Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы микроорганизмов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Каманина, Ольга Александровна

• Каманина, Ольга Александровна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Каманина, Ольга Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Золь - гель метод и его применение

1.2. Механизм и условия формирования кремнийсодержащих золь-гель матриц

1.2.1. Формирование мономодальных и бимодальных золь-гель матриц

1.2.1.1. Формирование мономодальных золь-гель матриц

1.2.1.2. Формирование бимодальных золь-гель матриц

1.3. Преимущества золь-гель матриц

1.4. Методы изучения состава и структуры кремнийорганических матриц

1.4.1. Инфракрасная-спектроскопия

1.4.2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

1.4.3. Световая микроскопия

1.5. Золь-гель процесс как метод иммобилизации биоматериала

1.5.1. Золь-гель процесс как метод иммобилизации ферментов

1.5.2. Золь-гель процесс как метод иммобилизации целых клеток микроорганизмов

1.5.3. Биосенсоры на основе иммобилизованных в золь-гель матрицы клеток и ферментов

1.5.3.1. Оптические биосенсоры

1.5.3.2. Электрохимические биосенсоры

1.5.4. Применение золь-гель технологии в хроматографии

1.6. Заключение

2.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы

2.2. Культивирование клеток микроорганизмов

2.3. Иммобилизация биоматериала и формирование электрода

2.4. Биосенсорные измерения

2.4.1. Влияние ионов тяжелых металлов на дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов

2.4.2. Влияние УФ на дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов

2.5. ИК-спектроскопия

2.6. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

2.7. Оптическая микроскопия

2.8. Моделирование процесса спиртового брожения

2.9. Хроматографические измерения

2.10. Статический режим деградации метанола

2.11. Динамический режим деградации метанола

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Динамика формирования кремнийорганических золь-гель структур51 3.2. Изучение структуры кремнийорганических матриц методом СЭМ

3.2.1. Изучение мономодальных и бимодальных матриц

3.2.2. Иммобилизация Gluconobacter oxydans в кремнийорганические матрицы различного состава

3.2.3. Иммобилизация Pichia augusta в кремнийорганические матрицы различного состава

3

3.3. Влияние соотношения силановых прекурсоров ТЭОС/МТЭС на характеристики биорецептора

3.3.1. Разработка макета биосенсора, на основе иммобилизованного в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы фермента глюкозооксидазы

3.3.2. Разработка макета биосенсора на основе иммобилизованных микроорганизмов в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы

3.3.2.1 Субстратная специфичность иммобилизованных уксуснокислых бактерий и метилотрофных дрожжей

3.3.2.2 Чувствительность биосенсоров на основе разработанных рецепторных элементов

3.3.2.2 Операционная стабильность биосенсора на основе разработанных биорецепторных элементов

3.3.2.4 Долговременная стабильность биосенсоров на основе разработанных биорецепторных элементов

3.3.2.5 рН среды

3.4. Преимущества золь-гель капсулы для защиты клеток от вредных факторов

3.4.2. Защита от токсического действия ионов тяжелых металлов

3.4.3. Защита от УФ-облучения

3.5. Апробация полученного гетерогенного биокатализатора на основе инкапсулированных в золь-гель матрицу метилотрофных дрожжей

3.5.1. Биосенсор для анализа бродильных масс на содержание этанола и сточных вод на содержание метанола

3.5.2. Статический и динамический режим утилизации метанолсодержащих стоков

3.5.2.1 Статический режим деградации метанола

3.5.2.2 Динамический режим пропускания

4

3.5.3.3. Сравнение статического и динамического режимов

3.5.3.Утилизация метанола в реальных образцах сточных вод

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BSE — обратно-отраженные электроны

SE — вторичные электроны

Vmax — максимальная скорость развития сигнала

АСМ — атомно-силовая микроскопия

БЭТ — капилярная адсорбция/десорбция азота

ВКМ — всероссийская коллекция микроорганизмов

ВРД — ведомственный руководящий документ.

ГО — глюкозооксидаза

ГХ — газовая хроматография

ДОЭ — детектор отраженных электронов

ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия

ДЭАЭ — диэтиламиноэтил

ИК — инфракрасное излучение

Км — константа Михаэлиса

МНПВО — многократно нарушенного полного внутреннего отражения МТЭС — метилтриэтоксисилан НФ — неподвижная фаза

ПАУ — полициклические ароматические углеводороды

ПВА — поли винил ацетат

ПВС — поливиниловый спирт

ПДК — предельно допустимая концентрация

ПЭГ — полиэтиленгликоль

РЭМ — растровая электронная микроскопия

СЭМ — сканирующая электронная микроскопия

ТМОС — тетраметоксисилан

ТЭОС — тетраэтоксисилан

УФ — ультрафиолет

ФЛ — фотолюминесценция

ЭПР — электронный парамагнитный резонанс

ЯМР — ядерный магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы микроорганизмов»

ВВЕДЕНИЕ

В процессе эволюции природных систем живые организмы развивают различные минерализованные структуры, которые представляют собой сложные иерархические архитектуры на основе композитных биоматериалов [1]. Важнейшая функция таких систем — защита организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий. Примерами одноклеточных организмов с минеральной оболочкой являются диатомные водоросли и радиолярии [2]. Эти организмы эволюционировали таким образом, что стали способны формировать силикатные капсулы на своей поверхности, образуя экзо-скелет для обеспечения механической защиты. При этом силикатная капсула не препятствует поступлению питательных веществ в клетку. Такие одноклеточные системы вдохновили исследователей на создание гибридных биоматериалов на основе живых клеток, инкапсулированных в неорганические полимерные капсулы [3-6].

Преимущества неорганических полимерных материалов, таких как силикагели, заключаются в их механической прочности, стабильности, инертности и благоприятном для большинства микроорганизмов химическом окружении, однако их применение существенно ограничено из-за низкой скорости пассивной диффузии питательных и газообразных субстратов. Особый интерес представляет иммобилизация биоматериала в гибридные кремнийорганические матрицы, которые имеют ряд преимуществ перед органическими и неорганическими полимерами: длительное сохранение на высоком уровне биологической активности микроорганизмов после завершения процесса иммобилизации; обеспечение эффективной защиты от внешних, повреждающих структуру матрицы, факторов, таких как механические, тепловые и биологические воздействия; постоянный объем и высокая пористость матрицы независимо от состава среды, что обеспечивает высокую скорость диффузионных потоков [7].

Для получения кремнийорганических материалов обычно применяют золь-гель

метод, который не требует энергоемкого, дорогостоящего оборудования, является

экономичным и экологически чистым [8, 9]. Важно отметить, что в подавляющем

большинстве случаев золь-гель технологии используют для иммобилизации ферментов

[7, 10, 11]. Использование кремнийорганических матриц на основе модифицированных

силикагелей для иммобилизации целых клеток является относительно новым

направлением исследований в прикладной биотехнологии, в том числе для получения

8

инкапсулированных клеток, так называемых «искусственных спор» («artificial spore») [12] Инкапсулированные микроорганизмы представляют значительный интерес для разработки эффективных биокатализаторов [13, 14], в том числе при создании биосенсоров [15].

Для получения кремнийорганических материалов в качестве силановых прекурсоров, как правило, используют тетраалкоксисиланы и алкилтриалкоксисиланы. Значительное влияние на размер пор получаемой золь-гель матрицы оказывает соотношение силановых прекурсоров [16]. Уменьшение полярности кремнийсо держащей матрицы за счет введения гидрофобной добавки (алкилтриалкоксисилана) способствует увеличению жизнеспособности иммобилизованных клеток, что приводит к увеличению долговременной стабильности при работе биорецепторных элементов биосенсоров [17]. Таким образом, варьирование количества гидрофобной добавки позволяет добиться, с одной стороны, высокой активности иммобилизованного биоматериала, а, с другой стороны, удовлетворительной прочности золь-гель матрицы. Для повышения стабильности структуры, регулирования реологических свойств формируемой матрицы и управления процессами ее структурообразования, в том числе создания в растворе пространственной структуры высокомолекулярного кремнийорганического полимера, модифицируют поверхность частиц золь-геля добавками полиэтиленгликоля (ПЭГ). Такие системы обладают высокой пластичностью, практически неограниченной седиментационной устойчивостью и высокой пористостью.

К недостаткам золь-гель метода для иммобилизации микроорганизмов можно отнести выделение в процессе формирования матрицы низших спиртов, которые токсичны для клеток [10]. Метилотрофные дрожжи и уксуснокислые бактерии характеризуются эффективной ферментативной системой окисления спиртов, поэтому иммобилизация этих микроорганизмов в золь-гель матрицы не должна приводить к потере активности под действием образующегося в процессе конденсации спирта. Следует отметить, что микробные сенсоры на основе метилотрофных дрожжей и уксуснокислых бактерий находят применение в биотехнологии и пищевой промышленности для мониторинга ферментационных процессов и контроля стоков производств.

Таким образом, разработка стабильных гетерогенных биокатализаторов, на основе иммобилизованных в кремнийорганические ферментов и целых клеток

микроорганизмов, которые можно использовать, в том числе, как биораспознающие элементы биосенсора, является актуальной задачей для экологии, биотехнологии и биоаналитической химии.

Цель работы:

Выявление закономерностей формирования ЗБ-архитектуры

биокремнийорганической золь-гель матрицы под влиянием клеток микроорганизмов для разработки гетерогенных биокатализаторов.

Задачи работы:

• Выявить динамику золь-гель процессов, протекающих в системе силановых прекурсоров метилтриэтоксисилана (МТЭС) и тетраэтоксисилана (ТЭОС) и порообразователя полиэтиленгликоля (ПЭГ) в условиях основного катализа методом ИК-спектроскопии.

• Исследовать структуру гибридных биоматериалов, полученных путем иммобилизации уксуснокислых бактерий С1исопоЬас1ег охус1ат и метилотрофных дрожжей Р1сЫа в кремнийорганические матрицы, с использованием методов ИК-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии. Выявить влияние соотношения кремнийорганических прекурсоров (ТЭОС и МТЭС) и порообразователя (ПЭГ 3000) на ЗО структуру образующихся материалов, их морфологию и степень инкапсулирования микроорганизмов.

• Изучить динамику инкапсулирования клеток микроорганизмов в выбранных условиях.

• Определить влияние соотношения силановых прекурсоров и стрессовых факторов (ионов тяжелых металлов и УФ излучения) на дыхательную активность микроорганизмов, иммобилизованных в золь-гель матрицы, в биораспознающем элементе сенсора.

• Исследовать возможность применения разработанных гетерогенных биокатализаторов для очистки и контроля метанолсодержащих стоков и мониторинга содержания этанола в процессе брожения.

Научная новизна

Впервые методом СЭМ установлено, что метилотрофные дрожжи Pichia augusta и уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans участвуют в самоорганизованном формировании архитектуры гибридной биокремнийорганической матрицы, причем архитектура зависит от типа микроорганизма.

Впервые установлена возможность инкапсулирования метилотрофных дрожжей Pichia augusta в бимодальные кремнийорганические матрицы с использованием золь-гель технологий как способа получения стабильных гетерогенных биокатализаторов. Показано, что выделяющийся в ходе золь-гель процессов спирт не оказывает токсического действия на эти микроорганизмы.

Изучена динамика образования капсулы вокруг каждой дрожжевой клетки методом оптической микроскопии. Показано, что в условиях основного катализа фторидом натрия капсулы вокруг клеток дрожжей формируются в течение пяти часов. Результаты исследования вносят вклад в развитие методов получения «искусственных спор» на основе инкапсулированных клеток.

Впервые показано, что 3D архитектура гибридных биоматериалов определяется соотношением кремниевых прекурсоров МТЭС и ТЭОС, это находит отражение в свойствах биокатализатора.

Практическая значимость

Работа вносит практический вклад в разработку гетерогенных биокатализаторов. Предложенный метод иммобилизации прост в исполнении и позволяет получать стабильные, высокочуствительные гетерогенные биокатализаторы, не требует энергоемкого, дорогостоящего оборудования и позволяет получать материалы сложного химического состава и структуры.

Разработана методика инкапсулирования метилотрофных дрожжей с помощью золь-гель технологии для получения стабильных биочувствительных гетерогенных биокатализаторов, которые можно использовать для тиражирования стандартных биораспознающих элементов сенсоров, гетерогенных биокатализаторов для очистки стоков химических и биотехнологических производств.

Выявлено, что кремнийорганическая капсула, которая формируется вокруг живых клеток метилотрофных дрожжей Pichia augusta, обеспечивает защиту иммобилизованных микроорганизмов в стрессовых условиях (присутствие ионов тяжелых металлов, облучение УФ), что можно использовать для периодической

стерилизации биосенсорной системы. Это позволит избежать микробной контаминации и дополнительно увеличит воспроизводимость анализа, основанного на изменении дыхательной активности микроорганизмов.

Разработаны и апробированы макеты биосенсора для определения содержания этилового спирта в образцах бродильной массы и утилизации метилового спирта в метанолсодержащих стоках химических производств. Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсора характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью.

Разработанный гетерогенный биокатализатор на основе метилотрофных дрожжей, иммобилизованных в кремнийорганическую матрицу, использован при разработке модельных биофильтров, которые перспективны для утилизации метанола в стоках промышленных производств.

Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы», соглашение № 14.В37.21.1231, а так же Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», 2013 г. (г. Липецк), госконтракт № 2244ГУ 1/2013.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Золь - гель метод и его применение

Золь-гель метод - это метод получения материалов, в том числе наноматериалов, включающий получение золя с последующим переводом его в гель, т. е. в коллоидную систему, состоящую из жидкой дисперсионной среды, заключенной в пространственную сетку, образованную соединившимися частицами дисперсной фазы.

Общее название «золь-гель процесс» объединяет большую группу методов получения материалов из растворов, существенным элементом которых является образование на одной из стадий процесса геля. В основе золь-гель процесса лежат процессы контролируемого гидролиза соединений алкоксидов М(ОЯ)х (М = 81, Т1, Ъх, V, Ъл, А1, Бп, Се, Мо, V/ и др.) или соответствующих хлоридов, в водной или органической, чаще спиртовой, среде и получения структур из эфиров кремниевой кислоты [18].

Золь-гель технологии являются хорошо развитой областью материаловедения. Превращение золей в гели - основа новейших нанотехнологий получения материалов, керамических мембран, оптических и антикоррозионных покрытий, фотоматериалов, высокодисперсных абразивов и других материалов с уникальными свойствами и регулируемой структурой [1-3]. Этот метод позволяет достичь снижения энергозатрат и высокой степени чистоты продуктов на всех стадиях синтеза при минимуме затрат на её достижение. Становится возможным получение данным методом продуктов, которые характеризуются: монофазной кристаллической структурой, обладающей строго стехиометрическим составом; отсутствием посторонних фаз [18].

Исключительно важную роль в золь-гель методе играют процессы удаления растворителя из геля (сушки). В зависимости от метода их осуществления могут быть получены различные продукты синтеза (гидрогели, ксерогели, амбигели, криогели, аэрогели). Общими особенностями этих продуктов являются сохранение микро- и наноразмеров структурных элементов и достаточно высокие значения удельной

■у

поверхности (сотни м /г), хотя объемная плотность может отличаться в сотни раз.

Новым перспективным направлением является применение золь-гель технологии в качестве каталитических покрытий сенсоров, мембран с иммобилизованными органическими молекулами для различных сенсоров, мембран топливных элементов, а также основных чувствительных элементов металлооксидных газовых сенсоров [19-21]

Безусловно, одним из широко распространенных применений золь-гель материалов в последние два десятилетия является использование для создания биокатализаторов для биосенсоров как матрицы при иммобилизации органических биомолекул или клеток микроорганизмов [22-24]. Такие сенсоры полагаются на непосредственный контакт биорецепторного элемента с физическим преобразователем и с компьютером, который фиксирует измеримый сигнал при протекании биологической реакции. Поэтому все вышеперечисленное делает золь-гель метод столь популярным. Преимущества таких систем позволяют применять их в качестве оптических и электрохимических датчиков, диагностических устройств и катализаторов. С быстрым развитием золь-гель технологии прекурсоров, наноинжерии полимеров и усовершенствованием методов, эта технология обещает вывести иммобилизацию биоматериала на новый уровень [25].

1.2. Механизм и условия формирования кремнийсодержащих золь-гель матриц

Традиционно под золь-гель методом понимают совокупность стадий, включающую приготовление раствора прекурсора, последовательный перевод его сначала в золь, а затем в гель за счёт процессов гидролиза и конденсации, последующее старение, высушивание (в некоторых методах термообработку продукта). Однако в последнее время этот термин часто используется для обозначения процессов, в которых отсутствует одна из этих стадий или стадии идут параллельно [26]. Особенно важными для получения наноструктур с заданными характеристиками являются процессы образования конденсированных форм при гидролизе прекурсоров, эта стадия определяет морфологию и фазовый состав получаемых продуктов [27]. Таким образом, золь-гель метод даёт возможность достаточно просто получать композиционные материалы.

Формирование золь-гель матрицы на основе эфиров кремниевой кислоты включает процессы гидролиза, в результате которого получают высокодисперсный коллоидный раствор — золь. Размер частиц дисперсной фазы в стабильном золе 10"9-10"6 м. Увеличение концентрации дисперсной фазы приводит к появлению коагуляционых контактов между частицами и началу структурирования — гелеобразования (вторая стадия золь-гель процесса). Коагуляционные структуры характеризуются низкой прочностью, определяемой Ван-дер-Ваальсовыми силами. Такие структуры характеризуются полным самопроизвольным восстановлением после механического разрушения [28].

Для повышения стабильности структур, регулирования реологических свойств и управления процессами структурообразования воздействуют на прочность контактов путем модификации поверхности частиц добавками поливинилацетата (ПВА), полиэтиленгликоля (ПЭГ) или путем создания в растворе пространственной структуры высокомолекулярного органического полимера. Такие системы обладают высокой пластичностью и практически неограниченной седиментационной устойчивостью; структура получаемых гелей сохраняется даже при таких больших размерах частиц дисперсной фазы, как 10"4 м.

При удалении дисперсионной среды (третья стадия процесса) появляются прочные фазовые контакты, при этом тиксотропные свойства теряются, и механические разрушения структуры становятся необратимыми. При высушивании гель

15

превращается в твердое тонкопористое тело (ксерогель) с конденсационно-кристаллизационной структурой.

Золь-гель метод базируется на способности формировать металл-оксидные, кремниевые и органосилоксановые матрицы, пористость которых определяется кремнийорганическими прекурсорами. В первой реакции, один или два силановых прекурсора (как правило, тетраметоксисилан 81(ОСНз)4 или метилтриметоксисилан СНз8|'(ОСНз)з), гидролизуются в присутствии воды, в результате происходит формирование силанольных (Б ¡-ОН) групп [29].

Формирование золь-гель матрицы на основе силановых прекурсоров включает процессы гидролиза ((1) и (2), рис. 1) и поликонденсации с образованием оксоалкоксопроизводных ((3) и (4), рис. 1) [12]. Процесс гидролиза и поликонденсации протекает по механизму [2].

ОЯ ОЯ

\ ш ]

.¡ЗЬмппСЖ +Н,0 __

__СМ'ЧШИ-Т^ -г Г^и -^0__^,О1>Ч||||ОН ^

к -ЯОН ' " 1

ОЫ ОИ

кгЛ.: НС1 ИаБ ШОН

К- К- К,К':СН3,С2Н5,С3Н7

I Ы I

хугл^--аЬимиСЖ +Н,0 -Ю/~__,:Зь.,||||ОН (2)

К0 к -ЯОН К° к

ОК о я

сж

.1ь>и|

ОЯ

ко^т..и.|ОН + НО|||...-^----

1 (и«-81-

ЯО ОЯ /

ЯО-

ОЯ

к

ОЯ

. ^.иЩ

А

-н2о

\—Б!-

|ОЯ

я

Я'

V

ЯО ОЯ

яо-~т •"|ОН + яо-—|......... .»

1 I -н 20

ОЯ ОЯ

/

V

ЯО-51 оя

ч ?

-81-^аЯ'

ж

N.

(3)

Однако характеристики и свойства отдельных золь-гель процессов связаны с рядом факторов, которые оказывают воздействие на скорость гидролиза и реакции конденсации это, например, рН, температура и время реакции, концентрация реагентов, природа и концентрация катализаторов, НгО^ молярное отношение и время сушки. Из вышеперечисленных факторов наиболее важными являются: рН, природа катализатора, НгО/^ молярное отношение и температура. Таким образом, контролируя эти факторы, можно изменять структуру и свойства золь-гель производных неорганических сетей в широком диапазоне. Например, Сакка и др. [30] отметили, что гидролиз ТЭОС с использованием кислотного катализа НС1 дает вязкий раствор, а следовательно, и кристаллический гель, который наиболее часто используют для иммобилизации биоматериала. Эти результаты согласуются со структурами, которые возникают при использовании силановых прекурсоров в кислой среде. При протекании реакции гидролиза в кислых условиях образуются линейные полимеры, а при основных катализаторах — разветвленные кластеры или коллоидные гели [29].

В кислых условиях, вполне вероятно, что алкоксидная группа является протонированной. Электронная плотность удалена от атомов кремния, что делает его более электрофильным и, следовательно, более восприимчивым к воздействию нуклеофила. Это приводит к формированию пента-координированного переходного состояния кремния, и реакция относится к вкг типу. Переходное состояние разрушается путем отщепления спирта и инверсией тетраэдра кремния, как показано на схеме 5.

СЖ

яо--(Ж + Н+

Ж

I

(Ж Б! ЯО--О-Н

I *

(5)

СЖ я

+ нон

\

'О-

ОЯ н+

оя

1Ю—1-

он + [ЮН +н+

Катализированный основаниями гидролиз кремниевых прекурсоров протекает немного медленнее, чем кислотно-катализируемый гидролиз при эквивалентной концентрации катализатора. Кислороды основных алкоксидов имеют тенденцию

17

отталкивать нуклеофил. Однако, как только начальный гидролиз произошел, следующие реакции протекают ступенчато, причем каждая последующая алкоксидная группа легче удаляется из мономера, чем предыдущая. Хотя гидролиз в основной среде идет медленно, он стремится быть полным и необратимым.

RO-

OR

¿r

-OR

OR

F----Ji----OR

с/ N»

Ri

F----Si----OR

w/7 \)R

(+H20)

)R

e

0

(6)

RO^ ^OR

F----Si----OH2

/ \

RO OR

OR

HO-Si-OR + HÖR + F"

OR

(7)

На этапе гидролиза (6) происходит нуклеофильная атака F" по положительно поляризованному Si с образованием отрицательно заряженного интермедиата с пятикоординационным атомом Si; затем (7) происходит нуклеофильная атака НгО, за счет неподеленной пары электронов кислорода, образуется 6-координационный переходный комплекс; далее происходит перенос протона и элиминирование ROH и аниона фтора F".

Гидролиз и реакции конденсации происходят одновременно, как только гидролитическая реакция инициируется. Гидролиз ведет к формированию групп силанола (=Si-OH), при реакции конденсации образуются силоксановые группы (=Si-0-Si=), реакции заканчиваются выделением спирта и воды как побочных продуктов.

Гомогенная поликонденсация идет путем отщепления воды или ROH, в результате чего образуется золь. При дальнейшей конденсации образуются первичные сферические частицы, размер которых существенно зависит от pH среды. При формировании частиц в Na - К - фосфатном буферном растворе с рН=7,6 образуются частицы с размером 2-20 нм, которые затем соединяются в цепочечные ассоциаты за счет сил Ван-дер-Ваальса, водородных и силоксановых (ковалентных) связей (уравнения 3,4) [29].

Гетерогенная поликонденсация происходит на ранних стадиях старения системы, при этом образуются рыхлые частицы мицеллярного типа. Реакция поликонденсации продолжается внутри зародышей, при этом число силоксановых связей растет. На этой

стадии происходит синерезис — выделение воды в ходе продолжающейся химической реакции поликонденсации, уплотнение структуры геля (рис. 1). Первичные частицы образуют друг с другом длинные цепи, которые пронизывают весь объем золя. Возникновение узлов пространственной сетки сопровождается значительным возрастанием вязкости, появлением высокоэластичности, упругости, способности к сохранению формы и утрате текучести.

первичные сферические цепочечные ассоциаты

частицы (5-20 им)

Рисунок 1 - Схема уплотнения структуры геля

На стадии сушки происходит удаление жидкости из пространственной структуры геля, образуя ксерогель [29]. Гидролиз и конденсация заканчиваются, однако гель «стареет», структурные изменения, вызванные такими процессами, как созревание Оствальда, огрубления и синерезиса, продолжаются и достигается равновесие. Каждый из процессов вызван различными силами и влияет на структуру геля по-разному.

Оствальдское созревание происходит из-за различий в растворимости между более мелкими и более крупными частицами. Результаты градиента концентраций вокруг мелких частиц (поскольку они растворяются) приводит к диффузии свободных мономеров в сторону больших частиц. Так мелкие частицы растворяются, и крупные частицы растут, создается более равномерное и устойчивое распределение частиц по размерам. То есть частицы, достигшие определенного, критического размера, начинают расти за счет растворения более мелких частиц (созревание Оствальда, эффект Кельвина) [29, 31]. В кислой среде частицы диоксида кремния с диаметром приблизительно 2 нм остаются стабильными в золе. В системе, катализируемой основанием при рН 7 или выше, частицы могут достигать 10 нм в диаметре или больше [29].

Укрупнение частиц происходит параллельно с другими процессами, протекающими при формировании геля. Оно определяется различием в поверхностной

19

энергии частиц. В то время как оствальдовское созревание происходит с подвижными частицами в растворе, укрупнение происходит с частицами, которые входят в структуру геля. Две частицы, находящиеся в контакте, создают зону плотной отрицательной кривизны между собой. Это может усилить и стабилизировать гель, но также может уменьшить площадь поверхности и препятствовать диффузии, препятствуя поровому пространству [3].

Гель мягкий и гибкий, и сжатие геля происходит во время продолжающейся конденсации с относительно небольшими капиллярными силами. Синерезис продолжается до того, как равновесие не будет достигнуто между укрупненными частицами. Увеличение упругости геля приводит к увеличению внутреннего капиллярного давления [31], которое может быть очень высоко [29]. Во влажных гелях, т.е. гелях не подвергнутых термической обработке и полному высыханию, капиллярные силы никогда полностью не исчезают, и наблюдается синерезис, как правило, менее 5%. В течение золь-гель превращений, вязкость раствора постепенно увеличивается, поскольку золь становится связанным для того, чтобы сформировать твердую, пористую сетку геля [32].

1.2.1. Формирование мономодалъиых и бимодальных золь-гель матриц

Контролируя реакции гидролиза и поликонденсации, особенно путем изменения рН или температуры, можно воздействовать на природу и наличие гидроксилированных частиц, которые впоследствии, участвуют в реакции конденсации, и поэтому контролировать конечный состав геля. Например, кислотные условия приводят к уплотнению микропористых сетей (размер пор менее 2 нм), тогда как частицы мезопористых гели (размер пор от 2 до 50 нм) получают в основных условиях. В случае использования кремниевых прекуроров, можно также использовать органически модифицированные алкоксиды общей формулы К'п-81(ОК)4, где Я' — может варьироваться от алкильной цепи к амино- или тиол-содержащих групп. Поскольку ковалентная связь БьЯ' не чувствительна к гидролизу, в конечном материале поддерживаются дополнительные химические гидрофобные функции. Для создания бимодальной золь-гель структуры дополнительно вносят органические полимеры, которые выполняют роль порообразователей. Так мономодальные матрицы содержат в своем составе только поры одного вида — нанопоры, а бимодальные

матрицы имеют два вида — микропоры (0,3-5 мкм, 0,5-8 мкм) и нанопоры (2-20 нм) [28].

1.2.1.1. Формирование мономодальных золь-гель матриц

Формирование золь-гель матрицы на основе силановых прекурсоров включает процессы гидролиза и поликонденсации с образованием гидроксоалкоксопроизводных и оксоалкоксопроизводных (механизм образования мономодальных кремнийорганических золь-гель матриц описан в п. 1.2) [29]. При формировании матрицы образуются так называемые монолиты с наноразмерными порами. Изначально получаемые гели ломкие или полугибкие. Старение получаемой матрицы происходит от нескольких дней до нескольких недель, поскольку завершается процесс поликонденсации, что усиливает прочность и упругость получаемой матрицы;

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Каманина, Ольга Александровна, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Wang S., Guo Z. Bio-inspired encapsulation and functionalization of living cells with artificial shells // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2014. - V. 113,1. 1. - P. 483-500.

2. Nassif N., Bouvet O., Noelle Rager M., Roux P. , Coradin Т., Livage J. Living bacteria in silica gels // Nat Mater. - 2002. - V. 1,1. 1. - P. 42-44.

3. Dickson D., Ely R. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2013. - V. 97, I. 5. - P. 1809-1819.

4. Blondeau M., Coradin V. Living materials from sol-gel chemistry: current challenges and perspectives // Journal of Materials Chemistry. - 2012. - V. 22,1. 42. - P. 22335-22343.

5. Meunier P. F., Dandoy P., Su B.-L. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials // Journal of Colloid and Interface Science. - 2010. - V. 342. - P. 211 -224.

6. Depagne P. , Roux P. , Coradin V. How to design cell-based biosensors using the sol-gel process // Anal Bioanal Chem. - 2011. - V. 400,1. 4. - P. 965-976.

7. Sakai-Kato K., Ishikura K. Integration of biomolecules into analytical systems by means of silica sol-gel technology // National Institute of Health Science. - 2005. - V. 6. - P. 70-75.

8. Avnir D., Coradin Т., Lev O., Livage J. Recent bio-applications of sol-gel materials // Journal of Materials Chemistry. - 2006. - V. 16,1. II.-P. 1013-1030.

9. Collinson M. M. Recent trends in analytical applications of organically modified silicate materials // TrAC Trends in Analytical Chemistry. - 2002. - V. 21,1. 1. - P. 31-39.

10. Preda G., Bizerea O., Vlad-Oros B. Sol-gel technology in enzymatic electrochemical biosensors for clinical analysis // Biosensors for Health, Environment and Biosecurity / Serra P. A. - Rijeka, Croatia: InTech, 2011. - P. 540.

11. Desimone M. F., Helary P. , Mosser G., Giraud-Guille M.-M., Livage J., Coradin V. Fibroblast encapsulation in hybrid silica-collagen hydrogels // Journal of Materials Chemistry. - 2010. - V. 20,1. 4. - P. 666.

12. Yang S. H., Hong D., Lee J., Ко E. H., Choi I. S. Artificial Spores: Cytocompatible Encapsulation of Individual Living Cells within Thin, Tough Artificial Shells // Small. -2013.-V. 9,1. 2.-P. 178-186.

13. Hu Q., Chen X., Zhao N., Li Y., Mao P. Fabrication and characterization of

dodecylamine derived monodispersed mesoporous bioactive glass sub-micron spheres //

Journal of Sol-Gel Science and Technology. - 2013.10.1007/sl 0971-013-3167-6. - P. 1-8.

98

14. Dickson D. J., Ely R. L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Appl Microbiol Biotechnol. - 2013. - V. 97,1. 5. - P. 180919.

15. Jia J., Tang M., Chen X., Qi L., Dong S. Co-immobilized microbial biosensor for BOD estimation based on sol-gel derived composite material // Biosensors and Bioelectronics. — 2003.-V. 18, 1. 8.-P. 1023-1029.

16. Wang X., Han M., Bao J., Tu W., Dai Z. A superoxide anion biosensor based on direct electron transfer of superoxide dismutase on sodium alginate sol-gel film and its application to monitoring of living cells // Analytica Chimica Acta. - 2012. - V. 717. - P. 61-66.

17. Rozga-Wijas K., Chojnowski J., Scibiorek M., Fortuniak W. Polysiloxane-silica hybrids from novel precursors by the sol-gel process // Journal of Materials Chemistry. - 2005. - V. 15,1. 24.-P. 2383-2392.

18. Основы золь-гель технологии нанодисперсного кремнезема. / Шабанова Н. А., Саркисов П. Д. - Москва: ИКЦ «Академия», 2004. - 208 с.

19. Основы золь-гель технологии нанокомпозитов. / Максимов А. И., Мошников В. А., Таиров Ю. М., Шилова О. А. - Санкт-Петербург: ООО «Техномедиа» / Изд-во «Элмор», 2007. — 255 с.

20. Trinchi A., Li Y. X., Wlodarski W., Kaciulis S., Pandolfi L., Russo S. P., Duplessis J., Viticoli S. Investigation of sol-gel prepared Ga-Zn oxide thin films for oxygen gas sensing // Sensors and Actuators A. - 2003. - V. 108. - P. 263-270.

21. Znaidi L. Sol-gel-deposited ZnO thin films: A review // Materials Science and Engineering B. .-2010.-V. 174.-P. 18-30.

22. Pauliukaite R. A superoxide anion biosensor based on direct electron transfer of superoxide dismutase on sodium alginate sol-gel film and its application to monitoring of living cells // Analytica Chimica Acta -2012. - V. 717. - P. 62-66.

23. Waibel M., Schulze H. Glucose biosensor based on covalent immobilization of enzyme in sol-gel composite film combined with Prussian blue/carbon nanotubes hybrid / Guanglei F., 2011.-P. 3973-3976.

24. Desimone M. F., De Marzi M. P. , Copello G. J., Fernández M. M., Pieckenstain F. L., Malchiodi E. L., Diaz L. E. Production of recombinant proteins by sol-gel immobilized Escherichia coli // Enzyme and Microbial Technology. - 2006. - V. 40,1. 1. - P. 168-171.

25. Jeronimo P. P., Araujo A. N., Conceicao B. S. M. M. M. Optical sensors and biosensors based on sol-gel films // Talanta. - 2007. - V. 72,1. 1. - P. 13-27.

26. Функциональные наноматериалы. / А.А. Е., А.В. JL; Под ред. Третьякова Ю. Д. -Москва: Физмалит, 2010.

27. Нанохимия. / Сергеев Г. Б. - Москва: Издательство МГУ, 2007. - V. 2-е изд., испр. и доп.

28. Gupta R., Chaudhury N. К. Entrapment of biomolecules in sol-gel matrix for applications in biosensors: problems and future prospects // Biosens Bioelectron. - 2007. - V. 22, I. 11.-P. 2387-2399.

29. Sol-Gel Science. The Physics and Chemistry of Sol-Gel Process. / Brinker P. J., Scherer G. W. - San Diego New York Boston London Sydney Tokyo Toronto: Academic Press, 1990. -908 c.

30. Sacca A., Carbone A., Passalacqua E., D'Epifanio A., Licoccia S., Traversa E., Sala E., Traini F., Ornelas R. Nafion-Ti02 hybrid membranes for medium temperature polymer electrolyte fuel cells (PEFCs) // Journal of Power Sources. - 2005. - V. 152. - P. 16-21.

31. Better Ceramics Through Chemistry VII: Materials Research Society symposia proceedings. / Coltrain В. K., Sanchez P., Schaefer D. W., Wilkes G. L.: Materials Research Society, 1996.

32. Rajan Premkumar J., Rosen R., Belkin S., Lev O. Sol-gel luminescence biosensors: Encapsulation of recombinant E. coli reporters in thick silicate films // Analytica Chimica Acta.-2002.-V. 462,1. 1.-P. 11-23.

33. Immobilization of Enzymes and Cells. / Guisan J. M.: Humana Press, 2006.

34. Samuneva В., Kabaivanova L., Chernev G., Djambaski P., Kashchieva E., Emanuilova E., Miranda Salvado I. M., Fernandes M. H. V., Wu A. Sol-gel synthesis and structure of silica hybrid materials // Journal of Sol-Gel Science and Technology. - 2008. - V. 48, I. 1-2. - P. 73-79.

35. Nassif N., Roux P. , Coradin Т., Rager M.-N., Bouvet О. M. M., Livage J. A sol-gel matrix to preserve the viability of encapsulated bacteria // Journal of Materials Chemistry. -2003. - V. 13,1. 2. - P. 203-208.

36. Nassif N., Roux P. , Coradin Т., Bouvet О. M. M., Livage J. Bacteria quorum sensing in silica matrices // Journal of Materials Chemistry. - 2004. - V. 14,1. 14. - P. 2264-2268.

37. Fiedler D., Hager U., Franke H., Soltmann U., Bottcher H. Algae biocers: astaxanthin formation in sol-gel immobilised living microalgae // Journal of Materials Chemistry. - 2007. -V. 17,1.3.-P. 261-266.

38. Perullini M., Amoura M., Roux P. , Coradin Т., Livage J., Japas M. L., Jobbagy M., Bilmes S. A. Improving silica matrices for encapsulation of Escherichiacoli using osmoprotectors//Journal of Materials Chemistry. -2011. - V. 21,1. 12.-P. 4546-4552.

39. Garratty G. Modulating the red cell membrane to produce universal/stealth donor red cells suitable for transfusion // Vox Sanguinis. - 2008. - V. 94,1. 2. - P. 87-95.

40. Епифанова А. А., Магаев О. В. Формирование пористой структуры силикатно-фосфатных систем // VII международная конференция студентов и молодых ученых «перспективы развития фундаментальных наук» - Россия, Томск, 2010. - Р. 283-286.

41. ИК спектры основных классов органических соединений. Справочные материалы. / Тарасевич Б. Н. - Москва, 2012.

42. J. P., Launer, Smith A. Infrared analysis of organosilicon compounds: spectra-structure correlation // Spectrochimica Acta. - 1987. - V. 16,1. 1-2. - P. 87-105.

43. Scanning electron microscopy : physics of image formation and microanalysis. / Reimer L.-Berlinu.a.: Springer, 1998.

44. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в 2 т. / Гоулдстейн Д., Ньюбери Д., др. П. Э. и.; Под ред. Гоулдстейн Д. — Москва: Мир, 1984.

45. Scanning Microscopy for Nanotechnology: Techniques and Applications. / Zhou W., Wang Z. L.: Springer, 2007.

46. Зеер Г. M., Фоменко О. Ю., Ледяева О. Н. Применение сканирующей электронной микроскопии в решении актуальных проблем материаловедения // Journal of Siberian Federal University. - 2009. - V. 4,1. 2. - P. 287-293.

47. Kim К. O., Lim S. Y., Hahn G. H., Lee S. H., Park P. В., Kim D. M. Cell-free synthesis of functional proteins using transcription/translation machinery entrapped in silica sol-gel matrix // Biotechnol Bioeng. - 2009. - V. 102,1. 1. - P. 303-7.

48. Takahashi R., Sato S., Sodesawa Т., Azuma V. Silica with Bimodal Pores for Solid Catalysts Prepared from Water Glass // Journal of Sol-Gel Science and Technology. - 2004. — V. 31.-P. 373-376.

49. Микроскопические методы исследования материалов. / Колин Эберхардт Э. К.: Техносфера, 2002.

50. Kanyas S., Aydin D., Kizilel R., Demirel A. L., Kizilel S. Nanoparticle and Gelation Stabilized Functional Composites of an Ionic Salt in a Hydrophobic Polymer Matrix // PLoS ONE. -2014.-V. 9,1. 2.-P. 88-95.

51. Gorton L. Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials: A review //Biotechnology Advances.-2012.-V. 30.-P. 512-523.

52. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы, пер. с англ/. / Вудворд Д. — Москва: «Мир», 1988.

53. Hamm P. Е., Merkel R., Springer О., Jurkojc P., Maier P. , Prechtel K. // Nature Biotechnology. - 2003. - V. 421. - P. 841.

54. Graham D., Pereira R., Barfield D., Cowan D. Nitrile biotransformations using free and immobilized cells of a thermophilic Bacillus spp // Enzyme and microbial technology. - 2000. -V. 26,1. 5-6.-P. 368-373.

55. Васькевич В. В., Гайшун В. Е., Коваленко Д. Л., Сидский В. В. Защитные золь-гель покрытия с гидрофобными свойствами // Проблемы физики, математики и техники. — 2011. — V. 3,1. 8. -Р. 15-19.

56. Pauliukaite R., Chiorcea Paquim А. М., Oliveira Brett А. М., Brett P. М. А. Electrochemical, EIS and AFM characterisation of biosensors: Trioxysilane sol-gel encapsulated glucose oxidase with two different redox mediators // Electrochimica Acta. -2006.-V. 52,1. l.-P. 1-8.

57. Gill I., Ballesteros A. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 1): sol gel encapsulated biologicals // Trends in biotechnology. - 2000. - V. 18,1. 7. - P. 282-296.

58. El-Ashgar N. M., El-Basioni A. I., El-Nahhal I. M„ Zourob S. M., El-Agez V. M., Taya S. A. Sol-Gel Thin Films Immobilized with Bromocresol Purple pH-Sensitive Indicator in Presence of Surfactants // ISRN Analytical Chemistry. - 2012. - V. 2012. - P. 11.

59. Muller P. , Kraushaar K., Doebbe A., Mussgnug J. H., Kruse O., Kroke E., Patel A. V. Synthesis of transparent aminosilane-derived silica based networks for entrapment of sensitive materials //Chem Commun (Camb). -2013. - V. 49,1. 86. - P. 10163-10165.

60. Waibel M., Schulze H. Screen-printed bienzymatic sensor based on sol-gel immobilized Nippostrongylus brasiliensis acetylcholinesterase and a cytochrome P450 BM-3 (CYP102-Al) mutant // Biosensors and Bioelectronics. - 2006. - V. 21. - P. 1132-1140.

61. Yildirim N., Odaci D., Ozturk G., Alp S., Ergun Y., Dornbusch K., Feller K.-H., Timur S. Sol-gel encapsulated glucose oxidase arrays based on a pH sensitive fluorescent dye // Dyes and Pigments. - 2011. - V. 89,1. 2. - P. 144-148.

62. Nguyen D. Т., Smit M., Dunn В., Zink J. I. Stabilization of creatine kinase encapsulated in silicate sol-gel materials and unusual temperature effects on its activity // Chemistry of Materials. - 2002. - V. 14,1. 10. - P. 4300-4306.

63. Frenkel-Mullerad H., Avnir D. Sol-gel materials as efficient enzyme protectors: Preserving the activity of phosphatases under extreme pH conditions // Journal of the American Chemical Society. - 2005. - V. 127. - P. 8077-8081.

64. Ferrer M. L., Monte F. d., Levy D. A novel and simple alcohol-free sol-gel route for encapsulation oflabile proteins//Chem. Mater. .-2002.-V. 14.-P. 3619-3621.

65. Tan S. N., Wang W., Ge L. Biosensors Based on Sol-Gel-Derived Materials // Comprehensive Biomaterials. - Oxford: Elsevier, 2011. - P. 471-489.

66. Carturan G., Campostrini R., Dire S., Scardi V., De Alteriis E. Inorganic Gels for Immobilization of Biocatalysts: Inclusion of Invertase-Active Whole Cells of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) into Thin Layers of Silica Gel Deposited on Glass Sheets // J Mol Catal. - 1989. - V. 57,1. 1. - P. 6-13.

67. Inama L., Diré S., Carturan G., Cavazza A. Entrapment of viable microorganisms by Si02 sol-gel layers on glass surfaces: trapping, catalytic performance and immobilization durability of Saccharomyces cerevisiae. // J Biotechnol. - 1989. - V. 30,1. 2.-P. 197-210.

68. Kuncova G., Podrazky O., Ripp S., Trogl J., Sayler G., Demnerova K., Vankova R. Monitoring the viability of cells immobilized by the sol-gel process // J. Sol Gel Sci. Technol. .-2004.-V.31.-P. 335-342.

69. Boettcher, U S., M M., W. P. Biocers: ceramics with incorporated microorganisms for biocatalytic, biosorptive and functional materials development // Mater Chem -2004. - V. 14. -P. 2176-2188.

70. Avnir D., Coradin Т., Lev O., Livage J. Recent bio-applications of sol-gel materials // Journal of Materials Chemistry. - 2006. - V. 16,1. 11. - P. 1013.

71. Ferrer M. L., Garcia-Carvajal Z. Y., Yuste L„ Rojo F., del Monte F. Bacteria Viability in Sol-Gel Materials Revisited: Cryo-SEM as a Suitable Tool To Study the Structural Integrity of Encapsulated Bacteria // Chemistry of Materials. - 2006. - V. 18,1. 6. - P. 1458-1463.

72. Alvarez G. S., Pieckenstain F. L., Desimone M. F., Estrella M. J., Ruiz O. A., Díaz L. E. Evaluation of sol-gel silica matrices as inoculant carriers for Mesorhizobium spp. cells // Current Reseach, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbioal Biotechnology / Mendez-Vilas A.FORMATEX, 2010. - P. 160-166.

73. Nassif N., Roux P. P., Coradin Т., Bouvet О. M. M., Livage J. Bacteria quorum sensing in silica matrices // Journal of Materials Chemistry. - 2004. - V. 14,1. 14. - P. 2264.

74. Арляпов В. А., Понаморева О. H., Алферов С. В., Алферов В. А., Решетилов А. Н. Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания

компонентов в многокомпонентных водных средах // Сенсорные системы. — 2011. — Т. 25, №4.-С. 352-360.

75. Wen G., Li Z., Choi M. M. F. Detection of ethanol in food: A new biosensor based on bacteria//Journal of Food Engineering.-2013.-V. 118,1. l.-P. 56-61.

76. Perullini M., Ferro Y., Durrieu P. , Jobbágy M., Bilmes S. A. Sol-gel silica platforms for microalgae-based optical biosensors // J Biotechnol. - 2014. - V. 179. - P. 65-70.

77. Jerónimo P. P. A., Araújo A. N., Conceiçâo B.S.M. Montenegro M. Optical sensors and biosensors based on sol-gel films // Talanta. - 2007. - V. 72,1. 1. - P. 13-27.

78. Dai J., Lu V. P., Deng L. Research on activities of drugs by use of an optical nitric oxide biosensor // Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. - 2007. - V. 38,1. 1. - P. 150-153.

79. Gavlasova P., Kuncova G., Kochankova L., Mackova M. Whole cell biosensor for polychlorinated biphenyl analysis based on optical detection // International Biodeterioration & Biodégradation. - 2008. - V. 62,1. 3. - P. 304-312.

80. Русанова Т. Ю., Левина H. А., Юрасов H. А., Горячева И. Ю. Нанопористые золь-гель материалы с иммобилизованными антителами для иммуноаффинного концентрирования пирена // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2009. -Т. 9, № 3. - С. 391-397.

81. Schôringhumer К., Cichna-Markl M. Sample clean-up with sol-gel enzyme and immunoaffmity columns for the determination of bisphenol A in human urine // Journal of Chromatography B. - 2007. - V. 850,1. 1-2. - P. 361-369.

82. Brenn-Struckhofova Z., Cichna-Markl M., Bohm P. , Razzazi-Fazeli E. Selective Sample Cleanup by Reusable Sol-Gel Immunoaffmity Columns for Determination of Deoxynivalenol in Food and Feed Samples // Analytical Chemistry. - 2006. - V. 79,1. 2. - P. 710-717.

83. Altstein M., Bronshtein A., Glattstein В., Zeichner A., Tamiri T., Almog J. Immunochemical Approaches for Purification and Detection of TNT Traces by Antibodies Entrapped in a Sol-Gel Matrix // Analytical Chemistry. - 2001. - V. 73, I. 11. - P. 24612467.

84. Lev O., Tsionsky M., Rabinovich L., Glezer V., Sampath S., Pankratov I., Gun J. Organically modified sol-gel sensors // Analytical Chemistry. - 1995. - V. 67,1. l.-P. 22A-30A.

85. Klodziñska E., Moravcova D., Jandera P., Buszewski B. Monolithic continuous beds as a new generation of stationary phase for chromatographic and electro-driven separations // Journal of Chromatography A.-2006. -V. 1109,1. l.-P. 51-59.

86. Химические и биологические сенсоры. / Б. Э. - Москва: Техносфера, 2005.

87. Shchipunov Y. A., Karpenko V. у. Y., Bakunina I. Y., Burtseva Y. V., Zvyagintseva V. y. N. A new precursor for the immobilization of enzymes inside sol-gel-derived hybrid silica nanocomposites containing polysaccharides // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. - 2004. - V. 58,1. 1. - P. 25-38.

88. Muynck C. D., Pereira P. S. S., M. Naesseus , Parmentier S., Soetaert W. The Genus Gluconobacter Oxydans: Comprehensive Overview of Biochemistry and Biotechnological Applications // Critical Reviews in Analytical Chemistry. - 2007. - V. 27. - P. 147-171.

89. K.A. Lusta , Reshetilov A. N. Physiologo-biochemical characteristics if Gluconobacter oxydans and prospects for its use in biotechnology and biosensor systems (review) // Prikl Biokhim Mikrobiol. - 1998. - V. 34. -1.4. - P. 339-53.

90. Matsushita K., Fujii Y., Y Ano , H Toyama , M Shinjoh , N Tomiyama , T Miyazaki , T Sugisawa , T Hoshino , . O. A. 5-keto-D-gluconate production is catalyzed by a quinoprotein glycerol dehydrogenase, major polyol dehydrogenase, in gluconobacter species // Appl Environ Microbiol. - 2003. - V. 69,1. 4. - P. 1959-66.

91. Г.Н. Павлишко Г. 3. Г., M.B. Гончар Алкогольоксидаза и ее биоаналитическое применение / Павлишко Г. Н. - Вестник. Львов УН-ТУ.. - С. 3-22.

92. Suiter G. J., Harder W., Veenhuis M. Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts // FEMS Microbiology Reviews. - 1993. - V. 11,1. 4. - P. 285-296.

93. Аэробные метилотрофы - перспективные объекты современной биотехнологии. / Троценко Ю. А.; Под ред. Trotsenko Y. А. и др.: Сибирский федеральный университет. Siberian Federal University., 2012.

94. Dickson D. J., Lassetter В., Glassy В., Page P. J., Yokochi A. F. T., Ely R. L. Diffusion of dissolved ions from wet silica sol-gel monoliths: implications for biological encapsulation //Colloids Surf В Biointerfaces. -2012. -V. 102.-P. 611-619.

95. Thevenot D. R., Toth K., Durst R. A., Wilson G. S. Electrochemical biosensors -recommended definitions and classification // Biosens Bioelectron. - 2001. — V. 16. - P. 121131.

96. Асулян Л. Д. Алфёров В. А., Долгая Д. В., Горячева А. А., Прокопенко Д. В. Свойства поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, растворов, пленок и биорецепторных элементов на его основе // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. — 2013. — Т. 2.-№ 1. - С. 231 -240.

97. Китова А.Е. П. О. Н., Алферов В.А., Кузмичев А.В., Ежков А.А., Арсеньев Д.В., Решетилов А.Н. . Перспективы применения биосенсорных экспресс-анализаторов при производстве спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий. — 2004. - Т. 4. -С. 11-13.

98. Hong D„ Park М., Yang S. Н., Lee J., Kim Y.-G., Choi I. S. Artificial spores: cytoprotective nanoencapsulation of living cells // Trends in Biotechnology. — 2013. - V. 31, I. 8.-P. 442-447.

99. Lin L., Xiao L. L., Huang S., Zhao L., Cui J. S„ Wang X. H., Chen X. Novel BOD optical fiber biosensor based on co-immobilized microorganisms in ormosils matrix // Biosens Bioelectron. - 2006. - V. 21,1. 9. - P. 1703-1709.