De Camilli, P.

(2009). A phosphoinositide switch controls the maturation and signaling properties of APPL endosomes. Cell, 136(6), 1110-21.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу поблагодарить моего научного руководителя Корнилову Елену Сергеевну за всестороннюю помощь в выполнении этой работы. Выражаю благодарность сотрудникам лаборатории динамики внутриклеточных мембран и отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта, в особенности М.В. Харченко, за помощь и поддержку. А также хочу сказать спасибо всем тем, кто на протяжении этих лет не переставал верить в меня.