Геномные исследования первично-прогрессирующей формы рассеянного склероза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Киселев Иван Сергеевич

• Киселев Иван Сергеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Киселев Иван Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология и клиническая характеристика РС

1.2. Этиология РС

1.3. Основные аспекты патогенеза РС

1.4. Патогенетические отличия первично-прогрессирующей и ремиттирующей форм РС

1.5. Исследование генетической предрасположенности к РС

1.6. Особенности генетической архитектуры ППРС

1.7. Основные механизмы эпигенетической регуляции генной экспрессии

1.8. Исследования метилирования ДНК при РС

Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Использованные в работе реактивы

2.2. Объект исследования

2.3. Выделение геномной ДНК из цельной крови и клеток

2.4. Генотипирование полиморфных вариантов, выбранных для анализа

2.5. Выделение мононуклеарных клеток и субпопуляции клеток СБ4+ из периферической крови

2.6. Полногеномный анализ метилирования ДНК из клеток периферической крови

2.7. Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Анализ ассоциации полиморфизма генов иммунного ответа с ППРС и РРС

3.1.1. Анализ ассоциации основных аллелей высокополиморфного гена HLA-DRB1 с ППРС и РРС

3.1.2. Анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов биаллельных полиморфных участков генов иммунного ответа с ППРС и РРС

3.1.3. Логистический регрессионный анализ и ЯОС-анализ выявленных генетических маркеров риска развития ППРС и РРС

3.2. Полногеномный анализ профилей метилирования ДНК больных ППРС и РРС

3.2.1. Анализ метилирования ДНК из мононуклеарных клеток крови

3.2.2. Анализ метилирования ДНК из СБ4+ Т-лимфоцитов

2

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген;

АС-ПЦР - полимеразная цепная реакция с аллель-специфическими праймерами; АТ - антитело;

ВПРС - вторично-прогрессирующий рассеянный склероз;

ГА - глатирамера ацетат;

ДИ - доверительный интервал;

ДМГ - дифференциально метилированные гены;

МНК - мононуклеарные клетки крови;

ОШ - отношение шансов;

ПИТРС - препараты, изменяющие течение РРС;

П.н. - пары нуклеотидов;

ППРС - первично-прогрессирующий рассеянный склероз; ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени;

РС - рассеянный склероз;

РРС - ремиттирующий рассеянный склероз;

ЦНС - центральная нервная система;

ЭАЭ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; 5mC - 5-метилцитозин;

AUC (Area Under the Curve) - площадь под кривой;

CCR5 (C-C Motif Chemokine Receptor 5) - ген, кодирующий C-C рецептор хемокина 5; CCL5 (C-C Motif Chemokine Ligand 5) - ген, кодирующий C-C хемокин 5; CD86 (Cluster of Differentiation 86) - ген, кодирующий мембранный белок CD86; CLEC16A (C-Type Lectin Domain Containing 16A) - ген, кодирующий член А семейства 16 белков с С-лектиновым доменом;

CTLA4 (СуюШхю T-Lymphocyte-Associated protein 4) - ген, кодирующий цитотоксический Т-лимфоцит ассоциированный белок 4;

CXCR5 (C-X-C Motif Chemokine Receptor 5) - ген, кодирующий C-X-C рецептор хемокина 5;

EDSS (Expanded Disability Status Scale) - расширенная шкала инвалидизации; FC (Fold Change) - величина различий;

GWAS (Genome-Wide Association Study) - полногеномный поиск ассоциаций; HLA (Human Leukocyte Antigen) - человеческий лейкоцитарный антиген;

HLA-DRB1 (Major Histocompatibility Complex, Class II, DR Beta 1) - ген, кодирующий в -цепь молекул HLA класса II;

IFNAR1 (Interferon Alpha And Beta Receptor Subunit 1) - ген, кодирующий субъединицу 1 рецептора интерферонов а и в;

IFNAR2 (Interferon Alpha And Beta Receptor Subunit 2) - ген, кодирующий субъединицу 2 рецептора интерферонов а и в; IL (Interleukin) - интерлейкин;

IL4 (Interleukin 4) - ген, кодирующий интерлейкин-4; IL6 (Interleukin 6) - ген, кодирующий Интерлейкин-6;

IL7RA (Interleukin 7 Receptor Subunit Alpha) - ген, кодирующий альфа-цепь рецептора интерлейкина-7;

IRF5 (Interferon Regulatory Factor 5) - ген, кодирующий транскрипционный фактор 5 семейства интерфероновых регуляторных факторов;

MHC (Major Histocompatibility Complex) - главный комплекс гистосовместимости; MIR146A - ген, кодирующий микроРНК hsa-mir-146a; MIR196A2 - ген, кодирующий микроРНК hsa-mir-196a; MIR499A - ген, кодирующий микроРНК hsa-mir-499a; MSSS (Multiple Sclerosis Severity Score) - шкала тяжести РС; PBS (phosphate buffered saline) - натрий-фосфатный буфер; ROC (Receiver Operating Characteristic) - рабочая характеристика приёмника; SNP (single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм; TGFB1 (Transforming Growth Factor Beta 1) - ген трансформирующего фактора роста бета 1;

Th (T-helper) - Т-хелпер;

Treg (regulatory T-cell) - регуляторная Т-клетка;

TNF (Tumor Necrosis Factor) -ген фактора некроза опухолей альфа;

VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - вариабельность числа тандемных повторов.

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Геномные исследования первично-прогрессирующей формы рассеянного склероза»

Актуальность проблемы

Достижения в области молекулярной биологии и молекулярной медицины в последние десятилетия позволили значительно расширить представления о механизмах формирования и протекания многих распространенных заболеваний человека, что, в свою очередь, привело к существенному прогрессу в их диагностике и терапии. В настоящее время внимание многих исследователей направлено на изучение аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний, распространенность которых в мире постоянно возрастает.

Рассеянный склероз (РС) - тяжелое хроническое заболевание центральной нервной системы (ЦНС), сочетающее в своем патогенезе аутоиммунную и нейродегенеративную компоненты и сопровождающееся прогрессирующей неврологической дисфункцией. Следствием неуклонного нарастания неврологического дефицита является необратимая инвалидизация пациентов в молодом трудоспособном возрасте, что обуславливает высокую социальную и экономическую значимость заболевания. РС встречается практически по всему земному шару, но распространенность его в разных популяциях сильно варьирует. В России это заболевание встречается с частотой около 80 случаев на 100 000 населения [28].

Этиология заболевания остается до конца не раскрытой, хотя установлено, что РС представляет собой комплексное заболевание и развивается под воздействием факторов внешней среды у лиц с генетической предрасположенностью [114]. При этом влияние внешних факторов на риск развития РС может быть в значительной мере опосредовано эпигенетическими механизмами, в частности, метилированием ДНК [227]. Наследование РС носит полигенный характер, и индивидуальный спектр независимо действующих или взаимодействующих полиморфных генов у больного может обуславливать различные проявления РС.

Течение РС характеризуется выраженной клинической гетерогенностью. В большинстве случаев у больных наблюдается ремиттирующая форма РС (РРС), характеризующаяся сменами периодов обострения (нарастание степени неврологического дефицита) и ремиссии (снижение или исчезновение неврологической симптоматики) [165]. Однако у 10-15% пациентов непрерывное нарастание неврологического дефицита наблюдается с самого начала болезни, и такая тяжелая злокачественнаяформа РС получила название первично-прогрессирующей (ППРС) [143].

Сейчас в мире разработаны и успешно применяются различные иммуномодулирующие препараты, изменяющие течение РРС, однако абсолютное их большинство не эффективно при терапии ППРС [289]. Поскольку на ранних стадиях заболевания дифференциальная диагностика ППРС и РРС может быть затруднена, в ряде случаев это приводит к назначению больным ППРС заведомо неэффективных при этой форме РС препаратов, а значит и к необратимому ухудшению состояния пациентов. Стоимость медикаментозной терапии РС в России для одного пациента составляет от 350 до 600 тыс. руб. в год [29], что определяет не только социальную, но и экономическую значимость проблемы ранней дифференциальной диагностики ППРС и РРС.

ППРС имеет существенные отличия от РРС как по механизмам развития патологического процесса [53], так и по целому ряду демографических и клинических характеристик, таких как гендерное соотношение больных, средний возраст дебюта заболевания, клинические признаки дебюта, скорость прогрессирования заболевания и др. [60, 143]. Эти отличия могут объясняться генетическими и эпигенетическими особенностями ППРС.

Изучение генетических особенностей РС традиционно проводили для РРС из-за его высокой распространенности. Наибольшую эффективность в обнаружении новых маркеров предрасположенности показал полногеномный поиск ассоциации (Genome Wide Association Study, GWAS), который в случае РРС позволил выявить более 200 однонуклеотидных полиморфизмов (singlenucleotide polymorphism, SNP), ассоциированных с [119]. Однако эффективность этого подхода напрямую зависит от размера исследуемых групп, состоящих в большинстве случаев из десятков и сотен тысяч людей. Всего два GWAS были проведены к настоящему моменту для больных ППРС, и каждый из них включал менее 1000 больных этой формой РС [118, 185]. Проведенные GWAS не выявили значимо ассоциированных с ППРС полиморфных вариантов кроме аллеля HLA-DRBJ*15 - главного маркера предрасположенности к РРС. Относительная малочисленность пациентов с ППРС делает актуальным поиск генетических детерминант этой формы РС с использованием подхода «ген-кандидат», при этом особый интерес вызывает поиск полиморфных вариантов генов иммунного ответа, которые могут по-разному участвовать в формировании патогенетических особенностей ППРС и РРС.

Вместе с тем, даже для относительно хорошо изученного РРС совокупный эффект всех генетических вариантов, идентифицированных в GWAS, по разным оценкам может объяснить не более 30% наследуемости [14]. Свой вклад в проблему «недостающей» наследуемости РС могут вносить эпигенетические модификации, не затрагивающие последовательности ДНК, но влияющие на экспрессию генов в различных клетках или

7

тканях. Одним из наиболее важных эпигенетических механизмов является метилирование ДНК в позиции С5 цитозинового основания в составе CpG-динуклеотидов. Метилирование CpG-сайтов в области промотора гена приводит к быстрому подавлению генной экспрессии с участием репрессорных белков [47]. Поиск отдельных дифференциально метилированных сайтов генома (ДМС) и специфических паттернов метилирования, характеризующих РС, может помочь в понимании механизмов его развития и способствовать разработке новых эффективных препаратов для терапии болезни. С помощью полногеномного анализа с использованием чипов высокой плотности удалось показать изменение профиля метилирования ДНК из различных клеток и тканей больных РРС в сравнении со здоровыми индивидами [117, 171, 172, 176]. Для больных ППРС подобных исследований не проводилось, что делает актуальным поиск эпигенетических маркеров, характеризующих эту тяжелую форму РС.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы было оценить вовлеченность генома в формирование предрасположенности к агрессивной первично-прогрессирующей форме РС на основании анализа связи генетической вариабельности (полиморфизм панели генов иммунного ответа) и эпигенетических модификаций (метилирование ДНК) с возникновением ППРС у этнических русских.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Провести анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов полиморфных вариантов панели генов, вовлеченных в регуляцию иммунного ответа и воспалительных реакций, с развитием ППРС в сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы.

2) Для выявления сходства и различий в генетической архитектуре ППРС и РРС провести для тех же генов анализ их ассоциации с РРС (в сравнении со здоровыми индивидами), а также аналогичный анализ при прямом сравнении между больными двумя формами РС.

3) Оценить прогностический потенциал выявленных генетических маркеров ППРС с помощью множественного логистического регрессионного анализа и ROC-анализа.

4) Для оценки вовлеченности эпигенетической модификации генома посредством его метилирования в формирование патогенетических особенностей двух форм РС провести полногеномный анализ профилей метилирования ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК) больных ППРС и РРС, а также здоровых индивидов контрольной группы с последующим сравнением полученных данных.

5) Для выявления у больных ППРС и РРС специфических профилей метилирования в CD4+ Т-лимфоцитах, играющих центральную роль в иммунопатогенезе РС, провести аналогичный анализ для ДНК, полученной из этих субпопуляций лимфоцитов.

Научная новизна работы

Впервые показана ассоциация с развитием ППРС аллелей/генотипов HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*11, IRF5 *A/A, CXCR5*A/A, CLEC16A*G/G и IFNAR2*C. Ассоциация с ППРС аллелей/генотипов HLA-DRB1*15, IL7RA*C/C и IL4*C/C показана впервые для русской популяции. Показано, что аллели/генотипы HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*15, IL7RA*C/C, CXCR5*A/A и CLEC16A*G/G ассоциированы с РС независимо от его формы.

Впервые показано, что аллели и генотипы HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1 *09, IL4*C/C, IL6*C, IRF5*A/A, MIR196A2*С и IFNAR2*С дискриминируют эти две формы РС; среди них выявлены ППРС-специфические (HLA-DRB1*07, IL4*C/C, IRF5*A/A, IFNAR2*C) и РРС-специфические варианты (HLA-DRB1*09 и IL6*C).

Впервые показано участие метилирования ДНК - эпигенетического механизма регуляции генной экспрессии - в формировании основных форм РС: ППРС и РРС. Паттерны ДМС из МНК позволили дискриминировать образцы больных ППРС, больных РРС и здоровых индивидов, на три обособленные группы.

Впервые показано, что ДМС, обнаруженные у больных ППРС как в МНК, так и в CD4+ Т-лимфоцитах, характеризуются существенным гиперметилированием по сравнению с больными РРС и здоровыми индивидами контрольной группы.

Теоретическая и практическая значимость

Идентифицированы полиморфные варианты генов иммунного ответа как ассоциированные с РС независимо от его формы, так и дискриминирующие ППРС и РРС. Эти результаты способствуют лучшему пониманию как генетической архитектуры РС в целом, так и генетических различий его клинических форм, а также указывают на возможные общие и различающиеся патогенетические компоненты развития аутоиммунного воспаления при ППРС и РРС.

Предложены композитные генетические модели для оценки суммарной предсказательной способности выявленных генетических маркеров. Композитная модель, построенная для прямого сравнения «ППРС vs РРС», может быть полезной для определения клинической формы РС, что может способствовать выбору эффективных терапевтических стратегий на ранних стадиях лечения РС у конкретного индивида.

Различия, обнаруженные в паттернах метилирования ряда генов при ППРС и РРС, свидетельствуют об участии метилирования ДНК как эпигенетического механизма в формировании этих двух форм РС. Тот факт, что более половины выявленных ДМС располагались в CpG-островках и в соседних с ними областях, указывает на их возможное функциональное значение в регуляции экспрессии генов, а значит и степени вовлечения этих генов в патогенез ППРС и РРС.

В целом, полученные результаты позволяют расширить знания о патогенезе ППРС, что может послужить основой для поиска новых терапевтических мишеней при лечении этой агрессивной формы РС.

Положения, выносимые на защиту

1) Выявлена генетическая предрасположенность к ППРС как к заболеванию полигенной природы, в формирование которого вовлечены гены иммунного ответа.

2) Выявлены общие для ППРС и РРС генетические детерминанты, а также варианты, различающие между собой эти две формы РС.

3) Показана особая роль локуса HLA в формировании клинического фенотипа РС: с развитием ППРС и РРС ассоциировано носительство разных групп аллелей гена HLA-DRB1.

4) Для дифференциальной диагностики ППРС и РРС могут быть полезны композитные модели, которые включают идентифицированные аллели/генотипы и обладают удовлетворитенльной предсказательной силой.

5) Показано различие профилей метилирования ДНК из МНК и CD4+ Т-лимфоцитов больных ППРС и РРС, при этом ППРС характеризуется повышенным уровнем метилирования ДНК как по сравнению с РРС, так и по сравнению со здоровыми индивидами.

Личное участие автора в получении научных результатов

Автору принадлежит основная роль в анализе литературных данных по теме диссертационной работы, разработке цели и задач исследования, статистической обработке полученных данных, их анализе и интерпретации, подготовке публикаций по результатам диссертационной работы. Автору принадлежит основная роль в формировании коллекции геномной ДНК больных ППРС и генотипировании полиморфных вариантов генов иммунного ответа у этих больных, а также в выделении клеток крови и подготовке всех образцов ДНК для полногеномного анализа

метилирования. Автор непосредственно участвовал в составлении коллекций геномной ДНК больных РРС и здоровых индивидов и их генотипировании.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты, представленные в настоящей работе, получены с использованием репрезентативных исследуемых групп и современных молекулярно-генетических методов, соответствующих поставленным целям и применяемых в аналогичных исследованиях. Материалы работы представлены на следующих международных и всероссийских научных конференциях: IX Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (2014, Москва); European Biotechnology Congress (2015, Bucharest); Clinical Epigenetics International Meeting CLEPSO (2016, Dusseldorf); 4-я Всероссийская конференция «Геномное секвенирование NGS-2016» (2016, Москва); 13th International Congress of Neuroimmunology (2016, Jerusalem); IX Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная Диагностика 2017» (2017, Москва); II Всероссийская конференция с международным участием «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (2017, Новосибирск); XIII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (2018, Москва).

Публикации

Результаты работы изложены в виде 10 публикаций в рецензируемых российских и международных научных журналах и 6 тезисов в сборниках материалов конференций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Большинство заболеваний человека являются многофакторными (комплексными). В основе развития комплексной патологии лежит наследственная предрасположенность, которая, как правило, имеет полигенную природу. На генетическую предрасположенность накладывается действие различных факторов внешней среды, многократно усиливающих риск развития заболевания. Взаимодействие наследственных и внешних факторов, приводящее к патологическому изменению клеточных процессов, в свою очередь может опосредоваться эпигенетическими механизмами регуляции генной экспрессии, к которым в настоящее время относят метилирование ДНК, ковалентную модификацию гистоновых белков и действие малых регуляторных некодирующих РНК [227].

К комплексным заболеваниям относят и рассеянный склероз (РС), тяжелое заболевание центральной нервной системы (ЦНС), представляющее собой серьезную медико-социальную проблему.

1.1. Эпидемиология и клиническая характеристика РС

РС - хроническое заболевание ЦНС, сочетающее в своем патогенезе аутоиммунную и нейродегенеративную компоненты и сопровождающееся прогрессирующей неврологической дисфункцией [227]. РС является одним из самых распространенных в мире неврологических заболеваний - по последним данным количество больных РС по всему земному шару превышает 2.5 млн человек, из них в России - более 150 тыс. человек [1]. Хотя случаи заболевания РС известны для всех этносов, включая латиноамериканские, азиатские и африканские, наибольшего распространения болезнь достигает среди жителей Европы [61]. В Российской Федерации распространенность РС составляет около 80 случаев на 100,000 населения, хотя еще несколько десятилетий назад регистрировалось менее 50 случаев на 100,000 [28]. Ежегодно в развитых странах РС диагностируются десятки тысяч новых случаев РС, и с каждым годом это число растет [21]. Во многом такой рост может быть связан с совершенствованием диагностики РС, однако не стоит исключать из рассмотрения и истинный рост заболеваемости. Хотя РС может развиваться в любом возрасте, чаще всего начальные симптомы заболевания проявляются у молодых людей, обычно в интервале от 20 до 40 лет [21]. В России средний возраст больных на момент постановки диагноза составляет 32±11 лет [29]. При отсутствии своевременного лечения нарастание неврологического дефицита ведет к быстрой инвалидизации больных молодого трудоспособного возраста, что определяет

высокую социальную значимость заболевания. Демографические исследования показали, что женщины заболевают РС примерно в 2.5-3 раза чаще, чем мужчины [232].

а

Рисунок 1.1. Схематическое представление динамики неврологических нарушений, происходящих при течении различных форм рассеянного склероза (модифицировано из [11]). Радиологически изолированный синдром (РИС), как правило, обнаруживается случайно при проведении МРТ головного мозга у бессимптомных пациентов и характеризуется обычными для РС очагами демиелинизации в ЦНС. Клинически изолированный синдром (КИС) диагностируется при развитии первого характерного для РРС клинического обострения, за которым могут следовать долгие годы ремиссии. Повторные обострения в комплексе с данными лабораторных и инструментальных методов диагностики дают основания для постановки диагноза РРС, который при длительном течении перетекает в ВПРС. ППРС характеризуется неуклонным прогрессированием неврологического дефицита с самого начала болезни.

Течение РС характеризуется выраженной клинической гетерогенностью. Наиболее часто - примерно в 85% случаев - развивается ремиттирующая форма заболевания (РРС) [165]. Для нее характерны чередования клинических обострений, проявляющихся в виде выраженных неврологических нарушений, и клинической ремиссии, во время которой неврологические показатели больного улучшаются или полностью восстанавливаются (рис. 1.1). В случае отсутствия эффективной медикаментозной терапии примерно у половины больных РРС в течение 10 лет от начала заболевания, а у 80-90% больных через

13

30 лет заболевание переходит во вторично-прогрессирующую форму РС (ВПРС), при которой происходит постоянное нарастание неврологического дефицита [144]. Развитие ВПРС влечет за собой быстрое нарушение трудоспособности и социальной адаптации пациентов вследствие накопления неврологических, а затем и психических нарушений.

У 10-15% больных непрерывное накопление неврологического дефицита без выраженных клинических ремиссий наблюдается с самого начала заболевания, в таком случае говорят о первично-прогрессирующей форме РС (ППРС) [143]. В отличие от основной ремиттирующей формы РС соотношение мужчин и женщин среди больных ППРС примерно равно, дебют заболевания происходит примерно на 10 лет позже, а скорость ухудшения состояния больных, оцениваемая по расширенной шкале инвалидизации (EDSS, Expanded Disability Status Scale), для ППРС превышает таковую для РРС почти в 2.5 раза [60, 143]. В ряде работ высказывалось предположение, что ППРС, по сути, представляет собой вторично-прогрессирующую стадию РС, ремиттирующая стадия которого протекает без выраженных клинических симптомов и потому не диагностируется вовремя [321], однако различия между ППРС и ВПРС обнаруживаются уже при сравнении демографических данных пациентов. Средний возраст больных ППРС на момент дебюта заболевания составляет около 40 лет, в то время как ВПРС развивается в более старшем возрасте, к тому же ВПРС характеризуется обычным и для РРС смещением соотношения полов пациентов в сторону женщин, чего не наблюдается при ППРС [124, 292].

В настоящее время разработаны и активно применяются по всему миру иммуномодулирующие препараты, изменяющие течение РРС (ПИТРС) [57]. При своевременном начале терапии они способны эффективно купировать прогрессирование заболевания, что позволяет больным существенно дольше вести активную жизнь. Однако абсолютное большинство используемых для лечения РРС препаратов не эффективно при терапии ППРС [289]. К настоящему времени на рынок лекарственных средств выведен только один препарат, обладающий доказанной эффективностью при ППРС, -окрелизумаб, представляющий собой гуманизированные анти-CD20 моноклональные антитела, направленные против зрелых B-лимфоцитов [209]. При этом на ранних стадиях заболевания дифференциальная диагностика ППРС и РРС может быть затруднена, что в ряде случаев может приводить к назначению больным ППРС заведомо неэффективных при этой форме заболевания ПИТРС, а значит и к необратимому ухудшению состояния пациентов. Кроме того, стоимость медикаментозной терапии РС в России для одного пациента может составлять от 350 до 600 тыс. руб. в год в зависимости от тяжести

заболевания [29], что определяет не только социальную, но и экономическую значимость проблемы ранней дифференциальной диагностики ППРС и РРС.

1.2. Этиология РС

Несмотря на то, что РС активно изучается, многие аспекты его этиологии до сих пор остаются неизвестными. Считается, что РС, как и другие распространенные аутоиммунные заболевания с выраженным воспалительным компонентом, относится к группе комплексной патологии и развивается при воздействии факторов внешней среды у лиц с генетической предрасположенностью [ 109].

Существование наследственной предрасположенности к РС не вызывает сомнения. Каждый восьмой больной РС имеет в семейном анамнезе случаи заболевания [99]. В близнецовых исследованиях обнаруживается существенное повышение конкордантности по РС у монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными [100]. К настоящему моменту проведено множество генетических исследований, подтвердивших существование наследственной предрасположенности к РС полигенного характера. Использование полногеномного поиска ассоциации (GWAS, Genome Wide Association Study) позволило выявить более 200 полиморфных локусов, ассоциированных с РС и часто расположенных в области генов иммунного ответа; среди них основным универсальным аллелем риска считается НЬА-0Л8/*1501 [119]. Особенности генетической архитектуры РРС и ППРС будут подробнее рассмотрены в последующих разделах.

Одним из наиболее известных внешних факторов, связанных с риском развития РС, является дефицит витамина D в организме. Его ключевая роль в формировании предрасположенности к РС была показана при анализе результатов крупных проспективных исследований, проведенных в США. Низкая концентрация в крови основного метаболита витамина D, 25-гидрокси-холекальциферола, имела выраженную корреляцию с высоким риском развития РС [212]. Витамин D вовлечен в регуляцию врожденного иммунитета, участвует в стимуляции активности регуляторных Т-клеток, способных подавлять аутоиммунные реакции, и ингибировании Th1 и ТЫ7-лимфоцитов, играющих основную роль в патогенезе РС [201]. Возможные механизмы участия витамина D в развитии РС остаются плохо изученными, однако в ряде работ показано его влияние на процессы эпигенетической регуляции генной экспрессии, происходящие в клетке, что может вести к существенным изменениям в профиле экспрессии генов по всему геному [237]. Так, 1,25-дигидрокси-холекальциферол, один из метаболитов витамина D, при связывании со своим рецептором индуцирует супрессию транскрипции

15

провоспалительного цитокина IL-17 путем привлечения гистоновой деацетилазы к промотору его гена; это ведет к деацетилированию гистонов и конденсации хроматина [133].

К числу внешних факторов, связанных с развитием РС причисляют инфекционные агенты, а прежде всего, вирусы. К настоящему моменту показана четкая связь высокого риска развития РС с перенесенным ранее инфекционным мононуклеозом - заболеванием, вызываемым вирусом Эпштейна-Барр, а в сыворотке многих больных РС наблюдаются высокие титры антител (АТ) к различным антигенам (АГ) этого вируса [8, 213, 316]. Стоит отметить, что для больных ППРС и РРС титры АТ к разным АГ вирусной частицы могут отличаться [74]. В ряде работ также показана связь риска развития РС и его клинических проявлений с заболеваемостью вирусом ветряной оспы [223, 255, 276]. Связь риска РС с перенесенными вирусными инфекциями может объясняться кросс-реактивностью вирусных АГ и аутоантигенов ЦНС, которая может способствать формированию патологического иммунного ответа у лиц с генетической предрасположенностью к РС. Кроме того вирусные агенты могут воздействовать на эпигенетический механизм метилирования ДНК. Так белок LMP1 (latent membrane protein 1) вируса Эпштейна-Барр способен активировать клеточные ДНК-метилтрансферазы, что ведет к гиперметилированию ряда собственных генов клетки и последующему подавлению их экспрессии [224]. Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолей вирусом Эпштейна-Барр приводит к развитию лимфогранулематоза, назофарингеальной карциномы и некоторых других онкологических заболеваний [153, 293, 294].

Еще одним важным фактором риска развития РС является курение табака. Хотя не все работы с использованием подхода «случай-контроль» выявляют значимую ассоциацию курения с риском РС [41, 306], сопоставимые результаты более достоверных проспективных когортных исследований позволяют с высокой степенью уверенности утверждать, что РС чаще развивается у курящих людей [107, 290, 300]. Показано, что у больных РС активное курение ведет к повышению уровней продукции провоспалительных цитокинов интерлейкина (IL)-6, IL-13, IL-17, IL-22 и хемокинов CCL2, CCL3 и CXCL10 и, при этом, снижает количество CD4+CD25+FoxP3+ регуляторных Т-клеток (Treg) [54]. Исследования последних лет показали, что курение, как и инфецирование вирусом Эпштейна-Барр, стимулирует метилирование ДНК [304]. Гиперметилирование генов-супрессоров опухолей обнаруживается у курящих больных раком легких и шейки матки [146, 169]. Кроме того, курение способствует модификации гистонов и изменению профилей экспрессии микроРНК в ряде клеточных популяций [123,

177], т.е. влияет на три основных механизма эпигенетической регуляции генной экспрессии.

На риск развития РС может влиять уровень половых гормонов, о чем свидетельствует более высокая заболеваемость РС среди женщин [60], однако точные механизмы этого влияния остаются мало изученными. Уровень женских половых гормонов, судя по всему, коррелирует с риском РС нелинейно. Показано, что его повышение у женщин может оказывать протективный эффект. Так прием пероральных контрацептивов в течение трех лет способствовал снижению риска РРС у женщин из Великобритании почти на 40% [5]. При этом для ППРС значимые результаты получить не удалось, что, вероятно, было связано с очень маленькой группой больных этой формой РС (всего 9 человек) [5]. Во время беременности также обнаруживается снижение риска развития РРС и частоты обострений у уже заболевших женщин [51, 259]. Протективный эффект при РС, который оказывает изменение уровня половых гормонов у женщин, носит временный характер и не обнаруживается при анализе риска в долгосрочной перспективе [5, 106]. Природа наблюдаемого эффекта может объясняться способностью эстрогенов в определенных концентрациях смещать баланс провоспалительных и противовоспалительных сигналов в сторону последних [309, 310]. При этом влияние половых гормонов на генную экспрессию помимо прочего опосредуется эпигенетическими процессами [30, 65, 239, 313].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Киселев Иван Сергеевич, 2019 год

Источник ДНК

Исследованные группы

Основной результат

Год, ссылка

Исследования дифференциального метилирования ДНК отдельных локусов

T-

лимфоциты

Больные РРС,

контрольная

группа

Обнаружено гиперметилирование области альтернативного промотора гена VDR у больных РРС.

2017 [9]

МНК

Больные РРС,

контрольная

группа

Обнаружено гиперметилирование промоторов генов TET2 и DNMT1, что может объяснять сниженный уровень экспрессии этих генов. Значимых различий в глобальном метилировании не выявлено.

2014 [34]

Больные РРС,

контрольная

группа

Выявлено существенное гиперметилирование промотора гена PTPN6 у больных РРС.

2012 [150]

Больные РРС,

контрольная

группа

Обнаружено гипометилирование промотора гена PAD2 у больных РРС, коррелирующее с повышенной экспрессией гена.

2012 [33]

Монозиготные близнецы, дискордантные по диагнозу РС

Не выявлено дифференциального метилирования промотора гена CIITA.

2008 [247]

Цельная кровь

Больные РРС в обострении и в ремиссии, контрольная группа

Анализ генов RUNX3, MLH1, IGF2, CDKN2A, SOCS1, NEUROG1, CACNA1G и CRABP1 выявил дифференциальное метилирование RUNX3, CDKN2A, SOCS1 и NEUROG1 у больных РРС в сравнении с контролями. Различий между больными в

2018 [273]

обострении и ремиссии не наблюдалось.

Больные РРС, контрольная группа Не выявлено дифференциального метилирования гена TMEM39A. 2017 [302]

Больные мягким РРС и тяжелым 1ШРС Анализ генов HLA-DRB1 и HLA-DRB5 не выявил связи их метилирования с формой РС. 2010 [97]

Сыворотка крови Больные РРС в обострении и в ремиссии, контрольная группа Обнаружено гиперметилирование гена MOG у больных РРС в обострении при сравнении с больными в ремиссиии и контрольной группой. 2016 [229]

Ткани мозга Больные РРС, контрольная группа Выявлено дифференциальное метилирование гена IL2RA у больных РРС. 2017 [77]

Больные РРС, контрольная группа Обнаружено гипометилирование гена PADI2 в нормальном белом веществе больных РРС. 2007 [186]

Исследования маркеров глобального метилирования ДНК

МНК Группы больных РРС до и после терапии интерфероном-бета, контрольная группа Выявлена связь гиперметилирования ретротранспозонов LINE-1 с высоким риском РРС и низкой эффективностью терапии ИФНб. 2017 [238]

Цельная кровь Больные РРС, контрольная группа Обнаружено гиперметилирование ретротранспозонов LINE-1 у больных РРС, причем уровень метилирования коррелировал со средним уровнем инвалидизации по шкале EDSS. 2016 [221]

Сыворотка крови Больные РРС, контрольная группа Обнаружено гиперметилирование элементов подсемейства L1PA2 ретротранспозонов LINE-1 у больных РРС. 2018 [66]

Исследования с применением чипов и высокопроизводительного секвенирования

CD4+ T-лимфоциты Больные РРС и ВПРС, контрольная группа Обнаружено гиперметилирование последних экзонов гена VMPHMIR21 у больных РРС при сравнении с контрольной группой и больными ВПРС. 2018 [258]

Больные РРС до и после лечения диметил- Обнаружено 945 ДМС, 97% которых было гиперметилировано после лечения. ДМС генов SNORD1A, SHTN1, MZB1 и TNF были расположены в промоторной области. 2018 [173]

фумаратом

Больные РРС, контрольная группа Показано дифференциальное метилирование локуса HLA в области генов HLA-DRB1, HLA-DRB5 и RNF39. ДМС также обнаружены в области генов HCG4B, PM20D1 и ERICH1. 2017 [172]

Больные РРС, контрольная группа Не выявлено значимых различий в метилировании ДНК больных РРС и здоровых контролей. 2015 [26]

Больные РРС, контрольная группа Показано дифференциальное метилирование локуса HLA (19 ДМС) в области гена HLA-DRB1 и 55 ДМС за его пределами, многие из которых локализованы в генах, связь которых с РС была показана ранее. 2014 [90]

Монозиготные близнецы, дискордантные по диагнозу РС Не выявлено значимых различий в метилировании ДНК между близнецами. 2010 [13]

CD8+ T-лимфоциты Больные РРС, контрольная группа Обнаружено 79 ДМС, ни один из которых не располагался в области гена HLA-DRB1. 2015 [171]

Больные РРС, контрольная группа Показано гиперметилирование ДНК у больных РРС по сравнению с контролем. Различий в уровнях метилирования отдельных ДМС не выявлено. 2015 [26]

CD19+ B-лимфоциты Больные РРС на лечении, контрольная группа Обнаружено крупное скопление ДМС в области гена LTA, а также ДМС в области РС-ассоциированных генов SLC44A2, LTBR, CARD11 и CXCR5. 2018 [174]

CD14+ моноциты Больные РРС, контрольная группа Обнаружено 2 ДМС в области гена HLA-DRB1. 2018 [149]

Цельная кровь Больные РРС, контрольная группа Показана связь курения с уровнем метилирования ДНК у больных РРС. Различия были более существенными для женщин и носителей гаплотипов риска РС локуса HLA. 2017 [176]

Больные РРС, контрольная группа Показаны значимые различия метилирования ДНК между больными РРС и контрольной группой. 2017 [77]

Больные РРС, контрольная группа Не выявлено значимых различий в метилировании ДНК больных РРС и здоровых контролей. 2015 [26]

Сыворотка Больные РРС в Обнаружены значимые различия паттернов 2010 [160]

крови обострении и в ремиссии, контрольная группа метилирования между всеми тремя группами.

Ткани мозга Демиелинизи-рованная и нормальная ткань мозга больных РС В демиелинизированной ткани гиппокампа выявлено дифференциальное метилирование 16 генов, экспрессия которых характерна для астроцитов и нейронов. 2017 [45]

Больные РРС, контрольная группа Обнаружено гиперметилирование генов, участвующих в поддержании жизнедеятельности олигодендроцитов; гены, вовлеченные в протеолитические процессы были гипометилированы. 2014 [117]

ДМС - дифференциально метилированный сайт

Наиболее распространенным подходом, применяемым для анализа метилирования ДНК, как и в случае генетической предрасположенности, стал поиск ДМС в области перспективных «генов-кандидатов». Подобный анализ в большинстве работ проводился в МНК, Т-лимфоцитах, сыворотке или цельной крови больных РРС в сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы, а в некоторых случаях и в сравнении с больными РРС на различных стадиях патологического процесса (обострение и ремиссия) (см табл. 1.2.). Были выявлены ДМС в области генов, вовлеченных в иммунный ответ (SOCSI) [273], функционирование нервной системы (MOG, NEUROGI) [33, 229], рост и развитие (PTPN6, CDKN2A) [150, 273], метаболизм витамина D (VDR) [9] и регуляцию генной экспрессии (DNMTI, TET2, RUNX3) [34, 273]. В двух работах, изучавших метилирование ДНК в тканях головного мозга, ДМС были выявлены в генах цитокинового рецептора IL2RA и пептидил-деиминазы PADI2, участвующей в посттрансляционной модификации основного белка миелина [77, 186]. Отдельно стоит отметить единственное проведенное к настоящему моменту исследование, включившее группу больных ППРС [97]. Проведенный в этой работе анализ метилирования генов HLA-DR8I и HLA-DR85 в цельной крови больных РРС, ППРС и здоровых индивидов не выявил значимых различий между группами.

В нормальных условиях повторяющиеся последовательности генома, ретротранспозоны суперсемейства LINE, содержат много метилированных CpG-сайтов, что предотвращает транскрипцию их генов [270], поэтому анализ их дифференциального метилирования получил широкое распространение, как простой способ оценки глобального уровня метилирования генома при различных опухолях и некоторых

аутоиммунных заболеваниях [66]. Уровень метилирования ретротранспозонов семейства LINE-1 изучался у больных РРС в МНК, в цельной крови и в сыворотке крови [66, 221, 238]. Во всех случаях наблюдали гиперметилирование LINE-1 при РРС. Кроме того, была обнаружена связь более высокого уровня метилирования LINE-1 с выраженной инвалидизацией по шкале EDSS и низкой эффективностью терапии интерфероном бета [221, 238]. Для больных ППРС подобных исследований не проводилось.

Поиск ДМС по всему геному с применением чипов высокой плотности или высокопроизводительного секвенирования в последние годы получил широкое распространение при анализе эпигенетических механизмов, вовлеченных в патогенез РС (см табл. 1.2). В отличие от GWAS полногеномный анализ метилирования не требует включения в исследование больших групп больных РС: обычно их размер варьирует в интервалах от пяти-шести до двадцати-тридцати пациентов. Несмотря на это, все подобные работы были выполнены с привлечением только больных РРС, а больные ППРС не были включены ни в одно из них. Большинство опубликованных работ концентрируется на анализе метилирования ДНК в CD4+ T-лимфоцитах, однако полученные в них данные достаточно противоречивы. В двух работах одной и той же исследовательской группы были получены значимые различия профилей метилирования у больных РРС и здоровых индивидов контрольной группы [90, 172]. Единственным дифференциально метилированным регионом, идентифицированным в этих работах, был гиперметилированный локус HLA, преимущественно в области гена HLA-DRB1. Другие ДМС, выявленные в одной из работ, не находят подтверждения в другой, что может объясняться отличиями в дизайне этих исследований. В работе [258] обнаружено гиперметилирование кластера ДМС в двух последних экзонах гена VMP1/MIR21 у больных РРС при сравнении с контрольной группой и больными ВПРС, а в работе [26] выявлено более 40 ДМС, характеризующихся номинальным уровнем значимости. Еще в одном исследовании вовсе не удалось обнаружить значимых различий метилирования ДНК у больных РРС и здоровых индивидов [13]. Авторы анализировали профили метилирования ДНК в трех парах монозиготных близнецов, дискордантных по диагнозу РС, и обнаружили между близнецами меньшие различия в уровнях метилирования, чем между неродственными здоровыми индивидами. В то же время, изучение ДНК CD4+ T-лимфоцитов одних и тех же больных РРС до и после курса терапии диметилфумаратом позволило выявить множество ДМС по всему геному, 97% которых были гиперметилированы после лечения [173]. Полученные в этом исследоваии результаты указывают на необходимость принимать во внимание терапию ПИТРС при подборе гомогенных групп больных РС для анализа метилирования.

Результаты, полученные для двух исследований метилирования ДНК CD8+ T-лимфоцитов, также трудносопоставимы. Так, в работе [26] обнаружено глобальное гиперметилирование ДНК при РРС, но не выявлено значимых различий метилирования отдельных CpG-сайтов; а результаты исследования [171] не подтверждают тенденции к гиперметилированию ДНК при РРС, однако обнаруживается 79 значимых ДМС. При изучении CD19+ B-лимфоцитов обнаружен кластер ДМС в области гена LTA, а также ряд ДМС в области генов SLC44A2, LTBR, CARD11 и CXCR5, которые ассоциированы с РС по результатам GWAS [174]. Стоит отметить, что группа больных РРС в этом исследовании была очень гетерогенной: в нее вошли как пациенты, не подвергающиеся медикаментозной терапии, так и больные, принимающие 5 различных иммуномодулирующих препаратов. В CD14+ моноцитах больных РРС метилирование гена HLA-DRB1 оказалось сниженным, причем преимущественно у носителей аллеля DRB1 *1501 [149]. В единичных работах обнаружены значимые различия профилей метилирования ДНК, полученной из сыворотки или цельной крови [77, 160]. В одном исследовании показана связь курения с уровнем метилирования ДНК у больных РРС, причем наиболее значимые различия были обнаружены у женщин и носителей гаплотипов риска РС локуса HLA [176]. В тканях головного мозга наблюдали дифференциальное метилирование ДНК, полученной из демиелинизированной и нормальной ткани гиппокампа [45], а также из ткани фронтальной коры больных РС и контрольной группы без патологических изменений [117].

В целом, для групп больных РРС показано изменение метилирование ряда локусов ДНК как различных клеток крови, так и ткани мозга по сравнению со здоровыми индивидами. Однако противоречивость полученных данных и отсутствие исследований, включающих группы больных ППРС, делает актуальным дальнейшее изучение метилирования ДНК как эпигенетического процесса регуляции генной экспрессии при РС.

Заключение

Достижения в области молекулярной биологии в последние десятилетия позволили значительно расширить представления о механизмах развития РС. При этом объектом изучения в большинстве работ становится РРС, а исследования редкой, но более тяжелой формы РС - ППРС немногочисленны и, во многом, противоречивы. В то же время накапливается все больше данных о том, что патогенез ППРС и РРС может существенно различаться. Следствием этого являются демографические и клинические отличия, наблюдаемые у больных этими формами заболевания, а также различия в эффективности медикаментозной терапии ППРС и РРС [289]. Подобные отличия могут объясняться

45

генетическими и эпигенетическими особенностями ППРС. Их выявление может помочь в расширении знаний о патогенезе ППРС, а кроме того поможет в разработке панелей маркеров для диагностики ППРС на ранних стадиях заболевания и новых препаратов для его терапии.

Исходя из всего вышеописанного, выполненная диссертационная работа направлена на изучение вовлеченности генома в развитие ППРС на основании анализа вклада генетического компонента (полиморфизм генов иммунного ответа и микроРНК) и эпигенетического компонента (метилирование ДНК) в предрасположенность к этой форме РС у этнических русских.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Использованные в работе реактивы

В работе использовали следующие реактивы: наборы для выделения ДНК из цельной крови QIAamp Blood Midi Kit ("QIAGEN", Германия); наборы для бисульфитной конверсии ДНК EZ DNA Methylation-Gold Kit ("Zymo Research", CŒA); чипы высокой плотности Infinium HumanMethylation450 BeadChip ("Illumina", CŒA); Taq-полимераза, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, олигонуклеотиды, флуоресцентно меченые зонды, буфер для ПЦГ (ЗAО "Cинтол", Pоссия); эндонуклеазы рестрикции, олигонуклеотиды, маркер молекулярной массы ДНК pUC19/Msp I (НПО "^бЭтим", Pоссия); наборы для генотипирования в реальном времени (ООО "ДНК-Технология", Pоссия; "Thermo Fisher Scientific", CŒA); агароза ("Pancreac", Испания); бромфеноловый синий, ксиленцианол ("BioRad", CŒA); Фиколл-1077 Гистопак, трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), NP-40, PBS в таблетках ("Sigma-Aldrich", CŒA); Tween 20, Triton X-100 ("Ferak", Германия); микробусы с антителами к CD4 и CD14-антигенам ("Miltenyi Biotec", Германия). Остальные реактивы категории о.с.ч. получали из российских фирм.

2.2. Объект исследования

Объектом генетического исследования стали 110 больных 111 IPC (50 женщин, 60 мужчин; средний возраст - 47.5 ± 10.7) и 564 больных PPC (393 женщины, 171 мужчина; средний возраст - 38.7 ± 10.7). В табл. 2.1. приведены основные демографические и клинические характеристики групп больных UPC и PPC. Образцы крови больных были предоставлены сотрудниками различных региональных неврологических центров и отделений, а также ГКБ №11 и №24 г. Mосквы. Диагноз «достоверный PC» ставился согласно критериям MакДональда в редакции от 2010 года [242]. Контрольную группу составили 424 здоровых добровольца (285 женщин, 139 мужчин; средний возраст - 44.2 ± 16.0 лет) без признаков неврологических заболеваний.

Таблица 2.1. Демографические и клинические характеристики больных ППРС и РРС.

Форма РС ППРС, n=110 РРС, n=564

Соотношение полов (женщины: мужчины) Средний возраст пациентов (лет)± ББ Средний возраст дебюта (лет) ± ББ Средняя длительность болезни (лет) ± ББ Среднее значение ББЗБ (лет)± ББ Среднее значение MSSS ± SD 1:1.2 (50:60) 47.5 ± 10.7 37.7 ± 10.1 9.7 ± 7.2 5.20 ± 1.49 7.10 ± 1.98 2.3:1 (393:171) 38.7 ± 10.7 27.4 ± 9.2 11.4 ± 7.4 2.76 ± 1.17 3.41 ± 1.91

Для всех клинических характеристик значение р, определенное с помощью критерия Манна-Уитни, было менее 0.01

В исследование метилирования ДНК были включены 8 больных ППРС (6 женщин и 2 мужчин) и 14 больных РРС (6 в стадии ремиссии и 8 в стадии обострения; 9 женщин и 5 мужчин) в возрасте от 28 до 58 лет. Средний уровень инвалидизации по шкале EDSS у больных ППРС составил 4.29 ± 0.39, у больных РРС - 2.32 ± 0.823. Больные, включенные в это исследование, никогда не принимали иммуномодулирующих препаратов. В контрольную группу вошли 8 здоровых добровольцев (6 женщин, 2 мужчин) в возрасте от 28 до 50 лет без признаков неврологических заболеваний.

Все включенные в исследование индивиды являлись этническими русскими по данным анкетирования и подписывали информированное согласие на участие в эксперименте. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ (протокол заседания №139 от 10.11.2014).

2.3. Выделение геномной ДНК из цельной крови и клеток

Для выделения геномной ДНК из цельной крови и клеток использовали коммерческие наборы QIAamp Blood Midi Kit.

1. В пробирки вносили 200 мкл протеиназы и 2 мл цельной крови, затем перемешивали и добавляли 2.4 мл лизирующего буфера AL, после чего интенсивно перемешивали в течение 1 минуты;

2. Смесь инкубировали на водяной бане 10 минут при 70°С, после чего добавляли в пробирку 2 мл 96% этанола и интенсивно перемешивали;

3. Переносили полученную смесь в колонки, помещенные в чистые пробирки и центрифугировали 3 минуты при 1850 g, затем удаляли из пробирок фильтрат;

4. В колонку вносили 2 мл отмывочного буфера AW1 и центрифугировали 2 минуты при 3200 g, затем вносили 2 мл отмывочного буфера AW2 и центрифугировали 15 минут при 3200 g;

5. Колонки оставляли в инкубаторе при 70°C на 10 минут для удаления остатков спирта и затем помещали в чистые пробирки;

6. Вносили в колонки 300 мкл буфера для элюции AE, инкубировали при комнатной температуре 5 минут, затем центрифугировали 4 минуты при 3200 g. Вносили в колонки еще 300 мкл буфера AE и повторяли проделанные операции;

7. Переносили фильтрат, содержащий ДНК в чистые пробирки типа эппендорф объемом 1.5 мл и хранили при +4 °C.

2.4. Генотипирование полиморфных вариантов, выбранных для анализа

Генотипирование выбранных полиморфных участков проводили различными методами, основанными на полимеразной цепной реакции (П1 IP) В случаях, когда отсутствовали литературные данные о методах генотипирования выбранных полиморфизмов, а также доступные для заказа коммерческие наборы, подбор олигонуклеотидов (праймеров и флуоресцентно-меченных зондов) для постановки HUP проводился с использованием ПО Primo SNP 3.4: SNP PCR Primer Design от Chang Bioscience или Primer3Plus от Whitehead Institute for Biomedical Research. Проверка специфичности праймеров к изучаемому фрагменту ДНК осуществлялась с помощью ПО BLAST NCBI. ПЦ? проводили в амплификаторах T100 ("BioRad", CŒA) или в детектирующих амплификаторах StepOnePlus ("Thermo Fisher Scientific", CŒA). В случае использования простой mP наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в агарозном геле, содержащем бромид этидия (1 мкг/мл) с последующей визуализацией в проходящем УФ-излучении. В качестве буфера для электрофореза использовали 1х TBE: 0.89 M Трис-борат; 0.89 M борная кислота; 0.002 M ЭДТ^ pH 8.0; 5х буфер для нанесения проб: 30% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксиленцианола.

Определение основных групп аллелей гена HLA-DRB1 проводили с помощью mP в реальном времени (ПЦP-PВ) с использованием коммерческих наборов HLA-ДНК-ТЕХ (ООО «ДНК Технология», Pоссия). Aмплификацию каждого образца проводили в детектирующем амплификаторе StepOnePlus ("ThermoFisher Scientific", CŒA) в 1б пробирках, каждая из которых содержала 10 мкл раствора специфических олигонуклеотидов под слоем парафина, 10 мкл раствора Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 80°C - 2 мин, 95°C - 10 мин; 2) 5 циклов: 94°C - 30 с, 64°C - 15 с; 3) 45 циклов: 94°C - 10 с, 64°C - 15 с; 4) 1 цикл: 94°C - 5 с; 5) 1 цикл: 25°C - 30 с; 5) хранение при 10°C. Основные группы аллелей гена HLA-DRB1, специфичные для каждого образца, определялись в соответствии с методикой

49

производителя по сочетанию пробирок, в которых наблюдалось накопление флуоресцентного сигнала.

Полиморфный участок rs333 в гене CCR5 генотипировали с помощью простой ПЦР с фланкирующими праймерами [263]. Использовали следующие праймеры: 5'-AGGTCTTCATTACACCTGCAGC-3' - прямой; 5'-CTTCTCATTTCGACACCGAAGC-3' - обратный.

Амплификацию проводили в амплификаторе Т100 ("BioRad", США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70мМ Трис HCl; 20мМ (NH4)2SÜ4; 0.025% Тритон-Х100; 0.2 мМ dNTP; 1.5мМ MgCl2; по 10 пмоль каждого праймера, 0.5 ед. Taq ДНК полимеразы, 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 40 циклов: 94°С - 30 с; 59°С - 30 с; 72°С -45с. 2) 1 цикл: 72°С - 7 мин. Наличие фрагмента длиной 137 п.н. в 3% агарозном геле после электрофоретического разделения свидетельствовало о присутствии в гене делеции 32 п.н., наличие фрагмента длиной 169 п.н. - гена дикого типа без делеции (рис. 2.1).

123456

ущщ tüf —» ^Н

и I

М w/d w/w w/w d/d w/d w/w о/к

Рисунок 2.1. Пример определения генотипов полиморфного варианта гбЗЗЗ в гене ССЯ5. М - маркер молекулярной массы; 1-6 - продукты амплификации образцов ДНК, 7 -отрицательный контроль (о/к). Для образцов, гомозиготных по аллелю дикого типа CCR5*w характерно присутствие на дорожке одного фрагмента длиной 169 п.н. (образцы 2, 3, 6), для гомозигот по мутантному аллелю CCR5*d - одного фрагмент длиной 137 п.н. (образец 4), у гетерозиготных образцов присутствуют оба этих фрагмента (образцы 1, 5).

Полиморфный вариант ге231775 в гене CTLA4 генотипировали путем анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР [179]. Использовали следующие праймеры:

5'-AAGGCTCAGCTGAACCTGGT-3' - прямой; 5'-CTGCTGAAACAAATGAAACCC-3' - обратный.

Амплификацию проводили в амплификаторе Т100 ("BioRad", США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0.05 М KCl, 0.01 М ТрисНС1 (pH 9.0), 5% формамид, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTP, по 5 пмоль каждого праймера, 0.5 ед. Taq-полимеразы, 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 94°С - 5 мин; 2) 30 циклов: 94°С - 1 мин; 58°С - 1 мин; и 72°С - 1 мин; 3) 1 цикл: 72°С - 7 мин. Продукт амплификации объемом 5 мкл инкубировали с 5 е.а. рестрикционной эндонуклеазы BstEII в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37°С в течение 5 часов. Наличие рестрикционного фрагмента длиной 130 п.н. в 3% агарозном геле после электрофоретического разделения свидетельствовало о присутствии аллеля A, наличие интактного фрагмента длиной 152 п.н. - аллеля G (рис. 2.2).

Рисунок 2.2. Пример определения генотипов полиморфного варианта rs231775 в гене CTLA4. М - маркер молекулярной массы; 1 - отрицательный контроль (о/к); 2-7 -продукты амплификации образцов ДНК. Для образцов, гомозиготных по аллелю CTLA4*A, характерно присутствие на дорожке одного фрагмента длиной 130 п.н. (образец 4), для гомозигот по аллелю CTLA4*G - одного фрагмент длиной 152 п.н. (образцы 5-7), у гетерозиготных образцов присутствуют оба этих фрагмента (образцы 2-3).

Гены IL7RA, TNF, TGFB1, IFNAR1 генотипировали методом методом ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров (АС-ПЦР)

Полиморфный вариант rs6897932 в гене IL7RA генотипировали методом АС-ПЦР с использованием следующих праймеров:

5'-AGATGGATCCTATCTTACTAAC-3' - прямой, специфичный к аллелю C; 5'-GAGATGGATCCTATCTTACTAAT-3' - прямой, специфичный к аллелю Т; 5'-ACATTTCAAGTGGCAGATGCTC-3' - прямой контрольный; 5'-TTCGTGAAATGCCTTAATCCCC-3' - общий обратный.

Амплификацию проводили в амплификаторе Т100 ("BioRad", США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей Yankovsky MgCl2 10 рН 9,0 (70 мМТрис-НО, рН 9.0, 20 мМ ^4)2Б04, 1 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% КР-40); 0.2 мМ dNTP; праймеры (один из аллелеспецифических и фланкирующие, по 5 пмоль/мкл); 0.5 ед. Taq-полимеразы; 50-100 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95°С - 1 мин, 62°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 3) 20 циклов: 95°С - 30 с, 56°С - 50 с, 72°С - 50 с; 4) хранение при 10°С. Присутствие в образце аллелей С и Т оценивали в 3% агарозном геле после электрофоретического разделения по наличию фрагментов длиной 426 и 204 п.н., соответствующих внутреннему контролю и аллелеспецифическому продукту, соответственно.

На рис.2.3. в качестве примера анализа генотипов полиморфных вариантов методом АС-ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов амплификации в агарозном геле представлено определение генотипов БКР ге6897932 в гене К7ВА.

1 2 3 4 5 6

-ч — — — — — « _ ~ Внутренний контроль, 426 п.н.

^ " ^ U^J Аллелеспецифическй продукт, 204 п.н.

М С/1 С/С СЯ С/Т ТЛ" о/к

Рисунок 2.3. Определение генотипов полиморфного варианта методом АС-ПЦР на примере SNP rs6897932 в гене IL7RA. М - маркер молекулярной массы; 1-5 - продукты амплификации образцов ДНК, 6 - отрицательный контроль (о/к). Для каждого образца на первой дорожке производилось определение аллеля C, на второй - аллеля T. Для образцов, гомозиготных по аллелю IL7RA*C, характерно присутствие аллелеспецифического продукта длиной 204 п.н. только на первой дорожке (образец 2), для гомозигот по аллелю IL7R*T - на второй дорожке (образец 5), у гетерозиготных образцов аллелеспецифический продукт присутствует на обеих дорожках (образцы 1, 3, 4).

Полиморфный вариант rs1800629 в гене TNF генотипировали методом АС-ПЦР [102] с использованием следующих праймеров:

5'-AATAGGTTTTGAGGGGCATGA-3' - прямой, специфичный к аллелю А; 5'-ATAGGTTTTGAGGGGCATGG-3' - прямой, специфичный к аллелю G; 5'-AGTCTCCGGGTCAGAATGAA-3' - прямой контрольный;

5'-САШАаСТСАТСШаАааАА-3' - общий обратный.

Амплификацию проводили в амплификаторе Т100 ("ЫоЯаё", США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-НС1 рН 9.0, 20 мМ (МН4)2БО4, 1.0 мМ М§СЬ, 0.025% Tween 20, 0.025% КР-40, по 5 пмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы, 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 30 циклов: 92°С - 50 сек.; 65°С - 1 мин. 30 сек.; 72°С - 1 мин; 2) 1 цикл: 72°С - 7 мин. Присутствие в образце аллелей А и G оценивали в 2% агарозном геле после электрофоретического разделения по наличию фрагментов длиной 577 и 230 п.н., соответствующих внутреннему контролю и аллелеспецифическому продукту, соответственно.

Полиморфный вариант гб1800469 в гене TGFB1 генотипировали методом АС-ПЦР [281] с использованием следующих праймеров:

5'-ОООСААСАООАСАССТОАА-3' - прямой, специфичный к аллелю А; 5'-ОООСААСАООАСАССТОАО-3' - прямой, специфичный к аллелю G; 5'-ААООСАТООСАССОСТТСТО-3' - общий обратный.

Амплификацию проводили в амплификаторе Т100 ("ЫоЯаё", США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-НС1 рН 9.0, 20 мМ (МН4)28О4, 1.0 мМ М§С12, 0.025% Tween 20, 0.025% КР-40, по 5 пмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы, 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С - 1 мин; 3) 20 циклов: 95°С - 30 сек; 58°С -50 сек; 72°С - 50 сек. Присутствие в образце аллелей А и G оценивали в 2% агарозном геле после электрофоретического разделения по наличию фрагмента длиной 265 п.н., соответствующего аллелеспецифическому продукту.

Полиморфный вариант ге1012335 в гене IFNAR1 генотипировали методом АС-ПЦР с использованием следующих праймеров:

5'-ОСААСААОААСААААСТСТОТО-3' - прямой, специфичный к аллелю С; 5'-ОСААСААОААСААААСТСТОТС-3' - прямой, специфичный к аллелю ^ 5'-ТОООСАОАТСАССТОАвОТТО-3' - прямой контрольный; 5'-ООАООСТОТТТОАТОТОТОАТО-3' - общий обратный.

Амплификацию проводили в амплификаторе Т100 ("ЫоЯаё", США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCI рН 9.5, 20 мМ (МН4)2БО4, 1 мМ MgCl2, 0. 025% Tween 20, 0.025% КР-40, по 5 пмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы, 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95оС - 1мин; 60°С - 1мин; 72°С - 1мин.; 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 56°С - 50 с; 72°С - 50 с. Присутствие в образце аллелей С и G оценивали в 2% агарозном геле после электрофоретического разделения по наличию фрагментов длиной 443 и 237 п.н.,

53

соответствующих внутреннему контролю и аллелеспецифическому продукту, соответственно.

Гены IL4, IL6, CCL5, CD86, MIR146A, IRF5, CXCR5, MIR196A2, CLEC16A, MIR499A и IFNAR2 проводили методом ПЦР-РВ.

Генотипирование полиморфного варианта rs2243250 в гене IL4 проводили методом ПЦР-РВ с использованием следующих праймеров и зондов: 5'-GGACCCAAACTAGGCCTCAC-3' - прямой; 5'-ACAGGCAGACTCTCCTACCC-3' - обратный.

5'-(ROX) GGGAGAACATTGTCCCCCAGTGC(BHQ2)-3' - специфичный к аллелю С; 5'-(FAM)GGGAGAACATTGTTCCCCAGTGCT (RTQ1)-3' - специфичный к аллелю Т. Амплификацию проводили в детектирующем амплификаторе StepOnePlus ("ThermoFisher Scientific", США) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей буфер Yankovsky MgCl2 10 pH 9.0 (70 мМ Трис-HCl, pH 9.0; 20 мМ (NH4)2SO4; 1 мМ MgCl2; 0.025% Tween 20; 0.025% NP-40); 0.2 мМ dNTP; праймеры (прямой и обратный; 1 пмоль/мкл); зонды (специфичный к аллелю С и специфичный к аллелю T; 0.4 пмоль/мкл); 1.0 ед Taq-полимеразы; 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 94°С - 10 мин; 2) 40 циклов: 94°С - 15 с, 68°С - 30 с; 3) хранение при 10°С. Рост интенсивности флуоресцентного сигнала, соответствующего метке ROX, свидетельствовал о присутствии аллеля C. Накопление сигнала, соответствующего метке FAM - аллеля T.

На рис. 2.4. в качестве примера анализа генотипов полиморфных вариантов методом ПЦР-РВ представлено определение генотипов SNP rs2243250 в гене IL4.

Рисунок 2.4. Определение генотипов полиморфного варианта методом ПЦР-РВ на примере БОТ ^2243250 в гене 1Ь4\ А) гомозигота ге2243250*С/С (накопление флуоресцентного сигнала, характерного для метки R0X); Б) гетерозигота ге2243250*С^ (накопление флуоресцентного сигнала, характерного для двух меток); В) гомозигота гs2243250*T/T (накопление флуоресцентного сигнала, характерного для метки БАМ).

Генотипирование полиморфного варианта ге1800795 в гене 1Ь6 проводили методом ПЦР-РВ с использованием следующих праймеров и зондов: 5'-CGCTAGCCTCAATGACGACC-3' - прямой; 5'-GGTGGGGCTGATTGGAAACC-3' - обратный.

5'-(R0X)GTGTCTTGCGATGCTAAAGGACGTCAC(BHQ2)-3' - специфичный к аллелю

G;

5'-(FAM) GTGTCTTGCCATGCTAAAGGACGTCAC(RTQ1)-3' - специфичный к аллелю C.

Амплификацию проводили в детектирующем амплификаторе StepOnePlus ("ThermoFisher Scientific", США) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10х ПЦР буфер Б (компания "Синтол", Россия); 2,5 мМ MgCl2; 0.2 мМ dNTP; праймеры (прямой и обратный; 1 пмоль/мкл); зонды (специфичный к аллелю G и специфичный к аллелю C; 0.4 пмоль/мкл); 1.0 ед Taq-полимеразы; 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 95°С - 10 мин; 2) 40 циклов: 95°С - 15 с, 64°С - 50 с; 3) хранение при 10°С. Рост интенсивности флуоресцентного сигнала, соответствующего метке ROX, свидетельствовал о присутствии аллеля G. Накопление сигнала, соответствующего метке FAM - аллеля C.

Генотипирование полиморфного варианта rs2107538 в гене CCL5 проводили методом ПЦР-РВ с использованием следующих праймеров и зондов: 5'-CAATGCCCAGCTCAGATCAAC-3' - прямой; 5'-GAGAGCAGGAAGCCGCTTTC-3' - обратный.

5'-(ROX)GGATGAGGGAAAGGAGATAAGATCTG (BHQ2)-3' -специфичный к аллелю А; 5'-(FAM)GGATGAGGGAAAGGAGGTAAGATCTG (RTQ1)-3' -специфичный к аллелю G. Амплификацию проводили в детектирующем амплификаторе StepOnePlus ("ThermoFisher Scientific", США) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10х ПЦР буфер Б (компания "Синтол", Россия); 2.5 мМ MgCl2; 0.2 мМ dNTP; праймеры (прямой и обратный; 1 пмоль/мкл); зонды (специфичный к аллелю А и специфичный к аллелю G; 0.4 пмоль/мкл); 1.0 ед Taq-полимеразы; 100-200 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 94°С - 10 мин; 2) 40 циклов: 94°С - 15 с, 66°С - 30 с; 3) хранение при 10°С. Рост интенсивности флуоресцентного сигнала, соответствующего метке ROX, свидетельствовал о присутствии аллеля A. Накопление сигнала, соответствующего метке FAM - аллеля G.

Генотипирование полиморфных вариантов генов CD86 (rs2255214), MIR146A (rs2910164), IRF5 (rs4728142), CXCR5 (rs523604), MIR196A2 (rs11614913), CLEC16A (rs6498169), MIR499A (rs3746444) и IFNAR2 (rs2248202) проводили методом ПЦР-РВ с использованием коммерческих наборов олигонуклеотидов TaqMan SNP Genotyping Assay ("Thermo Fisher Scientific", США). Амплификацию проводили в детектирующем амплификаторе StepOnePlus ("ThermoFisher Scientific", США) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 11,5 мкл Master Mix ("Thermo Fisher Scientific", США), 1 мкл смеси праймеров и зондов, 9,5 мкл dH2O, 50-100 нг ДНК. Программа амплификации: 1) 1 цикл: 95°С - 10 мин; 2) 40 циклов: 92°С - 15 с, 60°С - 60 с; 3) хранение при 10°С. Для полиморфного варианта в гене CD86 рост интенсивности флуоресцентного сигнала, соответствующего метке VIC, свидетельствовал о присутствии аллеля G; накопление

56

сигнала, соответствующего метке FAM - аллеля T. Для варианта в гене MIR146A накопление метки VIC свидетельствовало о присутствии аллеля C, метки FAM - аллеля G. Для варианта в гене CXCR5 накопление метки VIC свидетельствовало о присутствии аллеля A, метки FAM - аллеля G. Для варианта в гене MIR196A2 накопление метки VIC свидетельствовало о присутствии аллеля C, метки FAM - аллеля T. Для варианта в гене CLEC16A накопление метки VIC свидетельствовало о присутствии аллеля A, метки FAM -аллеля G. Для варианта в гене MIR499A накопление метки VIC свидетельствовало о присутствии аллеля G, метки FAM - аллеля A. Для варианта в гене IFNAR2 накопление метки VIC свидетельствовало о присутствии аллеля A, метки FAM - аллеля C.

2.5. Выделение мононуклеарных клеток и субпопуляции клеток CD4+ из периферической крови

1. Периферическую кровь собирали в вакуумные пробирки Vacuette с 3-х замещенной калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (К3ЭДТА) в качестве антикоагулянта.

2. Кровь разводили натрий-фосфатным буфером (phosphate buffered saline, PBS) в два раза, тщательно перемешивали.

3. Наслаивали 8 мл крови на 3 мл раствора Фиколл-1077 Гистопак и центрифугировали при 2000 об/мин на центрифуге Eppendorf 5810R (400g) 20 мин при комнатной температуре с отключенным торможением ротора.

4. Вносили в чистые пробирки по 4 мл PBS и собирали в каждую интерфазные кольца с двух пробирок с Гистопаком, далее центрифугировали при 250g 10 минут при 4°С.

5. Удаляли из пробирок супернатант, клетки разводили в 2 мл PBS, и объединяли все образцы одного индивида. Центрифугировали при 200g 10 минут при 4°С.

6. Удаляли из пробирок супернатант, клетки разводили в 5 мл PBS. Центрифугировали при 200g 10 минут при 4°С.

7. Удаляли из пробирок супернатант, клетки разводили в 2 мл PBS. Определяли концентрацию клеток с помощью подсчета в камере Горяева.

8. Отбирали 5 млн МНК в PBS для заморозки при -70°С и дальнейшего анализа метилирования ДНК. Оставшиеся МНК осаждали путем центрифугирования при 200g 10 минут при 4°С.

9. Сливали супернатант и добавляли в пробирку на каждые 10 млн МНК 20 мкл микробус с антителами к СБ4-антигенам и 80 мкл буфера для микробус. Инкубировали 20 мин при 4°С.

10. Вносили в пробирку 1-2 мл буфера на каждые 10 млн МНК и центрифугировали при 200g 10 минут при 4°С.

11. Супернатант сливали, затем разводили клеточный осадок в 500 мкл буфера и наносили на магнитную колонку (Miltenyi Biotec). Промывали колонку 500 мкл свежего буфера и повторяли процедуру еще 2 раза.

12. Вносили в колонку 1 мл свежего буфера и элюировали связавшиеся с носителем колонки CD4+ лимфоциты с помощью поршня, поставляемого производителем колонок, подсчитывали концентрацию клеток с помощью камеры Горяева.

13. Клетки аликвотировали по 5 млн CD4+ лимфоцитов и замораживали при -70°С и дальнейшего анализа метилирования ДНК.

2.6. Полногеномный анализ метилирования ДНК из клеток периферической крови

ДНК выделяли из МНК и из CD4+ клеток крови клеток с использованием коммерческих наборов QIAamp Blood Midi Kit как описано выше (см. п.2.3) 200-500 нг ДНК подвергали бисульфитной конверсии с использованием коммерческих наборов EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research, Германия) согласно методике производителя:

1. К 20 мкл образца ДНК добавляли 130 мкл реагента для конверсии СТ, полученную смесь инкубировали в термоциклере 10 минут при 98°С, а затем 3.5 часа при 64°С;

2. Добавляли к смеси 600 мкл связывающего буфера М, перемешивали и переносили смесь в колонку, помещенную в пробирку, после чего центрифугировали 30 секунд при 10000g и удаляли из пробирки фильтрат;

3. Вносили в колонку 100 мкл промывочного буфера М и центрифугировали 30 секунд при 10000g, фильтрат удаляли;

4. Вносили в колонку 200 мкл десульфирующего буфера М, инкубировали при комнатной температуре 15-20 минут, после чего центрифугировали 30 секунд при 10000g и удаляли из пробирки фильтрат;

5. Вносили в колонку 200 мкл промывочного буфера М, центрифугировали 30 секунд при 10000g и удаляли фильтрат из пробирки. Вносили еще 200 мкл промывочного буфера М, центрифугировали 30 секунд при 10000g и переносили колонку в чистую пробирку;

6. Вносили в колонку 10 мкл буфера М для элюции, инкубировали 5 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 30 секунд при 10000g для получения очищенного образца конвертированной ДНК.

Оценку уровня метилирования ДНК проводили с помощью чипов высокой плотности Infinium HumanMethylation450 BeadChip на сканере чипов iScan (Illumina, США) в ЦКП «Геномика» СО PAН (ИХБФМ СО PAН).

2.?. Статистический анализ

Оценка соответствия частот аллелей/генотипов исследуемых полиморфизмов равновесию Харди-Вайнберга производилась с помощью критерия х с использованием веб-инструмента SNPStats (www.snpstats.net/start.htm). Анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов с развитием 111 IPG или PPС в сравнениях «ПОТС vs Контроль», «PPС vs Контроль» и «ПОТС vs PPС» производили с помощью ПО GraphPad Prism с применением двухстороннего критерия Фишера (pf). Ассоциацию считали номинально значимой, если значение pf для нее было меньше 0.05, а 95% доверительный интервал (ДИ) для отношения шансов (ОШ) не пересекал 1. Поправку на множественные сравнения проводили методом Бенджамини-Хохберга (pcorr) с использованием стандартных инструментов среды R. Ассоциацию считали значимой, если значение pcorr, не превышало 0.05. Множественный логистический регрессионный анализ и Receiver Operating Characteristic (ROQ-анализ, выполненные с использованием ПО IBM SPSS, применяли для оценки предсказательной способности значимых полиморфных вариантов генов. Вариант включали в аддитивную композитную модель если значение p для коэффициента ß не превышало 0.05. Поскольку соотношение полов и средний возраст в сравниваемых группах значимо отличались, для исключения их влияния на результаты логистического регрессионного анализа для всех индивидов проводили пропорциональное взвешивание по полу и возрасту; индивидуальные коэфициенты вычислялись с помощью стандартных инструментов среды R.

Первичная обработка данных полногеномного метилирования ДНК и их нормализация были выполнены Л.В. Даниловой (Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore) с помощью специально разработанных скриптов на языке программирования R. Для оценки уровня метилирования CpG-сайтов в образцах вычисляли показатель ß, который является отношением интенсивности сигнала метилирования данной пробы к общей интенсивности сигнала этой пробы. Значение бета может варьировать от 0 для неметилированной пробы до 1 для полностью метилированной пробы. Вычисление значений ß во всех случаях проводили с использованием пакета methylumi для среды R.

Из дальнейшего анализа исключались те пробы, которые содержали SNP на расстоянии не более 10 пар нуклеотидов от исследуемого CpG-сайта, и пробы, которые характеризовались наличием перекрывания с повторяющимися последовательностями

59

ДНК, а также те пробы, которые не проходили порога значимости обнаружения сигнала равного 0.05 более чем в 5% образцов. Из рассмотрения также были исключены пробы, расположенные в половых хромосомах. CpG-сайт считали дифференциально метилированным (ДМС), если для него в сравниваемых группах средние значения показателя бета различались (Fold Change, FC) более чем на 10%, т.е. |log2FC| был > 0.1, а соответствующая величина p, определенная с помощью t-теста Стьюдента, была меньше 0.01. Локализацию конкретного CpG-сайта в CpG-островке определяли, использовуя аннотацию UCSC в hg19; ДМС, локализованые в 2 тысячах п.н. от CpG-островков, относили к соседним областям (shore), локализованые в 2 тысячах п.н. от соседних областей, - к отдаленным областям (shelf) [20]. Визуализацию сигналов ДМС с помощью метода главных компонент (principal component analysis, PCA) и построение карт интенсивности сигналов осуществляли с использованием стандартных методов среды R.

Для функционального анализа генов, содержащих дифференциально метилированные сайты (ДМГ), использовали аннотацию с биологическими функциями по базе данных Gene Ontology (geneontology.org) [288]. Анализ перепредставленности биологических функций и оценка распределения функций среди аннотированных генов проводились с использованием web-инструмента PANTHER Classification System (v.14.0 release from the 2018.12.03, pantherdb.org/).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Анализ ассоциации полиморфизма генов иммунного ответа с ППРС и РРС

В исследование были включены 18 полиморфных вариантов панели генов, вовлеченных в развитие иммунного ответа и воспалительных реакций, а именно генов цитокинов и их рецепторов (CCR5, IL7RA, IL4, TNF, IL6, CXCR5, CCL5 и TGFB1), генов сигнального пути интерферонов (IRF5, IFNAR1 и IFNAR2), генов Т-клеточных рецепторов (CTLA4 и CD86), генов, продукты которых участвуют в презентации антигена (CLEC16A и HLA-DRB1), а также генов микроРНК (MIR146A, MIR196A2 и MIR499A). При этом для генов CD86, IL7RA, HLA-DRB1, IRF5, CXCR5 и CLEC16A ранее уже были показаны ассоциации с РС в ряде GWAS, проведенных для европейских популяций [119].

Для гена HLA-DRB1 изучали распределение основных групп аллелей в исследуемых группах, в то время как в отобранных не-HLA генах-кандидатах выбор конкретных SNP ограничивался полиморфными участками, для которых частота минорного аллеля (minor allele frequency, MAF) была не менее 5%. Для всех выбранных полиморфных вариантов в русской популяции ассоциация с ППРС ранее не изучалась. Подробная характеристика выбранных для исследования полиморфных вариантов представлена в табл. 3.1.

Таблица 3.1. Характеристика исследуемых генов и их полиморфных вариантов.

Локус Ген Продукт гена SNP ID, нуклеотидная замена Эффект замены

2q33.2 CTLA4 Цитотоксический T-лимфоцит ассоциированный белок 4 rs231775, A > G Присутствие аллеля О вызывает замену треонина в положении 17 лидирующего пептида на аланин, что снижает уровень экспрессии СТЬЛ4 на поверхности клетки [203].

3p21.31 CCR5 C-C рецептор хемокина 5 rs333, w ^ del32 Делеция вызывает сдвиг рамки считывания, в результате чего экспрессируется укороченный нефункциональный пептид [262].

3q13.33 CD86 Мембранный белок CD86 rs2255214, G > T Нет данных.

5p13.2 IL7RA а-цепь рецептора интерлейкина-7 rs6897932, C > T Носительства аллеля C коррелирует с повышенным уровнем продукции растворимого IL7Ra [91].

5q31.1 IL4 Интерлейкин-4 rs2243250, C > T Носительство аллеля С коррелирует с повышенным уровнем экспрессии IL-4 в сыворотке крови [157].

5q33.3 MIR146A МикроРНК Ьва-ш1г-146а rs2910164, C > G Носительство аллеля G связано с повышенным уровнем продукции пре-микроРНК и зрелой miR-146a in vitro [128].

6p21.32 HLA- DRB1 Р1-цепь ИЬЛ класса II Основные группы аллелей Разные аллели отвечают за разную аффинность связывания различных антигенных пептидов [38].

6p21.33 TNF Фактор некроза опухоли rs1800629, G > A Носительство алелля A коррелирует с повышенным уровнем экспрессии TNF в МНК [102].

7p15.3 IL6 Интерлейкин-6 rs1800795, C > G Влияние полиморфизма на экспрессию может быть различным в зависимости от окружающих его SNP и типа клеток [225, 287].

7q32.1 IRF5 Транскрипционны й фактор 5 семейства интерфероновых регуляторных факторов rs4728142, G > A Промотор, содержащий аллель А характеризуется большей эффективностью связывания ядерных белков in vitro [148].

11q23.3 CXCR5 С-Х-С рецептор хемокина 5 rs523604, A > G Нет данных.

12q13.13 MIR196A2 МикроРНК Ьва-ш1г-196а-2 rs11614913, C > T Данные о влиянии полиморфизма на экспрекссию и активность зрелой микроРНК противоречивы [112, 245, 267].

16p13.13 CLEC16A Член А семейства 16 белков с С- rs6498169, G > A Носительство аллеля G коррелирует с

лектиновым доменом повышенным уровнем экспрессии DEX1 и SOCS1 в тимусе [155].

17q12 CCL5 C-C хемокин 5 rs2107538, C > T Носительство аллеля A вызывает снижение уровня экспрессии CCL5 в люциферазном тесте за счет образования в промоторной области дополнительного сайта связывания для транскрипционных факторов семейства GATA [222].

19q13.2 TGFB1 Трансформирующ ий фактор роста Р1 rs1800469, C > T Носительство алелля T коррелирует с повышенной концентрацией TGFB1 в плазме крови [89].

20q11.22 MIR499A МикроРНК hsa-mir-499 rs3746444, A > G Полиморфизм может влиять на эффективность связывания микроРНК с мишенью; носительство аллеля А связано с повышенным уровнем продукции miR-499a in vitro [291].

21q22.11 IFNAR1 Субъединица 1 рецептора интерферонов а и в rs1012335, G > C Полиморфизм может участвовать в модуляции активности регулятоных клеток при развитии глиом [80].

21q22.11 IFNAR2 Субъединица 2 рецептора интерферонов а и в rs2248202, C> A Нет данных.

3.1.1. Анализ ассоциации основных аллелей высокополиморфного гена HLA-DRB1 с ППРС и РРС

Определены частоты носительства распространенных групп аллелей (далее -аллелей) гена HLA-DRB1 среди больных ППРС, РРС и здоровых индивидов контрольной группы. Для всех исследованных аллелей гена HLA-DRB1 в контрольной группе равновесие Харди-Вайнберга соблюдалось. Анализ частот аллелей проводился в попарных сравнениях «ППРС vs Контроль», «РРС vs Контроль» и «ППРС vs РРС».

Частоты носительства аллелей гена HLA-DRB1, полученные в сравнении «ППРС vs Контроль» для больных ППРС и здоровых индивидов контрольной группы представлены в табл. 3.2. Аллель DRB1*15 был позитивно ассоциирован с ППРС при сравнении со здоровыми индивидами (р/ = 4.8х10-7; рсогг = 5.3х10-5; ОШ (95% ДИ) = 3.08 (1.96-4.72)), а аллель DRB1*07 оказался негативно ассоциированным (протективным) (р/ = 0.0017; рсогг = 0.049; ОШ (95% ДИ) = 0.38 (0.19-0.71)) после введения поправки Бенджамини-Хохберга на множественные сравнения. Негативная ассоциация аллеля DRB1*11 с ППРС была номинально значимой (р/ = 0.025; ОШ (95% ДИ) = 0.53 (0.30-092)). Для остальных аллелей значимых ассоциаций с развитием ППРС выявлено не было (табл. 3.2.).

Таблица 3.2. Сравнение частот носительства аллелей гена HLA-DRB1 у больных

ППРС и здоровых индивидов контрольной группы.

Аллели Носители (%) Значения р/ (значимые рсогг) ОШ (95% ДИ)

Больные ППРС, п=110 Здоровые индивиды, п=424

DRB1*01 25 (22.9) 110 (26.6) Н.з. Н.з.

DRB1*03 17 (15.6) 52 (12.6) Н.з. Н.з.

DRB1*04 31 (28.4) 95 (22.9) Н.з. Н.з.

DRB1*07 12 (11.0) 102 (24.6) 0.0017 (0.049) 0.38 (0.19-0.71)

DRB1*08 11 (10.1) 36 (8.7) Н.з. Н.з.

DRB1*09 6 (5.5) 14 (3.4) Н.з. Н.з.

DRB1*10 0 (0.0) 9 (2.2) Н.з. Н.з.

DRB1*11 18 (16.5) 113 (27.3) 0.025 0.53 (0.30-0.92)

DRB1*12 4 (3.7) 33 (8.0) Н.з. Н.з.

DRB1*13 22 (20.2) 93 (22.5) Н.з. Н.з.

DRB1*14 2 (1.8) 8 (1.9) Н.з. Н.з.

DRB1*15 54 (49.5) 100 (24.2) 4.8х10-7 (5.3х10-5) 3.08 (1.96-4.72)

DRB1*16 3 (2.8) 21 (5.1) Н.з. Н.з.

Н.з. - не обнаружено значимых различий.

Проведен анализ ассоциации аллелей гена HLA-DRB1 с развитием РРС в сравнении «РРС vs Контроль». В табл. 3.3. представлены частоты носительства аллелей HLA-DRB1 для больных РРС и здоровых индивидов контрольной группы. С учетом поправки на множественные сравнения позитивно ассоциированными с развитием РРС оказались аллели DRB1*03 р = 0.00082; р^гт = 0.030; ОШ (95% ДИ) = 1.83 (1.28-2.59)) и DRB1*15 (р/ = 5.7х10-13; рсогг = 1.3х10-10; ОШ (95% ДИ) = 2.76 (2.09-3.67)), а протективными аллелями оказались аллели DRB1*01 р = 0.00024; рсогг = 0.016; ОШ (95% ДИ) = 0.56 (0.41-0.76)) и DRB1*11 р = 0.00030; рсогг = 0.015; ОШ (95% ДИ) = 0.56 (0.41-0.76)).

Негативные ассоциации аллелей DRB1*09 (pf = 0.0030; ОШ (95% ДИ) = 0.20 (0.07-0.58)) и DRB1*\2 (pf = 0.0066; ОШ (95% ДИ) = 0.45 (0.26-0.78)) с РРС характеризовались номинальным уровнем значимости. Для остальных аллелей значимых ассоциаций с РРС выявлено не было (табл. 3.3.). РРС-ассоциированные аллели DRB1*11 и DRB1*15, были выявлены и при сравнении «ППРС vs Контроль», поэтому их можно считать вариантами, ассоциированными с РС независимо от его формы.

Таблица 3.3. Сравнение частот носительства аллелей гена HLA--DRB1 у больных РРС

и здоровых индивидов контрольной группы.

Аллели Носители (%) Значения pf (значимые pcorr) ОШ (95% ДИ)

Больные РРС, n=564 Здоровые индивиды, n=424

DRB1*01 94 (16.7) 110 (26.6) 0.00024 (0.016) 0.56 (0.41-0.76)

DRB1*03 117 (20.8) 52 (12.6) 0.00082 (0.030) 1.83 (1.28-2.59)

DRB1*04 107 (19.0) 95 (22.9) Н.з. Н.з.

DRB1*07 111 (19.8) 102 (24.6) Н.з. Н.з.

DRB1*08 48 (8.5) 36 (8.7) Н.з. Н.з.

DRB1*09 4 (0.7) 14 (3.4) 0.0030 0.20 (0.07-0.58)

DRB1*10 11 (2.0) 9 (2.2) Н.з. Н.з.

DRB1*11 98 (17.4) 113 (27.3) 0.00030 (0.015) 0.56 (0.41-0.76)

DRB1*12 21 (3.7) 33 (8.0) 0.0066 0.45 (0.26-0.78)

DRB1*13 139 (24.7) 93 (22.5) Н.з. Н.з.

DRB1*14 6 (1.1) 8 (1.9) Н.з. Н.з.

DRB1*15 263 (46.8) 100 (24.2) 5.7х10-13 (1.3х10-10) 2.76 (2.09-3.67)

DRB1*16 30 (5.3) 21 (5.1) Н.з. Н.з.

Н.з. - не обнаружено значимых различий.

Проведен анализ ассоциации аллелей гена HLA-DRB1 с развитием ППРС в сравнении «ППРС vs РРС». В табл. 3.4. представлены частоты носительства аллелей HLA-DRB1 для больных ППРС и РРС. При прямом сравнении двух форм РС выявлена позитивная ассоциация аллеля HLA-DRB1*09 c ППРС, выдерживающая поправку на множественные сравнения (pf = 0.0019; pcorr = 0.042; ОШ (95% ДИ) = 8.13 (2.14-25.77)), а также номинально значимые позитивная ассоциации аллеля DRB1 *04 с ППРС (pf = 0.038; ОШ (95% ДИ) = 1.69 (1.07-2.67)) и DRB1*07 - с РРС (pf = 0.031; ОШ (95% ДИ) = 0.50 (0.26-0.93)). Для остальных аллелей значимых ассоциаций с развитием ППРС или РРС при прямом сравнении групп больных этими формами РС выявлено не было (табл. 3.4.). Аллель DRB1*07 можно считать ППРС-специфическим, т.к. он оказался ассоциирован с

ППРС при сравнении не только с РРС, но и с контрольной группой; аналогично аллель DRB1*09 можно отнести к РРС-специфическим вариантам.

Таблица 3.4. Сравнение частот носительства аллелей гена HLA-DRB1 у больных

ППРС и РРС.

Аллели Носители (%) Значения pf (значимые рсогг) ОШ (95% ДИ)

Больные Ш1РС, п=110 Больные РРС, п=564

DRB1*01 25 (22.9) 94 (16.7) Н.з. Н.з.

DRB1*03 17 (15.6) 117 (20.8) Н.з. Н.з.

DRB1*04 31 (28.4) 107 (19.0) 0.038 1.69 (1.07-2.67)

DRB1*07 12 (11.0) 111 (19.8) 0.031 0.50 (0.26-0.93)

DRB1*08 11 (10.1) 48 (8.5) Н.з. Н.з.

DRB1*09 6 (5.5) 4 (0.7) 0.0019 (0.042) 8.13 (2.14-25.77)

DRB1*10 0 (0.0) 11 (2.0) Н.з. Н.з.

DRB1*11 18 (16.5) 98 (17.4) Н.з. Н.з.

DRB1*12 4 (3.7) 21 (3.7) Н.з. Н.з.

DRB1*13 22 (20.2) 139 (24.7) Н.з. Н.з.

DRB1*14 2 (1.8) 6 (1.1) Н.з. Н.з.

DRB1*15 54 (49.5) 263 (46.8) Н.з. Н.з.

DRB1*16 3 (2.8) 30 (5.3) Н.з. Н.з.

Н.з. - не обнаружено значимых различий.

3.1.2. Анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов биаллельных полиморфных участков генов иммунного ответа с ППРС и РРС

Определены частоты носительства аллелей и генотипов 17 не-HLA генов, вовлеченных в развитие иммунного ответа и воспалительных реакций, в группах больных ППРС, РРС и здоровых индивидов. Для аллелей и генотипов всех исследованных полиморфных вариантов в контрольной группе равновесие Харди-Вайнберга соблюдалось. Анализ частот носительства аллелей и генотипов проводился в попарных сравнениях «ППРС vs Контроль», «РРС vs Контроль» и «ППРС vs РРС».

Частоты носительства аллелей и генотипов полиморфных вариантов белок-кодирующих генов CD86 (^2255214), CXCR5 (ге523604), IFNAR2 (ге2248202) и генов микроРНК МШ146А (^2910164), МЖ196А2 (ге11614913) и МЖ499А (ге3746444) в русской популяции определены впервые. Проведено сравнение частот генотипов этих вариантов в группе здоровых индивидов с данными, представленными в базе КСБ1 ёЬБКР. Для всех полиморфных участков всех исследуемых генов частоты генотипов соответствуют таковым для европейских популяций.

Проведен анализ ассоциации аллелей/генотипов не-НЬА генов с развитием ППРС в сравнении «ППРС га Контроль». Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных БКР в области генов иммунного ответа, для которых выявлены значимые ассоциации с развитием ППРС при сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы представлены в табл. 3.5. После введения поправки на множественные сравнения носительство генотипа И4*С/С р = 0.0012;рсогг = 0.038; ОШ (95% ДИ) = 2.17 (1.35-3.57)) было позитивно ассоциировано с ППРС . Носительство генотипов ¡Ь7ЯЛ*С/С (р/ = 0.039; ОШ (95% ДИ) = 1.61 (1.04-2.50)), /ЯК5*Л/Л (р/ = 0.020; ОШ (95% ДИ) = 1.78 (1.12-2.85)), СХСЯ5 *Л/Л (р/ = 0.0024; ОШ (95% ДИ) = 1.96 (1.25-3.03)), СЬЕС16Л*О/О (р/ = 0.0039; ОШ (95% ДИ) = 2.12 (1.27-3.57)) и аллелей Ш5*Л р = 0.026; ОШ (95% ДИ) = 1.80 (1.083.03)) и ШЛК2*С р = 0.042; ОШ (95% ДИ) = 1.57 (1.01-2.42)) было номинально ассоциировано с ППРС.

Таблица 3.5. Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных БКР в области генов иммунного ответа, для которых выявлена значимая ассоциация с развитием ППРС

при сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы.

Полиморфный

участок (число больных ППРС Аллель/ Носители (%) Значения р/ (значимые рсотт) ОШ (95% ДИ)

/ индивидов контрольной группы) генотип Больные ППРС Контрольная группа

С 107 (97.3) 390 (92.6) Н.з. Н.з.

1Ь4 Т 25 (22.7) 165 (39.2) 0.0012 (0.038) 0.46 (0.28-0.74)

ге2243250 С/С 85 (77.3) 256 (60.8) 0.0012 (0.038) 2.17 (1.35-3.57)

(110/421) С/Т 22 (20.0) 134 (31.8) Н.з. Н.з.

Т/Т 3 (2.7) 31 (7.4) Н.з. Н.з.

С 101 (92.7) 377 (96.2) Н.з. Н.з.

¡Ь7ЯЛ Т 40 (36.7) 189 (48.2) 0.039 0.62 (0.40-0.96)

^6897932 С/С 69 (63.3) 203 (51.8) 0.039 1.61 (1.04-2.50)

(109/392) С/Т 32 (29.4) 174 (44.4) Н.з. Н.з.

Т/Т 8 (7.3) 15 (3.8) Н.з. Н.з.

Л 87 (79.1) 286 (67.8) 0.026 1.80 (1.08-3.03)

Ш5 О 76 (69.1) 338 (80.1) 0.020 0.56 (0.35-0.89)

^4728142 Л/Л 34 (30.9) 84 (19.9) 0.020 1.78 (1.12-2.85)

(110/422) Л/О 53 (48.2) 202 (47.9) Н.з. Н.з.

О/О 23 (20.9) 136 (32.2) 0.026 0.55 (0.33-0.93)

СХСЯ5 Л 91 (82.7) 315 (77.0) Н.з. Н.з.

ге523604 О 67 (60.9) 308 (75.3) 0.0024 0.51 (0.33-0.80)

(110/409) Л/Л 43 (39.1) 101 (24.7) 0.0024 1.96 (1.25-3.03)

A/G 48 (43.6) 214 (52.3) Н.з. Н.з.

G/G 19 (17.3) 94 (23.0) Н.з. Н.з.

A 82 (75.2) 367 (86.6) 0.0039 0.47 (0.28-0.79)

CLEC16A G 75 (68.8) 266 (62.7) Н.з. Н.з.

rs6498169 A/A 34 (31.2) 158 (37.3) Н.з. Н.з.

(109/424) A/G 48 (44.0) 209 (49.3) Н.з. Н.з.

G/G 27 (24.8) 57 (13.4) 0.0039 2.12 (1.27-3.57)

A 99 (90.8) 370 (87.9) Н.з. Н.з.

IFNAR2 C 69 (63.3) 222 (52.7) 0.042 1.57 (1.01-2.42)

rs2248202 A/A 40 (36.7) 199 (47.3) 0.042 0.64 (0.41-0.99)

(109/421) A/C 59 (54.1) 171 (40.6) Н.з. Н.з.

C/C 10 (9.2) 51 (12.1) Н.з. Н.з.

Н.з. - не обнаружено значимых различий.

Для других исследованных полиморфных вариантов значимых ассоциаций в сравнении «ППРС vs Контроль» выявлено не было, частоты носительства их аллелей и генотипов представлены в табл. 3.6.

Таблица 3.6. Частоты носительства аллелей и генотипов полиморфных участков не-Н^А генов, для которых не было выявлено ассоциации с развитием ППРС в сравнении

«ППРС vs Контроль».

Полиморфный участок (число больных ПИРС / индивидов контрольной группы) Аллель/ генотип Носители (%)

Больные ПИРС Контрольная группа

A 89 (80.9) 341 (82.0)

G 76 (69.1) 289 (69.5)

СТЬА4 гб231775 (110/416) A/A 34 (30.9) 127 (30.5)

A/G 55 (50.0) 214 (51.4)

G/G 21 (19.1) 75 (18.0)

w 108 (99.1) 418 (99.1)

d 20 (18.3) 92 (21.8)

CCR5 гб333 (109/422) w/w 89 (81.7) 330 (78.2)

w/d 19 (17.4) 88 (20.9)

d/d 1 (0.9) 4 (0.9)

G 83 (75.5) 325 (78.3)

T 82 (74.5) 297 (71.6)

CD86 ге2255214 (110/415) G/G 28 (25.5) 118 (28.4)

G/T 55 (50.0) 207 (49.9)

T/T 27 (24.5) 90 (21.7)

МЖ146А ге2910164 (109/424) C G 43 (39.4) 103 (94.5) 165 (38.9) 406 (95.8)

C/C 6 (5.5) 18 (4.2)

C/G 37 (33.9) 147 (34.7)

G/G 66 (60.6) 259 (61.1)

A 20 (18.2) 90 (21.7)

G 106 (96.4) 411 (99.0)

TNF rs1800629 (110/415) A/A 4 (3.6) 4 (1.0)

A/G 16 (14.5) 86 (20.7)

G/G 90 (81.8) 325 (78.3)

C 70 (63.6) 278 (66.0)

G 90 (81.8) 328 (77.9)

IL6 rs1800795 (110/421) C/C 20 (18.2) 93 (22.1)

C/G 50 (45.5) 185 (43.9)

G/G 40 (36.4) 143 (34.0)

C 103 (93.6) 371 (87.5)

T 65 (59.1) 261 (61.6)

MIR196A2 rs11614913 (110/424) C/C 45 (40.9) 163 (38.4)

C/T 58 (52.7) 208 (49.1)

T/T 7 (6.4) 53 (12.5)

A 33 (31.7) 148 (36.3)

G 102 (98.1) 386 (94.6)

CCL5 rs2107538 (104/408) A/A 2 (1.9) 22 (5.4)

A/G 31 (29.8) 126 (30.9)

G/G 71 (68.3) 260 (63.7)

C 100 (91.7) 309 (89.8)

T 58 (53.2) 195 (56.7)

TGFB1 rs1800469 (109/344) C/C 51 (46.8) 149 (43.3)

C/T 49 (45.0) 160 (46.5)

T/T 9 (8.3) 35 (10.2)

C 42 (38.2) 145 (34.2)

T 107 (97.3) 414 (97.6)

MIR499A rs3746444 (110/424) C/C 3 (2.7) 10 (2.4)

C/T 39 (35.5) 135 (31.8)

T/T 68 (61.8) 279 (65.8)

C 63 (57.3) 253 (60.5)

G 96 (87.3) 360 (86.1)

IFNAR1 rs1012335 (110/418) C/C 14 (12.7) 58 (13.9)

C/G 49 (44.5) 195 (46.7)

G/G 47 (42.7) 165 (39.5)

Проведен анализ ассоциации аллелей/генотипов не-HLA генов с развитием РРС в сравнении «РРС vs Контроль». Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных SNP, для которых выявлены значимые ассоциации с РРС при сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы представлены в табл. 3.7. Генотип IL7RA*C/C был

позитивно ассоциирован с РРС после поправки на множественные сравнения (р- = 0.0027; рсогг = 0.049; ОШ (95% ДИ) = 1.49 (1.15-1.92)). Ассоциации аллелей/генотипов CD86*G/G (р- = 0.044; ОШ (95% ДИ) = 1.33 (1.01-1.75)), К6*С (р- = 0.0073; ОШ (95% ДИ) = 1.46 (1.11-1.92)), CXCR5 *Л/Л (р- = 0.0035; ОШ (95% ДИ) = 1.54 (1.16-2.04)), CLEC16A*G/G (р-= 0.045; ОШ (95% ДИ) = 1.43 (1.02-2.04)) и IFNAR2*Л (р- = 0.039; ОШ (95% ДИ) = 1.59 (1.04-2.44)) с РРС оказались номинально значимы. Стоит отметить, что генотипы IL7RA*C/C, CXCR5*A/A и CLEC16A*G/G были ассоциированы не только с РРС, но и с ППРС при сравнении с контрольной группой, поэтому их можно отнести к категории вариантов ассоциированных с РС независимо от его формы

Таблица 3.7. Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных БКР в области генов иммунного ответа, для которых выявлена значимая ассоциация с развитием РРС при

сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы.

Полиморфный участок (число больных РРС / индивидов контрольной группы) Аллель/ генотип Носители (%) Значения р-

Больные РРС Контрольная группа (значимые рсогг) ОШ (95% ДИ)

G 465 (82.6) 325 (78.3) Н.з. Н.з.

CD86 T 369 (65.5) 297 (71.6) 0.044 0.75 (0.57-0.99)

гб2255214 G/G 194 (34.5) 118 (28.4) 0.044 1.33 (1.01-1.75)

(563/415) G/T 271 (48.1) 207 (49.9) Н.з. Н.з.

T/T 98 (17.4) 90 (21.7) Н.з. Н.з.

C 534 (94.8) 377 (96.2) Н.з. Н.з.

К7М T 221 (39.3) 189 (48.2) 0.0027 (0.049) 0.67 (0.52-0.87)

гб6897932 C/C 342 (60.7) 203 (51.8) 0.0027 (0.049) 1.49 (1.15-1.92)

(563/392) C/T 192 (34.1) 174 (44.4) Н.з. Н.з.

T/T 29 (5.2) 15 (3.8) Н.з. Н.з.

C 417 (73.9) 278 (66.0) 0.0073 1.46 (1.11-1.92)

G 432 (76.6) 328 (77.9) Н.з. Н.з.

гб1800795 C/C 132 (23.4) 93 (22.1) Н.з. Н.з.

(564/421) C/G 285 (50.5) 185 (43.9) Н.з. Н.з.

G/G 147 (26.1) 143 (34.0) 0.0073 0.68 (0.52-0.90)

A 456 (81.1) 315 (77.0) Н.з. Н.з.

CXCR5 G 374 (66.5) 308 (75.3) 0.0035 0.65 (0.49-0.86)

ге523604 A/A 188 (33.5) 101 (24.7) 0.0035 1.54 (1.16-2.04)

(562/409) A/G 268 (47.7) 214 (52.3) Н.з. Н.з.

G/G 106 (18.9) 94 (23.0) Н.з. Н.з.

CLEC16A A 462 (81.9) 367 (86.6) 0.045 0.70 (0.49-0.98)

rs6498169 G 380 (67.4) 266 (62.7) Н.з. Н.з.

(564/424) A/A 184 (32.6) 158 (37.3) Н.з. Н.з.

A/G 278 (49.3) 209 (49.3) Н.з. Н.з.

G/G 102 (18.1) 57 (13.4) 0.045 1.43 (1.02-2.04)

A 518 (92.0) 370 (87.9) 0.039 1.59 (1.04-2.44)

IFNAR2 C 286 (50.8) 222 (52.7) Н.з. Н.з.

rs2248202 A/A 277 (49.2) 199 (47.3) Н.з. Н.з.

(563/421) A/C 241 (42.8) 171 (40.6) Н.з. Н.з.

C/C 45 (8.0) 51 (12.1) 0.039 0.63 (0.41-0.96)