Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Белякин, Степан Николаевич

• Белякин, Степан Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Белякин, Степан Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель работы.

1.3. Научная новизна.

1.3. Практическая ценность.

1.4. Апробация работы.

1.5. Список публикаций по теме диссертации.

2. ГЕТЕРОХРОМАТИН В ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ.

4 2.1. Прицентромерный гетерохроматин политенных хромосом слюнных желез.

2.1.1. Молекулярный состав ПГХ.

2.2. Интеркалярный гетерохроматин.

2.3. Репликация и транскрипционная активность гетерохроматина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster»

1.1. Актуальность проблемы

В последнее время широко обсуждается вопрос о корреляции между временем репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла и экспрессией генов: например, геномное исследование временного паттерна репликации в культуре клеток показало, что в культуре клеток Кс дрозофилы ранняя репликация в S фазе ассоциируется с активным состоянием генов (Schuebeler et al., 2002). Амплификация хорионовых генов в фолликулярных клетках дрозофилы и тканеспецифичная регуляция кластера (3-глобиновых генов у млекопитающих также представляют интерес в рамках совместной регуляции репликации и экспрессии генов.

В норме, в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster поздняя репликация во многих случаях приводит к недорепликации поздно реплицирующихся районов (Zhimulev, 1998). При этом помимо прицентромерных районов, состоящих преимущественно из разнообразных повторов, около 60 сайтов в эухрсматиновых плечах политенных хромосом, демонстрируют недорепликацию (Zhimulev et al., 2003а). Такие районы имеют ряд характеристик, свойственных прицентромерному гетерохроматину (ПГХ), поэтому получили название интеркалярного гетерохроматина (ИГХ). Один из районов ИГХ, 89DE был ранее охарактеризован с помощью Саузерн-блот гибридизации, и было показано, что зона недорепликации имеет протяженность 300-400 т.п.н., а ДНК может иметь представленность менее 5% по сравнению с рано реплицирующимся геном rosy (Moshkin et al., 2001). Если эухроматиновая часть генома дрозофилы содержит 120 м.п.н., а среднюю длину зоны недорепликации принять за 300 т.п.н., то около 15% ДНК, не считая прицентромерного гетерохроматина, значительно недореплицируется в слюнных железах D. melanogaster.

Районы ИГХ могут быть прекрасной моделью для изучения связи между репликацией и экспрессией генов. Однако генетически эти районы фактически не охарактеризованы. Необходимо выяснить, какие гены находятся в этих районах, как они экспрессируются и т.д. Для решения этой задачи мы использовали уникальные свойства гена Su(UR) (Suppressor of Underreplication).

Мутация гена Su(UR) приводит к исчезновению разломов в политенных хромосомах и к частичной политенизации ПГХ. Саузерн-блот анализ показал восстановление представленности ДНК до 100% во всех исследованных районах недорепликации (Belyaeva et al., 1998). Таким образом, продукт гена Su(UR) может рассматриваться как транс-фактор, специфически контролирующий позднюю репликацию в геноме дрозофилы, по меньшей мере, в тканях с политенными хромосомами.

Дополнительные, трансгенные копии гена Su(UR), вызывают усиление недорепликации в районах, образующих разломы, а также появление ее в поздно реплицирующихся районах, лишенных недорепликации в норме.

Поскольку ген Su(UR) имеет такое уникальное проявление, он может быть использован как инструмент для изучения явления поздней репликации в политенных хромосомах и организации районов интеркалярного и прицентромерного гетерохроматина. Сравнение уровня политенизации в линиях с разными дозами гена Su(UR) поможет выявить в геноме дрозофилы зоны недорепликации и определить их генетическое содержание.

1.2. Цель работы

Целью данной работы является изучение молекулярных свойств и генетического состава прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина в слюнных железах D. melanogaster.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: • Приготовить библиотеку микроклонов и охарактеризовать молекулярный состав прицентромерных районов политенных хромосом линии Su(UR)'.

• Определить границы недореплицированных областей в районах интеркалярного гетерохроматина и построить геномную молекулярную карту недорепликации.

• Проанализировать генетическое содержание недореплицированных районов.

1.3. Научная новизна

Впервые описаны последовательности из прицентромерных районов, политенизирующихся у мутантов 8и(и13)~. В ходе этой работы были прокартированы цитологически несколько протяженных участков ДНК, которые не были прокартированы в рамках проекта по секвенированию генома ОгоэорЬНа melanogaster. Впервые построена точная молекулярная карта политенизации, на которой нанесены 52 протяженных района недорепликации, на всех длинных плечах хромосом дрозофилы. Проведено обобщение нескольких наборов данных, полученных разными авторами, касающихся репликации и экспрессии генома дрозофилы, что позволило сделать вывод об обогащении районов недорепликации генами, специфически коактивируемыми в клетках зародышевого пути самцов дрозофилы. Предложен новый принцип организации генома О. те/аподавГег - кластеризация генов в поздно реплицирующихся областях, облегчающая их совместную регуляцию.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Белякин, Степан Николаевич

4.3. Выводы

1. в результате анализа библиотек микроклонов, полученных из прицентромерных районов политенных хромосом, обнаружены ранее неизвестные повторенные и уникальные последовательности.

2. районы прицентромерного гетерохроматина имеют сходную молекулярную организацию с полностью политенизирующимися основаниями плеч хромосом, которые, по-видимому, могут рассматриваться как зона перехода между эу- и гетерохроматином.

3. с помощью микрочипов определены границы и степень представленности ДНК в 52 районах недорепликации и построена геномная карта недорепликации ДНК в политенных хромосомах слюнных желез О. те/алодавГег.

4. клетки в культуре Кс и клетки слюнных желез имеют похожую картину репликации

5. гены, экспрессирующиеся в процессе дифференцировки тканей зародышевого пути самцов, организованы в кластеры, располагающиеся в недореплицированных и поздно реплицирующихся районах генома О. те1аподаз1ег.

6. предложена и обсуждена модель организации генома melanogaster, связывающая временную программу репликации и регуляцию генов.

5. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит Игоря Федоровича Жимулева проводившего научное руководство представленной работой, Гиоргоса Кристофидеса и Фотиса Кафатоса из Европейской Молекулярно Биологической Лаборатории, с которыми автор сотрудничал во время выполнения части работы, касающейся проведения экспериментов с микрочипами и анализа полученных результатов, Елену Сергеевну Беляеву, Сергея Анатольевича Демакова и Артема Анатольевича Алексеенко за активное и заинтересованное обсуждение работы и помощь в выполнении некоторых экспериментов, Валерия Федоровича Семешина за предоставление электронно-микроскопических фотографий политенных хромосом, Виктора Шлому, Алексея Пиндюрина и многих-многих других людей, с которыми автор контактировал во время выполнения работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Белякин, Степан Николаевич, 2005 год

1. Дубинин, Н.П., Хвостова, В.В. and Мансурова, В.В. (1941) хромосомные аберрации,летальные мутации и доза Х-лучей. Докл АН СССР, 31,386-388.

2. Прокофьева-Бельговская, А.А. (1986) Гетерохроматические районы хромосом. Москва. Наука, 1-432.

3. Alekseyenko, A.A., Demakova, O.V., Belyaeva, E.S., Makarevich, G.F., Kotlikova, I.V., Nothiger, R. and Zhimulev, I.F. (2002) Dosage compensation and intercalary heterochromatin in X chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosoma, 111, 106-113.

4. Arbeitman, M.N., Furlong, E.E., Imam, F., Johnson, E., Null, B.H., Baker, B.S., Krasnow, M.A., Scott, M.P., Davis, R.W. and White, K.P. (2002) Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science, 297, 2270-2275.

5. Berghella, L. and Dimitri, P. (1996) The heterochromatic rolled gene of Drosophila melanogaster is extensively polytenized andtranscriptionally active in the salivary gland chromocenter. Genetics, 144, 117-125.

6. Bonaccorsi, S., Gatti, M., Pisano, C. and Lohe, A. (1990) Transcription of a satellite DNA on two Y chromosome loops of Drosophila melanogaster. Chromosoma, 99, 260-266.

7. Bonaccorsi, S., Pisano, C., Puoti, F. and Gatti, M. (1988) Y chromosome loops in Drosophila melanogaster. Genetics, 120, 10151034.

8. Boutanaev, A.M., Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y. and Nurminsky, D.I. (2002) Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature, 420, 666-669.

9. Brosseau, G. (1960) Genetic analysis of the male fertility factors on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Genetics, 45, 257-274.

10. Caizzi, R., Caggese, C. and Pimpinelli, S. (1993) Bari-1, a new transposon-like family in Drosophila melanogaster with a unique heterochromatic organization. Genetics, 133, 335-345.

11. Carmena, M., Abad, J.P., Villasante, A. and Gonzalez, C. (1993) The Drosophila melanogaster dodecasatellite sequence is closely linked to the centromere and can form connections between sister chromatids during mitosis. J Cell Sci, 105 ( Pt 1), 41-50.

12. Cayirlioglu, P., Ward, W.O., Silver Key, S.C. and Duronio, R.J. (2003) Transcriptional repressor functions of Drosophila E2F1 and E2F2 cooperate to inhibit genomic DNA synthesis in ovarian follicle cells. Mol Cell Biol, 23, 2123-2134.

13. Cenci, G., Belloni, G. and Dimitri, P. (2003) 1(2)41Aa, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster, is required for mitotic and meiotic chromosome condensation. Genet Res, 81,15-24.

14. Cheutin, T., McNairn, A.J., Jenuwein, T., Gilbert, D.M., Singh, P.B. and Misteli, T. (2003) Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HP1 binding. Science, 299, 721-725.

15. Cordeiro, M., Wheeler, L., Lee, C.S., Kastritsis, C.D. and Richardson, R.H. (1975) Heterochromatic chromosomes and satellite DNAs of Drosophila nasutoides. Chromosoma, 51, 65-73.

16. Devlin, R.H., Bingham, B. and Wakimoto, B.T. (1990) The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster. Genetics, 125, 129-140.

17. DiBartolomeis, S.M., Tartof, K.D. and Jackson, F.R. (1992) A superfamily of Drosophila satellite related (SR) DNA repeats restricted to the X chromosome euchromatin. Nucleic Acids Res, 20, 1113-1116.

18. Dickson, E., Boyd, J.B. and Laird, C.D. (1971) Sequence diversity of polytene chromosome DNA from Drosophila hydei. J Mol Biol, 61, 615627.

19. Dimitri, P. (1991) Cytogenetic analysis of the second chromosome heterochromatin of Drosophila melanogaster. Genetics, 127, 553-564.

20. Dimitri, P. (1997) Constitutive heterochromatin and transposable elements in Drosophila melanogaster. Genetica, 100, 85-93.

21. Eberl, D.F., Duyf, B.J. and Hilliker, A.J. (1993) The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophila melanogaster. Genetics, 134, 277-292.

22. Endow, S.A. and Gall, J.G. (1975) Differential replication of satellite DNA in polyploid tissues of Drosophila virilis. Chromosoma, 50, 175-179.

23. Endow, S.A., Polan, M.L. and Gall, J.G. (1975) Satellite DNA sequences of Drosophila melanogaster. J Mol Biol, 96, 665-692.

24. Ferguson, B.M. and Fangman, W.L. (1992) A position effect on the time of replication origin activation in yeast. Cell, 68, 333-339.

25. Fraser, P., Gribnau, J. and Trimborn, T. (1998) Mechanisms of developmental regulation in globin loci. CurrOpin Hematol, 5, 139-144.

26. Ganetzky, B. (1977) On the components of segregation distortion in Drosophlla melanogaster. Genetics, 86, 321-355.

27. Gatti, M. and Baker, B.S. (1989) Genes controlling essential cell-cycle functions in Drosophila melanogaster. Genes Dev, 3, 438-453.

28. Gatti, M. and Pimpinelli, S. (1992) Functional elements in Drosophila melanogaster heterochromatin. Annu Rev Genet, 26, 239-275.

29. Gilbert, D.M. (2002) Replication timing and transcriptional control: beyond cause and effect. Curr Opin Cell Biol, 14, 377-383.

30. Goldstein, L.S., Hardy, R.W. and Lindsley, D.L. (1982) Structural genes on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 7405-7409.

31. Hecht, A., Strahl-Bolsinger, S. and Grunstein, M. (1996) Spreading of transcriptional repressor SIR3 from telomeric heterochromatin. Nature, 383, 92-96.

32. Heun, P., Laroche, Т., Raghuraman, M.K. and Gasser, S.M. (2001) The positioning and dynamics of origins of replication in the budding yeast nucleus. J Cell Biol, 152, 385-400.

33. Hilliker, A.J. (1976) Genetic analysis of the centromeric heterochromatin of chromosome 2 of Drosophila melanogaster. deficiency mapping of EMS-induced lethal complementation groups. Genetics, 83, 765-782.

34. Hilliker, A.J., Appels, R. and Schalet, A. (1980) The genetic analysis of D. melanogaster heterochromatin. Cell, 21, 607-619.

35. Holmquist, G.P. (1987) Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression. Am J Hum Genet, 40, 151-173.

36. Hsieh, T. and Brutlag, D. (1979) Sequence and sequence variation within the 1.688 g/cm3 satellite DNA of Drosophila melanogaster. J Mol Biol, 135, 465-481.

37. Jenuwein, T. and Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science, 293, 1074-1080.

38. Kaufmann, B.P. (1946) Organization of the chromosome I. Break distribution and chromosome recombination in Drosophila melanogaster. J Exptl Zool, 102, 293-320.

39. Kaufmann, B.P. and Gay, H. (1958) The nuclear membrane as an intermediary in gene-controlled reactions. The Nucleus, 1, 57-74.

40. Kay, M.A., Zhang, J.Y. and Jacobs-Lorena, M. (1988) Identification and germline transformation of the ribosomal protein rp21 gene of Drosophila: complementation analysis with the Minute QUI locus reveals nonidentity. Mol Gen Genet, 213, 354-358.

41. Koryakov, D.E., Alekseyenko, A.A. and Zhimulev, I.F. (1999) Dynamic organization of the beta-heterochromatin in the Drosophila melanogaster polytene X chromosome. Mol Gen Genet, 260, 503-509.

42. Koryakov, D.E., Belyaeva, E.S., Alekseyenko, A.A. and Zhimulev, I.F. (1996) Alpha and beta heterochromatin in polytene chromosome 2 of Drosophila melanogaster. Chromosoma, 105, 310-319.

43. Le, M.H., Duricka, D. and Karpen, G.H. (1995) Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochromatin. Genetics, 141, 283-303.

44. Levinger, L. and Varshavsky, A. (1982a) Protein D1 preferentially binds A + T-rich DNA in vitro and is a component of Drosophila melanogaster nucleosomes containing A + T-rich satellite DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 7152-7156.

45. Levinger, L. and Varshavsky, A. (1982b) Selective arrangement of ubiquitinated and D1 protein-containing nucleosomes within the Drosophila genome. Cell, 28, 375-385.

46. Lohe, A.R. and Brutlag, D.L. (1986) Multiplicity of satellite DNA sequences in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 696-700.

47. Lohe, A.R. and Hilliker, A.J. (1995) Return of the H-word (heterochromatin). CurrOpin Genet Dev, 5, 746-755.

48. Lohe, A.R., Hilliker, A.J. and Roberts, P.A. (1993) Mapping simple repeated DNA sequences in heterochromatin of Drosophila melanogaster. Genetics, 134, 1149-1174.

49. Makunin, I.V., Volkova, E.I., Belyaeva, E.S., Nabirochkina, E.N., Pirrotta, V. and Zhimulev, I.F. (2002) The Drosophila suppressor of underreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes. Genetics, 160, 1023-1034.

50. Marchant, G.E. and Holm, D.G. (1988) Genetic Analysis of the Heterochromatin of Chromosome 3 in Drosophila melanogaster. II. Vital Loci Identified Through EMS Mutagenesis. Genetics, 120, 519-532.

51. Miklos, G.L. and Cotsell, J.N. (1990) Chromosome structure at interfaces between major chromatin types: alpha- and beta-heterochromatin. Bioessays, 12, 1-6.

52. Murphy, T.D. and Karpen, G.H. (1995) Localization of centromere function in a Drosophila minichromosome. Cell, 82, 599-609.

53. Oda, H., Uemura, T., Shiomi, K., Nagafuchi, A., Tsukita, S. and Takeichi, M. (1993) Identification of a Drosophila homologue of alpha-catenin and its association with the armadillo protein. J Cell Biol, 121, 1133-1140.

54. Oellers, N. and Hafen, E. (1996) Biochemical characterization of rolledSem, an activated form of Drosophila mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem, 271, 24939-24944.

55. Parks, S. and Wieschaus, E. (1991) The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell, 64, 447-458.

56. Rodriguez Alfageme, C., Rudkin, G.T. and Cohen, L.H. (1980) Isolation, properties and cellular distribution of D1, a chromosomal protein of Drosophila. Chromosoma, 78, 1-31.

57. Rollins, R.A., Morcillo, P. and Dorsett, D. (1999) Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes. Genetics, 152, 577-593.

58. Ross, J.M. and Zarkower, D. (2003) Polycomb group regulation of Hox gene expression in C. elegans. Dev Cell, 4, 891-901.

59. Schuebeler, D., Scalzo, D., Kooperberg, C., van Steensel, B., Delrow, J. and Groudine, M. (2002) Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster. a link between transcription and replication timing. Nat Genet, 32, 438-442.

60. Selig, S„ Okumura, K„ Ward, D.C. and Cedar, H. (1992) Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. Embo J, 11, 1217-1225.

61. Simon, I., Tenzen, T., Mostoslavsky, R., Fibach, E., Lande, L., Milot, E., Gribnau, J., Grosveld, F., Fraser, P. and Cedar, H. (2001) Developmental regulation of DNA replication timing at the human beta globin locus. Embo J, 20, 6150-6157.

62. Spellman, P.T. and Rubin, G.M. (2002) Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome. J Biol, 1, 5.

63. Spotswood, H.T. and Turner, B.M. (2002) An increasingly complex code. J Clin Invest, 110, 577-582.

64. Stevenson, J.B. and Gottschling, D.E. (1999) Telomeric chromatin modulates replication timing near chromosome ends. Genes Dev, 13,146151.

65. Strahl, B.D. and Allis, C.D. (2000) The language of covalent histone modifications. Nature, 403, 41-45.

66. Tchurikov, N.A., Kretova, O.V., Chernov, B.K., Golova, Y.B., Zhimulev, I.F. and Zykov, I.A. (2004) SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster. J Biol Chem, 279,11705-11710.

67. Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E., Nordenskjold, M., Ponder, B.A. and Tunnacliffe, A. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, 13, 718-725.

68. Torok, T., Harvie, P.D., Buratovich, M. and Bryant, P.J. (1997) The product of proliferation disrupter is concentrated at centromeres and required for mitotic chromosome condensation and cell proliferation in Drosophila. Genes Dev, 11, 213-225.

69. Tudor, M., Mitchelson, A. and O'Hare, K. (1996) A 1.5 kb repeat sequence flanks the suppressor of forked gene at the euchromatin-heterochromatin boundary of the Drosophila melanogaster X chromosome. Genet Res, 68, 191-202.

70. Vaury, C., Bucheton, A. and Pelisson, A. (1989) The beta heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements. Chromosoma, 98, 215-224.

71. Wakimoto, B.T. and Hearn, M.G. (1990) The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster. Genetics, 125, 141-154.

72. Warner, T.S., Sinclair, D.A., Fitzpatrick, K.A., Singh, M., Devlin, R.H. and Honda, B.M. (1998) The light gene of Drosophila melanogaster encodes a homologue of VPS41, a yeast gene involved in cellular-protein trafficking. Genome, 41, 236-243.

73. Williams, S.M. and Robbins, L.G. (1992) Molecular genetic analysis of Drosophila rDNA arrays. Trends Genet, 8, 335-340.

74. Zhang, P. and Spradling, A.C. (1995) The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics, 139, 659-670.

75. Zhimulev, I.F. (1998) Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet, 37, 1-566.

76. Zhimulev, I.F. and Belyaeva, E.S. (2003) Intercalary heterochromatin and genetic silencing. Bioessays, 25, 1040-1051.

77. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Pirrotta, V., Semeshin, V.F., Alekseyenko, A.A., Belyakin, S.N., Volkova, E.I., Koryakov, D.E., Andreyeva, E.N., Demakova, O.V., Kotlikova, I.V.,

78. Kolesnikova, T.D., Boldyreva, L.V. and Nanayev, R.A. (2003a) Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing. Genetica, 117, 259-270.

79. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S. and Semeshin, V.F. (1981) Informational content of polytene chromosome bands and puffs. CRC Crit Rev Biochem, 11, 303-340.

80. Zhimulev, I.F., Makunin, I.V., Volkova, E.I., Pirrotta, V. and Beliaeva, E.S. (2000) Effect of four doses of the Su(UR)ES gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster\. Genetika, 36, 1061-1070.

81. Zhimulev, I.F., Pokholkova, G.V., Bgatov, A.V., Semeshin, V.F., Umbetova, G.H. and Belyaeva, E.S. (1983) Genetic interpretation of polytene chromosomes banding pattern. Mol Biol Rep, 9, 19-23.