Гидрофильные халькогенсодержащие производные алкилированных фенолов: синтез, свойства, антиокислительная и биологическая активность тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.03, доктор наук Кандалинцева Наталья Валерьевна

• Кандалинцева Наталья Валерьевна
• доктор наук
• 2020

Оглавление диссертации доктор наук Кандалинцева Наталья Валерьевна

Введение

Глава 1. Алкилфенолы и их халькогенсодержащие производные как антиоксиданты

(литературный обзор)

1.1. Фенольные антиоксиданты: механизм действия и факторы, влияющие на эффективность

1.2. Серосодержащие вторичные антиоксиданты. Синергизм

1.3. Серосодержащие производные алкилированных фенолов как

полифункциональные антиоксиданты

1.4. Селен- и теллурсодержащие антиоксиданты

1.5. Водорастворимые биоантиоксиданты фенольного типа

1.6. Гидроксиарилалкановые кислоты и их производные как антиоксиданты

1.6.1. Природные кислоты и родственные им соединения

1.6.2. Фенозаны

1.7. Заключение

Глава 2. Галогениды 8-(ю-(гидроксиарил)алкил)изотиурония: синтез и свойства

2.1. Получение галогенидов 8-(ю-(гидроксиарил)алкил)изотиурония

2.1.1. Синтез исходных полупродуктов

2.1.2. Взаимодействие ю-(4(2)-гидроксиарил)галогеналканов с тиомочевинами

2.1.3. Взаимодействие ю-(3,5-диалкил-4-гидроксифенил)алканолов с бромоводородной кислотой и тиомочевиной

2.2. Химические свойства галогенидов S-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)изотиурония

2.2.1. Де-трет-бутилирование галогенидов 8-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-фенил)пропил)изотиурония под действием галогеноводородных кислот

2.2.2. Щелочной гидролиз галогенидов $-(ю-(4(2)-гидроксиарил)алкил)-изотиурония

2.2.3. Синтез производных сульфидного типа из галогенидов £-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)изотиурония и тиолов на их основе

2.2.4. Обменные реакции галогенидов изотиурония с солями щелочных металлов

2.2.5. Окисление галогенидов 8-(3-(4-гидроксиарил)пропил)изотиурония

гидропероксидами

2.3. Заключение

Глава 3. 8-(ю-(Гидроксиарил)алкил)тио(селено)сульфаты и ю-

(гидроксиарил)алкансульфонаты натрия: синтез и свойства

3.1. Синтез и свойства 8-(ю-(гидроксиарил)алкил)тиосульфатов натрия

3.1.1. Синтез 8-(ю-(гидроксиарил)алкил)тиосульфатов натрия

3.1.2. Некоторые свойства S-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил)-тиосульфата натрия

3.2. Синтез 8е-(3-(4-гидроксиарил)пропил)селеносульфатов натрия и производных на их основе

3.3. Синтез ю-(гидроксиарил)алкансульфонатов натрия

3.4. Заключение

Глава 4. Синтез и некоторые свойства ю-(4(2)-гидроксиарил)алкилтио(селено,

теллуро)алкановых кислот

4.1. Получение ю-((4-гидроксиарил)алкилтио)алкановых кислот по реакциям нуклеофильного замещения

4.2. Получение ю-(3-(4(2)-гидроксиарил)пропил)тиоалкановых кислот на основе аллилфенолов

4.3. Получение ю-(3,5-диалкил-4(2)-гидроксибензилтио)алкановых кислот

4.4. Получение ю-(3-(4-гидроксиарил)пропилселено(теллуро))алкановых кислот и их этиловых эфиров

4.5. Синтез солей ю-((4-гидроксиарил)алкилтио(селено))алкановых кислот

4.6. Взаимодействие ю-((4-гидроксиарил)алкилтио(селено))алкановых кислот с гидропероксидом кумола

4.7. Заключение

Глава 5. Исследование антиоксидантной активности синтезированных соединений

5.1. Изучение антирадикальной активности синтезированных соединений

5.1.1. Модели окисления углеводородных субстратов в гомогенных системах

5.1.2. Модель инициированного окисления метилолеата в водном растворе додецилсульфита натрия

5.2. Изучение общей антиоксидантной активности синтезированных соединений

5.2.1. Модель Си2+-индуцированного окисления этилолеата в водно-эмульсионной

среде

5.2.2. Модель автоокисления этилолеата в водно-эмульсионной среде

5.2.3. Модель автоокисления метилолеата

5.2.4. Модель автоокисления сливочного масла

5.3. Заключение

Глава 6. О биологической активности синтезированных соединений

6.1. Исследование безопасности применения синтезированных соединений in vitro

и in vivo

6.2. Исследование биоантиоксидантных свойств синтезированных соединений

in vitro

6.3. Исследование биологической активности синтезированных соединений in vivo

6.4. Заключение

Глава 7. Экспериментальная часть

7.1. Материалы, оборудование, методы анализа и исследования

7.2. Синтез исходных соединений и полупродуктов

7.3. Получение галогенидов $-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)изотиурония

7.3.1. Получение галогенидов изотиурония по реакции ю-(4-гидроксиарил)-галогеналканов с тиомочевиной в условиях открытой системы

7.3.2. Получение галогенидов изотиурония по реакции ю-(4-гидроксиарил)-галогеналканов с тиомочевинами в ампулах

7.3.3. Получение галогенидов изотиурония по реакции ю-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)алканолов с бромоводородной кислотой и мочевиной

7.4. Химические свойства галогенидов $-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)изотиурония

7.4.1. Взаимодействие галогенидов S-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-пропил)изотиурония с галогеноводородными кислотами

7.4.2. Щелочной гидролиз

7.4.3. Взаимодействие галогенидов $-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)изотиурония с галогеналканами в щелочной среде

7.4.4. Обменные реакции галогенидов изотиурония с солями щелочных металлов

7.4.5. Взаимодействие галогенидов изотиурония с гидропероксидами

7.5. Синтез и свойства $-(ю-(гидроксиарил)алкил)тио(селено)сульфатов

7.5.1. Синтез и свойства $-(ю-(гидроксиарил)алкил)тиосульфатов натрия

7.5.2. Синтез Sе-(3-(4-гидроксиарил)пропил)селеносульфатов натрия и производных на их основе

7.6. Синтез ю-(гидроксиарил)алкансульфонатов

7.7. Синтез ю-(4(2)-гидроксиарил)алкилтио(селено, теллуро)алкановых кислот и их производных

7.7.1. Получение ю-((4-гидроксиарил)алкилтио)алкановых кислот по реакциям нуклеофильного замещения

7.7.2. Получение ю-(3-(4(2)-гидроксиарил)пропилтио)алкановых кислот на основе аллилфенолов

7.7.3. Получение ю-(3,5-диалкил-4(2)-гидроксибензилтио)алкановых кислот

7.7.4. Получение ю-(3-(4-гидроксиарил)пропилселено(теллуро))алкановых кислот и их этиловых эфиров

7.7.5. Синтез солей ю-((4(2)-гидроксиарил)алкилтио(селено))алкановых кислот

7.8. Исследование реакционной способности синтезированных соединений

7.8.1. Модель инициированного окисления кумола

7.8.2. Модель инициированного окисления стирола

7.8.3. Модель инициированного окисления метилолеата в хлорбензоле

7.8.4. Модель инициированного окисления метилолеата в водном растворе додецилсульфата натрия

7.8.5. Исследование противопероксидной активности

7.8.6. Модель Си2+-индуцированного окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде

7.8.7. Модель автоокисления метилолеата в водно-эмульсионной среде

7.8.8. Модель автоокисления метилолеата

7.8.9. Модель автоокисления сливочного масла

7.8.10. Исследование влияния гидрофильных алкилфенолов на биолюминесценцию Ph. phosphoreum

Заключение

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гидрофильные халькогенсодержащие производные алкилированных фенолов: синтез, свойства, антиокислительная и биологическая активность»

Введение

Актуальность темы исследования. К настоящему времени научно обоснована необходимость включения эндогенных антиоксидантов в комплексную терапию сво-боднорадикальных патологий - заболеваний, протекающих на фоне повышенной интенсивности образования продуктов неполного восстановления кислорода - активированных кислородных метаболитов (АКМ). В число таких патологий входят широко распространённые сердечно-сосудистые, воспалительные, онкологические, эндокринные и нейродегенеративные заболевания, что обуславливает актуальность поиска эффективных способов их лечения. Опыт применения для данных целей природных антиоксидан-тов-нутриентов (Р-каротина, витаминов А, Е, С, коэнзима Q и др.) оказался не самым удачным: многочисленные рандомизированные клинические исследования не подтвердили эффективность использования таких препаратов и сформировали запрос на создание лекарственных средств на основе антиоксидантов абиогенного происхождения.

Среди синтетических ингибиторов свободнорадикального окисления наибольшую известность получили алкилированные фенолы, в течение многих десятилетий успешно используемые в качестве термостабилизаторов полимерных и иных органических материалов технического назначения, а также пищевых антиоксидантов. Отдельные представители таких ингибиторов (ионол, пробукол, дибуфелон) применяются в медицине; природные алкилфенолы (токоферолы, убихинолы и др.) играют важную роль в антиок-сидантной защите живых организмов. Особый интерес в качестве биоантиоксидантов представляют серосодержащие производные алкилированных фенолов, превосходящие по эффективности in vitro и in vivo свои не содержащие серы аналоги, благодаря способности взаимодействовать с АКМ различной химической природы - как с активными радикалами, так и гидропероксидами. Ранее было показано, что алкилфенолы, содержащие в заместителях сульфидные группы (такие как 2,6-диметил-4-додецилтиометил-фенол и бис-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил)сульфид, безопасны в применении, проявляют выраженную протекторную активность при различных свобод-норадикальных патологиях и перспективны в качестве новых средств антиоксидантоте-рапии.

Ценными биоантиоксидантными свойствами, по всей видимости, обладают также селен- и теллурсодержащие алкилфенолы, однако такие соединения представлены отно-

сительно небольшим числом структур и как полифункциональные антиоксиданты пока малоизучены.

Названные алкилфенолы и их 8 (Se, Te)-содержащие производные являются ли-пофильными соединениями, в то время как для медицинской практики более актуальны гидрофильные антиоксиданты, отличающиеся высокой биодоступностью, удобством способов введения и дозирования, пригодные для применения в инфузионной терапии острых состояний. В этой связи представляется актуальным создание гидрофильных биоантиоксидантов с бифункциональным механизмом противоокислительного действия.

Степень разработанности темы. В ряду известных фенольных антиоксидантов (ФАО) подавляющее большинство соединений обладает липофильными свойствами, число известных водорастворимых форм весьма ограничено. Гидрофильные ФАО построены по единому принципу и состоят из фенольного остова (как правило, структурно соответствующего эффективному липофильному антиоксиданту) и полярного (обычно ионогенного) фрагмента, придающего соединению способность растворяться в водных средах. Наиболее известными соединениями такого рода являются производные а-токоферола, в структуре которых радикал С16Н33 замещен на карбоксильную группу (тролокс) или а-Б-глюкопиранозилметильный фрагмент (ТМС), а также 2,6-ди-трет-бутилфенолы, содержащие в положении 4 алкильный заместитель с карбоксилат-анионом (фенозаны) или катионом алкиламмония. В основе противоокислительного действия таких соединений лежит антирадикальная активность.

Гидрофильные серосодержащие ФАО, для которых по аналогии с липофильными антиоксидантами следует ожидать более высокой противоокислительной активности благодаря сочетанию антирадикальных и противопероксидных свойств, в литературе представлены единичными соединениями, включающими в свою структуру тиосуль-фатные, изотиурониевые или карбоксильные группы, при этом как полифункциональные антиоксиданты не охарактеризованы. Водорастворимые формы селен- и теллурсо-держащих фенольных соединений в известной нам литературе не встречаются.

Направленный синтез гидрофильных ФАО, обладающих набором желательных качеств, невозможен без учета закономерностей «структура - свойство». Вместе с тем, такие зависимости до последнего времени изучены не были. В то же время немногочисленные сравнительные исследования противоокислительных свойств названных антиок-

сидантов свидетельствуют о том, что к ним малоприменимы закономерности «структура - антиокислительная активность», выявленные прежде для их липофильных аналогов.

Ранее нашими коллегами совместно с сотрудниками НИОХ СО РАН были разработаны эффективные способы функционализации 2,6-диалкилфенолов, основанные на введении в положение 4 гидроксиалкильного заместителя и последующем превращении яара-гидроксиалкилфенолов в галоидпроизводные с различным числом и строением орто-заместителей. Это открыло перспективы синтеза на основе последних структурно-родственных рядов гидрофильных ФАО с последующей возможностью изучения на их примере закономерностей изменения различных свойств в зависимости от строения, которые могли послужить основой для молекулярного дизайна и направленного синтеза новых соединений с желательными свойствами.

Целью настоящей работы явилось создание нового поколения гидрофильных фенольных антиоксидантов с полифункциональным механизмом антиокислительного действия и комплексом ценных свойств для применения в различных областях биологии и медицины.

Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Разработать способы синтеза, выделения и очистки гидрофильных алкилфе-нолов, содержащих в заместителях изотиурониевые, сульфонатные, тио(селено)-сульфатные, карбоксильные, а также сульфидные, селенидные и теллуридные группы;

2. Осуществить синтез библиотек структурно-родственных гидрофильных 8 (8е, Те)-содержащих фенольных соединений;

3. Провести сравнительное исследование (био)антиоксидантной активности синтезированных соединений различных структур в различных модельных системах и выявить зависимости «структура - свойство», открывающие возможности для молекулярного дизайна и направленного синтеза полифункциональных гидрофильных биоантиок-сидантов, обладающих набором ценных свойств;

4. Предложить новые эффективные гидрофильные антиоксиданты с полифункциональным механизмом антиокислительного действия и выраженной протекторной активностью при свободнорадикальных патологиях для использования в биологии и медицине.

Научная новизна.

Решена научная проблема разработки новых высокоэффективных и биодоступных агентов для защиты от окислительного стресса и терапии сопряженных с ним патологических процессов на основе направленного синтеза гидрофильных халькогенсодер-жащих производных алкилированных фенолов

Осуществлен синтез структурно-родственных рядов гидрофильных производных алкилированных фенолов - галогенидов 8-(ю-(4(2)-гидроксиарил)алкил)изотиурония, S-(ю-(4(2)-гидроксиарил)алкил)тио- и Sе-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)селеносульфатов, ю-(4-гидроксиарил)алкансульфонатов натрия, а также ю-(4(2)-гидроксиарил)алкилтио-(селено,теллуро)алкановых и и их солей.

Изучено взаимодействие ю-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)алканолов с концентрированными бромо- и хлороводородными кислотами и тиомочевиной и солей S-(3-(3,5-ди-mреm-бутил-4-гидроксифенил)пропил)изотиурония с конц. ИБг и HCl. Установлено, что при взаимодействии названных алканолов с HHal и SC(NH2)2 наряду с замещением алифатической ОН-группы протекает де-трет-бутилирование, что приводит к соответствующим галогенидам S-(ю-(4-гидроксифенил)алкил)изотиурония. Показано, что галогениды S-(3-(3,5-ди-mреm-бутил-4-гидроксифенил)пропил)изотиурония под действием конц. HBr претерпевают полное де-трет-бутилирование, а в случае HCl процесс останавливается на стадии образования моно-трет-бутилзамещенного производного.

Изучено взаимодействие 3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1 -галоген-пропанов с Na2SeSÜ3 в водно-спиртовом растворе, на этой основе предложены удобные методы синтеза ранее неизвестных Sе-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)селеносульфатов и соответствующих им диселенидов.

Осуществлен синтез ряда новых производных фенолов - бутил-(3-(3,5-диметокси-4-гидроксифенил)- и бутил-(3-(3,4,5-тригидроксифенил)пропил)сульфидов, 2-(3-(4-гидроксиарил)пропилтио)этан-1,1 -диил-бис-(диэтилфосфонат)ов, бутил-(3-(3 -этокси-4-гидроксифенил)- и бутил-(3-(3,4-дигидроксифенил)пропил)селенидов, бис-(3-(4-гидроксиарил)пропил)селенидов и -диселенидов, бис-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил)теллурида и -дителлурида, представляющих интерес в качестве потенциальных биологически активных веществ.

Выявлено наличие у синтезированного бис-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-фенил)пропил)селенида выраженной гипогликемической активности и способности активизировать накопление гликогена в печени при отсутствии токсических свойств.

Впервые получен бис-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил)-дителлурид, и показаны возможности его использования в синтезах различных тел-луроалкилфенолов.

Предложен метод получения ю-(3-(4-гидроксиарил)пропилселено(теллуро)-алкановых кислот из соответствующих диселенидов (дителлуридов) с использованием тетрагидробората натрия и галогеналкановых кислот.

Впервые в различных модельных системах проведено системное сравнительное исследование противоокислительных свойств структурно-родственных рядов гидрофильных производных алкилированных фенолов.

Созданы банки констант скоростей взаимодействия вновь синтезированных се-ро(селен)содержащих фенолов с пероксидными радикалами стирола, кумола и метило-леата, в том числе в водных средах.

Изучено влияние ю-((4-гидроксиарил)алкилтио(селено)алкановых кислот на разложение гидропероксида кумола в среде уксусной кислоты. Установлено, что для названных тиоалкановых кислот стехиометрия данного взаимодействия изменяется в зависимости от строения заместителя, содержащего атом серы.

Установлено влияние структурных факторов на способность гидрофильных тио-алкилфенолов ингибировать окисление липидных субстратов (в том числе выделенных липопротеинов) в различных условиях.

Выявлена взаимосвязь между структурой гидрофильных фенолов и их противовоспалительной активностью; структурой и токсическими свойствами.

Предложены новые соединения, обладающие противовоспалительной, гипогли-кемической, гепатопротекторной, противоопухолевой, хондропротекторной и геропро-текторной активностью, кардио- и радиопротекторными свойствами. Установлено, что для ряда синтезированных соединений фармакологически ценные свойства проявляются через влияние на геном клетки посредством активации системы Keap1/Nf2/ARE.

Теоретическая и практическая значимость.

Предложены эффективные методы получения галогенидов 3-(ю-(4(2)-гидроксиарил)алкил)изотиурония, 3-(ю-(4(2)-гидроксиарил)алкил)тио- и Зе-((о-(4-

гидроксиарил)алкил)селеносульфатов, ю-(4-гидроксиарил)алкансульфонатов натрия, ю-(4(2)-гидроксиарил)алкилтио(селено,теллуро)алкановых кислот и их солей, представляющих интерес в качестве биологически активных веществ.

Впервые создана библиотека гидрофильных производных алкилированных фенолов, включающая десятки соединений, образующих структурно-родственные ряды с вариациями в строении отдельных фрагментов, что позволяет позиционировать их как удобные объекты для изучения закономерностей изменения различных свойств в зависимости от строения.

Предложены эффективные способы превращения ю-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)алканолов и солей 8-(ю-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-алкил)изотиурония соответственно в моно- и ди-орто-незамещенные галогениды 8-(ю-гидроксифенил)алкил)изотиурония, что открывает удобные и эффективные пути синтеза ранее труднодоступных ю-(4-гидроксифенил)алкантиолов - тиоаналогов природных биологически активных веществ и ю-(3-трет-бутил-4-гидроксифенил)алкантиолов -ключевых полупродуктов синтеза эффективных антиоксидантов.

Найдены условия щелочного гидролиза солей 8-(ю-(4-гидрокси-арил)алкил)изотиурония, приводящие к соответствующим тиолам с высокими выходами, а также осуществлять на основе названных солей изотиурония одностадийные синтезы дисульфидов и сульфидов.

Расширен синтетический потенциал названых солей изотиурония и соответствующих им тиолов - на их основе получены производные тиаалкилфенолов, дополнительно функционализированные в алкильном заместителе атомами галогена, гидроксильны-ми и метилен-бис-(диэтилфосфонат)ными группами, в ароматическом ядре - атомами брома, метокси- и гидроксизаместителями.

Изучена динамика изменения состава реакционных смесей при взаимодействии яара-галогенпропилзамещенных фенолов с №28е80э в 50%-ном водном этаноле и в условиях снижения в растворителе спиртовой компоненты. Предложены удобные и эффективные методы получения органических селеносульфатов и диселенидов, исходя из соответствующих галогеналканов с использованием сульфита натрия и элементарного селена. Показаны возможности использования бис-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)-диселенидов в качестве синтонов для получения селенидов различного строения.

Осуществлен синтез бис-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]-селенида, обладающего выраженной гипогликемической активностью и перспективного для дальнейших исследований в качестве антидиабетического средства.

Предложен метод синтеза бис-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил)-дителлурида - удобного синтона для получения различных теллуроалкилфенолов.

Изучена динамика изменения состава реакционной смеси при взаимодействии 2,6-диметилфенола с формальдегидом и тиопропановой кислотой при различных мольных отношениях, на этой основе предложена эффективная, пригодная для масштабирования методика синтеза 3-(3,5-диметил-4-гидроксибензилтио)пропановой кислоты и ее калийной соли.

Предложен метод получения ю-(3-(4-гидроксиарил)пропилселено)алкановых кислот из соответствующих диселенидов. Показана его эффективность для синтеза аналогичных теллуросодержащих соединений.

Изучено разложение гидропероксида кумола под действием ю-((4-гидроксиарил)алкилтио(селено)алкановых кислот в среде уксусной кислоты. Показано, что в структурно-родственном ряду алкилтиоалкановых кислот стехиометрия данного взаимодействия изменяется в зависимости от числа метиленовых звеньев, отделяющих атом серы от ароматического ядра и карбоксильной группы.

Установлены закономерности влияния структуры гидрофильных тиоалкилфено-лов на их антирадикальные свойства, способность ингибировать окисление олеатов в различных условиях и Си2+(Ре2+)-индуцированное окисление выделенных липо-протеинов, а так же на токсические свойства in vitro и in vivo и противовоспалительную активность in vivo. Показано, что найденные закономерности могут быть использованы для прогноза свойств вновь синтезированных соединений, а, соответственно, и в молекулярном дизайне и направленном синтезе новых соединений с определенной активностью.

В рядах синтезированных соединений выявлены агенты, обладающие выраженной противовоспалительной, гипогликемической, гепатопротекторной, противоопухолевой и геропротекторной активностью, кардиопротекторными и радиозащитными свойствами.

Предложен новый эффективный индуктор системы Keap1/Nf2/ARE.

Разработан способ экспресс-скрининга потенциальных антиоксидантов с использованием модели Си2+-индуцированного окисления выделенных липопротеинов низкой плотности.

Методология и методы исследования. Диссертационная работа базируется на актуальных достижениях химической науки и выполнена с привлечением комплекса современных методов синтеза и исследования строения и свойств органических соединений.

Выделение и очистка веществ осуществлялись методами экстракции, кристаллизации и хроматографии. Для анализа состава реакционных смесей и полученных продуктов привлекали ВЭЖХ и ГХ/МС. Состав и строение синтезированных соединений устанавливали методами элементного и рентгеноструктурного анализа, ЯМР, ИК, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Свойства синтезированных соединений изучали с привлечением манометрического, титриметрического, спектрофотометрического и биолюминесцентного методов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- новые гидрофильные производные алкилированных фенолов, включающие с свою структуру изотиурониевые, сульфонатные, тио- и селеносульфатные группы, тио(селено, теллуро)алкилкарбоксильные и тио(селено, теллуро)алкилкарбоксилатные фрагменты;

- методы синтеза серо(селен, теллур)-содержащих производных алкилирован-ных фенолов;

- характер и результаты взаимодействия ю-(3,5-диалкил-4-гидроксифенил)алканолов с бромоводородной кислотой и тиомочевиной, галогенидов 8-(3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил)изотиурония с бромо- и хлороводородными кислотами, 3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-галоген-пропанов с се-леносульфатом натрия;

- закономерности влияния структуры синтезированных соединений на их антирадикальные свойства, способность ингибировать окисление олеатов в различных условиях и Си2+(Ре2+)-индуцированное окисление выделенных липопротеинов, а так же на токсические свойства in vitro и in vivo;

- наличие у синтезированных соединений полифункциональной противоокис-лительной активности;

- наличие у синтезированных соединений ценных фармакологических свойств, их перспективность практического использования в качестве биологически активных антиоксидантов.

Степень достоверности. Достоверность полученных результатов основана на использовании современных методов синтеза, анализа и исследования свойств органических соединений; обеспечивалась тщательностью и повторностью проведения экспериментов, подтверждена соответствием экспериментальных данных теоретически ожидаемым.

Личный вклад соискателя. Направление диссертационного исследования было определено автором совместно с научным консультантом. На начальных этапах научного поиска совместно проводились работы по синтезу ряда 8-замещенных фенолов и полупродуктов их синтеза, что нашло отражение в совместных публикациях, часть из которых была использована как в настоящей работе, так и в ранее защищенной докторской диссертации А. Е. Просенко «Полифункциональные серо-, азот-, фосфорсодержащие антиоксиданты на основе алкилированных фенолов: синтез, свойства, перспективы применения». Указанные диссертационные работы отличаются целью и задачами исследования, полученными результатами и итоговыми выводами, их пересечение носит единичный, несистемный характер и связано с использованием единичных соединений в различных синтетических стратегиях и целях.

Результаты, представленные в работе, получены автором лично или при его непосредственном участии. Автор внес основной вклад в формирование общего направления исследования, постановку конкретных задач, планирование и проведение химических экспериментов, их описание, интерпретацию и публикацию полученных результатов. В исследованиях биологической направленности автор принимал участие в постановке задач исследования, обсуждении дизайна экспериментов и полученных экспериментальных данных, публикации результатов.

В период работы над диссертацией осуществлялось руководство научно-исследовательской деятельностью студентов и аспирантов, под руководством автора была защищена кандидатская диссертация Олейник А. С. «Синтез, антиоксидантная и биологическая активность 8-[ю-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и ю-(гидроксиарил)-алкансульфонатов натрия».

Апробация результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на всероссийских и международных конференциях, включая, в частности: II и IV Национальные научно-практические конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001, 2005), Международную конференцию «Современные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2001), VI, VII, VIII и IX Международные конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002, 2006, 2010, 2015), Четвертую и Седьмую Всероссийские научно-практические конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009, 2015), 4-й Международный симпозиум по химии и применению фосфор-, сера- и кремнийорганических соединений «Петербургские встречи» (Санкт-Петербург, 2002), XV Международную конференцию и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2007), Всероссийскую научную конференцию «Современные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2007), V и VI Международные научно-практические конференции «Тяжёлые металлы и радионуклеиды в окружающей среде» (Семей, 2008, 2010), International Conference on Prevention of Age-Related Diseases (Shanghai, 2009), 17th Annual Meeting of the Society for Redox Biology & Medicine (Orlando, 2010), Annual Meeting of Society for Free Radical Research (Oslo, 2010), VIII Международный симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012), Кластер конференций по органической химии «0ргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013), Международную научно-практическую конференцию «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013), 14th International Conference on Oxidative Stress Reduction, Redox Homeostasis and Antioxidants (Paris, 2014), Всероссийские конференции молодых ученых и VII - VIII школы им. академика Н. М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2015, 2019; приглашенный лектор), XIV Всероссийскую научно-практическую конференцию с международным участием им. А. Ю. Барышникова «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2017), II и III Международные конференции «Свободные радикалы в химии и жизни» (Минск, 2017, 2019), Всероссийскую научную конференцию с международным участием «Современные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2017), XV Всероссийскую научно-практическую конференцию им А. Ю. Барышникова «Новые отечественные противоопухолевые препараты и медицинские

технологии: проблемы, достижения, перспективы» (Москва, 2018), 25th Annual Meeting of the Society for Redox Biology & Medicine (Chicago, 2018), XXI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 2019), 26th Annual Meeting of the Society for Redox Biology & Medicine (Las Vegas, 2019).

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 132 работы, в том числе 32 статьи в рецензируемых научных изданиях, входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования, и иных научных изданиях, рекомендованных ВАК, 2 монографии, 2 патента, статьи в иных изданиях, тезисы докладов в сборниках конференций.

Диссертационная работа выполнялась в рамках комплексной университетской темы «Синтез и исследование полифункциональных фенольных антиоксидантов» (№ гос. рег. 01.200.209186) и направления научных исследований «Полифункциональные фе-нольные антиоксиданты и биологически активные вещества» (рег. в РОСРИД: АААА-А18-118091390005-1 (2018 г.), АААА-А19-119111290030-8 (2019 г.)).

Исследования биологической активности новых соединений проводились при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований: 01-04-49306-а «Исследование антиоксидантного действия парафункциональных производных фенолов», 03-04-06385-мас «Программа поддержки молодых ученых (для проекта 01-04-49306)», 0504-48819 «Активация антиоксидант-отвечающего элемента новыми гидрофильными бифункциональными фенольными антиоксидантами», 09-04-00600-а «Регуляторная роль антиоксидант-респонсивного элемента при воспалении», 09-04-01376 «Метаболическая регуляция генерации активных форм кислорода и азота в митохондриях мозга, сердца и печени и защита от окислительного стресса», 11-04-00640 «Участие редокс-чувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в дифференцировке, активации и апоптозе различных субпопуляций Т-лимфоцитов», 14-04-00551 «Участие активированных кислородных метаболитов и редокс-чувствительных сигнальных систем в развитии и персистенции гранулематозного воспаления», 16-54-00050 «Исследование антиокси-дантных и регуляторных свойств новых водорастворимых фенольных соединений в биологических системах».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав основного содержания, заключения, списка литературы (495 наименований, включая публи-

кации автора по теме исследования) и приложений. Общий объем диссертации без приложений составляет 378 страниц, она содержит 131 схему, 35 рисунков и 63 таблицы.

Автор выражает искреннюю благодарность всем, кто был причастен к появлению данной работы, всем соавторам опубликованных работ, и лично акад. РАН

Г. А. Толстикову |, акад. РАН В. В. Ляховичу, акад. НАН Беларуси С. Н. Черенкевичу, чл.-корр. РАН В. А. Вавилину - за сотрудничество и соавторство, д-ру мед. наук Е. Б. Меньщиковой, д-ру биол. наук Н. К. Зенкову (ФИЦ фундаментальной и трансляци-

онной медицины), д-ру мед. наук М. И. Душкину |, д-ру мед. наук Колесниковой О. П

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Кандалинцева Наталья Валерьевна, 2020 год

- 1

Снижение пространственной затрудненности фенольного гидроксила при замене трет-бутильных орто-заместителей на циклогексильные и метильные сопровождалось снижением эффективности ингибирующего действия, которое в ряду кислот 3-(4-гидроксиарил)пропильного ряда было выражено более ярко, чем у их бензильных аналогов. Так, например, длительность периода индукции автоокисления МО при последовательной замене трет-бутильных заместителей на метильные в ряду пропилтиоэтано-вых кислот 214 - 244 - 218 сократилась в ~ 4.8 раза, в соответствующем ряду кислот бензильного типа 229 - 253 - 252 - только в ~ 1.8 раза.

Невысокую ингибирующую активность частично -экранированных фенолов в отношении липидных субстратов связывают, в первую очередь, с образованием водородных связей ArO№"OC(OR)R'. Вместе с тем, такие связи, безусловно, возникали и при окислении МО в хлорбензоле, однако в последнем случае тиоэтановые кислоты, имеющие метильные и циклогексильные заместители, превосходили по величине k7 свои ди-трет-бутилзамещенные аналоги 214 и 229 (таблица 5-1).

Это позволяет считать, что обсуждаемое снижение эффективности ингибирующе-го действия в ряду тиоэтановых кислот обусловлено, главным образом, уменьшением устойчивости соответствующих феноксильных радикалов.

Поскольку в реакции (7) не наблюдается исчезновения свободной валентности эффективность ингибитора в значительной степени зависит от инертности ArO^ в реакции продолжения цепи (10):

ArO^ + RH ^ ArOH + R% kio Эффективными АО являются только соединения, для которых kio << k2 [28]. Вполне естественно, что наличие в орто-положениях фенольного кольца объемных трет-бутильных заместителей, создающих стерические препятствия для протекания реакции (10), является одним из основных факторов, обеспечивающих отличные ингибирующие свойства пространственно-затрудненных фенолов.

При анализе данных таблицы 5-17 обращает на себя внимание и тот факт, что ди-трет-бутилзамещенная бензилтиоэтановая кислота 229 несколько уступала по эффективности своему пропильному аналогу 214, а менее экранированные бензилтиоэтановые кислоты 252, 253 и 254 превосходили по противоокислительному действию свои гомологи - пропилтиоэтановые кислоты 252, 253 и 254, соответственно.

Зависимость АОА синтезированных тиоалкановых кислот от особенностей строения wapa-заместителя - удаленности сульфидной группы от ароматического ядра и карбоксильной группы - рассматривали в рядах орто-ди-трет-бутил- и диметил-замещенных соединений (таблица 5-18). В результате было установлено, что изменение числа метиленовых звеньев, разделяющих ароматическое ядро и атом серы и атом серы и карбоксильную группу, отражается на АОА соединений с различным орто-замещением не идентичным образом.

Таблица 5-18. Влияние (ю-(3,5-диалкил-4-гидроксифенил)алкилтио)алкановых кислот на автоокисление метилолеата (1 мкмоль/г, 60 °С)

Антиоксидант Период индукции

Формула п т Номер Т, суток

^Ви 1 1 229 37

нсх^. 1 2 256 41

Т 1 0

3 1 214 43

3 2 216 79

1 1 1 252 2о

1 2 259 61

Т 1 0

3 1 218 9

3 2 222 67

- 1

Так, например, в случае ди-трет-бутилзамещенных тиоэтановых кислот введение двух дополнительных метиленовых звеньев между ароматическим углеродом и атомом серы при переходе от 229 к 214 сопровождалось небольшим увеличением АОА. Вместе с тем, в случае диметилзамещенных соединений аналогичный переход от 252 к 218 сопровождался существенным снижением АОА. Наблюдаемые различия в АОА указанных соединений в чистом виде не коррелируют ни с их антирадикальной активностью (п. 5.1.1 настоящей главы), ни с противопероксидной (глава 4, п. 4.6.) и могут быть связаны только с проявлением различных синергических эффектов.

Для оценки синергических эффектов у исследуемых соединений в данной модельной системе их ингибирующее действие сравнивали с эффективностью бинарных композиций триалкилфенолов (ТМФ и ионола) с синергистами - 3-(4-метоксифенил)-пропилтио- и бензилтиоалкановыми кислотами. Количественно эффекты синергизма в смесевых композициях характеризовали величиной Дт:

Дт = (тАгОН+Б - То) / ((ТАгОЫ -То) + (ТБ -То))

а в молекулах (ю-(4-гидроксиарил)алкилтио)алкановых кислот - величиной Дт':

Дт' = (тгтк - то) / ((ТАгОЫ -То) + (тб -То)) где То - период индукции неингибированного окисления; таюн+б - период индукции окисления в присутствии бинарной композиции из триалкилфенола и синергиста; тб и тагон - периоды индукции окисления в присутствии синергиста и триалкилфенола, соответственно; т гтк -

период индукции окисления в присутствии (ю-(4-гидроксиарил)алкилтио)алкановой кислоты

Добавки 1 мкмоль/г индивидуальных синергистов в метилолеат не оказывали противоокислительного действия, величина периода индукции для этих случаев (тб) не отличалась от контрольного значения (то) и составляла 1 мин. Вместе с тем, смесевые композиции синергистов с триалкилфенолами оказывались в ряде случаев эффективнее индивидуальных антиоксидантов, что свидетельствует о возникновении синергических эффектов (таблица 5-19).

Следует отметить, что в данной модельной системе используемый нами в качестве реперного антиоксиданта ионол характеризовался крайне высокой АОА. По способности ингибировать автоокисление метилолеата ТМФ значительно уступал ионолу, несмотря на более высокую скорость взаимодействия с пероксорадикалами окисляемого субстрата (таблица 5-1), что, как и в рассмотренном выше случае тиоэтановых кислот, связано с высокой активностью орто-метилированных феноксильных радикалов в реакции (10). По эффективности ингибирующего действия ионол превосходил и фенозан-кислоту 74. Принимая во внимание, что фенозан-кислота 74 не уступает ионолу по величине k7 при окислении МО в РИС1 (см. таблицы 5-1 и 5-5), различия в АОА этих экранированных фенолов следует связывать с различиями в активности образуемых или фе-ноксилов.

Таблица 5-19

Влияние бинарных композиций на автоокисление метилолеата, [ЛЮН]=[^] =

1 мкмоль/г, 60 °С

Синергист (Б) ЛгОИ

ТМФ Ионол

Формула Я п т Номер ТЛгОИ+Б, сут. Лт ТЛгОИ+Б, сут. Лт

Н 1 1 333 14 1.08 53 1.00

Н 1 2 334 34 2.75 77 1.46

МеО 3 1 227 13 1.00 53 1.00

МеО 3 2 228 46 3.75 74 1.40

- 13 53

Основным путем гибели феноксильных радикалов в условиях автоокисления, как известно, является реакция (9), которая для 2,6-ди-трет-замещенных феноксилов протекает по пути диспропорционирования (глава 1, схема 1-4). Значения константы скорости данной реакции k9 для ионола и метилокса 4 (метилового эфира фенозан-кислоты) различаются на порядок: 8700 и 740 М-1 с-1, что связано с меньшим числом бензильных атомов водорода в молекуле эфира 4 и стерическими затруднениями, создаваемыми группой СООМе для подхода ди-трет-бутилзамещенного феноксила [16].

Очевидно, что в случае фенозан-кислоты 74 последний фактор будет возрастать в силу образования водородных связей СООИ"ЮС(ОЯ)Я'. Таким образом, следует ожидать, что в рассматриваемой модельной системе ионол будет обрывать больше цепей окисления, чем фенозан-кислота 74 той же концентрации, что обеспечивает большую длительность периода индукции автоокисления МО, ингибированного ионолом.

По результатам проведенных исследований бинарные композиции ионола и ТМФ с 3-(4-метоксифенил)пропилтио- и бензилтиоэтановыми кислотами фактически не отличались по АОА от индивидуальных фенолов. Вместе с тем, аналогичные композиции с тиопропановыми кислотами демонстрировали четкие синергические эффекты, степень выраженности которых была выше для композиций на основе ТМФ.

Среди (ю-(4-гидроксиарил)алкилтио)алкановых кислот с различным строением пара-заместителя наибольшей АОА характеризовались тиопропановые кислоты, обладающие синергизмом (Лт' > 1) и соответствующие бинарным композициям с выраженным синергическим эффектом (Лт > 1): ди-трет-бутилзамещенная 216 и диметилзаме-щенные 259 и 222 (таблица 5-20). При этом степень выраженности синергизма у указанных кислот оказалась выше, чем у соответствующих им бинарных композиций (Лт'/ Лт > 1).

При анализе данных таблицы 5-20 обращает на себя внимание, что смесь ионола и 334 так же обладала выраженным синергическим эффектом Лт = 1.46, однако соответствующая ей тиопропановая кислота 256 высокой АОА не отличалась. Мы полагаем, что данный результат связан с тем, что 256, подобно фенозан-кислоте 74 и по тем же причинам, не эквивалентна ионолу по антирадикальной активности в условиях автоокисления метилолеата.

Таблица 5-20. Синергические эффекты (ю-(3,5-диалкил-4-гидроксифенил)алкилтио)-алкановых кислот при окислении метилолеата, 1 мкмоль/г, 60 °C

(ю-(4-гидроксиарил)алкилтио)алкановая кислота Бинарная композиция Дт'/ Дт

Формула n m Номер ТГТК, сут. Дт' Состав Дт

t-Bu 1 1 229 37 0.69 Ионол + 333 1.00 0.69

H°Yl ° 1 2 256 41 0.77 Ионол + 334 1.46 0.53

3 1 214 43 0.81 Ионол + 227 1.00 0.81

3 2 216 79 1.50 Ионол + 228 1.40 1.07

1 1 1 252 20 1.58 ТМФ + 333 1.08 1.46

hoTS ° 1 2 259 61 5.00 ТМФ + 334 2.75 1.82

3 1 218 9 0.67 ТМФ + 227 1.00 0.67

3 2 222 67 5.50 ТМФ + 228 3.75 1.47

В целом полученные результаты позволяют считать, что высокая АОА ряда исследованных тиоалкановых кислот обусловлена полифункциональным механизмом их противоокислительного действия и наличием внутреннего синергизма. С этими представлениями хорошо согласуется факт изменения продолжительности периода индукции окисления МО в присутствии названных кислот неаадитивного изменению их концентрации.

На рисунке 5-10 представлена диаграмма периодов индукции автоокисления метилолеата, ингибированного добавками антиоксидантов, содержащих в качестве гидрофильного фрагмента карбоксильную группу. Согласно представленным данным, во всём диапазоне исследованных концентраций от 0.25 до 2.5 мкмоль/г фенозан-кислота 74 уступала по антиоксидантной активности своему серосодержащему аналогу 214.

В области низких концентраций водорастворимый аналог а-токоферола - тролокс превосходил по эффективности как фенозан 74, так и его серосодержащие аналоги, однако при переходе концентраций от 1.0 до 2.5 мкмоль/г для тролокса не наблюдалось усиления ингибирующего действия, а противоокислительная активность прочих исследованных соединений существенно возрастала. При этом различия в значениях периодов индукции т при концентрациях ингибиторов в 1.0 и 2.5 мкмоль/г увеличивались в ряду 74 - 214 - 259.

140 -

120 ■

о

К К

а и

еК

к

к

«

о к л 0)

С

100 -80 -60 -40 -20 -0

У//Л 0,25 мкмоль/г [\\У1 0,5 мкмоль/г Р9991 1 мкмоль/г I I 2,5 мкмоль/г

н

но.

контроль

он

259

и

^Аон

Рисунок 5-10. Диаграмма периодов индукции окисления метилолеата (60 оС), ингибированного гидроксиарил(тиа)алкановыми кислотами

Феномен снижения эффективности противоокислительного действия при увеличении концентрации описан для а-токоферола и ряда других природных антиоксидан-тов, относящихся к орто-незамещенным и частично-экранированным фенолам; он обусловлен участием соответствующих феноксилов в реакции (10), и с ним связывают неудачи в клиническом использовании таких антиоксидантов для лечения свободно-радикальных патологий [12].

Выявленные различия в зависимости эффективности противоокислительного действия от концентрации для тролокса и тиоалкановых кислот 214 и 259 (особенно и ор-то-диметилзамещенной 259) позволяют считать, что дозозависимая инверсия антиокислительного действия, являющаяся существенным недостатком природных антиоксидан-тов, и в частности а-токоферола и его гидрофильных производных, для синтезированных нами соединений не характерна.

В таблице 5-21 представлены значения периодов индукции автоокисления МО, ингибированного рядом синтезированных 8е-содержащих соединений и их тиоаналогов.

Таблица 5-21. Влияние селен- и серо-содержащих производных (3-(4-гидроксиарил)-алкильного ряда на автоокисление метилолеата (1 мкмоль/г, 60 °С)

Антиоксидант Период индукции т,

Формула я X п Номер суток

^Би 8 1 163 100

^Би 8 2 167 46

ОН ОН ^Би 8е 1 193 89

ТУ 1 Т t-Бu 8е 2 186 41

Н 8 1 335 9

Н 8е 1 194 45

Н 8е 2 188 17

он t-Бu 8 - 216 79

t-Бu 8е — 278 46

I 0 и Н 8 — 224 26

Н 8е — 281 45

Ионол 53

Показано, что в рядах липофильных и гидрофильных производных наиболее высокой АОА, превышающей АОА ионола, обладают орто-ди-трет-бутилзамещенные соединения с сульфидной группой - сульфид 163 и тиопропановая кислота 216. Замена сульфидной группы на дисульфидную, а так же удаление одной трет-бутильной группы во всех случаях приводили к снижению противоокислительной активности. Вместе с тем, замена серы на селен различным образом отражалась на ингибирующих свойствах ди- и моно-трет-бутилированных соединений: снижалась в первом случае и увеличивалась во втором.

Данный результат оказался весьма неожиданным, и мы сочли возможным связать его с различным вкладом синергической составляющей в АОА серо- и селенсодержа-щих ФАО с различным орто-замещением. В этой связи провели сравнительное исследование синергических эффектов в бинарных композициях фенолов с различным орто-замещением с дидодецилсульфидом и дидодецилселенидом. В качестве реперных выбрали антиоксиданты, традиционно используемые на практике в качестве ингибиторов

окисления липидсодержащих продуктов: ионол, 2-трет-бутил-4-метоксифенол (БОА) и а-токоферол. Данные соединения различались как степенью пространственного экранирования фенольной группы, так и значениями константы скорости k7 (таблица 5-22).

Согласно полученным данным, эквимолярные добавки дидодецилсульфида приводили к заметному увеличению периода индукции только в случае ди-трет-бутилзамещенного ионола. В то же время аналогичная добавка дидодецилселенида слабо влияла на АОА ионола, но давала высокие синергические эффекты с БОА и а-токоферолом. Такой результат полностью согласуется с представлениями классической работы Г. В. Карпухиной и Н. М. Эмануэля [54] о наличии оптимального отношения констант скоростей взаимодействия компонентов синергической композиции с активными радикалами и гидропероксидами k7/ks, при котором синергизм достигает максимальных значений.

Таблица 5-22. Синергизм в композициях фенольных соединений с дидодецилсульфидом (DDS) и дидодецилселенидом(DDSe), автоокисление метилолеата, ([Ф.AO]=[DDS]=[DDSe]=1 мкмоль/г, 60 °С)

ФАО Бинарная композиция

с DDS с DDSе

Формула Наименование k7 X 10-4, М-1 с-1 TArOH, сут. TArOH+DDS, сут. Дт TArOH+DDSc, сут. Дт

НО t-Bu t-Bu^Q> Ме ионол 3.2 53 66 1.25 61 1.13

НО t-Bu ОМе БОА 13 49 50 1.02 224 4.55

Ме 11 А 1^с1бнзз Me^f^O^Me Ме а-токоферол 130 17 17 1.00 68 3.94

- - - 1 2 -

Примечание. Значения k7 измерены при окислении метиллинолеата, 50 оС по [33]

5.2.4. Модель автоокисления сливочного масла

Сливочное масло в отличие от других жиров, используемых в пищевой и косметической отраслях, содержит довольно много влаги: по ГОСТ 32261-2013 — до 25 % при жирности > 72.5 %. В этой связи для предотвращения окислительной порчи сливочного масла подходят как гидро-, так и липофильные антиоксиданты, в то время как в прочие пищевые жиры удается вводить только липофильные соединения [428]. Соответственно, мы рассматривали сливочное масло как весьма перспективный субстрат для исследования брутто-ингибирующей активности синтезированных гидрофильных соединений.

Принимая во внимание, что при производстве сливочных масел допускается использование добавок эндогенных антиоксидантов (пропилгаллат, бутокситолуол, буток-сианизол и др.) [428], а при одновременном присутствии в окисляющемся субстрате нескольких антиоксидантов между ними могут возникать синергические или антагонистические отношения, в качестве субстрата для исследования АОА синтезированных соединений мы выбрали сливочное масло домашнего изготовления.

Автоокисление сливочного масла с добавками исследуемых соединений (1 мкмоль/г) проводили в процессе его хранения на воздухе в тонком (2-3 мм) слое при 27 °С (т. пл. сливочных масел составляет 28-37 °С) в течение 3 и 6 месяцев. Согласно полученным данным (таблица 5-23), в рядах исследованных соединений наилучшую сохранность масла обеспечивали орто-ди-трет-бутилзамещенные тиосульфаты 168 и 182, а также тиосульфат 184 на основе 3,5-ди-трет-бутилпирокатехина. Снижение степени пространственного экранирования фенольной группы при замене трет-бутильных заместителей на метильные или циклогексильные группы, как и удаление одного из ор-то-заместителей приводило существенному снижению противоокислительной активности.

Независимо от характера орто-замещения и срока хранения масла сульфонатные производные ингибировали окисление менее эффективно, чем их тиосульфатные аналоги, что свидетельствует о проявлении последними в данной модельной системе полифункционального механизма противоокислительного действия.

Таблица 5-23. Влияние тиосульфатных и сульфонатных производных алкилированных фенолов на хранение сливочного масла, 1 мкмоль/г, 27 оС

Антиоксидант [ROOH], отн.ед.

Формула R2 П Номер 3 мес. 6 мес.

он 1 - 168 1 1

Cy Cy - 169 16

V H — 174 7 18

^^^БОзМа Cy H - 178 26

ОН | - 200 8.5 9

К-уЦ-' 2 Cy Cy - 205 20

V H - 208 11 21

Me - 210 17

ОН

- - 1 182 1

- - 0 212 7

ОН OH S(CH2)2SSOзNa - 184 1

тх OH S(CH2)2SOзNa - 213 2,5

(CH2)зSSOзNa H - 183 6

Фенозан калия 77 2.5 2

- 17

Сопоставление ингибирующей активности тиосульфатов 168 и 182 и сульфонатов 200 и 212 позволяет считать, что бивалентная сера тиосульфатного фрагмента вносит больший вклад в ингибирующую активность соединений, чем сульфидная группа.

Следует заметить, что фенозан калия 77 в данной модельной системе закономерным образом уступал по АОА тиосульфату 168, однако превосходил по эффективности сульфонат 200. Большая АОА фенозана калия 77 в сравнении с 200 может быть связана с возможностью регенерации активной формы ингибитора за счет окисления С-Н-связи при |3-атоме углерода пара-заместителя (схема 1-59).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что модель автоокисления сливочного масла в процессе его хранения подходит для изучения брутто-

ингибирующих эффектов полифункциональных гидрофильных антиоксидантов, однако имеет существенный недостаток — значительную длительность проведения эксперимента.

5.3. Заключение

Результаты исследований, представленных в настоящей главе, свидетельствуют, что синтезированные соединения обладают способностью ингибировать окисление различных субстратов и в различных условиях окисления.

В модельных реакциях инициированного окисления стирола, кумола, метилолеата в хлорбензоле и метилолеата в водном растворе 8Б8 измерены констаты скорости k7 взаимодействия синтезированных соединений и их липофильных аналогов с пероксид-ными радикалами, а так же стехиометрические коэффициенты ингибирования f. Впервые создан банк величин k7 и f для широкого круга структурно-связанных гидрофильных производных алкилфенолов.

На примере ю-((4-гидроксиарил)алкилтио)алкановых кислот установлено, что наибольшие различия в величинах k7 для фенолов с полярными группами в пара-заместителе и с различным числом и строением орто-заместителей наблюдаются при окислении модельных ароматических углеводородов (стирола, кумола), при окислении метиолеата в хлорбензоле данные различия нивелируются в силу снижения величины k7 для частично-экранированных фенолов. При переходе к окислению метилолеата в водном растворе 8Б8 наблюдается значительное снижение величины k7 для всех исследованных соединений. Показано, что величины k7 и f, характеризующие антирадикальную активность гидрофильных ФАО, возрастают при удлинении углеводородной цепи, разделяющей ионогенную группу и ароматическое ядро.

В модельных системах окисления липидных субстратов в отсутствие радикального инициатора 8-(ю-(4-гидроксиарил)алкил)тиосульфаты и соответствующие им тио-алкановые кислоты превосходят по эффективности ингибирующего действия свои аналоги, не содержпщие в структуре атомов бивалентной серы, что подтверждает принадлежность названных соединений к полифункциональным антиоксидантам. Показано, что АОА ряда ю-((4-гидроксиарил)алкилтио)алкановых кислот усилена эффектами внутреннего синергизма.

Глава 6. О биологической активности синтезированных соединений

В настоящей главе представлены результаты исследований биологической активности синтезированных соединений. Данные исследования были проведены в институтах СО РАН Новосибирского научного центра, в Новосибирском государственном аграрном университете, Новосибирском государственном педагогическом университете (на профильных кафедрах и в НИИ химии антиоксидантов), в Институте проблем химической физики РАН (г. Черноголовка), в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе Минздрава России (г. Москва), в Белорусском государственном университете (г. Минск), а так же в ОАО «Волгореченскрыбхоз».

6.1. Исследование безопасности применения синтезированных

соединений in vitro и in vivo

В рамках настоящей работы мы ставили перед собой задачу создания полифункциональных гидрофильных антиоксидантов для практического использования в качестве ингибиторов свободнорадикального окисления в живых системах. В этой связи, выбирая структурные блоки для своих антиоксидантов, мы изначально учитывали потенциальную возможность проявления синтезируемыми соединениями токсических свойств и стремились минимизировать таковые. Так, свои исследования мы начали с пространственно-затрудненных фенолов, поскольку было известно, что они, в отличие от неэкранированных аналогов, фактически не проявляют токсических свойств (таблица 6-1); в качестве гидрофильных фрагментов так же использовали группы (-SC(NH2)2Hal, -SÜ3Na, -SSÜ3Na, -COOH), встречающиеся в структурах фармакологических препаратов [429]. Несмотря на это, в процессе выполнения работы возникла необходимость в изучении влияния структурных факторов на токсичность синтезированных соединений [430, 337].

Основным подходом к первичной оценке безопасности применения новых соединений является определение средней летальной дозы LD50 на лабораторных животных. Определение острой токсичности для десятков вновь синтезированных соединений требует вовлечения в острый эксперимент значительного числа лабораторных животных,

что сопряжено с финансовыми затратами и проблемами этического плана. В этой связи мы сочли целесообразным провести предварительную оценку токсичности синтезированных соединений in vitro.

Исследования проводили на культурах светящихся бактерий Photobacterium phos-phoreum (Микробиосенсор B17-677F) из коллекции Института биофизики СО РАН, которые ранее были успешно использованы для определения токсичности соединений различной химической природы и экологического мониторинга [431-434]. О токсичности синтезированных соединений судили по величине ID50, численно равной концентрации, снижающей интенсивность биолюминесценции на 50%.

Таблица 6-1. Острая токсичность некоторых фенольных соединений (per os)

[14, 56, 125, 126, 435,]

Все исследованные соединения дозозависимо снижали интенсивность биолюми-нисценции Ph. Phosphoreum, причем данная зависимость носила линейный характер и позволяла определять величину ID50 графическим способом (рисунок 6-1).

Согласно полученным результатам (таблица 6-2), влияние синтезированных соединений на бактериальную биолюминесценцию изменялось в зависимости от числа и строения орто-заместителей, а так же природы ионогенной группы.

Значения ID50 в зависимости от строения фенольного фрагмента в рядах тиосуль-фатов и сульфонатов изменялись в близких пределах - от 0.37 до 5.87 мМ и от 0.21 до 5.90 мМ, соответственно; а для соответствующих хлоридов изотиурония варьировали значительно шире - от 20 мкМ до 670 мМ.

В рядах солей изотиурония и тиосульфатов изменение числа и строения орто-алкильных заместителей сходным образом отражалось на величинах ID50. Так, при переходе от ди-трет-бутилзамещенных соединений к орто-незамещенным производным в рядах 106а - 111а - 109а и 168 - 174 - 171 происходило увеличение значений ID50, что свидетельствовало об уменьшении токсического эффекта соединений на Ph. Phosphoreum. Аналогичным образом величина ID50 изменялась в ряду тиосульфатов 168 - 172 -170 при последовательной замене трет-бутильных орто-заместителей на метильные

® - 1

о - 2

s

5 120-

S .

I

S

ю 80-

S

S -

0-

50

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

концентрация, мМ

Рисунок 6-1. Зависимость интенсивности биолюминисценции Рк phosphoreum от концентрации S-[3-(4-гидроксифенил)пропил]тиосульфата натрия (171): 1 - для отдельной пробы, 2 - среднее для данной концентрации.

Таблица 6-2. Значения Ю50 для исследованных гидрофильных производных алкилфенолов

общей формулы: еж

я Я1 Я2 Яз Номер ГО50, мМ

н Г-Би (СШ)з880зКа Г-Би 168 0.65

н Ме (СШ)з880зКа Ме 170 4.68

н Су (СШ)з880зКа Су 169 0.Э7

н н (СШ^ОзШ н 171 з.14

н н (СШ)з880зКа Г-Би 174 1.84

н н (СШ)з880зКа Су 178 0.96

н Ме (СШ)з880зКа Г-Би 172 1.Э8

Ме н (СШ)з880зКа н 176 5.87

н Г-Би (Сн2)з8(СШ)2880зКа Г-Би 182 0.45

н Г-Би Г-Би (СШ)з880зКа 183 1.07

н Г-Би (СШ)з80зКа Г-Би 200 1.Э4

н Ме (СШ)з80зКа Ме 206 5.41

н Су (СШ)з80зКа Су 169 1.96

н н (СШ)з80зКа н 207 0.21

н н (СШ)з80зКа Г-Би 208 0.51

н н (СШ)з80зКа Су 209 1.00

н Ме (СШ)з80зКа Г-Би 210 5.90

Ме н (СШ)з80зКа н 176 2.з8

н Г-Би (СШ^С^Ш^О Г-Би 106а 0.02

н н (СШ^С^Ш^О Г-Би 111а 46.4

н Ме (СШ^С^Ш^О Ме 108а 208

н н (СШ^С^Ш^О н 109а 2з5

Ме н (СШ^С^Ш^О н 114а 670

н Г-Би (СШ^С^нМе^О Г-Би 120а Э8.1

н Г-Би (СШ^^Ш^С^Ш^О Г-Би 158a 0.02

группы, диметилзамещенный хлорид изотиурония 108а также оказывал существенно меньшее влияние на биолюминисценцию, чем его пространственно-экранированный аналог 106а.

Вместе с тем, снижение степени пространственного экранирования фенольной группы при замене трет-бутильных заместителей на циклогексильные приводило к увеличению токсического воздействия тиосульфатов на РК. рhosphoreum, среди исследованных тиосульфатов наименьшее значение ГО50 было зафиксировано для производного 169 с дициклогексильным орто-замещением.

В случае 3-(4-гидроксиарил)пропансульфонатов изменения в строении фенольно-го фрагмента отражались на степени токсического влияния соединений на бактериальные культуры иным образом. Так, при последовательном удалении трет-бутильных групп при переходе от 200 к 208 и далее к 207 значения ГО50 снижались, а не увеличивались; а сульфонат 210 с метил-трет-бутильным замещением оказывал меньший токсический эффект, чем его диметильный аналог 170. Аналогично и циклогексилзамещен-ные соединения 205 и 203 оказались менее токсичны, чем их трет-бутилзамещенные производные 200 и 208, соответственно.

Между тем, метилирование фенольной ОН-группы приводило к увеличению значений ГО50 независимо от природы ионогенного фрагмента: и хлорид изотиурония 114а и тиосульфат 176 и сульфонат 211 характеризовались существенно большими значениями ГО50, чем их фенольные гомологи 109а, 171 и 207.

Введение в структуру хлорида изотиурония 106а К-метильных заместителей при переходе к 120а сопровождалось снижением способности ингибировать свечение бактерий, а введение тиометиленового фрагмента в пара-заместитель при переходе от 106а к 158a не оказывало влияния величину ГО50. Тиосульфаты 168 и 182, различающиеся на тиометиленовый фрагмент, незначительно разнились по значениям обсуждаемого параметра.

/—^ с» и и и

С другой стороны, в рядах соединении с одинаковой структурой гидроксиариль-ного фрагмента замена ионогенной группы неоднозначно отражалась на изменении значений ГО50. Так, для орто-незамещенных производных величина ГО50 возрастала в ряду сульфонат 207 < тиосульфат 171 « хлорид изотиурония 109а, при появлении в молекулах двух трет-бутильных заместителей картина менялась кардинально - наибольшую токсичность в отношении РК. рhosphoreum демонстрировал хлорид изотиурония 106а,

наименьшую - сульфонат 200. Следует заметить, что хлорид изотиурония 106а проявлял большую токсичность, чем сульфонат 200 и тиосульфат 168 и в отношении Escherichia coli [192].

В целом, полученные результаты свидетельствовали о структурно-зависимом влиянии исследованных соединений на биолюминесценцию Ph. phosphoreum. Однако принципиальное значение имел вопрос о возможности экстраполяции этих данных на токсичность синтезированных производных в отношении животных организмов.

Острую токсичность синтезированных соединений изучали в НИИ фундаментальной и клинической иммунологии и в лаборатории фармакологических исследований Новосибирского института органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН. Средние летальные дозы LD50 определяли на мышах-самцах линии С57В1/6 при однократном внутрибрюшинном введении по [436].

Согласно полученным результатам (таблица 6-3) синтезированные нами тиосуль-фаты и сульфонаты характеризовались величинами LD50 в диапазоне от 150 до 1000 и от 275 до 3000 мг/кг, соответственно; в ряду исследованных натриевых солей тиоэтано-вых кислот LD50 изменялась от 200 до 950 мг/кг, а для солей изотиурония данный показатель принимал более низкие значения - от 30 до 600 мг/кг. Большая часть синтезированных соединений по классификации К. К. Сидорова [437] относится к 4 классу токсичности («малотоксично») и только пространственно-экранированные соли изотиурония 106а, 120а и 158a классу («умеренно токсично»), а орто-незамещенный и диметилза-мещенный сульфонаты (207 и 206, соответственно) - к 5 классу («практически нетоксично»).

Следует отметить, что описанные ранее гидрофильные производные 3-(4-гидроксиарил)пропильного ряда, содержащие в качестве полярных фрагментов алки-ламмонийные группы, характеризуются величинами LD50 от 45 до 125 мг/кг [193]. Таким образом, в настоящей работе нами были синтезированы гидрофильные антиокси-данты, которые выгодно отличаются от предложенных ранее сниженным токсическим влиянием на живые организмы.

Анализ данных таблицы 6-3 позволяет заключить, что токсическое воздействие синтезированных соединений на лабораторных животных, как и на Ph. phosphoreum, носило структурно-зависимый характер. При этом вариации в строении синтезированных соединений отражались на степени их токсического воздействия на бактериальные

Таблица 6-3. Острая токсичность гидрофильных производных алкилфенолов

общей формулы: сж

я Я1 Я2 Яз Я4 Номер ЬБзо, мг/кг Класс токсичности

н ¿-Би н (СШ)з88ОзШ ¿-Би 168 175 4

н Ме н (СШ)з88ОзШ Ме 170 1000 4

н Су н (СШ)з88ОзШ Су 169 з20 4

н н н (СШ)з88ОзШ н 171 800 4

н н н (СШ)з88ОзШ ¿-Би 174 450 4

н н н (СШ)з88ОзШ Су 178 з00 4

н Ме н (СШ)з88ОзШ ¿-Би 172 288 4

Ме н н (СШ)з88ОзШ н 176 975 4

н ¿-Би н (СШ)з8(СШ)288ОзКа ¿-Би 182 280 4

н ¿-Би н ¿-Би (СШ)з88ОзШ 183 150 4

н он 8(СШ)288ОзШ ¿-Би ¿-Би 184 180 4

н ¿-Би н (СШ)з8О№ ¿-Би 200 275 4

н Ме н (СШ)з8О№ Ме 206 з000 5

н Су н (СШ)з8О№ Су 169 425 4

н н н (СШ)з8О№ н 207 1800 5

н н н (СШ)з8О№ ¿-Би 208 860 4

н н н (СШ)з8О№ Су 209 зб5 4

н Ме н (СШ)з8О№ ¿-Би 210 750 4

Ме н н (СШ)з8О№ н 176 1225 5

н ¿-Би н (СШ)з8С(№)2С1 ¿-Би 106а з0 з

н н н (СШ)з8С(№)2С1 ¿-Би 111а 112 4

н Ме н (СШ)з8С(№)2С1 Ме 108а 110 4

н н н (СШ)з8С(№)2С1 н 109а 175 4

Ме н н (СШ)з8С(№)2С1 н 114а 600 4

н ¿-Би н (Сн2)з8С(КИМе)2С1 ¿-Би 120а 50 з

н ¿-Би н (Сн2)з8(Сн2)28С(КИ2)2С1 ¿-Би 158а з0 з

н ¿-Би н (СШ^СШСООШ ¿-Би 294 200 4

н Ме н (СШ^СШСООШ Ме 297 950 4

н н н (СШ^СШСООШ н 298 900 4

н ¿-Би н (Сн2)з8е(Сн2)2СООКа ¿-Би 302 500 4

культуры и лабораторных грызунов сходным, но не вполне идентичным образом. Так, для всех изученных вариантов орто-замещения в ряду 4-пропилфенолов с различными ионогенными фрагментами значения LD50 изменялись единообразно: хлорид изотиурония « тиосульфат ~ тиоэтаноат < сульфонат. Независимо от природы ионогенного фрагмента в пара-заместителе снижение пространственной затрудненности фенольного гидроксила при удалении трет-бутильных заместителей или их последовательном замещении на метильные группы или при переходе от ди-трет-бутильного замещения к дициклогексильному неизменно сопровождалось снижением токсических свойств.

Данный результат входит в определенное противоречие с известными представлениями о большей безопасности пространственно-затрудненных фенолов в сравнении с менее экранированными аналогами [185]. Так, по данным [14] LD50 для незамещенного фенола составляет 436 мг/кг, для изомерных диметилфенолов - 809-1140 мг/кг, для 2,6-ди-трет-бутил-4-алкилфенолов - 5800-10000 мг/кг. Однако все эти алкилфенолы являются гидрофобными соединениями, и потому их низкая токсичность может быть связана с их малой растворимостью в биосредах живых организмов. В подтверждение этому токсичность алкилированных фенолов обычно снижается при увеличении их массы и липофильности. В частности, установлено, что величины LD50 возрастают при переходе от ионола к его 4-этилзамещенному гомологу, а так же при переходе от одноядерных фенолов к бис-фенолам (таблица 6-1).

Синтезированные нами ФАО гидрофильны и обладают достаточно высокой растворимостью в биосредах независимо от степени пространственной экранированности фенольной группы. Этот фактор, очевидно, является решающим для изменения характера зависимости степени выраженности их токсических свойств от числа и объема ал-кильных заместителей в сравнении с липофильными аналогами.

Наименьшей токсичностью в ряду орто-ди-трет-бутилзамещенных соединений характеризовался селенотиопропионат 302 c LD50 равной 500 мг/кг. Ди-трет-бутилзамещенные тиосульфаты - изомеры 168 и 183 и их пирокатехиновый аналог 184, несмотря на различия в строении, характеризовались близкими величинами LD50 (150180 мг/кг).

Введение тиометиленовой вставки в пара-заместитель при переходах от 168 к 182 и от 106а к 158a отражалось на острой токсичности соединений, точно таким же образом, как и на их способности тушить биолюминисценцию Ph. Phosphoreum, - несколько

снижало токсичность тиосульфата 182 и не влияло на токсические свойства хлорида изотиурония 158a.

В результате соотнесения значений ЬБбо и ГО50 для исследованных тиосульфатов и хлоридов изотиурония нами были выявлены две реакционные серии, в пределах которых указанные величины надежно коррелируют друг с другом (рисунки 6-2 и 6-3).

"Ё1000-1

О ^ 800

600-

400-

200

ЬБ50 = 144 + 161ГО50 г = 0.94

ГО50, мМ

Рисунок 6-2. Зависимость между величинами LD50 и Ю50 для S-[ю-(гидроксиарил)-

алкил]тиосульфатов натрия

0

0

1

2

3

4

5

6

-

600

3 500

400-

300200 100 0-

ЬБ = 17.9 + 0.8ГО

50 50

г = 0.98

—I—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I

0 100 200 300 400 500 600 700

1Б , мМ

50'

Рисунок 6-3. Зависимость между величинами LD50 и Ю50 для хлоридов S-[ю-(4-гидроксиарил)алкил]изотиурония

С использованием корреляционного уравнения, выведенного по экспериментально измеренным величинам LD50 и ID50 для тиосульфатов 168, 170, 169, 174, 172, 176, 182 и 183, рассчитывали значения LD50 для соединений 171 и 178 по известным ID50. Вычисленные значения LD50 составили 627 и 286 мг/кг, соответственно, что удовлетворительно совпало со значениями, определёнными впоследствии экспериментальным путём - 800 и 300 мг/кг. Следует отметить, что данный подход позволил уменьшить число лабораторных животных, вовлеченных в эксперимент по определению LD50 для тиосульфатов 171 и 178.

6.2. Исследование биоантиоксидантных свойств синтезированных

соединений in vitro

Способность синтезированных соединений ингибировать развитие окислительного стресса в живых организмах первоначально изучали в различных модельных системах in vitro, где интенсивность свободнорадикального окисления индуцировали под действием химических агентов (солей металлов переменной валентности, добавок пе-роксида водорода) или ферментативных реакций.

В таблице 6-4 представлены результаты сравнительного исследования биоантиоксидантных свойств тиосульфатов 168, 174, 171 и 176 и соответствующих сульфонатов 200, 208, 207 и 211 с различным числом трет-бутильных заместителей [365, 413, 438, 439]. В экспериментах оценивали влияние указанных соединений на окисление выделенных липопротеидов низкой плотности (ЛНП) под действием солей металлов переменной валентности (5 мкМ CuSO4, 25 мкМ FeSO4; система 1) и на генерацию активированных кислородных метаболитов (АКМ), стимулированными нейтрофилами крови ("дыхательный взрыв"), включая изменение активности гранулоцитов в образцах цельной крови при стимуляции зимозаном (система 2), образование пероксинитрит-аниона (ONOO) при разложении морфолиносиднонимина (система 3) и ингибирование супероксидного ион-радикала в системе "люцегинин - ксантиноксидаза - ксантин" (система 4). За интенсивностью окисления следили по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), флуоресцентным методом (система 1) или по уровню люминол/люцигенин/-зависимой хемилюминесценции (системы 2-4).

Таблица 6-4. Антиокислительная активность некоторых тиосульфатов и сульфонатов

3-(4-оксиарил)пропильного ряда (Ю50, мкМ)

Антиоксидант Система 1 Система Система Система

Формула Я Я1 Я2 номер Си2+ Бе2+ 2 3 4

сж Н Г-Би Г-Би 168 10 1.5 123 10.7 1044

Н Г-Би Н 174 30 18 525 9.7 1214

V Н Н Н 171 400 380 27 2.9 577

^^ БОзМа

о Ме Н Н 176 11800 >1х106 74 16.5 1285

СЖ I Н Г-Би Г-Би 200 15 3.6 631 24.7 207

Н Г-Би Н 208 43 32 1170 10.1 1064

у Н Н Н 207 2770 2650 214 5.9 2878

Ме Н Н 211 Дозозависимое стимулирование

Фенозан калия 77 13 1.8 800 21.3 1170

Об эффективности исследованных антиоксидантов судили по концентрации, обеспечивающей 50 %-ное ингибирование окислительных процессов (ГО50).

Согласно полученным данным, все исследованные соединения, за исключением анизольного сульфоната 211, в той или иной степени подавляли интенсивность окислительных процессов во всех рассматриваемых системах. При этом способность соединений ингибировать окислительную модификацию ЛНП при последовательном удалении трет-бутильных орто-заместителей как в ряду тиосульфатов 168 - 174 - 171, так и сульфонатов 200 - 208 - 207 существенно снижалась. В системах 2-4 столь же явно выраженной зависимости между ингибирующим действием исследованных соединений и степенью пространственного экранирования фенольной ОН-группы не наблюдалось. Вместе с тем, в модельных системах 1-3 исследованные сульфонаты демонстрировали более низкую АОА, чем соответствующие им тиосульфаты, что, по всей видимости, связано с противопероксидной активностью тиосульфатных групп, поскольку свечение люминола, как известно, инициируется пероксидом водорода и пероксинитритом [15]. Во всех случаях для достижения полуингибирования окисления требовались большие концентрации фенозана калия, нежели тиосульфата 168, что так подтверждает наличие интеграции противоокислительного действия фенольного и тиосульфатного фрагментов данного соединения.

Биоантиоксидантные свойства тиосульфата 168 и сульфонатов с ди-трет-бутильным, дициклогексильным и диметильным орто-замещением (200, 205 и 206, соответственно) оценивали и по их влиянию на выживаемость штаммов E. coli дикого типа (АВ1157) и дефектного по генам ферментов репарации окислительных повреж-дений (ВН910) при обработке H2O2. В линейке исследованных соединений, наиболее эффективным оказался диметилфенол 206, который в отношении обоих штаммов существенно превосходил тролокс по защитному действию (в 1.2 раза в отношении АВ1157 и в 5.2 раза в отношении ВН910). Тиосульфат 168 не уступал тролоксу по защитному эффекту только в случае штамма дикого типа, но на обоих штаммах демонстрировал лучшие результаты, чем соответствующий ему по строению сульфонат 200 [192].

Влияние галогенидов изотиурония различного строения на окисление выделенных ЛНП проводили в различных концентрациях в сравнении с гидро- и липофильными аналогами. В результате было установлено, что все исследованные соединения проявляют выраженную АОА уже в концентрации 1-5 мкМ (таблица 6-5), при этом во всем диапазоне исследованных концентраций (1-100 мкМ) для липо- и гидрофильных соединений наблюдалась сходная, отличная от линейной, зависимость ингибирующего эффекта от концентрации (рисунок 6-4).

Щ 0 20 40 60 80 100

К

Концентрация, мкМ

Рисунок 6-4. Зависимость степени накопления ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) при окислении ЛНП от концентрации антиоксидантов: 1 - 294, 2 - ионол, 3 - 106а, 4 - 163, 5 - пробукол, 6 - фенозан калия 77, 7- 108а

Таблица 6-5

Влияние антиоксидантов на накопление ТБК-реактивных продуктов в ЛНП (5 мкМ CuSO4, 37 оС)

Степень ингибирования накопления ТБК-РП, % ГО50,

Формула Rl R2 П X Шифр 1 мкМ 5 мкМ 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ мкМ

t-Bu t-Bu 3 sc(NH2)2а 106а 38 62 72 86 93 3.0

t-Bu Me 3 SC(NH2)2Br 113Ь 31 47 68 67 73 5.5

Me Me 3 sc(NH2)2a 108а 8 30 38 49 65 51.8

t-Bu t-Bu 1 SC(NH2)2Br 115Ь 6 26 34 63 79 33.0

"«ЧА, t-Bu t-Bu 3 SC(NH2)2I 106с 31 53 64 69 72 4.7

t-Bu t-Bu 3 s(cн2)2SC(NH2)2a 158а 28 50 60 68 72 5.7

1 ^ п t-Bu t-Bu 3 SC(NMe2)2I 121с 0 42 57 63 68 9.1

t-Bu t-Bu 3 SCH2COONa 294 24 61 81 95 100 3.6

t-Bu t-Bu 2 COOK 77 11 46 54 60 64 7.5

t-Bu t-Bu 1 H ионол 34 60 80 89 93 3.4

1-Ви но^ © "3 МН2 С1 123 3 36 50 56 65 12.5

1 © из мн2 а

1-Ви но—(/ \-х 1-Ви SC(Me2)S пробукол 37 49 62 65 71 5.5

1-Ви (^2^(^2)3 163 36 46 62 68 78 6.1

ю 4

На всех взятых для исследования концентрациях наиболее эффективно накопление ТБК-реактивных продуктов окисления ингибировали хлорид изотиурония 106а и тиоэтаноат натрия 294, которые по АОА не уступали ионолу и превосходили все прочие реперные антиоксиданты - пробукол, 163 и фенозан калия 77. В ряду галогенидов изотиурония 106а - 113Ь - 108а при снижении степени пространственного экранирования фенольного гидроксила в результате замены трет-бутильных орто-заместителей на ме-тильные происходило снижение ингибирующей активности. В то же время введение в молекулу 106а сульфидной группы при переходе к 158а, К-метильных заместителей и/или замена хлорид-иона на иодид при переходе к 121с и 106с не способствовало увеличению способности изотиурониевых соединений ингибировать окисление ЛНП.

Медь-стимулированное окисление ЛНП широко используется в медико-биологических исследованиях для тестирования препаратов на биоантиоксидантные свойства, а так же антиатерогенную активность, поскольку эффективное ингибирование свободнорадикального окисления ЛНП в организме является важным механизмом подавления атерогенеза [12]. Вместе с тем, данный метод в классической постановке имеет существенные недостатки: во-первых, ЛНП, полученные от разных групп здоровых доноров, отличаются по составу и окисляемости, и как следствие параметры ГО50, полученные на разных партиях ЛНП для одних и тех же соединений, существенно разнятся по своим значениям; во-вторых, - для определения ГО50 традиционно проводят окисление ЛНП в присутствии трех различных концентраций исследуемого вещества (обычно 1, 10 и 100 мкМ), а затем аппроксимацией к линейной функции находят значение 1С50. Между тем, зависимость эффективности ингибирования окисления ЛНП от концентрации АО не носит строго линейного характера (рисунок 6-4) и, как следствие, значения 1С50 определяются со значительной ошибкой.

Нами был запатентован [440] усовершенствованный вариант данного метода, позволяющий сократить трудоемкость и повысить воспроизводимость получаемых результатов: предложено оценивать АОА не по величине ГО50, а по длительности лаг-фазы (периода индукции) окисления ЛНП на заданной концентрации (1 мкМ) в единицах активности ионола. Результаты оценки АОА ряда синтезированных нами соединений и ре-перных биоантиоксидантов с использованием такого подхода представлены в таблице 66.

Таблица 6-6. Влияние некоторых фенольных антиоксидантов на период индукции окисления ЛНП (5 мкМ CuSO4, 1мкМArOH, 37 оС)

Антиоксидант Период индукции

Формула R n X Шифр Минут Отн. ед.

R t-Bu 1 H ионол 68.3 1.00

hoyS t-Bu 3 SSO3Na 168 65.5 0.96

H t-Bu 3 2 SSO3Na COOK 174 77 14.1 5.0 0.21 0.07

t-Bu t-Bu НО—^ \-X-¿ \—OH t-Bu t-Bu SC(Me2)S (CH2>S(CH2> (CH2>Se(CH2> (CH2>Te(CH2> пробукол 163 193 289 31.4 47.7 75.0 157.0 0.46 0.70 1.10 2.30

Полученные данные подтверждают, что пространственно-экранированный тиосульфат 168 является эффективным ингибитором Cu^-зависимого окисления ЛНП: по противоокислительному действию он практически не отличался от ионола и существенно превосходил фенозан калия 77. Снижение экранированности фенольной группы при переходе от 168 к его моно-трет-бутил-замещенному аналогу 174 сопровождалось резким снижением АОА.

т-ч *J *J *J *J

В рассматриваемой модельной системе известный гиполипидемический препарат пробукол уступал по эффективности тиофану, замена атома серы в структуре последнего на селен и теллур приводила к росту АОА. В ряду исследованных антиоксидантов только селенид 193 и теллурид 289 превосходили по эффективности ионол. Способность синтезированных соединений защищать ЛНП от окисления свидетельствует о потенциальном наличии у них антиатерогенной активности [12].

6.3. Исследование биологической активности синтезированных

соединений in vivo

К настоящему времени известно более 200 заболеваний и патологических состояний, протекающих на фоне активации в живом организме процессов неферментативного окисления. Это так называемые свободнорадикальные патологии, в число которых вхо-

дят распространенные сердечнососудистые, воспалительные, нейродегенеративные, онкологические и эндокринные заболевания, в том числе внесенные ВОЗ в перечень ведущих причин смерти в мире. Не удивительно, что биологическую активность синтезированных соединений изучали на моделях именно таких патологий.

Одной из классических моделей свободнорадикальных патологий у животных является токсический гепатит, вызываемый введением тетрахлорметана: CCU метаболи-зируется в микросомах печени с образованием трихлорметильных радикалов, последние индуцируют процессы перекисного окисления липидов в мембранах и вызывают гибель гепатоцитов, что приводит к появлению в крови экспериментальных животных гепато-целлюлярных ферментов, в частности, аланин- и аспартатаминотрансфераз (АЛАТ и АСАТ, соответственно) [14]. Синтезированные гидрофильные производные ю-(4-гидроксиарил)пропильного ряда с различными ионогенными фрагментами и разной степенью пространственного экранирования фенольной группы в условиях CCU-индуцированного токсического гепатита проявляли выраженную протекторную активность, что выражалось в достоверном снижении активности АЛАТ в сыворотке крови экспериментальных животных [411, 441]. При этом гидрофильные производные 2,6-ди-трет-бутилфенола тиосульфат 168 и хлорид изотиурония 106а превосходили по эффективности свои орто-незамещенные аналоги 171 и 109а, что соответствует различиям в противоокислительной активности данных соединений. Лучшие из исследованных ингибиторов (168 и 106а) так же превосходили по гепатозащитным свойствам фенозан калия и реперный препарат глутоксим (рисунок 6-5).

На модели CCl4-индуцированного гепатита выявлено наличие биоантиокси-дантной активности и у бензилтиоэтановой кислоты 252. В таблице 6-7 представлены результаты сравнительного исследования гепатопротекторных свойств ряда тиопроиз-водных на основе 2,6-диметилфенола, а также реперных соединений с трет-бутильным орто-замещением. В линейке исследованных соединений тиоэтановая кислота 252 демонстрировала лучший протекторный эффект, её введение в организм экспериментальных животных достоверно снижало выход из гепатоцитов АЛАТ и АСАТ, а также нормализовало показатели интенсивности окислительных процессов в гомогенате печени - снижало активность глутатионредуктазы и уровень ТБК-реактивных продуктов окисления и увеличивало содержание восстановленного глутатиона.

I II III

VII VIII IX

Рисунок 6-5. Активность АЛАТ в сыворотке крови мышей в норме (I), при ^Ь-индуцированном гепатите без антиоксидантной защиты (II) и на фоне протекторного действия сульфоната 200 (III),тиосульфата 168 (IV), хлорида изотиурония 106а (V), хлорида диэтиламмония 44g (VI), тиосульфата 171 (VII), хлорида изотиурония 109а (VIII), хлорида диэтиламмония 44i (IX), фенозана калия 77 (X)и глутоксима (XI).

3-(4-Гидрокси-3,5-диметилбензилтио)пропионат калия (293, он же антиоксидант ТФ-7) проявлял выраженную протекторную активность при токсических гепатитах, вызванных у мышей введением а-нафтилизотиоцианата и тетрациклина. Данные формы гепатита, в отличие от СС14-индуцированного, не вызывают выраженного цитолиза ге-патоцитов, а проявляются в большей степени в метаболических нарушениях. Протекторный эффект пропионата 293 проявлялся в снижении уровня накопления ТБК-реактивных продуктов, нормализации активности щелочной фосфотазы и каталазы в сыворотке крови экспериментальных животных (приложение 5).

В условиях рыбоводческого хозяйства обработка икры осетровых пропионатом 293 обеспечила повышение темпов развития и снижение гибели эмбрионов, повышение выживаемости личинок осетровых на стадии перехода к активному питанию (приложение 6).

Таблица 6-7. Влияние фенольных соединений (80 мг/кг, per os) на развитие С&4-индуцированного гепатита мышей линии С57В1/6

Соединение АЛАТ, ЕД/л АСАТ, ЕД/л GR, нмоль/мин мг белка GSH, мг/г белка ТБК-РП, нмоль/10 мг белка

Общая формула Ri R2 n X R Номер

R2 Me Me 1 S CH2COOH 252 2379 ± 284* 2496 ± 267* 24.9 ± 3.0* 8.83 ± 0.53* 8.54 ± 4.52*

Me Me 1 S С12Н25 315 4564 ± 520* 4690 ± 586* 37.3 ± 2.4 6.94 ± 0.62 12.4 ± 4.64

Me Me 1 S(O) С12Н25 336 5853 ±432* 5208 ± 606* 27.2 ± 3.2 6.93 ± 0.57 8.47 ± 3.24*

Me Me 1 S CH2CH2OH 337 7924± 816 7795± 712 21.3 ± 1.9* 9.92 ± 0.57* 6.44 ± 0.93*

t-Bu t-Bu 3 S С12Н25 309 6147± 778 6295 ± 743 24.5 ± 3.0* 7.42 ± 0.64 9.85 ± 3.53*

t-Bu H 0 O Me БОА 2925±381* 3507±413* 29.5 ± 2.5 6.65±0.44 10.38 ± 3.31*

Интактные животные 90 ± 2.4 117.2 ± 20.4 18.5 ± 1.3 10.7 ± 0.89 7.76 ± 0.83

Введение ССЦ 7463 ± 923 8030 ± 994 33.0 ± 2.8 6.31 ± 0.52 17.9 ± 3.12

Примечания: АЛАТ - аланинаминотрансфераза, АСАТ - аспартатаминотрансфераза, GR - глутатионредуктаза, GSH -восстановленный глутатион, ТБК-РП - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой; * - Р < 0.05 относительно контрольной группы с введением ССЦ

По данным [442], производные 2,6-диметилфенола, содержащие в пара-алкильном заместителе ионогенные группы -SSOзNa, -SOзNa, -SCH2COOK проявляли фунгистатическую активность в отношении микроскопических грибов, продуцирующих микотоксины в комбикормах, используемых при выращивании цыплят-бройлеров. Введение тех же антиоксидантов в рацион цыплят-бройлеров, подвергающихся интоксикации соединениями свинца и кадмия, препятствовало накоплению тяжёлых металлов в органах и тканях [443] и оказывало положительное влияние рост и развитие цыплят

[444].

Пространственно-экранированный тиосульфат 168 восстанавливал работу изолированного сердца крысы после получасовой ишемии миокарда до исходных значений

[445] и способствовал восстановлению иммунной системы мышей, подвергшихся облучению или введению циклофосфана [446].

Радиопротекторными свойствами наряду с тиосульфатом 168 обладает и его ди-метилзамещенный аналог 170 [447], оба соединения дозозависимо (в концентрациях 20200 мкг/мл) подавляли пролиферацию иммунокомпетентных клеток, что может быть ценно для подавления реакций отторжения трансплантатов и при аллергических заболеваниях, а так же уменьшали воспаление в почечной ткани мышей при иммунокомплекс-ном гломерулонефрите [447, 448].

Вместе с тем, тиосульфат 168 (200 мкг/мл) усиливал пролиферативную активность в культуре мононуклеарных клеток крови больных хроническим вирусным гепатитом С, что свидетельствует о возможном наличии у данного соединения противовирусной активности [137].

На модели каррагинан-индуцированного отёка (крысы) показано, что тиосульфа-ты 168, 174, 171 и сульфонаты 200, 208, 207 с различным числом трет-бутильных заместителей обладают противовоспалительной активностью, однако между степенью выраженности последней и противоокислительными свойствами исследованных соединений прямой корреляции не наблюдалось [413]. В ряду исследованных соединений лучшим противовоспалительным агентом оказался тиосульфат 174 с одним трет-бутильным орто-заместителем, получивший впоследствии известность под названием «ТС-13», - он превзошел по эффективности действия, как свои структурные аналоги, так и реперные препараты - фенозан калия и аспирин (рисунок 6-6).

70 -i

60-

в 50

cö Ч cö

s 40 4

£

ю о

н о о а к

а 20

с:

30-

10-

0

12345 6789 10

Рисунок 6-6. Влияние фенольных соединений на выраженность воспалительной реакции: 1 - контроль, 2 - 168, 3 - 171, 4 - 174 , 5 - 200, 6 - 207, 7 - 208, 8 - 211, 9 - фенозан калия 77, 10 - аспирин (* достоверное отличие от контроля, Р < 0.05)

Высокая противовоспалительная активность тиосульфата 174 была подтверждена в условиях острого асептического и хронического воспаления [449, 450, 451, 452]. Обнаружено, что внутрижелудочное введение крысам раствора соединения 174 (100 мг/кг массы тела) приводит к существенному снижению выраженности острого асептического воспаления, индуцированного внутривенной инъекцией суспензии частиц зимозана -уменьшению содержания гранулоцитов в крови и генерации ими АКМ, а также объемной плотности инфильтратов в печени. Однократное назначение раствора тиосульфата 174 (200 мг/кг массы тела) способствовало увеличению выживаемости мышей, у которых моделировали эндотоксиновый шок путем внутрибрюшинного введения раствора липополисахарида E. coli. При ревматоидно-подобном полиартрите, индуцированным гетерологичным коллагеном, тиосульфат 174 уменьшал выраженность клинических признаков воспаления лишь на ранних стадиях, но ингибировал генерацию H2O2 моноцитами и, отчасти, нейтрофилами крови.

Тиосульфат 174 и мексидол с одинаковой эффективностью ингибировали развитие окислительного стресса, обусловленного повреждением суставного хряща у экспериментальных животных. При этом тиосульфат 174 проявлял выраженное хондропро-текторное действие: его применение обеспечивало формирование полноценного органо-

типического регенерата в процессе посттравматической регенерации хрящевой ткани. Для мексидола аналогичной активности не выявлено [453].

В дополнительных исследованиях было установлено, что в рядах структурно-родственных тиосульфатов 168, 174, 171, 176 и сульфонатов 200, 208, 207, 211 противовоспалительная активность тесно связана с их способностью усиливать транскрипцию GSTP1 - гена, кодирующего глутатион^-трансферазу P1. При этом тиосульфат 174 оказался единственным соединением, которое на различных концентрациях превосходило по эффективности классический индуктор ARE трет-бутилгидрохинон (таблица 6-8). Так было продемонстрировано, что противовоспа-лительная активность тиосульфата 174, основана на его способности индуцировать экспрессию генов, контролируемых ан-тиоксидант-респонсивным элементом (ARE), кодирующим белки, участвующие в воспалительном процессе [453, 454, 455, 456]. Следует заметить, что биологические эффекты фенольных соединений в организме довольно часто определяются их регуляторным действием, а не антиокислительными свойствами, это справедливо даже для такого классического АО, как а-токоферол [457, 458], при этом редоксчувствительные транскрипционные факторы, включая ARE, являются важной мишенью действия экзогенных фенольных антиоксидантов [459].

Таблица 6-8. Уровень экспрессии гена GSTP1 в клетках HepG2, обработанных исследуемыми фенольными антиоксидантами

Антиоксидант Концентрация, мкМ

Формула R R1 R2 шифр 10 20 50 100