Гибридные биокатализаторы с регенерацией NADPH на основе формиатдегидрогеназы и монооксигеназ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Паршин Павел Дмитриевич

• Паршин Павел Дмитриевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Паршин Павел Дмитриевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Мультиферментные системы

2.1.1. Общие сведения

2.1.2. Системы гибридных белков

2.2. Ферментативные системы регенерации NAD(P)H/NAD(P)+

2.2.1. Общие сведения

2.2.2. Ферменты, используемые для регенерации NAD(P)H

2.2.3. Ферменты, используемые для регенерации NAD(P)+

2.3. Формиатдегидрогеназа

2.3.1. Общие сведения

2.3.2. Структура формиатдегидрогеназ

2.3.2.1. Анализ аминокислотной последовательности

2.3.2.2. Пространственная структура

2.3.3. Основные свойства

2.3.4. Белковая инженерия

2.3.5. Применение формиатдегдрогеназ

2.4. Фенилацетонмонооксигеназа из Thermobifida fusca (PAMO)

2.4.1. Общие сведения

2.4.2. Белковая инженерия

2.4.2.1. Коферментная специфичность

2.4.2.2. Субстратная специфичность

2.4.2.3. Другие направления белковой инженерии

2.4.3. Системы гибридных белков на основе PAMO

2.4.4. Применение PAMO

2.5. Цитохром P450 из Bacillus megaterium (P450 BM3)

2.5.1. Общие сведения

2.5.2. Структура P450 BM3

2.5.3. Основные свойства и физиологическая роль P450 BM3

2.5.4. Белковая инженерия

2.5.5. Бифункциональные системы гибридных белков на основе P450 BM3

2.5.6. Применение P450 BM3

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.2. Методы

3.2.1. Создание генетических конструкций

3.2.1.1. Создание генетических конструкций PseFDH

3.2.1.2. Создание генетических конструкций PAMO

3.2.1.3. Создание генетических конструкций систем гибридных белков на основе PAMO и FDH

3.2.1.4. Создание генетических конструкций систем гибридных белков на основе BM3 и FDH

3.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля

3.2.4. Трансформация клеток Е.соН

3.2.5. Выделение плазмидной ДНК

3.2.6. Секвенирование ДНК

3.2.7. Экспрессия систем химерных белков и свободных ферментов

3.2.8. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях

3.2.9. Выделение и очистка ферментов

3.2.10. Анализ препаратов ферментов с помощью MALDI-масс-спектрометрии

3.2.11. Определение концентраций ферментов

3.2.12. Определение активностей ферментов

3.2.13. Изучение кинетики термоинактивации

3.2.14. Изучение термостабильности с помощью ДСК

3.2.15. Изучение конверсии миристиновой кислоты методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии

3.2.16. Изучение конверсии Р-ионона методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии

3.2.17. Изучение конверсии бензилацетона методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии

3.2.18. Компьютерное моделирование структур ферментов

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Влияние His6 на свойства бактериальной формиатдегидрогеназы

4.1.1. Получение мутантных FDH с His6

4.1.2. Экспрессия мутантных FDH с His6

4.1.3. Очистка FDH с различным расположением His6

4.1.4. Каталитические характеристики FDH с различным расположением His6

4.1.5. Температурная стабильность FDH с различным расположением His6

4.2. Влияние His6 на свойства PAMO

4.2.1. Получение вариантов PAMO с различным расположением His6

4.2.2. Очистка PAMO с различным расположением His6

4.2.3. Каталитические характеристики PAMO с различным расположением His6

4.2.4. Температурная стабильность PAMO с различным расположением His6

4.3. Системы гибридных белков на основе PAMO и FDH

4.3.1. Получение систем гибридных белков на основе PAMO и FDH с различным расположением ферментов

4.3.2. Очистка полученных систем гибридных белков

4.3.3. Свойства систем гибридных белков на основе PAMO и FDH

4.4. Системы гибридных белков на основе BM3 и FDH

4.4.1. Получение систем гибридных белков на основе BM3 и FDH с различным расположением ферментов

4.4.2. Очистка полученных систем гибридных белков

4.4.3. Кинетические характеристики формиатдегидрогеназной реакции систем гибридных белков на основе BM3 и FDH

4.4.4. Кинетические характеристики монооксигеназной реакции систем гибридных белков на основе BM3 и FDH

4.4.5. Конверсия органических субстратов системами гибридных белков на основе BM3 и FDH

4.5.6. Дизайн линкера и его влияние на свойства систем гибридных белков на основе BM3 и FDH

V. ВЫВОДЫ

VI. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BVMO - монооксигеназа Байера-Виллигера

BVMOs - монооксигеназы Байера-Виллигера

CHMO - циклогексанонмонооксигеназа

CPMO - циклопентанонмонооксигеназа

FAD - флавинадениндинуклеотид

FDH - формиатдегидрогеназа

FDHs - формиатдегидрогеназы

FMN - флавинмононуклеотид

GDH - глюкозодегидрогеназа

G6PDH - глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа

PseFDH - формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp

NAD+ - Никотинамидадениндинуклеотид, окисленный

NADH - Никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный

NADP+ - Никотинамидадениндинуклеотидфосфат, окисленный

NADPH - Никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленный

PAMO - фенилацетонмонооксигеназа из Thermobifida fusca

P450 - цитохром P450

P450 BM3 - цитохром P450 из Bacillus megaterium

PDB - база данных белковых структур (Protein Data Bank)

dNTP - дезоксирибонуклеотид трифосфат

ATP - аденозинтрифосфорная кислота

ТАК - теория активированного комплекса

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

Tris - трис(оксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гибридные биокатализаторы с регенерацией NADPH на основе формиатдегидрогеназы и монооксигеназ»

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Ферменты являются непревзойдёнными катализаторами как по активности, так и селективности. Поэтому они все более широко используются на практике - как в промышленности, медицине, диагностике, так и в научных исследованиях. Ярким примером являются NAD(P)+-зависимые оксидоредуктазы, использующие в качестве одного из субстратов восстановленную форму кофермента NAD(P)H. Например, самым крупномасштабным промышленным процессом ферментативного хирального синтеза является получение L-трет-лейцина с помощью лейциндегидрогеназы. Для снижения стоимости таких процессов в систему вводится второй фермент, переводящий образующийся в ходе основной реакции NAD(P)+ обратно в восстановленную форму. Одним из лучших ферментов, катализирующих вторую реакцию, является формиатдегидрогеназа (FDH, EC 1.2.1.2.). Однако абсолютное большинство природных FDH являются ферментами, высокоспецифичными к NAD+, но не к NADP+, что до недавнего времени не позволяло разрабатывать биокаталитические процессы с помощью NADP+-зависимых оксидоредуктаз.

В нашей лаборатории проводятся систематические исследования формиатдегидрогеназ из разных источников. Было показано, что FDH из бактерии Pseudomonas sp.101 (PseFDH) имеет высокую каталитическую активность и до сих пор остается наиболее стабильным ферментом среди всех описанных формиатдегидрогеназ. В 1993 г. впервые в мире с помощью метода рационального дизайна была получена первая версия мутантной NADP+-зависимой PseFDH. Этот фермент был успешно испытан в различных биокаталитических процессах, включая стереоспецифическое гидроксилирование по реакции Байера-Виллигера. Работы по инженерии этого фермента были продолжены и в настоящее время в нашем распоряжении имеется версия мутантной NADP+-специфичной PseFDH, которая по своим параметрам превосходит все известные описанные аналоги, полученные в других лабораториях мира.

Монооксигеназы Байера-Виллигера (BVMO) катализируют реакцию окисления органических кетонов до соответствующих лактонов или сложных эфиров. Большим преимуществом является возможность проведения реакции в мягких условиях, так как они не требуют использования органических пероксидов и используют в качестве окислителя молекулярный кислород. Использование BVMO позволяет проводить реакцию с очень высокой регио- и стереоселективностью и выходом целевого продукта более 98-99%. Кроме того, ферменты данного семейства способны окислять не только кето-группы, но и различные гетероатомы, такие как сера, азот, фосфор, бор или селен.

Одним из особенно интересных представителей семейства BVMO является фенилацетонмонооксигеназа из Thermobifida fusca (PAMO), которая обладает уникальной для фермента данного семейства температурной стабильностью. PAMO, как и все остальные BVMO является NADP+^ависимой монооксигеназой, поэтому несмотря на уникальность данного фермента проблема регенерации кофактора остается актуальной. В случае BVMO кроме FDH для регенерации NADPH используется фосфитдегидрогеназа (PTDH), вторым продуктом которой является фосфат-ион. Однако, наш фермент обладает рядом весомых преимуществ по сравнению с PTDH. Например, продукт реакции FDH -углекислый газ (бикарбонат), в отличие от фосфат-иона легко отделяется при очистке конечного продукта.

Другим перспективным кандидатом на создание биокатализатора с использованием FDH для регенерации NADPH является монооксигеназа CYP102A1 из Bacillus megaterium (цитохром P450 BM3). Данный фермент является гем-содержащей NADP+^ависимой монооксигеназой, способной катализировать ю- гидроксилирование жирных кислот. P450 BM3 является уникальным представителем своего семейства благодаря самым высоким каталитическим константам. Кроме того, данный фермент является природным фьюжн-ферментом, что обуславливает его растворимость и добавляет привлекательности в качестве кандидата для использования в биотехнологических процессах. Достижения белковой инженерии последних лет позволили получить мутантные формы P450 BM3 со значительно расширенной субстратной специфичностью, которые способны катализировать гидроксилирование строительных блоков лекарственных соединений, молекул терпеновой природы и ксенобиотиков.

Ферменты, созданные природой, имеют ограничения по своей активности. Поэтому для создания новых более эффективных биокатализаторов разрабатываются новые методы и подходы. Одним из таких подходов является создание гибридных ферментов, в которых с помощью специального линкера в одну полипептидную цепь объединены два (а иногда и более) фермента. Создание подобных систем может приводить к увеличению каталитической эффективности системы в целом за счёт пространственного сближения активных центров. Для фундаментальной науки изучение подобных систем представляет интерес за счет возможности изучения эффекта туннелирования субстрата, который становится возможным при сближении активных центров и их фиксации в пространстве. Этот эффект обусловлен снижением диффузионных ограничений и может приводить к значительному повышению каталитической эффективности системы в целом. Последнее обуславливает интерес к изучению подобных систем не только с точки зрения

фундаментальной биохимии, но и с точки зрения прикладной биотехнологии. Исследованиям в данной области и посвящена данная работа.

Степень разработанности темы. В случае формиатдегидрогеназы в литературе имеются примеры получения слитых белков FDH с тремя оксидоредуктазами. Однако все эти гибридные белки были получены с NAD+-, но не NADP+-зависимыми FDH, а второй фермент был дегидрогеназой (не монооксигеназой), не содержащей в активном центре простетической группы. Слитые белки имели полипептидную цепь не более 800 аминокислотных остатков. В случае PAMO и цитохрома P450 BM3 слитые белки были получены с фосфитдегидрогеназой.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является получение и изучение свойств систем гибридных белков на основе PseFDH и двух различных монооксигеназ (PAMO и P450 BM3).

Задачи исследования:

- Изучение влияния и расположения последовательности из шести аминокислотных остатков гистидина на свойства формиатдегидрогеназы;

- Изучение влияния и расположения последовательности из шести аминокислотных остатков гистидина на свойства фенилацетонмонооксигеназы;

- Получение и изучение гибридных белков на основе PseFDH и PAMO с различным расположением ферментов друг относительно друга;

- Получение и изучение гибридных белков на основе PseFDH и P450 BM3 с различным расположением ферментов друг относительно друга и различными линкерными последовательностями;

- Изучение влияния типа используемой для регенерации кофактора PseFDH на свойства гибридных белков на основе монооксигеназ.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы были проведены систематические исследования по получению и изучению свойств двух гибридных белков на основе PseFDH и РАМО или Р450 ВМ3. Изучено влияние положения метки His6 на уровень экспрессии и свойства. Получены модельные структуры полноразмерного Р450 ВМ3, а также различных вариантов гибридов PseFDH с РАМО или Р450 ВМ3 с гистидиновой меткой. Впервые получены и изучены бифункциональные системы гибридных белков на основе (PseFDH + РАМО) и (PseFDH + Р450 ВМ3). В случае (PseFDH + Р450 ВМ3) полученные гибридные белки представляли собой активные гомоолигомеры с субъединицей из 1400 аминокислотных остатков, содержащей четыре домена с различной каталитической активностью. Проведен дизайн линкера полученных систем. Показано, что

все полученные системы гибридных белков обладают свойствами не хуже, чем смесь соответствующих ферментов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в данной работе, важны для понимания влияния наличия гистидиновой метки на свойства ферментов. Полученные результаты могут быть использованы для получения других мультиферментных систем на основе PseFDH с гистидиновой меткой. Изучение влияния расположения гистидиновой метки на свойства фенилацетонмонооксигеназы позволило получить вариант фермента, обладающего в несколько раз большим выходом экспрессии в клетках E.coli. Получены системы гибридных белков на основе PseFDH и P450 BM3, демонстрирующие в 4-6 раз большую активность в процессе гидроксилирования миристиновой кислоты.

Методология и методы исследования. В рамках данной работы были использованы следующие методы и подходы: биоинформатика (конструирование праймеров, моделирование расположения гистидиновой метки); методы генетической инженерии (полимеразная цепная реакция, рестрикция, лигирование, выделение ДНК, получение плазмид); микробиологические методы и методы молекулярной биологии (трансформация, экспрессия в клетках E.coli); хроматографические методы (аффинная хроматография, гель-фильтрация), аналитические методы изучения физико-химических свойств ферментов (спектрофотометрия, ГХ/МС).

Вклад автора в проведенное исследования. Все научные результаты, изложенные в диссертации, получены при личном участии Паршина Павла Дмитриевича под руководством проф., д.х.н. Тишкова Владимира Ивановича и д.х.н. Пометун Анастасии Александровны.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наличие аминокислотной последовательности из шести аминокислотных остатков гистидина на N-конце не оказывает значительного влияния на свойства формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101.

2. Вариант фенилацетонмонооксигеназы из Thermobifida fusca с гистидиновой меткой на N-конце аминокислотной последовательности обладает в 3-5 раз большим уровнем экспрессии и в 3-4 раза большей температурной стабильностью, по сравнению с ферментами, содержащими гистидиновую метку на С-конце.

3. Объединение PseFDH и PAMO в гибридный белок не оказывает значительного влияния на эффективность конверсии бензилацетона.

4. Объединение PseFDH и P450 BM3 в гибридный белок приводит к увеличению каталитической эффективности процесса окисления миристиновой кислоты в 4-6 раз. Системы гибридных белков с расположением PseFDH на N-конце аминокислотной последовательности обладают большей каталитической эффективностью, по сравнению с системами, где на N-конце расположен P450 BM3. Тип и длина линкера не оказывают влияния на каталитические характеристики гибридных белков.

5. Тип используемой формиатдегидрогеназы не оказывает влияния на каталитические характеристики гибридных белков.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность данных экспериментов обеспечена использованием современных методов исследования, проведением ряда независимых экспериментов с использованием положительных и отрицательных контролей. Все эксперименты проводили на сертифицированном оборудовании в трех и более независимых повторах. Для анализа данных использовали современные методы статистической обработки.

Основные результаты работы были представлены на международных конгрессах и конференциях: 44th FEBS Congress (Краков, Польша, 2019), International conference NANO-2019 (Кишинев, Республика Молдова, 2019) International conference Biotrans 2019 (Гронинген, Нидерланды, 2019), International Conference "Biocatalysis: Fundamentals and Applications", (Истра, 2017; С.-Петербург, 2019 ), VI Съезд Биохимиков России (Дагомыс, Сочи, Россия, 2019), XXI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science и Scopus, 4 тезиса докладов в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science и Scopus, и 10 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 147 страницах и содержит 60 рисунков, 36 таблиц и 223 ссылки.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Мультиферментные системы

2.1.1. Общие сведения

За последние несколько десятилетий активное изучение ферментов привело к их широкому использованию в самых различных областях промышленности [1]. В индустрии на данный момент в основном используются процессы с одним ферментом, однако, так как в природе многие процессы катализируются сложными ферментативными комплексами [2], в последние годы проводится множество исследований систем, состоящих из нескольких ферментов [3]. За счет пространственного сближения ферментов и их фиксации в пространстве друг относительно друга, можно добиться большого количества положительных эффектов. Например, при проведении линейных каскадных реакций подобный подход позволяет не проводить стадии выделения и очистки промежуточных соединений, что значительно сокращает время и трудоемкость процесса. Кроме того, нестабильные и/или токсичные промежуточные соединения не накапливаются в системе, а сразу используются в следующем процессе, что делает процесс безопаснее в целом и уменьшает вероятность побочных реакций. В случае обратимых реакций, использование нескольких ферментов может использоваться для смещения равновесия в сторону продуктов реакции [4].

Катализируемые каскадные реакции могут иметь не только линейный вид, но и циклический. Например, если фермент использует кофактор в качестве переносчика электронов, мультиферментная система может содержать второй фермент, катализирующий сопряженную реакцию окисления/восстановления кофактора. На данном принципе основаны ферментативные системы регенерации NAD(P)H. Данный подход может использоваться не только для циклического восстановления кофактора, что значительно понижает стоимость процесса, но и для получения второго продукта.

Подобные системы широко распространены в живых организмах. Было изучено, что высокоточная организация мультиферментных комплексов может приводить к повышению локальной концентрации ферментов и их субстратов, увеличивать эффективность работы ферментов за счет сокращения времени диффузии молекулы субстрата между активными центрами ферментов и, как следствие, уменьшать влияние конкурирующих процессов в клетке [5]. Существует несколько вариантов структурной организации таких систем. Одним из них является простое объединение нескольких ферментов с помощью большого количества нековалентных связей. Подобный подход реализуется в структуре a2ß2 триптофан синтазы из бактерии Salmonella typhimurium [6] и различных метаболонов [7].

Вторым типом организации является подход создания более прочных биомолекулярных каркасов, в которых ферменты иммобилизованы на поверхности различной природы (клеточные стенки, липидные слои, углеводородные цепи, нуклеиновые кислоты или другие пептидные структуры). По такому принципу устроены, например, ферментные комплексы в целлюлосомах [8].Третьим вариантом архитектуры систем из нескольких ферментов являются системы гибридных (химерных) белков. В данном методе два или более ферментов объединены в одну полипептидную цепь, чаще всего с помощью специальных линкерных последовательностей, которые способны обеспечить необходимое пространственное разделение молекул и оптимальную укладку структуры в целом. Таким образом устроены, например, ацетил-кофермент А карбоксилаза [9], пирролин-5-карбоксилат синтаза [10] и исследуемый в данной работе цитохром P450 из Bacillus megaterium [11]

Учитывая описанные выше преимущества мультиферментных систем, по сравнению с одиночными ферментами, легко объясняется повышенный интерес к искусственному созданию первых. Не смотря на огромный рывок в развитии методов компьютерного моделирования, конструирование систем, связанных за счет многоточечных нековалентных взаимодействий представляет собой чрезвычайно сложную задачу. Поэтому большинство исследований посвящены иммобилизации нескольких ферментов на различных носителях [3] или созданию систем гибридных белков [12].

За последние годы было проведено колоссальное количество исследований, посвящённых созданию систем с иммобилизованными ферментами. Большую популярность имеет подход, в ходе которого проводят иммобилизацию сразу нескольких ферментов на поверхности клеточных стенок бактерий или дрожжей. Для этого методами генетической инженерии ферменты объединяют с липидосвязанными якорными белками. Возможность получить систему за одну экспрессию, отсутствие необходимости этапа очистки и возможность проводить реакции с субстратами, которые не могут диффундировать через клеточную стенку организма носителя являются большими преимуществами данного метода. К сожалению, используя данный метод крайне сложно количественно прогнозировать и оценивать концентрации ферментов на поверхности клетки. Еще одним важным недостатком является неспособность данных систем работать в присутствии веществ, токсичных для организмов, что значительно сужает спектр применения. Кроме того, ограниченное количество видов якорных белков приводит к ограниченному количеству ферментов, которые можно иммобилизовать таким образом [13,14].

Другой распространенный метод заключается в химической иммобилизации ферментов на липидные капли, что позволяет получить преимущество при работе с гидрофобными субстратами/интермедиатами. В данном методе также практически отсутствует ограничение по количеству ферментов, которые можно иммобилизовать. В работе [15] продемонстрирована иммобилизация ферментов путем биосинтеза этилацетата в дрожжах Saccharomyces cerevisiae данным методом.

Методы создания комплексов ферментов с нуклеиновыми кислотами позволяют добиться высокой степени контроля архитектуры комплексов, однако низкая стабильность, очень высокая стоимость и сложность их создания значительно ограничивают использование данного метода. Известным примером данного подхода является технология «ДНК оригами» [16].

2.1.2. Системы гибридных белков

Системы гибридных белков представляют собой комплекс из двух или более белковых доменов, объединенных в одну полипептидную цепь и часто отделенных друг от друга специальным линкером (коротким полипептидом). Создание данных систем можно отнести к частному случаю иммобилизации фермента, когда в качестве матрицы выступает другой фермент. Подобные системы можно получить или с помощью различных посттрансляционных модификаций, однако, подобный подход достаточно трудоемок и часто приводит к получению нескольких продуктов. Более удобным способом получения систем гибридных белков является создание генетической конструкции, кодирующей желаемый фермент, что легко сделать методом полимеразной цепной реакции [17].

Успех конструирования системы гибридных белков складывается из двух факторов: выбора ферментов и дизайна линкера. Выбор ферментов обычно диктуется целью создания системы, а дизайн линкера производится уже в зависимости от выбранных ферментов. Как показывают проведенные исследования, длина и тип линкера могут оказывать значительное влияние на свойства финальной системы. По типу линкеры условно разделяют на жесткие и гибкие, в зависимости от аминокислотного состава. Так, к гибким линкерам относят полипептиды, богатые маленькими гидрофильными аминокислотными остатками, такими как глицин. Подобные линкеры используются для обеспечения подвижности объединенных белков относительно друг друга. Наибольшее распространение получил гибкий линкер (GGGGS) n, где n-количество таких звеньев. Жесткие линкеры обычно богаты пролинами или спиральными структурами и используются для сохранения фиксированного расстояния между ферментами в системе. Еще одним важным типом являются расщепляемые линкеры, позволяющие in vivo

разделить домены. Для этого в линкер добавляют сайт расщепления протеолитических ферментов или дисульфидную связь, которая может быть восстановлена, например, в кровотоке [18].

В большом количестве исследований было продемонстрировано, что объединение двух ферментов может привезти к увеличению уровня экспрессии, степени конверсии субстрата, каталитической эффективности и стабильности, по сравнению со смесью свободных ферментов [19]. В таблице 1 суммированы некоторые примеры успешных работ по созданию систем гибридных белков. Исследования по конструированию систем гибридных белков с регенерацией NAD(P)H для монооксигеназ Байера-Виллигера будут рассмотрены более подробно в соответствующих разделах обзора литературы.

Технология создания систем гибридных белков нашла своё применение не только в упомянутых выше процессах катализа. Так, объединение фермента с зеленым флуоресцирующим белком (GFP) позволило современной микроскопии получить инструмент для визуализации локализации фермента в клетках и тканях [20], а присоединение различных аффинных полипептидных фрагментов к ферменту способствовало широкому развитию аффинной хроматографии [21]. Добавление полипептидной последовательности к ферменту также является распространённым методом решения проблемы низкой растворимости фермента и образования телец включения. Для этого можно использовать мальтоза-связывающий белок [22], тиоредоксин [23], GST и SUMO [12]. Системы гибридных белков также получили широкое распространение в биофармацевтике [24]. Например, множество белковых лекарственных препаратов были объединены с Fc доменом иммуноглобулина G1 [25], человеческим сывороточным альбумином [26] или трансферрином [27], с целью улучшения терапевтического эффекта за счет увеличения времени полураспада препарата в плазме крови.

Таблица 2.1

Эффекты объединения ферментов в систему гибридных белков

Ферменты Линкер Катализируемая реакция Эффект Источник данных

Леводнон редуктаза из Leifsonia aquatica н м-амннотрансфераза Paracoccus denitrifican Богатые РД.З, 20 а.о. Превращение спиртов (изосорбнда) е амнноспнрты с сопряженной регенерацией пиродоксаль фосфата Увеличение конверсии субстрата в 2 раза по сравнению со смесью свободных ферментов [28]

Щелочная а-амилаза нз Älkahmcnas amylolytica н пептид АЕАЕАКАКАЕА ЕАКАК РТРРТТРТ РРТГРТРТ Гидролиз крахмала Увеличение кСа: в Зг5 раза, и: кш /Км в 5,3 раза. Интервал рН стабильности расширен с 7.0-11.0 до 7.0-12.0. Температурный оптимум активности увеличен с 5 0е С до 55°С. Время жизни фермента при 60°С увеличилось в 2 раза. Увеличение химической стабильности б присутствии Н.О; на 54%. [29]

Гндроксинитрил лназа (HNL) из А. thaliana и бактериальный FbFP Флуоресцентная реакция Стабильность при рН 4,75 увеличилось в 43 раза. [30]

Алкогольдегндрогеназа (ADH) и моноксигеназа Байера-Внллигера Pseudomonas piiiida КТ2440 н Rhodococcvs jostii RHA1 (0)1: Двустадийная реакция получения эфиров из длннноцепочечных спиртов через кетон Эффективность конверсии большого количества субстратов возросла в 1,5 раза по сравнению со смесью свободных ферментов. [31]

BVMO из Rhodococcus jostii RHA1 н HL ADH ЗОЗААО Получение у-бутиролактона из цнклобутанола и 1,4-бутандиола Увеличение выхода продукта в 4 раза. [32]

Таблица 2.1(продолжение)

Эффекты объединения ферментов в систему гибридных белков

Ферменты Линкер Катализируемая реакция Эффект Источник данных

CbEDH и ADH из Lactobacillus brevis. (ЕАААК): Восстановление карбонильных соединении до хнральных спиртов Увеличение удельной активности по FDH в 4 раза. Активность по ADH уменьшилась на 25%. Система обладает повьппенной стабильностью при температурах выше 50°С. [33]

Фосфнтдетидрогеназ а (PTDH) н Р45 0 ВМЗ SRSAAG NADPH-зависнмое гидроксилироБанне омепразола и роглнлазона Увеличение к^щ обоих ферментов на 25%. Км по NADP" возросла в три раза, по фосфиту уменьшилась на 25%. [34]

Мономер фру ктозо- 1,6-бифосфат альдолазы нз Staphylococcus carnosas н димер днгидроксиацетон киназы Citobacterfreundü QGQGQ Двустадийный синтез: киназная реакция DHA с последующей альдолазной реакцией. Скорость процесса возросла в 20 раз. Небольшое увеличение операционной стабильности системы. [35]

Кснл оз нд аз а- арэбннозндаза piar) из Thermoaxaerobacter etkanoliciís и кснланаза (Хупа) нз Thermomyces lanuginosa SAGS&AAGSGSG Гидролиз сахароЕ . Кц по двум субстратам из трех уменьшились, по третье:, г/ увеличилась на 20%. Температурная стабильность системы повысилась. [36]

CYP51 Лонестерол деметилаза н железо-серосодержащая NADPH-редуктаза нз Nocardia farcinica 1 STEQSAKE APAETLGAER 2 AAVDAKAS AGEAPAETLGAFR 14-а-деметилирование лонестеролэ Увеличение Ь.2т в 30 раз, Км совпадает со значением для свободного фермента. [37]

2.2. Ферментативные системы регенерации КАБ(Р)Н/КАБ(Р)+

2.2.1. Общие сведения

Существует множество оксидоредуктаз требующих наличие кофермента, который может выступать в качестве переносчика водорода, кислорода, электронов или целых функциональных групп. Наиболее важными коферментами являются АМР/АОР/АТР и КАО(Р)+/КАО(Р)Н. Хотя АМР/АОР/АТР необходимы для любых процессов метаболизма энергии в живых организмах, большинство процессов с их использованием крайне тяжело воспроизвести в экономически выгодном промышленном процессе из-за высокой сложности. Поэтому больший интерес к себе приковывают процессы, катализируемые КАО(Р)Н-зависимыми ферментами, и, в частности, оксидоредуктазами.

Одной из главных проблем в подобных процессах является высокая стоимость и низкая стабильность КАО(Р)Н. Отличным выходом в данной ситуации является использование систем регенерации КАО(Р)Н, основанных на свойстве данного кофактора существовать в двух формах - окисленной и восстановленной, и достаточно легко переходить из одной в другую за счёт переноса гидрид иона. Существует четыре принципиально различных подхода к реализации данной задачи: химический, фотохимический, электрохимический и ферментативный, в зависимости от способа «перевода» кофактора обратно из окисленной формы в восстановленную. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки, подробно разобранные в обзорной статье [38].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Паршин Павел Дмитриевич, 2021 год

VI. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Arbige M. V., Shetty J.K., Chotani G.K. Industrial Enzymology: The Next Chapter // Trends Biotechnol. - Elsevier Inc., 2019. - Vol. 37, № 12. - P. 1355-1366.

2. Chen R., Chen Q., Kim H., Siu K.H., Sun Q., Tsai S.L., Chen W. Biomolecular scaffolds for enhanced signaling and catalytic efficiency // Curr. Opin. Biotechnol. - Elsevier Ltd, 2014. - Vol. 28. - P. 59-68.

3. Ellis G.A., Klein W.P., Lasarte-Aragonés G., Thakur M., Walper S.A., Medintz I.L. Artificial Multienzyme Scaffolds: Pursuing in Vitro Substrate Channeling with an Overview of Current Progress // ACS Catal. - 2019. - Vol. 9, № 12. - P. 10812-10869.

4. Ricca E., Brucher B., Schrittwieser J.H. Multi-enzymatic cascade reactions: Overview and perspectives // Adv. Synth. Catal. - 2011. - Vol. 353, № 13. - P. 2239-2262.

5. Huang X., Holden H.M., Raushel F.M. Channeling of substrates and intermediates in enzyme-catalyzed reactions // Annu. Rev. Biochem. - 2001. - Vol. 70. - P. 149-180.

6. Miles E.W. The tryptophan synthase a2p2 complex: A model for substrate channeling, allosteric communication, and pyridoxal phosphate catalysis // J. Biol. Chem. - 2013. -Vol. 288, № 14. - P. 10084-10091.

7. Abadjieva A., Pauwels K., Hilven P., Crabeel M. A new yeast metabolon involving at least the two first enzymes of arginine biosynthesis: Acetylglutamate synthase activity requires complex formation with acetylglutamate kinase // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, № 46. - P. 42869-42880.

8. Doi R.H., Kosugi A. Cellulosomes: Plant-cell-wall-degrading enzyme complexes // Nat. Rev. Microbiol. - 2004. - Vol. 2, № 7. - P. 541-551.

9. Tong L. Acetyl-coenzyme A carboxylase: Crucial metabolic enzyme and attractive target for drug discovery // Cell. Mol. Life Sci. - 2005. - Vol. 62, № 16. - P. 1784-1803.

10. Pérez-Arellano I., Carmona-Álvarez F., Martínez A.I., Rodríguez-Díaz J., Cervera J. Pyrroline-5-carboxylate synthase and proline biosynthesis: From Osmotolerance to rare metabolic disease // Protein Sci. - 2010. - Vol. 19, № 3. - P. 372-382.

11. Munro A.W., Leys D.G., McLean K.J., Marshall K.R., Ost T.W.B., Daff S., Miles C.S., Chapman S.K., Lysek D.A., Moser C.C., Page C.C., Dutton P L. P450 BM3: The very model of a modern flavocytochrome // Trends Biochem. Sci. - 2002. - Vol. 27, № 5. - P. 250-257.

12. Bell M R., Engleka M.J., Malik A., Strickler J.E. To fuse or not to fuse: What is your purpose? // Protein Sci. - 2013. - Vol. 22, № 11. - P. 1466-1477.

13. Bugada L.F., Smith M.R., Wen F. Engineering Spatially Organized Multienzyme Assemblies for Complex Chemical Transformation // ACS Catal. - 2018. - Vol. 8, № 9. -P. 7898-7906.

14. Schüürmann J., Quehl P., Festel G., Jose J. Bacterial whole-cell biocatalysts by surface display of enzymes: toward industrial application // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2014. - Vol. 98, № 19. - P. 8031-8046.

15. Lin J.L., Zhu J., Wheeldon I. Synthetic Protein Scaffolds for Biosynthetic Pathway Colocalization on Lipid Droplet Membranes // ACS Synth. Biol. - 2017. - Vol. 6, № 8. -P.1534-1544.

16. Fu J., Liu M., Liu Y., Woodbury N.W., Yan H. Interenzyme substrate diffusion for an

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

enzyme cascade organized on spatially addressable DNA nanostructures // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - Vol. 134, № 12. - P. 5516-5519.

Bryksin A. V., Matsumura I. Overlap extension PCR cloning: A simple and reliable way to create recombinant plasmids // Biotechniques. - 2010. - Vol. 48, № 6. - P. 463-465.

Chen X., Zaro J.L., Shen W.C. Fusion protein linkers: Property, design and functionality // Adv. Drug Deliv. Rev. - Elsevier B.V., 2013. - Vol. 65, № 10. - P. 1357-1369.

Aalbers F.S., Fraaije M.W. Enzyme Fusions in Biocatalysis: Coupling Reactions by Pairing Enzymes // ChemBioChem. - 2019. - Vol. 20, № 1. - P. 20-28.

Yuste R. Fluorescence microscopy today // Nat. Methods. - 2005. - Vol. 2, № 12. - P. 902-904.

Terpe K. Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2003. - Vol. 60, № 5. - P. 523533.

di Guana C., Lib P., Riggsa P.D., Inouyeb H. Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein // Gene. - 1988. - Vol. 67, № 1. - P. 21-30.

Edward R. LaVallie, Elizabeth A DiBlasico, Sharlotte Kovacic, Kathleen L. Grant P.F.S. and J.V. A Thioredoxin Gene Fusion Expression System That Circumvents Inclusion Body Formation in the E. Coli. Cytoplasm // Nat. Biotechnol. - 1993. - Vol. 11. - P. 1591564.

Schmidt S.R., Berger S., Lowe P., Tesar M. Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges // Fusion Protein Technol. Biopharm. Appl. Challenges. - 2015. - Vol. 7, № 3. - P. 456-460.

Dumont J.A., Low S.C., Peters R.T., Bitonti A.J. Monomeric Fc fusions: Impact on pharmacokinetic and biological activity of protein therapeutics // BioDrugs. - 2006. - Vol. 20, № 3. - P. 151-160.

Weimer T., Wormsbächer W., Kronthaler U., Lang W., Liebing U., Schulte S. Prolonged in-vivo half-life of factor VIIa by fusion to albumin // Thromb. Haemost. - 2008. - Vol. 99, № 4. - P. 659-667.

Kim B.J., Zhou J., Martin B., Carlson O.D., Maudsley S., Greig N.H., Mattson M.P., Ladenheim E.E., Wustner J., Turner A., Sadeghi H., Egan J.M. Transferrin fusion technology: A novel approach to prolonging biological half-life of insulinotropic peptides // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2010. - Vol. 334, № 3. - P. 682-692.

Lerchner A., Daake M., Jarasch A., Skerra A. Fusion of an alcohol dehydrogenase with an aminotransferase using a PAS linker to improve coupled enzymatic alcohol-to-amine conversion // Protein Eng. Des. Sel. - 2016. - Vol. 29, № 12. - P. 557-562.

Yang H., Lu X., Liu L., Li J., Shin H.D., Chen R.R., Du G., Chen J. Fusion of an oligopeptide to the N terminus of an alkaline a-amylase from Alkalimonas amylolytica simultaneously improves the enzyme's catalytic efficiency, thermal stability, and resistance to oxidation // Appl. Environ. Microbiol. - 2013. - Vol. 79, № 9. - P. 30493058.

Emmi Scholz K., Kopka B., Wirtz A.A., Pohl M.M., Jaeger K.E., Krauss U. Fusion of a flavin-based fluorescent protein to hydroxynitrile lyase from arabidopsis thaliana improves enzyme stability // Appl. Environ. Microbiol. - 2013. - Vol. 79, № 15. - P.

4727-4733.

31. Jeon E.Y., Baek A.H., Bornscheuer U.T., Park J.B. Enzyme fusion for whole-cell biotransformation of long-chain sec-alcohols into esters // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2015. - Vol. 99, № 15. - P. 6267-6275.

32. Huang A.L., Tang W., Röllig R., Aalbers F.S., Fraaije W., Kara S. Convergent cascade catalyzed by monooxygenase-alcohol dehydrogenase fusion applied in organic media // ChemBioChem. - 2019. - Vol. 20. - P. 1653-1658.

33. Li B., Li Y., Bai D., Zhang X., Yang H., Wang J., Liu G., Yue J., Ling Y., Zhou D., Chen H. Whole-cell biotransformation systems for reduction of prochiral carbonyl compounds to chiral alcohol in Escherichia coli // Sci. Rep. - 2014. - Vol. 4. - P. 1-5.

34. Beyer N., Kulig J.K., Bartsch A., Hayes M.A., Janssen D.B., Fraaije M.W. P450BM3 fused to phosphite dehydrogenase allows phosphite-driven selective oxidations // Appl. Microbiol. Biotechnol. - Applied Microbiology and Biotechnology, 2017. - Vol. 101, № 6. - P. 2319-2331.

35. Iturrate L., Sánchez-Moreno I., Oroz-Guinea I., Pérez-Gil J., García-Junceda E. Preparation and characterization of a bifunctional aldolase/kinase enzyme: A more efficient biocatalyst for C-C bond formation // Chem. - A Eur. J. - 2010. - Vol. 16, № 13. - P.4018-4030.

36. Wang R., Xue Y., Wu X., Song X., Peng J. Enhancement of engineered trifunctional enzyme by optimizing linker peptides for degradation of agricultural by-products // Enzyme Microb. Technol. - Elsevier Inc., 2010. - Vol. 47, № 5. - P. 194-199.

37. Choi K.Y., Jung E.O., Jung D.H., Pandey B P., Lee N., Yun H., Park H.Y., Kim B.G. Novel iron-sulfur containing NADPH-Reductase from Nocardia farcinica IFM10152 and fusion construction with CYP51 lanosterol demethylase // Biotechnol. Bioeng. - 2012. -Vol. 109, № 3. - P. 630-636.

38. Wichmann R., Vasic-Racki D. Cofactor regeneration at the lab scale // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. - 2005. - Vol. 92. - P. 225-260.

39. Maurer S.C., Schulze H., Schmid R.D., Urlacher V. Immobilisation of P450 BM-3 and an NADP+ Cofactor Recycling System: Towards a Technical Application of Heme-Containing Monooxygenases in Fine Chemical Synthesis // Adv. Synth. Catal. - 2003. -Vol. 345, № 6-7. - P. 802-810.

40. Liu Q., Zhou J., Yang T., Zhang X., Xu M., Rao Z. Efficient biosynthesis of l-phenylglycine by an engineered Escherichia coli with a tunable multi-enzyme-coordinate expression system // Appl. Microbiol. Biotechnol. - Applied Microbiology and Biotechnology, 2018. - Vol. 102, № 5. - P. 2129-2141.

41. Jiang W., Fang B.S. Construction and evaluation of a novel bifunctional phenylalanine-formate dehydrogenase fusion protein for bienzyme system with cofactor regeneration // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - Springer Berlin Heidelberg, 2016. - Vol. 43, № 5. - P. 577584.

42. Park H.A., Park G., Jeon W., Ahn J.O., Yang Y.H., Choi K.Y. Whole-cell biocatalysis using cytochrome P450 monooxygenases for biotransformation of sustainable bioresources (fatty acids, fatty alkanes, and aromatic amino acids) // Biotechnol. Adv. -Elsevier, 2020. - Vol. 40, № August 2019. - P. 107504.

43. Wu S., Snajdrova R., Moore J.C., Baldenius K., Bornscheuer U.T. Biocatalysis: Enzymatic Synthesis for Industrial Applications // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2021. -

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

Vol. 60, № 1. - P. 88-119.

Özgün G.P., Ordu E.B., Tütüncü H.E., Yelboga E., Sessions R.B., Karagüler N.G. Site Saturation Mutagenesis Applications on Candida methylica Formate Dehydrogenase // Scientifica (Cairo). - 2016. - Vol. 2016. - P. 4902450.

Serov A.E., Popova A.S., Fedorchuk V. V, Tishkov V.I. Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae // Biotechnology. -2002. - Vol. 367. - P. 841-847.

Wu W., Zhu D., Hua L. Site-saturation mutagenesis of formate dehydrogenase from Candida bodinii creating effective NADP+-dependent FDH enzymes // J. Mol. Catal. B Enzym. - 2009. - Vol. 61, № 3-4. - P. 157-161.

Adolph H.W., Maurer P., Schneider-bernlöhr H., Sartorius C., Zeppezauer M. Substrate specificity and stereoselectivity of horse liver alcohol dehydrogenase // Eur. J. Biochem. -1991. - Vol. 201. - P. 615-625.

Kelemen-Horvath I., Nemestothy N., Belafi-Bako K., Gubicza L. Stereoselective reduction of 2-phenylpropionaldehyde by alcohol dehydrogenase with cofactor regeneration // Chem. Pap. - 2002. - Vol. 56, № 1. - P. 52-56.

Hirakawa H., Kamiya N., Yata T., Nagamune T. Regioselective reduction of a steroid in a reversed micellar system with enzymatic NADH-regeneration // Biochem. Eng. J. - 2003.

- Vol. 16, № 1. - P. 35-40.

Müller C.A., Weingartner A.M., Dennig A., Ruff A.J., Gröger H., Schwaneberg U. A whole cell biocatalyst for double oxidation of cyclooctane // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.

- Springer Berlin Heidelberg, 2016. - Vol. 43, № 12. - P. 1641-1646.

Kohl A., Srinivasamurthy V., Böttcher D., Kabisch J., Bornscheuer U.T. Co-expression of an alcohol dehydrogenase and a cyclohexanone monooxygenase for cascade reactions facilitates the regeneration of the NADPH cofactor // Enzyme Microb. Technol. -Elsevier, 2018. - Vol. 108, № September 2017. - P. 53-58.

Ensari Y., de Almeida Santos G., Ruff A.J., Schwaneberg U. Engineered P450 BM3 and cpADH5 coupled cascade reaction for ß-oxo fatty acid methyl ester production in whole cells // Enzyme Microb. Technol. - 2020. - Vol. 138, № March.

Cosgrove M.S., Naylor C., Paludan S., Adams M.J., Levy H.R. On the mechanism of the reaction catalyzed by glucose 6-phosphate dehydrogenase // Biochemistry. - 1998. - Vol. 37, № 9. - P. 2759-2767.

Hummel W. Enzyme-catalyzed synthesis of optically pure R(+)-phenylethanol // Biotechnol. Lett. - 1990. - Vol. 12, № 6. - P. 403-408.

Schüürmann J., Quehl P., Lindhorst F., Lang K., Jose J. Autodisplay of glucose-6-phosphate dehydrogenase for redox cofactor regeneration at the cell surface // Biotechnol. Bioeng. - 2017. - Vol. 114, № 8. - P. 1658-1669.

Lin S.S., Miyawaki O., Nakamura K. Continuous production of L-carnitine with NADH regeneration by a nanofiltration membrane reactor with coimmobilized L-carnitine dehydrogenase and glucose dehydrogenase // J. Biosci. Bioeng. - 1999. - Vol. 87, № 3. -P.361-364.

Pongtharangkul T., Chuekitkumchorn P., Suwanampa N., Payongsri P., Honda K., Panbangred W. Kinetic properties and stability of glucose dehydrogenase from Bacillus amyloliquefaciens SB5 and its potential for cofactor regeneration // AMB Express. -

Springer Berlin Heidelberg, 2015. - Vol. 5, № 1. - P. 1-12.

58. Valikhani D., Bolivar J.M., Dennig A., Nidetzky B. A tailor-made, self-sufficient and recyclable monooxygenase catalyst based on coimmobilized cytochrome P450 BM3 and glucose dehydrogenase // Biotechnol. Bioeng. - 2018. - Vol. 115, № 10. - P. 2416-2425.

59. Johannes T.W., Woodyer R.D., Zhao H. Efficient Regeneration of NADPH Using an Engineered Phosphite Dehydrogenase // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - Vol. 96, № 1. - P. 18-26.

60. Weckbecker A., Gröger H., Hummel W. Regeneration of nicotinamide coenzymes: principles and applications for the synthesis of chiral compounds // Biosyst. Eng. - 2010. - Vol. 1. - P. 195-242.

61. Cho S.W., Cho E.H., Choi S.Y. Activation of two types of brain glutamate dehydrogenase isoproteins by gabapentin // FEBS Lett. - Federation of European Biochemical Societies, 1998. - Vol. 426, № 2. - P. 196-200.

62. Carrea G., Bovara R., Longhi R., Cremonesi P., Lodi R. Enzymatic Preparation of 12-Ketochenodeoxycholic Acid With Regeneration of Nicotinamide Cofactors. // Biotechnol Bioeng. - 1984. - Vol. 26. - P. 560-563.

63. Xu M.Q., Li F.L., Yu W.Q., Li R.F., Zhang Y.W. Combined cross-linked enzyme aggregates of glycerol dehydrogenase and NADH oxidase for high efficiency in situ NAD+ regeneration // Int. J. Biol. Macromol. - Elsevier LTD, 2020. - Vol. 144. - P. 1013-1021.

64. Brondani P.B., Dudek H.M., Martinoli C., Mattevi A., Fraaije M.W. Finding the Switch: Turning a baeyer-villiger monooxygenase into a NADPH Oxidase // J. Am. Chem. Soc. -2014. - Vol. 136, № 49. - P. 16966-16969.

65. Jormakka M., Byrne B., Iwata S. Formate dehydrogenase - A versatile enzyme in changing environments // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2003. - Vol. 13, № 4. - P. 418-423.

66. Noji T., Jin T., Nango M., Kamiya N., Amao Y. CO2 photoreduction by formate dehydrogenase and a ru-complex in a nanoporous glass reactor // ACS Appl. Mater. Interfaces. - 2017. - Vol. 9, № 4. - P. 3260-3265.

67. Schirwitz K., Schmidt A., Lamzin V.S. High-resolution structures of formate dehydrogenase from Candida boidinii // Protein Sci. - 2007. - Vol. 16, № 6. - P. 11461156.

68. Тишков В.И., Попов В.О. Механизм действия формиатдегидрогеназы и ее практическое применение // Биохимия,. - 2004. - Vol. 69, № 11. - P. 1537-1554.

69. Pometun A.A., Boyko K.M., Yurchenko T.S., Nikolaeva A.Y., Kargov I.S., Atroshenko D.L., Savin S.S., Popov V.O., Tishkov V.I. Highly-Active Recombinant Formate Dehydrogenase from Pathogenic Bacterium Staphylococcus aureus: Preparation and Crystallization // Biochem. - 2020. - Vol. 85, № 6. - P. 689-696.

70. Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalyzed by the bacterial formate dehydrogenase // Biochimie. -1989. - Vol. 71, № 4. - P. 551-557.

71. Alekseeva a a, Savin S.S., Tishkov V.I. NAD (+) -dependent Formate Dehydrogenase from Plants. // Acta Naturae. - 2011. - Vol. 3, № 11. - P. 38-54.

72. Fedorchuk V. V., Galkin A.G., Yasny I.E., Kulakova L.B., Rojkova A.M., Filippova A.A., Tishkov V.I. Effect of interactions between amino acid residues 43 and 61 on

thermal stability of bacterial formate dehydrogenases // Biochem. - 2002. - Vol. 67, № 10. - P. 1145-1151.

73. Shabalin I.G., Polyakov K.M., Tishkov V.I., Popov V.O. Atomic Resolution Crystal Structure of NAD(+)-Dependent Formate Dehydrogenase from Bacterium Moraxella sp. C-1 // Acta Naturae. - 2009. - Vol. 1, № 3. - P. 89-93.

74. Romanova E.G., Alekseeva A.A., Pometun E.V., Tishkov V.I. Determination of the Concentration of Active Sites and the Catalytic Rate Constant of Recombinant Formate Dehydrogenase from Glycine max // Moscow Univ. Chem. Bull. - 2010. - Vol. 65, № 3.

- P.127-130.

75. Guo Q., Gakhar L., Wickersham K., Francis K., Vardi-kilshtain A., Major D.T., Cheatum C.M., Kohen A. Structural and Kinetic Studies of Formate Dehydrogenase from Candida boidinii // Biochemistry. - 2016. - Vol. 55, № 19. - P. 2760-2771.

76. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. // J. Mol. Biol. - 1994. - Vol. 236. - P. 759-785.

77. Filippova E. V., Polyakov K.M., Tikhonova T. V., Stekhanova T.N., Boiko K.M., Popov V.O. Structure of a new crystal modification of the bacterial NAD-dependent formate dehydrogenase with a resolution of 2.1 Â // Crystallogr. Reports. - 2005. - Vol. 50, № 5.

- P.796-800.

78. Shabalin I.G., Filippova E. V., Polyakov K.M., Sadykhov E.G., Safonova T.N., Tikhonova T. V., Tishkov V.I., Popov V.O. Structures of the apo and holo forms of formate dehydrogenase from the bacterium Moraxella sp. C-1: Towards understanding the mechanism of the closure of the interdomain cleft // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. - International Union of Crystallography, 2009. - Vol. 65, № 12. - P. 13151325.

79. Fogal S., Beneventi E., Cendron L., Bergantino E. Structural basis for double cofactor specificity in a new formate dehydrogenase from the acidobacterium Granulicella mallensis MP5ACTX8 // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2015. - Vol. 99, № 22. - P. 9541-9554.

80. Shabalin I.G., Serov A.E., Skirgello O.E., Timofeev V.I., Samygina V.R., Popov V.O., Tishkov V.I., Kuranova I.P. Recombinant formate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana: Preparation, crystal growth in microgravity, and preliminary X-ray diffraction study // Crystallogr. Reports. - 2010. - Vol. 55, № 5. - P. 806-810.

81. Tishkov V.I., Pometun A.A., Stepashkina A. V., Fedorchuk V. V., Zarubina S.A., Kargov I S., Atroshenko D.L., Parshin P.D., Shelomov M.D., Kovalevski R.P., Boiko K.M., Eldarov M.A., D'Oronzo E., Facheris S., Secundo F., Savin S.S. Rational Design of Practically Important Enzymes // Moscow Univ. Chem. Bull. - 2018. - Vol. 73, № 1. - P. 1-6.

82. Sadykhov E.G., Serov A.E., Voinova N.S., Uglanova S. V., Petrov A.S., Alekseeva A.A., Kleimenov S.Y., Popov V.O., Tishkov V.I. A comparative study of the thermal stability of formate dehydrogenases from microorganisms and plants // Appl. Biochem. Microbiol. -2006. - Vol. 42, № 3. - P. 236-240.

83. Tishkov V.I., Popov V.O. Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase. // Biochemistry. (Mosc). - 2004. - Vol. 69, № 11. - P. 1252-1267.

84. Serov A.E. Structure-function relationship of recombinant formate dehydrogenases from

bacery yeasts and methylotrophic bacterium. - M.V. Lomonosov Moscow State University, 2002.

85. NANBA H., TAKAOKA Y., HASEGAWA J. Purification and Characterization of an a-Haloketone-resistant Formate Dehydrogenase from Thiobacillus sp. Strain KNK65MA, and Cloning of the Gene // Biosci. Biotech. Biochem. - 2003. - Vol. 67, № 10. - P. 21452153.

86. Hatrongjit R., Packdibamrung K. A novel NADP+-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: Screening, purification and characterization // Enzyme Microb. Technol. - Elsevier Inc., 2010. - Vol. 46, № 7. - P. 557-561.

87. Alpdagta§ S., Yücel S., Kapka9 H.A., Liu S., Binay B. Discovery of an acidic, thermostable and highly NADP+ dependent formate dehydrogenase from Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 // Biotechnol. Lett. - 2018. - Vol. 40, № 7. - P. 1135-1147.

88. NANBA H., TAKAOKA Y., HASEGAWA J. Purification and Characterization of Formate Dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus Strain KNK607M, and Cloning of the Gene // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2003. - Vol. 67, № 4. - P. 720-728.

89. Ding H.-T., Liu D.-F., Li Z.-L., Du Y.-Q., Xu X.-H., Zhao Y.-H. Characterization of a thermally stable and organic solvent-adaptative NAD+-dependent formate dehydrogenase from Bacillus sp. F1 // J Appl Microbiol. - 2011. - Vol. 111, № 5. - P. 1075-1085.

90. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues // Eur. J. Biochem. - 2000. - Vol. 267, № 5. - P. 1280-1289.

91. Alekseeva A.A., Serenko A.A., Kargov I.S., Savin S.S., Kleymenov S.Y., Tishkov V.I. Engineering catalytic properties and thermal stability of plant formate dehydrogenase by single-point mutations // Protein Eng. Des. Sel. - 2012. - Vol. 25, № 11. - P. 781-788.

92. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., V.I. T. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. // FEBS Lett. - 1999. - Vol. 445. - P. 183-188.

93. Tishkov V.I., Goncharenko K. V., Alekseeva A.A., Kleymenov S.Y., Savin S.S. Role of a Structurally Equivalent Phenylalanine Residue in Catalysis and Thermal Stability of Formate Dehydrogenases from Different Sources // Biochem. - 2015. - Vol. 80, № 13. -P. 1690-1700.

94. Alekseeva A.A., Fedorchuk V. V., Zarubina S.A., Sadykhov E.G., Matorin A.D., Savin S.S., Tishkov V.I. The role of Ala198 in the stability and coenzyme specificity of bacterial formate dehydrogenases // Acta Naturae. - 2015. - Vol. 7, № 1. - P. 60-69.

95. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii.: pat. US2003/0157664 USA. - US Patent Application Publication, 2003.

96. Karagüler N.G., Sessions R.B., Binay B., Ordu E.B., Clarke A.R. Protein engineering applications of industrially exploitable enzymes: Geobacillus stearothermophilus LDH and Candida methylica FDH // Biochem Soc Trans. - 2007. - Vol. 35, № 6. - P. 16101615.

97. Ordu E.B., Yelboga E., Secundo F., Sessions R.B., Karagüler N.G. The effect of methionine to cysteine substitution on the stability of formate dehydrogenase from Candida methylica // J. Mol. Cat. B Enz. - 2012. - Vol. 82. - P. 109-114.

98.

99.

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

Ordu E.B., Sessions R.B., Clarke A.R., Karagüler N.G. Effect of surface electrostatic interactions on the stability and folding of formate dehydrogenase from Candida methylica // J. Mol. Catal. B Enzym. - Elsevier B.V., 2013. - Vol. 95. - P. 23-28.

Özgün G.P., Ordu E.B., Tütüncü H.E., Yelboga E., Sessions R.B., Karagüler N.G. Site Saturation Mutagenesis Applications on Candida methylica Formate Dehydrogenase // Sci. - 2016. - Vol. 2016. - P. 4902450.

Alekseeva a a, Savin S.S., Kleimenov S.Y., Uporov I. V, Pometun E. V, Tishkov V.I. Stabilization of plant formate dehydrogenase by rational design. // Biochem. Biokhimiia.

- 2012. - Vol. 77, № 10. - P. 1199-1209.

Kargov I.S., Kleimenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I., Alekseeva A.A. Improvement of the soy formate dehydrogenase properties by rational design // Protein Eng. Des. Sel. -2014. - Vol. 28, № 6. - P. 171-178.

Alekseeva A.A., Kargov I.S., Kleimenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I. Additivity of the Stabilization Effect of Single Amino Acid Substitutions in Triple Mutants of Recombinant Formate Dehydrogenase from the Soybean Glycine max // Acta Naturae. - 2015. - Vol. 7, № 3. - P. 55-64.

Tishkov V.I., Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase // Biomol. Eng. -2006. - Vol. 23, № 2-3. - P. 89-110.

Pometun A.A., Kleimenov S.Y., Zarubina S.A., Kargov I.S., Parshin P.D. Comparison of the Thermal Stability of New Formate Dehydrogenases by Differential Scanning Calorimetry. - 2018. - Vol. 73, № 2. - P. 79-83.

Andreadeli A., Platis D., Tishkov V., Popov V., Labrou N.E. Structure-guided alteration of coenzyme specificity of formate dehydrogenase by saturation mutagenesis to enable efficient utilization of NADP+ // FEBS J. - 2008. - Vol. 275, № 15. - P. 3859-3869.

Hoelsch K., Sührer I., Heusel M., Weuster-Botz D. Engineering of formate dehydrogenase: Synergistic effect of mutations affecting cofactor specificity and chemical stability // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2013. - Vol. 97, № 6. - P. 2473-2481.

Ihara M., Kawano Y., Urano M., Okabe A. Light Driven CO2 Fixation by Using Cyanobacterial Photosystem I and NADPH-Dependent Formate Dehydrogenase // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, № 8. - P. 1-8.

Baerends R.J.S., De Hulster E., Geertman J.M.A., Daran J.M., Van Maris A.J.A., Veenhuis M., Van Der Klei I.J., Pronk J.T. Engineering and analysis of a Saccharomyces cerevisiae strain that uses formaldehyde as an auxiliary substrate // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - Vol. 74, № 10. - P. 3182-3188.

Wang S., Zhang Y., Dong H., Mao S., Zhu Y., Wang R., Luan G., Li Y. Formic acid triggers the "acid crash" of acetone-butanol-ethanol fermentation by Clostridium acetobutylicum // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - Vol. 77, № 5. - P. 1674-1680.

Mondal B., Song J., Neese F., Ye S. Bio-inspired mechanistic insights into CO2 reduction // Curr Opin Chem Biol. - Elsevier Ltd, 2015. - Vol. 25. - P. 103-109.

Gai P.P., Zhao C.E., Wang Y., Abdel-Halim E.S., Zhang J.R., Zhu J.J. NADH dehydrogenase-like behavior of nitrogen-doped graphene and its application in NAD+-dependent dehydrogenase biosensing // Biosens. Bioelectron. - Elsevier, 2014. - Vol. 62.

- P.170-176.

Gai P., Ji Y., Chen Y., Zhu C., Zhang J., Zhu J.-J. A nitrogen-doped graphene/gold

nanoparticle/formate dehydrogenase bioanode for high power output membrane-less formic acid/O 2 biofuel cells // Analyst. - 2015. - Vol. 140, № 6. - P. 1822-1826.

113. Abdellaoui S., Seow Chavez M., Matanovic I., Stephens A.R., Atanassov P., Minteer S.D. Hybrid molecular/enzymatic catalytic cascade for complete electro-oxidation of glycerol using a promiscuous NAD-dependent formate dehydrogenase from: Candida boidinii // Chem. Commun. - 2017. - Vol. 53, № 39. - P. 5368-5371.

114. Jensen C.N., Hart S., Ali S.T., Cartwright J., Ward J., Turkenburg J.P., Grogan G., Allen M.J. A Flavoprotein Monooxygenase that Catalyses a Baeyer-Villiger Reaction and Thioether Oxidation Using NADH as the Nicotinamide Cofactor // ChemBioChem. -2012. - Vol. 13, № 6. - P. 872-878.

115. Demir A.S., Talpur F.N., Betul Sopaci S., Kohring G.W., Celik A. Selective oxidation and reduction reactions with cofactor regeneration mediated by galactitol-, lactate-, and formate dehydrogenases immobilized on magnetic nanoparticles // J. Biotechnol. -Elsevier B.V., 2011. - Vol. 152, № 4. - P. 176-183.

116. Zhu Y., Li H., Liu P., Yang J., Zhang X., Sun Y. Construction of allitol synthesis pathway by multi-enzyme coexpression in Escherichia coli and its application in allitol production // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2015. - Vol. 42, № 5. - P. 661-669.

117. Bozic M., Pricelius S., Guebitz G.M., Kokol V. Enzymatic reduction of complex redox dyes using NADH-dependent reductase from Bacillus subtilis coupled with cofactor regeneration // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - Vol. 85, № 3. - P. 563-571.

118. Jiang W., Xu C. zhen, Jiang S. zhi, Zhang T. duo, Wang S. zhen, Fang B.S. Establishing a Mathematical Equations and Improving the Production of l-tert-Leucine by Uniform Design and Regression Analysis // Appl Biochem Biotechnol. - Applied Biochemistry and Biotechnology, 2017. - Vol. 181, № 4. - P. 1454-1464.

119. Lu J., Zhang Y., Sun D., Jiang W., Wang S., Fang B. The Development of Leucine Dehydrogenase and Formate Dehydrogenase Bifunctional Enzyme Cascade Improves the Biosynthsis of L-tert-Leucine // Appl. Biochem. Biotechnol. - Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016. - Vol. 180, № 6. - P. 1180-1195.

120. Gao X., Yang S., Zhao C., Ren Y., Wei D. Artificial multienzyme supramolecular device: Highly ordered self-assembly of oligomeric enzymes in vitro and in vivo // Angew Chem Int Ed Engl. - 2014. - Vol. 53, № 51. - P. 14027-14030.

121. Spieler V., Valldorf B., Maaß F., Kleinschek A., Hüttenhain S.H., Kolmar H. Coupled reactions on bioparticles: Stereoselective reduction with cofactor regeneration on PhaC inclusion bodies // Biotechnol. J. - 2016. - Vol. 11, № 7. - P. 890-898.

122. Braun M., Sun B., Anselment B., Weuster-Botz D. Novel whole-cell biocatalysts with recombinant hydroxysteroid dehydrogenases for the asymmetric reduction of dehydrocholic acid // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2012. - Vol. 95, № 6. - P. 14571468.

123. Ojima Y., Suryadarma P., Tsuchida K., Taya M. Accumulation of pyruvate by changing the redox status in Escherichia coli // Biotechnol Lett. - 2012. - Vol. 34, № 5. - P. 889893.

124. Akinterinwa O., Khankal R., Cirino P.C. Metabolic engineering for bioproduction of sugar alcohols // Curr. Opin. Biotechnol. - 2008. - Vol. 19, № 5. - P. 461-467.

125. Hölsch K., Weuster-Botz D. Enantioselective reduction of prochiral ketones by engineered bifunctional fusion proteins // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2010. - Vol. 56,

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

№ 4. - P. 131-140.

Tao R., Jiang Y., Zhu F., Yang S. A one-pot system for production of l-2-aminobutyric acid from l-threonine by l-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based on l-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase // Biotechnol Lett. - 2014. - Vol. 36, № 4. - P. 835-841.

Kamerbeek N.M., Janssen D.B., van Berkel W.J.H., Fraaije M.W. Baeyer-Villiger Monooxygenases, an Emerging Family of Flavin-Dependent Biocatalysts // Adv. Synth. Catal. - 2003. - Vol. 345, № 67. - P. 667-678.

Han L., Liang B. New approaches to NAD(P)H regeneration in the biosynthesis systems // World J. Microbiol. Biotechnol. - Springer Netherlands, 2018. - Vol. 34, № 10. - P. 141.

Riebel A., Fink M.J., Mihovilovic M.D., Fraaije M.W. Type II flavin-containing monooxygenases: A new class of biocatalysts that harbors baeyer-villiger monooxygenases with a relaxed coenzyme specificity // ChemCatChem. - 2014. - Vol. 6, № 4. - P. 1112-1117.

Willetts A., Joint I., Gilbert J.A., Trimble W., Mühling M. Isolation and initial characterization of a novel type of Baeyer-Villiger monooxygenase activity from a marine microorganism // Microb. Biotechnol. - 2012. - Vol. 5, № 4. - P. 549-559.

Jensen C.N., Cartwright J., Ward J., Hart S., Turkenburg J.P., Ali S.T., Allen M.J., Grogan G. A Flavoprotein Monooxygenase that Catalyses a Baeyer-Villiger Reaction and Thioether Oxidation Using NADH as the Nicotinamide Cofactor // ChemBioChem. -2012. - Vol. 13, № 6. - P. 872-878.

Fraaije M.W., Kamerbeek N.M., Van Berkel W.J.H., Janssen D.B. Identification of a Baeyer-Villiger monooxygenase sequence motif // FEBS Lett. - 2002. - Vol. 518. - P. 43-47.

Fraaije M.W., Wu J., Heuts D.P.H.M., Van Hellemond E.W., Spelberg J.H.L., Janssen D.B. Discovery of a thermostable Baeyer-Villiger monooxygenase by genome mining // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2005. - Vol. 66, № 4. - P. 393-400.

Dudek H.M., Torres Pazmino D.E., Rodriguez C., De Gonzalo G., Gotor V., Fraaije M.W. Investigating the coenzyme specificity of phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - Vol. 88, № 5. - P. 11351143.

Torres Pazmino D.E., Baas B.J., Janssen D.B., Fraaije M.W. Kinetic mechanism of phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca // Biochemistry. - 2008. - Vol. 47, № 13. - P. 4082-4093.

Malito E., Alfieri A., Fraaije M.W., Mattevi A. Crystal structure of a Baeyer-Villiger monooxygenase // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 101, № 36. - P. 13157-13162.

Wu J.T., Wu L.H., Knight J A. Stabilityof NADPH: Effectof VariousFactorson the Kineticsof Degradation Materials and Methods // Clin. Chem. Clin. Chem. - 1986. - Vol. 32, № 2. - P. 314-319.

Völker A., Kirschner A., Bornscheuer U.T., Altenbuchner J. Functional expression, purification, and characterization of the recombinant Baeyer-Villiger monooxygenase MekA from Pseudomonas veronii MEK700 // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - Vol. 77, № 6. - P. 1251-1260.

Kamerbeek N.M., Fraaije M.W., Janssen D.B. Identifying determinants of NADPH

specificity in Baeyer-Villiger monooxygenases // Eur. J. Biochem. - 2004. - Vol. 271, № 11. - P. 2107-2116.

140. Orru R., Dudek H.M., Martinoli C., Torres Pazmino D.E., Royant A., Weik M., Fraaije M.W., Mattevi A. Snapshots of enzymatic baeyer-villiger catalysis: Oxygen activation and intermediate stabilization // J. Biol. Chem. - 2011. - Vol. 286, № 33. - P. 2928429291.

141. Beier A., Bordewick S., Maika G., Schmidt S., Bergh T. van den, Peters C., Joosten H., Bornscheuer U.T. Switch in Cofactor Specificity of a Baeyer-Villiger Monooxygenase // ChemBioChem. - 2016. - Vol. 17, № 24. - P. 2312-2315.

142. Cahn J.K.B., Baumschlager A., Brinkmann-Chen S., Arnold F.H. A general Biology tool the NAD / NADP cofactor preference of oxidoreductases // ACS Synth. Biol. - 2017. -Vol. 6, № 2. - P. 326-333.

143. Balke K., Beier A., Bornscheuer U.T. Hot spots for the protein engineering of Baeyer-Villiger monooxygenases // Biotechnol. Adv. - 2018. - Vol. 36. - P. 247-263.

144. Bocola M., Schulz F., Leca F., Vogel A., Fraaije M.W., Reetz M.T. Converting phenylacetone monooxygenase into phenylcyclohexanone monooxygenase by rational design: Towards practical Baeyer-Villiger monooxygenases // Adv. Synth. Catal. - 2005.

- Vol. 347, № 7-8. - P. 979-986.

145. Reetz M.T., Wu S. Laboratory evolution of robust and enantioselective Baeyer-Villiger monooxygenases for asymmetric catalysis // J. Am. Chem. Soc. - 2009. - Vol. 131, № 42.

- P.15424-15432.

146. Torres Pazmino D.E., Snajdrova R., Rial D. V., Mihovilovic M.D., Fraaije M.W. Altering the substrate specificity and enantioselectivity of phenylacetone monooxygenase by structure-inspired enzyme redesign // Adv. Synth. Catal. - 2007. - Vol. 349, № 8-9. - P. 1361-1368.

147. Dudek H.M., Fink M.J., Shivange A. V., Dennig A., Mihovilovic M.D., Schwaneberg U., Fraaije M.W. Extending the substrate scope of a Baeyer-Villiger monooxygenase by multiple-site mutagenesis // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2014. - Vol. 98, № 9. - P. 4009-4020.

148. Wu S., Acevedo J.P., Reetz M.T. Induced allostery in the directed evolution of an enantioselective Baeyer-Villiger monooxygenase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2010.

- Vol. 107, № 7. - P. 2775-2780.

149. Parra L.P., Acevedo J.P., Reetz M.T. Directed evolution of phenylacetone monooxygenase as an active catalyst for the baeyer-villiger conversion of cyclohexanone to caprolactone // Biotechnol. Bioeng. - 2015. - Vol. 112, № 7. - P. 1354-1364.

150. Dudek H.M., de Gonzalo G., Pazmino D.E.T., Stepniak P., Wyrwicz L.S., Rychlewski L., Fraaije M.W. Mapping the substrate binding site of phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca by mutational analysis // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - Vol. 77, № 16. - P. 5730-5738.

151. Matsui T., Dekishima Y., Ueda M. Biotechnological production of chiral organic sulfoxides: Current state and perspectives // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2014. - Vol. 98, № 18. - P. 7699-7706.

152. Zhang Z.G., Lonsdale R., Sanchis J., Reetz M.T. Extreme synergistic mutational effects in the directed evolution of a baeyer-villiger monooxygenase as catalyst for asymmetric sulfoxidation // J. Am. Chem. Soc. - 2014. - Vol. 136, № 49. - P. 17262-17272.

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

Cummings Ryerson C., Ballou D.P., Walsh C. Mechanistic Studies on Cyclohexanone Oxygenase // Biochemistry. - 1982. - Vol. 21, № 11. - P. 2644-2655.

Cahn J.K.B., Baumschlager A., Brinkmann-Chen S., Arnold F.H. Mutations in adenine-binding pockets enhance catalytic properties of NAD(P)H-dependent enzymes // Protein Eng. Des. Sel. - 2015. - Vol. 29, № 1. - P. 31-38.

Torres Pazmino D.E., Riebel A., De Lange J., Rudroff F., Mihovilovic M.D., Fraaije M.W. Efficient biooxidations catalyzed by a new generation of self-sufficient Baeyer-Villiger monooxygenases // ChemBioChem. - 2009. - Vol. 10, № 16. - P. 2595-2598.

van Beek H.L., de Gonzalo G., Fraaije M.W. Blending Baeyer-Villiger monooxygenases: Using a robust BVMO as a scaffold for creating chimeric enzymes with novel catalytic properties // Chem. Commun. - 2012. - Vol. 48, № 27. - P. 3288-3290.

Krzek M., van Beek H.L., Permentier H.P., Bischoff R., Fraaije M.W. Covalent immobilization of a flavoprotein monooxygenase via its flavin cofactor // Enzyme Microb. Technol. - Elsevier Inc., 2016. - Vol. 82. - P. 138-143.

Fürst M.J.L.J., Gran-Scheuch A., Aalbers F.S., Fraaije M.W. Baeyer-Villiger Monooxygenases: Tunable Oxidative Biocatalysts // ACS Catal. - 2019. - Vol. 9, № 12. -P. 11207-11241.

Bong Y.K., Song S., Nazor J., Vogel M., Widegren M., Smith D., Collier S.J., Wilson R., Palanivel S.M., Narayanaswamy K., Mijts B., Clay M.D., Fong R., Colbeck J., Appaswami A., Muley S., Zhu J., Zhang X., Liang J., Entwistle D. Baeyer - Villiger Monooxygenase-Mediated Synthesis of Esomeprazole As an Alternative for Kagan Sulfoxidation // J. Org. Chem. - 2018. - Vol. 83. - P. 7453-7458.

Monooxygenase B.V., Rioz-marti A., Gonzalo G. De, Fraaije M.W., Torres D.E. Synthesis of chiral 3-alkyl-3,4-dihydroisocoumarins by dynamic kinetic resolutions catalyzed by a Baeyer-Villiger monooxygenase // J. Org. Chem. - 2010. - Vol. 75. - P. 2073-2076.

Rioz-martinez A., Gonzalo G. De, Pazmino E.T., Fraaije M.W., Gotor V. Enzymatic Baeyer - Villiger Oxidation of Benzo-Fused Ketones : Formation of Regiocomplementary Lactones // J. Org. Chem. - 2009. - № 2. - P. 2526-2532.

Engineering P., Biotechnology N., Doi B. Nonhazardous biocatalytic oxidation in Nylon-9 monomer synthesis on a 40 g scale with efficient downstream processing // Biotechnol. Bioeng. - 2017. - Vol. 114. - P. 1670.

Bernhardt R. Cytochromes P450 as versatile biocatalysts // J. Biotechnol. - 2006. - Vol. 124, № 1. - P. 128-145.

Brodie B.B.., Axelrod J., Cooper J.R., Gaudette L., La Du B.N., Mitome C., Udenfriend S. Detoxication of Drugs and Other Foreign Compounds by Liver Microsomes // Science (80-. ). - 1995. - Vol. 121, № 3147. - P. 603-604.

Cook D.J., Finnigan J.D., Cook K., Black G.W., Charnock S.J. Cytochromes P450: History, Classes, Catalytic Mechanism, and Industrial Application // Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 1st ed. - Elsevier Inc., 2016. - Vol. 105. - 105-126 p.

Omura Tsuneo, Sato R. The Carbon Monoxide-binding Pigment of Liver Microsomes I. Evidence for its hemorpotein Nature // J. Biol. Chem. - 1964. - Vol. 239, № 7. - P. 23702378.

Fulco J., Miura Y. (ro- 2) Hydroxylation of fatty acids by a soluble system from Bacillus

megaterium // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249, № 6. - P. 1880-1888.

168. Miles J.S., Munro A.W., Rospendowski B.N., Smith W.E., Mcknight J., Thomson A.J. Domains of the catalytically self-sufficient cytochrome P450 BM3. Genetic construction, overexpression, purification and spectroscopic characterization. // Biochem. J. - 1992. -Vol. 288, № 2. - P. 503-509.

169. Joyce M.G., Ekanem I.S., Roitel O., Dunford A.J., Neeli R., Girvan H.M., Baker G.J., Curtis R.A., Munro A.W., Leys D. The crystal structure of the FAD/NADPH-binding domain of flavocytochrome P450 BM3 // FEBS J. - 2012. - Vol. 279, № 9. - P. 16941706.

170. Sevrioukova I.F., Li H., Zhang H., Peterson J.A., Poulos T.L. Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999. - Vol. 96, № 5. - P. 1863-1868.

171. Roccatano D. Structure, dynamics, and function of the monooxygenase P450 BM-3: Insights from computer simulations studies // J. Phys. Condens. Matter. - IOP Publishing, 2015. - Vol. 27. - P. 1-16.

172. Whitehouse C.J.C., Bell S.G., Wong L.-L. P450 bm3 (CYP102A1): connecting the dots // Chem. Soc. Rev. - 2012. - Vol. 41, № 3. - P. 1218-1260.

173. Haines D.C., Tomchick D.R., Machius M., Peterson J.A. Pivotal Role of Water in the Mechanism of P450BM-3 // Biochemistry. - 2001. - Vol. 40, № 45. - P. 13456-13465.

174. Seifert A., Vomund S., Grohmann K., Kriening S., Urlacher V.B., Laschat S., Pleiss J. Rational design of a minimal and highly enriched CYP102A1 mutant library with improved regio-, stereo- and chemoselectivity // ChemBioChem. - 2009. - Vol. 10, № 5. - P. 853-861.

175. Kitazume T., Haines D.C., Estabrook R.W., Chen B., Peterson J.A. Obligatory Intermolecular Electron-Transfer from FAD to FMN in Dimeric P450BM-3 // Biochemistry. - 2007. - Vol. 46, № 42. - P. 11892-11901.

176. Yeom H., Sligar S.G., Fulco A.J. The role of Thr268 in oxygen activation of cytochrome P450BM-3 // Biochemistry. - 1995. - Vol. 34. - P. 14733-14740.

177. Sevrioukova I., Peterson J.A. Domain-domain interaction in cytochrome P450BM-3 // Biochemie. - 1996. - Vol. 78. - P. 744-751.

178. Zhang H., Yokom A.L., Cheng S., Su M., Hollenberg P.F., Southworth D.R., Osawa Y. The full-length cytochrome P450 enzyme CYP102A1 dimerizes at its reductase domains and has flexible heme domains for efficient catalysis // J. Biol. Chem. - 2018. - Vol. 293, № 20. - P. 7727-7736.

179. Jeffreys L.N., Pacholarz K.J., Johannisen L.O., Girvan H.M., Barran P.E., Voice M.W., Munro A.W. Characterization of the structure and interactions of P450 BM3 using hybrid mass spectrometry approaches // J. Biol. Chem. - 2020. - Vol. 295, № 22. - P. 75957607.

180. Krivitskaya A. V., Pometun A.A., Parshin P.D., Khrenova M.G., Urlacher V.B., Tishkov V.I. Full Structure Modeling of Three-Domains Monooxygenase CYP102A1 BM3 from Bacillus megaterium // Moscow Univ. Chem. Bull. - 2020. - Vol. 75, № 3. - P. 162-166.

181. Daff S.N., Chapman S.K., Turner K.L., Holt R.A., Govindaraj S., Poulos T.L., Munro A.W. Redox Control of the Catalytic Cycle of Flavocytochrome P-450 BM3 // Biochemistry. - 1997. - Vol. 36. - P. 13816-13823.

182. Rittle J., Green M.T. Cytochrome P450 Compound I: Capture, Characterization, and C-H Bond Activation Kinetics // Science (80-. ). - 2010. - Vol. 330. - P. 933-937.

183. Warman A.J., Roitel O., Neeli R., Girvan H.M., Seward H.E., Murray S.A., McLean K.J., Joyce M.G., Toogood H., Holt R.A., Leys D., Scrutton N.S., Munro A.W. Flavocytochrome P450 BM3: an update on structure and mechanism of a biotechnologically important enzyme // Biochem. Soc. Trans. - 2005. - Vol. 33, № 4. - P. 747-753.

184. English N., Palmer C.N.A., Alworth W.L., Kang L., Hughes V., Wolf C.R. Fatty acid signals in Bacillus megaterium are attenuated by cytochrome P-450-mediated hydroxylation // Biochem J. - 1997. - Vol. 368. - P. 363-368.

185. Urlacher V.B., Girhard M. Cytochrome P450 monooxygenases: An update on perspectives for synthetic application // Trends Biotechnol. - Elsevier Ltd, 2012. - Vol. 30, № 1. - P. 26-36.

186. Otey C.R., Bandara G., Lalonde J., Takahashi K., Arnold F.H. Preparation of human metabolites of propranolol using laboratory-evolved bacterial cytochromes P450 // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - Vol. 93, № 3. - P. 494-499.

187. Landwehr M., Hochrein L., Otey C.R., Kasrayan A., Bäckvall J.E., Arnold F.H. Enantioselective a-hydroxylation of 2-arylacetic acid derivatives and buspirone catalyzed by engineered cytochrome P450 BM-3 // J. Am. Chem. Soc. - 2006. - Vol. 128, № 18. -P. 6058-6059.

188. Park S.H., Kim D.H., Dooil K., Kim D.H., Jung H.C., Pan J.G., Taeho A., Donghak K., Yun C.H. Engineering bacterial cytochrome P450 (P450) BM3 into a prototype with human P450 enzyme activity using indigo formation // Drug Metab. Dispos. - 2010. -Vol. 38, № 5. - P. 732-739.

189. Damsten M.C., van Vugt-Lussenburg B.M.A., Zeldenthuis T., de Vlieger J.S.B., Commandeur J.N.M., Vermeulen N.P.E. Application of drug metabolising mutants of cytochrome P450 BM3 (CYP102A1) as biocatalysts for the generation of reactive metabolites // Chem. Biol. Interact. - 2008. - Vol. 171, № 1. - P. 96-107.

190. Eiben S., Bartelmäs H., Urlacher V.B. Construction of a thermostable cytochrome P450 chimera derived from self-sufficient mesophilic parents // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007. - Vol. 75, № 5. - P. 1055-1061.

191. Girvan H.M., Dunford A.J., Neeli R., Ekanem I.S., Waltham T.N., Joyce M.G., Leys D., Curtis R.A., Williams P., Fisher K., Voice M.W., Munro A.W. Flavocytochrome P450 BM3 mutant W1046A is a NADH-dependent fatty acid hydroxylase: Implications for the mechanism of electron transfer in the P450 BM3 dimer // Arch. Biochem. Biophys. -Elsevier Inc., 2011. - Vol. 507, № 1. - P. 75-85.

192. Chowdhary P.K., Stewart L., Lopez C., Haines D.C. Short communication A single mutation in P450BM-3 enhances acyl homoserine lactone : Acyl homoserine substrate binding selectivity nearly 250-fold // J. Biotechnol. - 2008. - Vol. 135, № 4. - P. 374376.

193. Li Q.S., Ogawa J., Schmid R.D., Shimizu S. Residue size at position 87 of cytochrome P450 BM-3 determines its stereoselectivity in propylbenzene and 3-chlorostyrene oxidation // FEBS Lett. - 2001. - Vol. 508, № 2. - P. 249-252.

194. Sulistyaningdyah W.T., Ogawa J., Li Q.S., Maeda C., Yano Y., Schmid R.D., Shimizu S. Hydroxylation activity of P450 BM-3 mutant F87V towards aromatic compounds and its

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207

208

application to the synthesis of hydroquinone derivatives from phenolic compounds // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2005. - Vol. 67, № 4. - P. 556-562.

Urlacher V.B., Makhsumkhanov A., Schmid R.D. Biotransformation of ß-ionone by engineered cytochrome P450 BM-3 // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. - Vol. 70, № 1. - P. 53-59.

Watanabe Y., Laschat S., Budde M., Affolter O., Shimada Y., Urlacher V.B. Oxidation of acyclic monoterpenes by P450 BM-3 monooxygenase: influence of the substrate E/Z-isomerism on enzyme chemo- and regioselectivity // Tetrahedron. - 2007. - Vol. 63, № 38. - P. 9413-9422.

Zhou H., Wang B., Wang F., Yu X., Ma L., Li A., Reetz M.T. Chemo- and Regioselective Dihydroxylation of Benzene to Hydroquinone Enabled by Engineered Cytochrome P450 Monooxygenase // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2019. - Vol. 58, № 3. - P. 764-768.

Jeffreys L.N., Poddar H., Golovanova M., Levy C.W., Girvan H.M., McLean K.J., Voice M.W., Leys D., Munro A.W. Novel insights into P450 BM3 interactions with FDA-approved antifungal azole drugs // Sci. Rep. - 2019. - Vol. 9, № 1. - P. 1-12.

Ost T.W.B., Miles C.S., Murdoch J., Cheung Y., Reid G. a, Chapman S.K., Munro A.W. Rational re-design of the substrate binding site of flavocytochrome P450 BM3 // FEBS Lett. - 2000. - Vol. 486. - P. 173-177.

Arnold F.H., Peters M.W., Meinhold P. Regio- and enantioselective alkane hydroxylation with modified cytochrome P450. // J. Am. Chem. Soc. - 2003. - Vol. 123. - P. 1344213450.

Meinhold P., Peters M.W., Hartwick A., Hernandez A.R., Arnold F.H. Engineering cytochrome P450 BM3 for terminal alkane hydroxylation // Adv. Synth. Catal. - 2006. -Vol. 348, № 6. - P. 763-772.

Whitehouse C.J.C., Bell S.G., Yang W., Yorke J.A., Blanford C.F., Strong A.J.F., Morse E.J., Bartlam M., Rao Z., Wong L.L. A highly active single-mutation variant of P450BM3(CYP102A1) // ChemBioChem. - 2009. - Vol. 10. - P. 1654-1656.

Roberts A.G., Katayama J., Kaspera R., Ledwitch K. V., Le Trong I., Stenkamp R.E., Thompson J.A., Totah R.A. The role of cytochrome P450 BM3 phenylalanine-87 and threonine-268 in binding organic hydroperoxides // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. -Elsevier B.V., 2016. - Vol. 1860, № 4. - P. 669-677.

Appel D., Lutz-Wahl S., Fischer P., Schwaneberg U., Schmid R.D. A P450 BM-3 mutant hydroxylates alkanes, cycloalkanes, arenes and heteroarenes // J. Biotechnol. - 2001. -Vol. 88, № 2. - P. 167-171.

Li Q.S., Schwaneberg U., Fischer M., Schmitt J., Pleiss J., Lutz-Wahl S., Schmid R.D. Rational evolution of a medium chain-specific cytochrome P-450 BM-3 variant // Biochim. Biophys. Acta - Protein Struct. Mol. Enzymol. - 2001. - Vol. 1545, № 1-2. - P. 114-121.

Santos G.D.A., Dhoke G. V., Davari M.D., Ruff A.J., Schwaneberg U. Directed evolution of P450 BM3 towards functionalization of aromatic O-heterocycles // Int. J. Mol. Sci. -2019. - Vol. 20, № 13.

Wang Z.J., Peck N.E., Renata H., Arnold F.H. Cytochrome P450-catalyzed insertion of carbenoids into N-H bonds // Chem. Sci. - 2014. - Vol. 5, № 2. - P. 598-601.

Lewis J.C., Bastian S., Bennett C.S., Fu Y., Mitsuda Y., Chen M.M., Greenberg W.A.,

Wong C.H., Arnold F.H. Chemoenzymatic elaboration of monosaccharides using engineered cytochrome P450BM3 demethylases // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2009.

- Vol. 106, № 39. - P. 16550-16555.

209. O'Hanlon J.A., Ren X., Morris M., Wong L.L., Robertson J. Hydroxylation of anilides by engineered cytochrome P450BM3 // Org. Biomol. Chem. - Royal Society of Chemistry, 2017. - Vol. 15, № 41. - P. 8780-8787.

210. Steck V., Kolev J.N., Ren X., Fasan R. Mechanism-Guided Design and Discovery of Efficient Cytochrome P450-Derived C-H Amination Biocatalysts // J. Am. Chem. Soc. -2020. - Vol. 142, № 23. - P. 10343-10357.

211. Lewis J.C., Mantovani S.M., Fu Y., Snow C.D., Komor R.S., Wong C.H., Arnold F.H. Combinatorial alanine substitution enables rapid optimization of cytochrome P450BM3 for selective hydroxylation of large substrates // ChemBioChem. - 2010. - Vol. 11, № 18.

- P. 2502-2505.

212. Wong T.S., Arnold F.H., Schwaneberg U. Laboratory Evolution of Cytochrome P450 BM-3 Monooxygenase for Organic Cosolvents // Biotechnol. Bioeng. - 2004. - Vol. 85, № 3. - P. 351-358.

213. Sadeghi S.J., Di Nardo G., Gilardi G. Chimeric cytochrome P450 3A4 used for in vitro prediction of food-drug interactions // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2020. - Vol. 67, № 4. - P. 541-548.

214. Beyer N., Kulig J.K., Bartsch A., Hayes M.A., Janssen D.B., Fraaije M.W. P450BM3fused to phosphite dehydrogenase allows phosphite-driven selective oxidations // Appl. Microbiol. Biotechnol. - Applied Microbiology and Biotechnology, 2017. - Vol. 101, № 6. - P. 2319-2331.

215. Beyer N., Kulig J.K., Fraaije M.W., Hayes M.A., Janssen D. Exploring PTDH-P450BM3 variants for the synthesis of drug metabolites // ChemBioChem. - 2017. - P. 326-337.

216. Dodhia V.R., Fantuzzi A., Gilardi G. Engineering human cytochrome P450 enzymes into catalytically self-sufficient chimeras using molecular Lego // J. Biol. Inorg. Chem. - 2006.

- Vol. 11, № 7. - P. 903-916.

217. Di Nardo G., Fantuzzi A., Sideri A., Panicco P., Sassone C., Giunta C., Gilardi G. Wildtype CYP102A1 as a biocatalyst: Turnover of drugs usually metabolised by human liver enzymes // J. Biol. Inorg. Chem. - 2007. - Vol. 12, № 3. - P. 313-323.

218. Sowden R.J., Yasmin S., Rees N.H., Bell S.G., Wong L.L. Biotransformation of the sesquiterpene (+)-valencene by cytochrome P450cam and P450BM-3 // Org. Biomol. Chem. - 2005. - Vol. 3, № 1. - P. 57-64.

219. Seifert A., Antonovici M., Hauer B., Pleiss J. An Efficient Route to Selective Bio-oxidation Catalysts: an Iterative Approach Comprising Modeling, Diversification, and Screening, Based on CYP102A1 // ChemBioChem. - 2011. - Vol. 12, № 9. - P. 13461351.

220. Koch D.J., Chen M.M., Van Beilen J.B., Arnold F.H. In vivo evolution of butane oxidation by terminal alkane hydroxylases AlkB and CYP153A6 // Appl. Environ. Microbiol. - 2009. - Vol. 75, № 2. - P. 337-344.

221. Zilly F.E., Acevedo J.P., Augustyniak W., Deege A., Reetz M.T. Tuning a P450 enzyme for methane oxidation // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2011. - Vol. 50, № 12. - P. 27202724.

222. Yu S., Zhu L., Zhou C., An T., Zhang T., Jiang B., Mu W. Promising properties of a formate dehydrogenase from a methanol- assimilating yeast Ogataea parapolymorpha DL-1 in His-tagged form // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2014. - Vol. 98, № 4. - P. 16211630.

223. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues // Eur. J. Biochem. - 2000. - Vol. 267, № 5. - P. 1280-1289.