Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович

• Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Сериновые протеиназы микрорганизмов

1. Принципы классификации протеолитических ферментов

2. Общая характеристика сериновых протеиназ

3. Химотрипсинопрдобные протеолитические ферменты бактерий

II. Глутамилэндопептидазы-особое семейство химотрипсинов

1. Физико-химические свойства глутамилэндопептидаз 18 микроорганизмов

2. Эволюционное биоразнообразие микробных глутамилэндопептидаз

3. Структурные особенности глутамилэндопептидаз бактерий

4. Механизм катализа глутамилэндопептидаз

5. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз

III. Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидаз микроорганизмов

IV. Практическое применение глутамилэндопептидаз 42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Штаммы и плазмиды

2. Выделение плазмидной ДНК

3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

4. Трансформация клеток В. subtilis плазмидной ДНК

5. Питательные среды

6. Культивирование бактерий

7. Определение белка

8. Определение протеолитической активности фермента

9. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма

10. Электрофорез в ПААГ

11. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

12. Иммуноферментный анализ

13. Определение субстратной специфичности

14. Влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидазы

15. Физико-химические свойства и кинетические характеристики 63 глутамилэндопептидазы

16. Энзиматические свойства глутамилэндопептидазы

17. Математическая обработка результатов 64 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 66 1. Динамика роста и накопления глутамилэндопептидазы в 66 культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis

2. Подбор питательной среды для эффективной продукции 69 глутамилэндопептидазы В. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis

3. Очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой 74 рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных фазах роста и молекулярная масса белка

4. Иммунологический анализ препаратов глутамилэндопептидазы 79 В. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных фазах роста

5. Масс-спектрометрический анализ препаратов

6. Электрофорез препаратов глутамилэндопептидазы В. intermedius 82 в нативных условиях

7. Влияние ингибиторов на активность препаратов 83 глутамилэндопептидазы В. intermedins

8. Субстратная специфичность фермента

9. Кинетические параметры глутамилэндопептидазы разных фаз 86 роста

10. рН-оптимум и рН-стабильность фермента

11. Температурный оптимум и температурная стабильность 87 фермента разных фаз роста

12. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность 92 глутамилэндопептидазы разных стадий роста

13. Влияние дитиоэритритола на активность 92 глутамилэндопептидазы разных фаз роста

14. Влияние парахлормеркурибензоата и солей ртути на активность 94 глутамилэндопептидазы разных фаз роста

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста»

Актуальность проблемы. Интерес к микробным ферментам и, в частности, к протеиназам бацилл, объясняется недостаточной способностью протеолитических белков животного и растительного происхождения удовлетворять спрос на жизненные потребности населения планеты. Микроорганизмы являются источником всех типов гидролаз благодаря широкому разнообразию, простоте культивирования, безопасности в работе, способности к генетическим преобразованиям. Использование ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими веществами. Протеолитические белки микроорганизмов высокоактивны, доступны и легко биодеградируются. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологического производства бактериальных ферментов, область применения которых — промышленность, медицина, научные исследования.

Одной из наиболее интересных групп класса протеолитических ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. Эти белки участвуют в адаптационных процессах в условиях стресса, спорообразовании и прорастании спор. Неослабевающий интерес к этим ферментам обусловлен широтой их практического применения. Выход целевого продукта у бацилл может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции, либо модификацией гена. На основе протеиназ бацилл конструируются каталитические антитела с протеолитической активностью. Выделены протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа заболеваний, связанных с тромбообразованием, актуальным является поиск новых ферментов с высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндопептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Поэтому они являются высокоточными "инструментами" для фрагментации белковых молекул при исследовании первичной структуры.

Поскольку бациллы секретируют различные протеиназы, выделение индивидуальных белков контаминирует с белковыми примесями, которые создают аналитические ошибки при исследовании фермента. Генно-инженерные методы позволяют создавать рекомбинантные штаммы, содержащие на плазмиде ген индивидуального фермента, что перспективно для разработки способов получения гомогенных протеиназ.

Целью работы явилось выделение, очистка и сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом на разных фазах роста.

В работе решались следующие задачи:

1. Подбор условий культивирования для выделения глутамилэндопептидазы В. intermedins из рекомбинантного штамма В. subtilis на разных стадиях роста.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins из культуральной жидкости рекомбинантного штамма на разных стадиях роста.

3. MALDI-TOF анализ аминокислотных последовательностей глутамилэндопептидазы, соответствующей разным фазам роста.

4. Сравнительное исследование свойств глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста.

5. Выяснение роли дисульфидной связи в образовании конформеров глутамилэндопептидазы.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована глутамилэндопептидаза В. intermedins, секретируемая рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных стадиях роста. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств ранней и поздней глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные о различии каталитических характеристик (Кт и kcat) ранней и поздней протеиназы. Установлено, что оба препарата идентичны по первичной структуре, их N- и

С-концевые аминокислотные остатки совпадают. Впервые получены данные, указывающие, что поздний фермент содержит восстановленную дисульфидную связь в отличие от ранней глутамилэндопептидазы. Сравнительные исследования позволили заключить, что наличие дисульфидной связи может определять велечину молекулярной активности глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции глутамилэндопептидазы В. intermedins на разных стадиях роста для проведения эффективной очистки фермента. Полученный в работе рекомбинантный штамм В. subtilis может быть использован как эффективный продуцент глутамилэндопептидазы. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств раннего и позднего фермента рекомбинантного штамма В. subtilis позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, об особой подгруппе ферментов - глутамилэндопептидазах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования . поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной. Программы РНП 2.11.1005. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Республики Татарстан (2007 г) и были удостоены именной стипендии президента Республики Татарстан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны условия культивирования и получена глутамилэндопептидаза В. intermedins, соответствующая разным фазам роста рекомбинантного штамма.

2. Глутамилэндопептидаза, разных фаз роста характеризуется идентичной аминокислотной последовательностью, но отличается по каталитическим характеристикам и энзиматическим свойствам.

3. Дестабилизация глутамилэндопептидазы стадии позднего стационара по сравнению с соответствующим ферментом фазы замедления роста связана со статусом дисульфидной связи в белковой глобуле.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Материалах докладов съезда с международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008), Материалах XL VI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 21 научных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович

выводы

1. Подобраны компоненты питательной среды, для получения высокого уровня активности ранней (24 ч роста) и поздней (48 ч роста) глутамилэндопептидазы В. intermedins в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis.

2. Выделена и очищена глутамилэндопептидаза В. intermedins, соответствующая фазе замедления роста и стационарной фазе роста рекомбинантного штамма, со степенью очистки, составляющей 1257 для ранней и 1350 - для поздней протеиназы и выходом 7.8% и 12.5%, соответственно. Молекулярная масса ранней и поздней глутамилэндопептидазы составляет 23 кДа.

3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя глутамилэндопептидаза имеет идентичную последовательность аминокислот, N - и С- концы которой совпадают.

4. Установлены различия в каталитических свойствах глутамилэндопептидазы, секретируемой в фазе замедления роста и стационарной фазе бактерий.

5. Установлено, что уровень каталитической активности глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста бактерий, определяется статусом дисульфидной связи в конформации белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович, 2009 год

1. Балабан, Н. П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedins. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента Текст. / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, А.М, Усманова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская // Биохимия.- 1993. Т. 58. - №12. - С. 1923 - 1928.

2. Балабан, Н. П. Выделение и характеристика глутамилэндопептдазы 2 Bacillus intermedins Текст. / Н.П. Балабан, А.М Марданова, М.Р. Шарипова, и др. // Биохимия. 2003. - Т. 68. - № 11. - С. 1514 - 1521.

3. Безбородое, А. М. Секреция ферментов у микроорганизмов Текст. / A.M. Безбородов, Н.И. Астапович. М.: Наука, 1984. - С. 58.

4. Габдрахманова, JI. А. Среда для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / JI.A. Габдрахманова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. -2000. Т. 69. - №5. - С. 653 - 659.

5. Демидюк, И.В. Особенности функциональной организации глутамилэндопептидаз Текст. / И.В. Демидюк, С.В. Костров // Мол. Биология. 1999. - Т.ЗЗ. - №2. - С. 100 - 105.

6. Дунаевский, Я. Е. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточних протеиназ микромицетов Текст. / Я.Е. Дунаевский, Т.Н. Грубань, Г.А. Белякова и др. // Микробиология. -1999. Т. 68. - № 3. - С. 324 - 329.

7. Егоров, Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. -М.: Издательство МГУ, 1983.

8. Замолодчикова, Т.С. Граспазы-особая группа протеиназ семейства химотрипсинов, утративших дисульфидную связь в активном центре Текст. / Т.С. Замолодчикова, Е.А. Соколова, Е.В. Смирнова // Биохимия. 2003 - Т. 68. - №3. - С. 375 - 383.

9. Ицкович, Е. JI. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius Текст. / E.JT. Ицкович, JT.B. Знаменская, Н.П. Балабан, Т.А. Ершова, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т.64. - №.5. - С. 623 -629.

10. Каверзнева, Е. Д. Стандартный метод определения протеолитической активности комплексных препаратов протеаз Текст. / Е.Д. Каверзнева // Прикл. биохимия и микробиология. 1971. - Т. 7. - № 2. - С. 225 - 228.

11. Лениджер, А. Основы биохимии Текст. / А. Лениджер. М.: Мир, 1985.-С. 365.

12. Липкин, В.М. Первичная структура субъединицы ДНК - зависимой РНК - полимеразы Е. coli. II Пептиды, полученные при гидролизе протеазой из Staphylococcus aureus Текст. / В.М. Липкин, Н.Н.

13. Модянов, Ю.В. Смирнов, О.Ю. Чертов, B.C. Хохряков, В.В. Тюрин, Н.А. Потапенко // Биорг. химия. 1982. - Т. 8, №12. - С. 1620 - 1623.

14. Люблинская, JL А. Ферментативный синтез пептидных субстратов сериновых протеиназ Текст. / Люблинская Л.А., Воюшина Т.Л., Степанов В.М // Биоорганическая химия. 1982.- Т.8. - №.12. - С. 1620 -1624.

15. Люблинская, Л. А. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенные субстраты сериновых протеиназ Текст. /Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина // Биоорг. химия. -1987. -Т. 13. -№ 6.-С.748 -753.

16. Мильготина, Е. И. Глутамилэндопептидазы. Структура, функции, практическое использование Текст. / Мильготина Е.И., Воюшина Т.Л., Честухина Г.Г // Биоорганическая химия. 2003.-Т.29. - №.6. - С. 563 -576.

17. Мосолова, О. В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов Текст. / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, О.М. Ходова, И.А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т.52. - №3. - С. 414 - 422.

18. Новикова, Т. М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei 5-724 Текст. / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - № 6. - С. 772 - 777.

19. Перт, С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Д. Перт.-М.: Мир, 1980.-С. 331.

20. Ревина Л. П. Исследование действия Glu, Asp-специфичной протеиназы Streptomyces thermovulgaris на пептидные и белковые субстраты Текст. /

21. Л.П. Ревина, Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Н.И. Гребенщиков, JI.A. Баратова, В.М. Степанов // Биохимия. 1989. - Т. 54. - №5. - С. 846 - 850.

22. Руденская, Г. Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов — новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ Текст. / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. 1998. - Т.24. - №4. - С.256 - 261.

23. Серкина, А. В. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ Текст. / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорганическая химия. 2001. - Т. 27. - № 5. - С. 323 - 346.

24. Хайдарова, Н. В. Glu,Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris Текст. / Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. -1989. Т.54. - №.1. - С. 46 - 52.

25. Шарипова, М.Р. Синтез и секреция фосфогидролаз и протеинзы Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, В.И. Вершинна, Н.П. Балабан, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1987. - Т. 56. - №5. - С. 805 - 811.

26. Шлегель, Г. Общая микробиология Текст. / Г. Шлегель. М.: Мир, 1987. - С. 76-79.

27. Anagnostopolous, С. Requirements for transformation in Bacillus subtilis Text. / C. Anagostopolous, J. Spizizen // Journal of Bacteriology. 1961. -V. 81.-P. 741-746.

28. Banerjee, A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albigans Text. / A. Banerjee, K. Ganesan, A. Datta // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137.-P. 2455 -2461.

29. Barbosa, J. A. A structural model for the glutamate-specific endopeptidase from Streptomyces griseus that explains substrate specificity Text. / J.A. Barbosa, R.C. Garratt, J.W. Saldanha // FEBS Letters. 1993. - V.324. -№1. -P. 45 - 50.

30. Barrett, A. J. Perspectives in biochemistry and biophysics. Families and clans of serine peptidases Text. / A.J. Barrett, N.D. Rawlings //. Arch. Biochem. Biophys 1995. - V.318.- № 2. - P. 247 - 250.

31. Bordusa, F. Nonconventional amide bond formation catalysis: programming enzyme specificity with substrate mimetics Text. / F. Bordusa // Braz J.Med Biol. Res. 2000. - V. 33. - №5. - P. 469 - 485.

32. Breddam, K. Substrate preferences of glutamic acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrutes based on intramolecular fluorecscence quenching Text. / K. Breddam, M. Mendal // Eur.J.Bioch. -1992.-V.206.-P. 103 107.

33. Brenner, S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines Text. / S. Brenner // Nature. 1988. - V. 334. - P. 528 - 530.

34. Carmona, C. Nucleotide sequence of the serine protease gene of Staphylococcus aureus, strain V8 Text. / C. Carmona, G.L. Cray // Nucleic Acids Research 1987. - V. 15. - №16. - P. 6757.

35. Cerovsky, V. V8 proteinase-catalyzed peptide synthesis in hydrophilic organic solvents with low water content Text. / V. Cerovsky // Tetrahedron Lett. 1991.-V. 32.-P. 3421 -3424.

36. Coleman, G. A model for the regulation of bacterial extracellular enzyme and toxin biosynthesis Text. / G. Coleman, S. Brown, D.A. Stormonth // J. Theor. Biol. 1975.-V.52. -№1.-P. 143 - 148.

37. Czapinska, R. Structural and energetic determinants of the Sl-site specificity in serine proteases Text. / R. Czapinska, J. Otlewski // Eur.J.Bioch. 1999. -V.260.-P. 571 -595.

38. Drapeau, G. R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus Text. / G.R. Drapeau, Y. Boily, J.J. Houmard // J. Biol. Chem. 1972. -V.247. - №20.- P.6720 - 6726.

39. Drapeau, G. R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease Text. / G.R. Drapeau // Methods enzymol. 1977. - V.47. - P. 189 - 191.

40. Drapeau, G. R. The primary structure of staphylococcal protease Text. / G.R. Drapeau// Can.J.Biochem. 1978. - V.56. - №6. - P. 534 - 544.

41. Enzyme nomenclature 1992: recommendation of the Nomenclature Committee of The International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes // San Diego. -1992.-P. 862.

42. Errington, J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expressionand control of morphogenesia Text. / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 1 -33.

43. Fersht, A. Enzyme structure and mechanism Text. / A. Fersht, W.H. Freeman // San Francisco, CA. 1984.

44. Gudmundsdottir, A Atlantic cod trypsins: from basic research to practical applications Text. / A. Gudmundsdottir, H.M. Palsdottir // Marine Biotechnology. 2005. - V.7. - P. 77 - 88.

45. Haensler, M. Enzymatic formation of Glu-Xaa bonds using Glu/Asp-specific endopeptidase from Bacillus liheniformis + Text. / M. Haensler, H.D. Wissmann, N. Wehofsky // J.Peptide in frozen agueous systems Sci. 2000. -V.6.-P. 366-371.

46. Houmard, J. Staptylococcal protease: a proteolytic enzyme specific for glutamyl bonds Text. / J. Houmard, G.R. Drapeau // Proc Natl Acad Sci USA. 1972.-V. 69, №12.-P. 3506-3509.

47. Houmard, J. Kinetic investigation of the staphylococcal protease-catalyzed hydrolyzed of synthetic substrates Text. / J. Houmard // Eur.J.Biochem. -1976.-V. 68.-P. 621 -627.

48. Huang, Ph. L. Proteolytic fragments of anti HIV and anti-tumor proteins MAP30 and GAP31 are biologically active Text. / Ph. L. Huang, Y. Sun, H. Chen, H. Kung, P.L. Huang, S. Lee-Huang // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1999. - V. 262. - P. 615 - 623.

49. Krem, M. M. Molecular markers of serine protease evolution Text. / M.M. Krem, E. Di Cera// The EMBO J. -2001. -V. 20 № 12. - P. 3036-3045.

50. Laemmli, H. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4 Text. / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. -P. 680- 685.

51. Lesk, A. M. Conservation and variability in the structure of serine proteinases of the chymotrypsin family Text. / A.M Lesk, W.D. Fordman // J.Mol.Biol. -1996.-V.258.-P. 501 537.

52. Masaki, T. Purification and some properties of Achromobacter protease la from Achromobacter lyticus M497-1 Text. / T. Masaki, H. Suzuki, M. Soejima // Agric. Biol. Chem. 1986. - V.50. - №12. - P. 3087 - 3091.

53. Moravkova, J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megaterium Text. / J.Moravkova, J. Chaloupka // Folia Microbiol. 1984,-V. 29.-P. 273 -281.

54. Murzin, A.G. Principles determining the structure of 3-sheet barrels in proteins: The observed structures [Text. / A.G. Murzin, A.M. Lesk, C. Chothia// J. Mol. Biol. 1994.-V. 236.-P. 1382- 1400

55. Nienaber, V.L. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel histidine triad in substrate binding Text. / V.L. Nienaber, К Breddam, J.J. Birktoft // Biochemistry. 1993. - V. 32. P. 11469 - 11475.

56. Ohara-Nemoto, Y. Characterization and molecular cloning of a glutamyl endopeptidase from Staphylococcus epidermidis Text. / Y. Ohara-Nemoto, Y. Ikeda, M. Kobayashi, M. Sasaki, S. Tajika, S. Kimura // Microb. Pathog. -2002.-V. 33.-№1.-P. 33-41.

57. Perego, M The oligopeptide transport system of Bacillus subtilis a role in the initiation of sporulation Text. / M. Perego, C.F. Higgins, S.R. Pearce, M.P. Gallagher, J.A. Hoch//Mol. Microbiol. 1991. -V. 5. - P. 173 - 185.

58. Power, S. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin Text. / S. Power, R.M. Adams, J.A. Wells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. -№5.-P. 3096-3100.

59. Rao, M. B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases Text. / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge et al. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. -V. 62. - № 3. - P: 597 - 635.

60. Rawlings N. D. Evolutionary families of peptidases Text. / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Biochem. J. 1993. - V. 290. - P. 205 - 218.

61. Rawlings, N. D. Introduction: clan SB containing the subtilisin family. In A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Handbook of Proteolytic Enzymes // San Diego: Academic Press, 1998. P. 284 - 288.

62. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual Text. / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

63. Schuster, M. Enzyme-catalyzed peptide synthesis in ice Text. / M. Schuster, A. Aaviksaar, H.-D. Jakubke // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - №24. - P. 8093-8102.

64. Serrano, M. A Bacillus subtilis secreted protein with a role in endospore coat assembly and function Text. / M.A. Serrano, R. Ziehao, P. Ricca et al. // J. Bacteriol. 1999. -V. 181. - P. 3632 - 3643.

65. Siezen, R.J. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin- like serine proteases Text. / R.J. Siezen, W.M. de Vos, J.A.M. Leunissen, B.W. Dijkstra // Protein Eng. 1991. - V. 4. -P. 719-737.

66. Siezen, R. J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like proteases Text. / R.J. Siezen, J.A. Leunissen // Prot. Sci. 1997. - V. 6. - P. 501 - 523.

67. Stennicke, H. R. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus Text. / H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam // Protein Science. 1996. - V. 78. - P. 2266 - 2275.

68. Svendsen, I. The primery structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus Text. / I. Svendsen, M.R. Jensen, K. Breddam // FEBS Letters. 1991.-V. 292.-№ 1,2.-P. 165 - 167

69. Svendsen, I. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis Text. /1. Svendsen, K. Breddam // Eur.J.Biochem. 1992. - V. 204. - P. 165 - 171.

70. Taguchi, S. The complete amino acid substitutions at position 131 that are positively involved in cold adaptation of subtilisin BPN Text. / S. Taguchi, S. Komada, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 66. - № 4. -P. 1410- 1415.

71. Vlakhov, S. Induction of elastase biosynthesis in Streptomyces sp. 82 Text. / S. Vlakhov, P. Dalev, P. Kabadzhova et al. // Antibiotiki i khimioterapia. -1996.-V. 292.-№ 1-2.-P. 165 167.

72. Yokoi, K. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri Text. / K. Yokoi, M. Kakikawa, H. Kimoto, K. Watanabe, H. Yasukawa, A. Yamakawa, A. Taketo, K-I. Kodaira. // Gene. 2001. - V. 281. - P. 115 - 122.