Гетерогенность полиморфизмов в гене NPHS2 у детей с нефротическим синдромом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Корниенко, Владимир Юрьевич

• Корниенко, Владимир Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Корниенко, Владимир Юрьевич

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1 Обзор литературы

1.1 Общие сведения о физиологии почек, основных белках базальной мембраны

1.1.1 Строение нефрона, клубочковая фильтрация, базальная мембрана

1.1.2 Канальцевые реабсорбция и секреция.

1.1.3 Белки базальной мембраны клубочка

1.2 Современные представления об этиологии и патогенезе нефротического синдрома

1.2.1 Стероидрезистентпый иефротический синдром

1.2.2 Врожденный иефротический синдром финского типа

1.2.3 Другие синдромы

1.2.4 Полиморфизмы гена подоцина при пефротическом синдроме

ГЛАВА II. Материалы и методы

11.1 Характеристика обследованных больных

11.2. Морфологические ме тоды исследования

II.3 Молекулярно-гепетические методы исследования

11.4. Реактивы, буферные рас творы и ферменты

11.5. Статистические методы

ГЛАВА III. Результаты и обсуждение собственных исследований.

III Л. Результаты секвепирования гена NPHS2 у детей группы сравнения

111.2. Результаты секвенироиания гена NPHS2 у детей со стероидчувствительным нефротическим 53 синдромом.

111.3. Результаты секвепировапия гена NPIIS2 у детей со стероидрезистентным пефротнческим синдромом.

III. 4. Разработка панели для определения пуклеотидпых замен в гене NPIIS2 методом мультиплексной реакции элонгации праймера (SNaPshol)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гетерогенность полиморфизмов в гене NPHS2 у детей с нефротическим синдромом»

Нефротический синдром (НС) объединяет гетерогенную группу гдомерулярных заболеваний и является одной из актуальных проблем детской нефрологии. Заболеваемость первичным НС составляет 2-13 случаев на 100 ООО детей в возрасте до 10 лет [1]. Постоянное увеличение числа больных с нефротическим синдромом, прогрессирующих до стадии терминальной почечной недостаточности и нуждающихся в замести тельной почечной терапии (перитопиальпым диализом, - или в трансплантации почки) [2], показывает необходимость включения проблемы НС в список приоритетных исследований в нефрологии.

Для понимания этиологии и патогенеза пефротического синдрома научные исследования последних лет были сосредоточены на оценке вклада генетических факторов в механизмы повреждения и фиброгенеза почек.

В общей сложности, по данным крупных европейских медицинских центров, наследственные гломерулопатии занимают от 6,5 до 15% среди патологий, ведущей к хронической почечной недостаточности (ХПН). В то же время, около 20% от общего числа детей с диагнозом нефротический синдром составляет группа пациентов со стероидрезистентным нефротическим синдромом в этиологии и патогенезе которых, генетические факторы играют важную роль

В настоящее время для изучения роли генетических факторов в этиологии и патогенезе мультифакториальпых заболеваний, к которым относится и НС, часто используется подход, основанный па исследовании полиморфных маркеров генов-кандидатов. Таким геном-кандидатом, нарушения в последовательности которого могут приводить к возникновению резистентности к ппококортикоидам при терапии НС, является ген подоципа (ИРН82). Подоцин - это трансмембранный белок, играющий важную роль в процессах клубочковой фильтрации, окспресируетея в специализированных клетках почек - иодоцшах. За синтез белка подоцина ответственен ген NPHS2. Различные мутации в гене подоцина являются не только частой причиной возникновения и прогрессировапия нефротического синдрома, по и устойчивости кчерапии ипококортикоидами при лечении последнего.

Этот ген расположен па 1 хромосоме в положении Iq25-q31. Он состоит из 8 экзопов, интронных и промоторпой облас1ей

В настоящее время известно множество различных полиморфизмов и му таций в гене NPHS2, мисенс-мутации, нонсенс-мутации, а также делеции.

Так, например Duca Di.M. с соавторами, после обследования итальянских пациентов обнаружили три мутации в промоторном регионе NPIIS2, которые сильно снижали экспрессию гена |П1]. Hinkes В. с соавторами показали, что при НС 69% мутаций в rene NPHS2 - это нонсенс-мутации, сдвиг рамки считывания или мутация R138Q [113]. Furue Т. с соавторами после определения пуклеотпдной последова1елыюети NPHS2 у 11 японских больных выявили наличие полиморфизма в 318 положении у 7 из 11 детей |114]. Berdeli А. с соавторами при исследовании 295 детей в турецкой популяции больных псфротическим синдромом обнаружили 37 новых мутаций в iene NPHS2 [2¡. В ряде случаев спорадически возникший фокальносегментарный гломерулосклероз (ФСГС) во взрослом состоянии был ассоциирован с носительством гетерозиготного генотипа Arg/Gly. Иногда подоцип прису[ствуе1 в нодоцшах, по [еряет способность удерживать пефрип в липидпых мостиках, на это влияют такие мутации как R138Q, D160G, R168C, R168H, R168S, V180М, P20L, V260B [1111.

В России исследований lena NPIIS2 практически не проводилось, существуют еденичные работы 127, 117, 128).

Определение вклада полиморфных маркеров и мутаций гена NPHS2, в развитие резистентности к'терапии пнокортикоидними препаратами является одной из важных и актуальных проблем нефрологии. В этом случае от молекулярио-генетической диагностики может зависеть тип терапии нефротического синдрома. Эффективная молскулярно-генетическая диагностика позволит избежать дорогой и неэффективной терапии.

Цель исследования.

Изучить роль полиморфных маркеров гена ЫРН32 в развитии резистентности к ппококортикоидной терапии у детей с нефротическим синдромом в российской выборке детей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

Задачи исследования:

1. Сформировать репрезентативную выборку пациентов с признаками стероидрезистентного и стероидчувствительпого нефротического синдрома для проведения молекулярно-гепстического анализа гена МРН82.

2. Провести полное ссквспировапие гена N¡4-132 у детей с наиболее выраженными признаками стероидрезистентного и стероидчувствительпого нефротического синдрома.

3. Изучить распределение полиморфных маркеров гена ЫРН82 у детей с нефротическим синдромом (стероидчувствительная и стероидрезистептпая формы) в зависимости от клинической формы заболевания.

4. Определить пуклеотидную последовательность гена АРН82 у детей с нефротическим синдромом в зависимости от морфологических изменений в почках.

5. Разработать мультиплексную панель па наиболее значимые пуклеотидные замены гена МРН82 у больных нефротическим синдромом, основанную па реакции удлинения олигопуклеотидов (8№Рз1ю1).

Научная новизна работы.

Впервые у российских дечей с нефротическим синдромом проведен комплексный молекулярпо-гснетический анализ полиморфизмов гена АГРНБ2, основанный на изучении пуклеотидных последовательностей гена А1РН82 в группах стероидрезистеп'шых, стероидчуствтельпых и здоровых детей. Показано, чю наиболее перспеюивным для диагноежки стероидрезистептиого пефротического синдрома (СРЫС) в российской выборке детей является полиморфный маркер 11229(2. Представленный в европейской популяции полиморфный маркер 111380 (Нткеэ В., 2008), среди больных в российской выборке со стероидрезистепчным нефрожческим синдромом выявлен не был.

Впервые выявлена и описана новая мутация с.768в>А (\V256X), которая может приводить к образованию терминирующего кодона, прерывавающего синтез белка.

В случаях семейного стреоидрезистептного пефротического синдрома была обнаружена ранее описанная мутация в гене ЫРИ82, приводящая к формированию терминирующего кодона С1и87Тепп, обрывающая синтез белка.

Впервые разработана мультиплексная панель, включающая в себя основные пуклогидпые замены гена А¡РН82, встречающиеся при СРНС. Разработанная панель основана на реакции удлинения олигонуклеотида (8ЫаРзЬо1). Предложенная панель позволила в 5 раз ускорить диагностику основных мутаций, описанных в гене ¡\iPNS2.

Практическая значимое п> работы

Выявление значимых аллельпых вариантов полиморфных маркеров гена ЫРН82 свидетельствует о повышенном генетическом риске возникновения повреждения щелевой диафрагмы и как следствие развитие стероидрезистентпой формы пефротического синдрома, что создает практическую и теоретическую базу для разработки диагностических методов прогнозирования терапии этого заболевания.

Разработанная мулы индексная панель (ЗЫаРзЬоО позволяет проводить диагностику 7 наиболее частых полиморфных маркеров, расположенных в гене МРН82 в 5 раз быстрее, чем с помощью секвенирования методом Сэпгера.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработаны последовательное ¡и олигопуклеотидов для амплификации и секвенирования всех экзонных областей гена N№82 с захватом промоторпой и частичным захватом иптроппых областей.

2. Основные полиморфные маркеры, для которых показана ассоциация с стероидрезистентным пефротическим синдромом не выявлялись у здоровых детей и у больных со стероидчувствительпым пефротическим синдром.

3. Наиболее распространённым, ассоциированным с резистентностью к стероидной терапии нефротического синдрома, в российской выборке больных детей является иуклеошдпая замена 0755А (11229С)). Полиморфный маркер III38^), характерный для европейской популяции больных со СРНС, в российской выборке не обнаружен.

4. В гене ЫРН82 обнаружена новая, ранее не описанная пуклеотидпая замена с.7680>А (\V256X), приводящая к образованию терминирующего кодона, обрывающего синтез белка.

5. При семейной форме СРНС выявлена значимая пуклеотидная замена с.2590>Т (01и87Тегт).

6. Разработана мультиплексная 8№Р81ю1. панель, значительно ускоряющая проведения исследования 7 основных пуклеотидных замен в гепе ИРН82, в том числе, в положениях соответствующим КЛ 38(2 и К-229С).

Апробация и публикации

Материалы диссертации были представлены на XV Конгрессе педиатров России (Москва, 2010); Европейском конгрессе по генетике человека (Амстердам, 2010), V Европейском конгрессе педиатров (Вена, 2011), IV международной школе по молекулярной генетике (Звенигород, 2010); научных конференциях лаборатории мембранологии с группой генетических исследований НЦЗД РАМН.

По материалам диссер:ации опубликовано 7 печатных работ, включая 3 статьи в журналах входящих в список ВАК, а также тезисы докладов и сообщений па конференциях.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Корниенко, Владимир Юрьевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нефротический синдром объединяет группу гломерулярных заболеваний и является одной из актуальных проблем детской нефрологии. По данным литературы, из общего числа детей с диагнозом нефротический синдром 80% составляют дети со стероидрезистентпым нефротическим синдромом |110|. 13 международных регистрах стероидрезистептный нефротический синдром рассматривают как наиболее частое заболевание почек. Исследования последних лет свидетельствуют о важном вкладе генетических факторов в механизмы развития стероидрезистептного нефротического синдрома |2, 8, 13, 14]. Для изучения роли генетических факторов часто используется подход, основанный на поиске полиморфных маркеров генов-кандидатов. Среди многочисленных работ, посвященных исследованию клинической значимости мутаций и полиморфизмов, ассоциируемых с стероидрезистентпым нефротическим синдромом, большое значение придаётся гену подоцина (NPHS2) [2, 8].

Подоцип является белком, который участвует в формировании единой структуры щелевой диафрагмы, он подобно шпильке, замыкает нефрин в подоцитах [13, 111] и так же как нефрин и белок CD2AP связан липидными мостиками [12].

Различные мутации в гене подоцина (NPITS2) являются не только частой причиной возникновения и прогрессировапия гломерулонефрита, но и устойчивости к терапии ппококортикоидами при его лечении; именно при дефиците белка может развиться стероидрезистептный нефротический синдром [2, 8, 13, 14|.

Настоящая работа посвящена анализу роли мутаций и полиморфных маркеров в гене подоцина и их генетической гетерогенности в развитии стероидрезистептного нефротического синдрома, что позволит разработать систему индивидуального прогнозирования течения заболевания и с учетом генетических особенностей использовать более эффективную терапию.

В работе представлен анализ молекулярно-генегических исследований 37 детей с первичным несемейным сгероидрезистентпым нефротическим синдромом (14 мальчиков и 23 девочки) в возрасте от 2 мес. до 15 лет и 2 детей из одной семьи в возраст 10 и 7 лет. Наряду с этим были обследованы 15 детей со стероидчувспепельным нефротическим синдромом. Больные наблюдались в отделении нефрологии ФГБУ «НЦЗД» РАМН. Кроме того, были обследованы 15 относительно здоровых детей.

В данной работе использовались клинические, молекулярпо-генетческие, морфологические методы.

У всех детей, как со стероидрезистентным, так и стероидчувствительным нефротическим синдромом проводилась биопсия почечной ткани. Данные диагнозы были установлены па основании общепринятых диагностических критериев и данных морфологического исследования биоптатов ночек. При морфологическом исследовании, проведённом у всех 39 нацистов со сюроидрезисгентпым нефротическим синдромом, были выявлены следующие морфологические варианты: болезнь минимальных изменений - в 39% случаев, фокальносегментарный гломерулосклероз - в 51%, мезаш иопролиферагивный гломерулонефрит - в 10%. В то же время, у детей со стероидчуствительпым нефротическим синдромом при морфологическом исследовании были обнаружены следующие морфологические варианты: болезнь минимальных изменений -40% случаев, фокальносегментарный гломерулосклероз - 13%, мезангиопролиферативпый гломерулонефрит - 13%, для остальных 34% биопсия не проводилась. Клиническое проявление стероидрезистентного нефротического синдрома отмечалось у детей в возрасте от 11 мес. до 16 лет, при этом детей с дебютом заболевания до года было 14%, от года до шести лет - 36%, старше шести лет - 49%, медиана составила 2. Для стероидчувствительного пефротического синдрома дебют заболевания приходился па возраст от 3 мсс. до 11 лет. При этом количество детей с дебютом заболевания до года составило 13%, от года до шести лет - 47%, старше 7 лет - 39%, медиана составила 2,5.

Молекулярно-гепетическое исследование 87 детей было проведено в лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ФГБУ «НЦЗД» РАМН.

Ранее было показано, что причиной резистентности к терапии могут быть нарушения различного рода iсна подоципа [2, 8, 13, 14]. В настоящей работе нами впервые с использованием секвепировапия по методу Сэигера, была изучена кодирующая область гена подоципа у достаточно широкой группы больных из разных регионов России, с диагнозом стероидрезистентпый пефротический синдром и стероидчувствительпый нефротичеекий синдром. Анализ проведенных исследований показал, что для российской выборки детей наиболее перспективной для целей диагностики является нуклеождная замена (1755 А (rs61747728), соответствующая аминокислотной замене R229Q. Полученные нами данные показывают, что у больных СРНС нуклеотидпая замена G755A встречается достоверно чаще (р=0,007, "/2=7,41) по сравнению с группами стероидчувствительных и здоровых. Ранее было показано, что э i а замена ассоциирована с протеипурией и микроальбумипурией [14J. Однако Weber S. с соавторами исследовали 319 пациентов из Франции и североафриканских стран и пришли к заключению, чю G755A (R229Q) является полиморфизмом, не приводящим к нарушению клубочковой фильтрации [124]. Karle S.M. и др. провели исследование 53 пациентов из 27 семей, а также 25 спорадических случаев пефротчсскою синдрома и отмстили, что G755A (R229Q) встречался в 3 из 4 семей, имеющих одну мутацию в гене NPHS2. При этом авторы отмечают, что функция аминокислотной замены R229Q неизвестна и относят данную замену к полиморфизмам [125]. Группа авторов Bakr А. и др., исследовав 16 египетских пациентов со стероидрезистентпым нефротичсским синдромом, не обнаружила замены R229Q, также авторы не обнаружили и другой известной замены R138Q [126]. Patrick Niaudet отмечает, что замена R229Q представлена приблизительно в 4% случаев в западной популяции, при этом клиническое значение замены R229Q остаётся неизвестным [127|. Однако этот автор указывает на то, что в 10-30% случаев при спорадическом стероидрезистентпом пефротическом синдроме обнаруживается эта мутация в гене NPHS2. Hinkes В. с соавторами показали, что при семейном пефротическом синдроме замена R229Q присутствует в 27,7% случаев [113]. Stephen Tonna и др., исследуя 56 немецких пациентов с болезнью тонких базальпых мембран, показал, что аминокислотная замена R229Q гена NPIIS2 встречается у 9% больных [123]. В нашем исследовании R229Q встретилась в 20,5% случаев, что согласуется с ранее опубликованными данными [123, 127]. Нами также показано, что замена R229Q достоверно чаще встречается в группе больных со стероидрезистсптным синдромом в сравнении со здоровыми. Хотя многие авторы указывают замену R229Q как популяционный полиморфизм [124, 125, 127], другие показывают его ассоциацию с протеипурией, липидемией, микроальбумипурией [113, 123|.

Среди больных с обнаруженной пуклеотидной заменой G755A (R229Q) у троих больных после проведённой терапии метилпреднизолоном и цитостатическими препаратами, болезнь перешла в стадию ремиссии, и у 5 ремиссия не была достигнута. Факт, что у большинства больных, имеющих R229Q в группе со стероидрезистсптным нефротичсским синдромом, не проявилась стадия рсмиссии, согласуется с современными представлениями о взаимосвязи G755A (R229Q) с резистентностью к терапии.

Многие авторы в своих работах отмечают, что наиболее распространённой мутацией, характерной для западноевропейской популяции, является замена R138Q | 127, 113]. Niaudet Р. также указывает, что R1380 является наиболее часюй мутацией в северной Европе [127]. Hinkes В. с соавторами при исследовании 430 пациентов с семейным стероидрезисчешным псфрошчсским синдромом из европейской популяции ошешл, что замена R138Q встречается в 57,5% случаев [113]. В нашем исследовании аминокислотная замена R138Q в исследуемой выборке не была обнаружена. Возможно, это связано с малой выборкой. При исследовании российских детей, рядом авторов чакже не было выявлено R138Q. Полтавец и др. исследовали ген NPHS2 у 21 ребёнка и не выявили никаких нуклеотидпых замен [ 128].

Особый интерес вызывас! новая, обнаруженная нами и ранее не описанная иуклеотидная замена c.768G>A, соответствующая аминокислотной замене W256X. Мы не обнаружили упоминания о ней в лшературпых источниках, доступных нам. Также этой замены нет в интернет базах данных. У 2 больных нами была обнаружена описанная ранее замена в кодоне Glu87Term 115].

В нашей выборке были обнаружены 2 нуклеогидные замены, расположенные в 5'- нетранслирусмой области гена NPITS2. Одна из них находилась в промоторпой области в положении IVS1-31G>A, а другая в 5'-петранслируемой области в положении c.35G>T.

Ранее были предприняты попытки исследования промотора гена NPHS2. М. Di Duca и др., исследовали промоторную область гена NPHS2 на наличие eis- и trans- регуляторпых элементов. В их работе приняли участие

542 пациента с различными пефропатиями [129]. В результате было выявлено, что сочетание двух полиморфных маркеров в положениях -116С / -51С среди больных с IgA нефропатией ассоциируется с протеинурией и повышенным уровнем креатипина. В наших исследованиях положения -116С / -51С не были изучены вследствие их удалённости от кодирующей области, которая была исследована нами в данной работе. Однако нами было показано, что нуклеошдная замена 1VS1-31G>A (rs 1079291), расположенная в промоторпой области, встречается достоверно выше в группе больных с болезнью минимальных изменений, по сравнению с контрольной группой. Caridi G. с др., рассматривая промоторную область гена NPHS2, указывают на то, что наличие пуклеотидпых замен в промоторпой области этого гена, вероятно, могут приводить к снижению экспрессии мРНК [130].

Во многих работах описываклся нуклеотидные замены, не изменяющие аминокислотную последовательность белка. В гене NPTIS2 к таким заменам относятся: G34G, S96S, А318А, L346L. В исследованиях, проводимых другими авторами, обнаруживаются данные замены различных комбинации, однако их относят к полиморфным маркерам, не оказывающим влияния па развитие резистентности или же нарушение клубочковой фильтрации в подоцитах. Так, например, McKenzie L.M. и др. в своей работе |120] обнаружили различные синонимичные нуклеотидные замены в гене NPHS2. Автор считает, что синонимичные замены, также как и нуклеотидные замены в интропной области гена NPHS2, пе ассоциированы с фокальпоссгмептарпым гломсрулосклерозом. Karle S.M. и др. в своей работе [125] указывают па полиморфные маркеры A3 18A, G34G, S96S, L346L в гене NPHS2. В нашей работе также были обнаружены полиморфные маркеры, характерные для гена NPITS2: А318А, G34G, S96S, L346L. Статистический анализ подтвердил 01сутствис ассоциации с резистентностью к терапии нефротического синдрома.

Для гена N14182 также известны различные пуклеотидные замены в интронной области. Наиболее интересной из часто встречающихся является нуклеотидпая замена 1У87+7А>0. Полтавец и др. обнаружили данную нуклеотидпую замену у больных со стероидрсзистсптным нефротическим синдромом в российской выборке больных [128]. СапсИ С и др. также обнаружили вышеуказанную замену. Однако ассоциация с развитием резистентности к терапии или возникновение патологических состояний выявлена не была [131]. В нашем исследовании этот полиморфизм чаще встречался в группе больных СРНС, по сравнению с другими группами. Такая ситуация может быть объяснена его близким расположением к 7 экзопу экзониой области, а значш, и возможным участием в формировании сайта сплайсинга между экзоппой и интронной областями 7 экзона. В настоящее время известно, что клиническая значимость пуклеотидпых замен в сайте сплайсинга неравнозначна. Как правило, считают, что сайт сплайсинга состоит из восьми пуклеотидов в интроппую и экзонпую сторону, наиболее критичными из них являются мутации в первом и втором положениях, далее клиническая значимость пуклеотидпых замен снижается, и к восьмому пуклеотиду она сводится к минимуму. В нашей работе было отмечено, что нуклеотидпая замена 1У87+7А>0 в седьмом положении интропа встречалась чаще в группе больных с стероидрезистентным нефротическим синдромом. Таким образом, мы предположили возможный механизм патологического воздействия нуклеотидной замены 1У87+7А>С приводящий к образованию изменённой мРНК и как следствие, пурушению синтеза подоципа.

Нами также были обнаружены пуклеотидные замены в интронной области в других положениях: IУ83+15070Т, 1У87+540>А, 1У87+1078С>С. Нуклеотидпая замена 1У87-И078С>С присутствовала только в группе, где ремиссия не была достигнута. Замена 1У83+15070Т описана нами впервые. Как отмечалось выше (см. стр. 53), выявлена ассоциация между нуклеотидной заменой 1У83+1507С>Т и прогрессировавшем стероидрезистентпого нефротического синдрома. Однако механизмы влияния нуклеотидных замен, находящихся в интронной области остаются неясными, т.к. в интроппых областях гена ИРНБ! не извест но регуляторных областей.

Также у одного пациент а из группы, где ремиссия не была достигнута, были обнаружены обе нуклеотидные замены: гй6 1747728 (11229^)) и 1У87+Ю780>С. Нуклеотидная замена 1У83+15070Т в группе больных с последующей ремиссией встречалась 3 раза, а в группе больных без ремиссии 6 раз.

Появление метода реакции элонгации олигопуклеотида (8НаРзЬо1) в некоторых случаях позволяет отказаться от секвепировапия всей последовательности того или иного гена, существенно ускорив диагностику по выбранным "точкам" в последовательности ДНК. Для упрощения диагностики стероидрезисгентпого нефротического синдрома нами была разработана мультиплексная панель, основанная на реакции элонгации олигопуклеотида (8ЫаРзЬо1). Ранее различными авторами было показано, что в гене ИРНБ! существуют несколько позиций, в которых нуклеотидные замены, приводящие к стероидрезистептпой форме нефротического синдрома, встречаются особенно часто [2, 8, 13, 14]. Выборочное исследование этих "точек" позволило бы избежать трудоёмкого исследования методом прямого автоматического секвепировапия экзонной части гена ЫРН82 и существенно ускорить и удешевить диагностику стероидрезисгентпого нефротического синдрома. Основной проблемой при разработке мультиплексной панели является сложность предсказания всех взаимодействия между олигонуклеотидами, которые возможно будут происходить во время проведения реакции элонгации. В настоящее время программное обеспечение может лишь приблизительно предсказать последствия ДНК-ДНК взаимодействия и определить температуры плавления подобранных олигонуклеотидов. Как правило, после обширного компьютерного исследования олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР системы, впоследствии фебуется тонкая практическая работа по определению условий проведения мультиплексной ПЦР реакции.

Первоначально нами были разработанные несколько вариантов последовательностей олигонуклео1идов для проведения мультиплексной реакции, в процессе практической работы отчасти из них пришлось отказаться вследствие их неработоспособности.

Основываясь па ранее опубликованных данных, мы разработали мультиплексную 8ЫаРйНо1 панель для диагностики замен в следующих положениях: 111380 (^74315343), 0215Х, 112290 (геб 1747728), Т2321, Е2370 (гб 146906190), А242У (ге61747727), с.396А>Т. Разработанная панель была отлажена на генетическом анализаторе АВ1 3130. В процессе проверки панели были исследованы три человека с пуклеотидпой заменой 112290 (гэб 1747728) в трёх аллельпых вариантах.

Результаты, полученные с помощью 8ЫаРз11о1 панели, подтвердили аллельпые варианты, определённые ранее методом прямого секвепирования. На следующем этапе с иомощыо представленной мультиплексной панели была исследована группа из 18 человек. Среди исследуемых пациентов у 1 была обнаружена нуклеошдная замена К2290 (гб6 1747728) в гомозиготном состоянии. Проверка полученных результатов секвеиироваиием методом Сэигера подтвердила их достоверность.

Таким образом, пасюящсй работе памп были разработаны последовательности олигонуклеотидов для амплификации экзопных, промоюрной и иптропных областей гена ЫРН82. Проведено исследование кодирующей области гена А'РП82 у больных российской выборки в группах со стеропдрезистеншым нефротическим синдромом, стероидчувствительпым нефротическим синдромом и группой сравнения.

Впервые для российской выборки больных проведено генетическое сравнение групп стероидрезистептных и стероидчувствительных больных. Были обнаружены характерные для российской выборки детей полиморфные маркеры и мутации (IVS1-31G>A, c.35G>T, IVS3+15070T, IVS7+7A>G, IVS7+54G>A, IVS7+1078G>C, R229Q, W256X, S96S, A318A, L346L). Показана диагностическая значимость нуклеотидной замены G755A (R229Q) для изученной выборки российских больных СРНС. Выявлена новая ранее не описанная пуклеотидная замена c.768G>A (W256X) приводящая к образованию терминирующего кодона и, таким образом, обрывающая синтез полипептидпой цепи. Нами были исследованы 2 случая семейного стероидрезистентного пефротического синдрома, при которых была подтверждена обнаруженная ранее замена Glu87Term в гомозиготном состоянии (Tikhomirov 2007). Разработана мультиплексная панель SNaPshot для определения частых мутаций в гене подоцина (NPHS2), которая может быть применена для более быстрой диагностики основных мутаций в гене подоцина. Полученные данные важны для проведения диагностики и обследования больных с псфротическим синдромом, что позволит использовать адекватные методы терапии.