Геномно-протеомная характеристика вариабельности Helicobacter pylori тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Момыналиев, Куват Темиргалиевич

• Момыналиев, Куват Темиргалиевич
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Момыналиев, Куват Темиргалиевич

СОКРАЩЕНИЯ:.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Патогенна ли бактерия Helicobacter pylori?.

1.1.1. Инфицирование и персистенция Н. pylori.

1.1.2. Проблема исчезновения Н. pylori.

1.1.3. Последствия присутствия или отсутствия Н. pylori в популяции человека.

1.1.4. Влияние//, pylori на физиологию человека.

1.1.5. Ассоциация//, pylori с раком желудка.

1.1.6. Связь Н. pylori с астмой и аллергическими состояниями.

1.1.7. Н. pylori и гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ).

1.2. Макро- н микрогетерогенность //. pylori.

1.2.1. Микрогетерогенность Н. pylori.

1.2.2. Аллельная гетерогеность и популяционная структура Н. pylori.

1.2.3. Генетическая макровариабельность Н. pylori.

1.2.4. Методы предсказания горизонтально перенесенных генов в бактериях.

1.2.5. Геномные изменения в процессе адаптации Н. pylori.

1.2.6. Функциональная гетерогенность Н. pylori.

1.3. Возможные причины гетерогенности Н. pylori.

1.3.1. Мутации и репарация мутации.

1.3.1.1. Метилирование геномной ДНК как возможная причина мутаций в

H. pylori.

1.3.1.2. Системы рестрикции-модификации Н. pylori.

1.3.2. Трансформация Н. pylori.

1.3.3. Рекомбинации in vivo.

I.3.3.1. Рекомбинационный аппарат Н. pylori.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы//, pylori и манипуляции с ними.

2.2. Создание плазмнд, использованных для инактивации генов-участников систем рестрикции-модификации.

2.3. Мультилокусное секвенирование Н. pylori изолятов.

2.4. Создание ДНК-макроматриц Н. pylori.

2.5. Геномное сканирование клинических штаммов Н. pylori.

2.6. Транскрипционное профилирование штаммов Н. pylori.

2.7. Дифференциальный двухмерный гель-электрофорез изолятов

Н. pylori.

2.8. Оценка степени метилирования ДИК Н. pylori.

2.9. Минисеквенирование ACGT мотивов в Н. pylori J99.

2.10. Мнкрофлюидпый клеточный сенсор.

2.11. Скрининг мутаций в рифампицинустойчивых Н. pylori штаммах.

2.12. ОТ-ПЦР в реальном режиме времени.

2.13. Сопоставление белок-кодирующих последовательностей Н. pylori

26695 и J99.

ГЛАВА 3. Макро- и ¡чнкровариабельность Н. pylori.

3.1. Аллельная гетерогенность изолятов Н. pylori.

3.1.1. Мультилокусное секвенирование H. pylori штаммов, выделенных от лиц европеоидной расы.

3.1.2. Аллельная гетерогенность штаммов Н. pylori, выделенных от пародов, проживающих компактно в Сибири.

3.2. Структурная макрогетероннность Н. pylori.

3.2.1. Созданне ДНК-макроматрнц Н. pylori.

3.2.1.2. Подбор условий для формирования ДНК-макроматрицы.

3.2.1.3. Валидация ДНК-макроматрицы Н. pylori.

3.2.2. Сравнительный геномный анализ штаммов Н. pylori.

3.2.2.2. Макрогетерогеность клинических изолятов Н. pylori.

3.2.2.3. Идентификация штаммоспецифических генов Н. pylori.

3.2.3. Предсказания горизонтально перенесенных генов в геноме

Н. pylori.

3.2.3.1. Обоснование необходимости разработки метода предсказания ГПГ.

3.2.3.2. Разработка алгоритма для предсказания горизонтально перенесенных (чужеродных) генов в геноме бактерий.

3.2.3.3. Идентификация горизонтально перенесенных генов в Н. pylori.

3.2.3.4. Симуляция ложно-отрицательных результатов.

3.2.3.5. Валидация теста. Сравнение с экспериментальными данными.

3.2.3.6. Валидация теста. Биологическое подтверждение.

3.2.3.7. Обогащение функциональных групп Н. pylori чужеродными генами.

3.3. Трапскрнпцнопно-протеомное профнлнровапне Н. pylori.

3.3.1. Сравнительный анализ транскрипционных профилей штаммов

H.pylori.

3.3.1.1. Транскрипционная гетерогенность клинических изолятов Н. pylori.

3.3.1.2. Подтверждение полученных данных.

3.3.1.3. Анализ транскрипционных профилей клинических изолятов

Н. pylori.

3.3.2. Сравнительная характеристика протеомных карт клинических изолятов Н. pylori.

ГЛАВА 4. Микро- и макроварнабельиость Н. pylori как следствие адаптации бактерии к окружающему стрессу.

4.1. Фепотниическая вариабельность Н. pylori при раннем раке желудка.

4.1.1. Обоснование модели.

4.1.2. Мультилокусное тнпирование изолятов Н. pylori.

4.1.3. Дифференциальная экспрессия белков НрРР и НрХГ изолятов.

4.1.4. Белки, экспрессия которых обнаружена только в изолятах ПрХГ или НрРР.

4.1.5. Экспрессия белков Н. pylori в разных отделах желудка при гастрите и раннем раке.

4.1.6. Корреляция экспрессионных профилей НрХГ или НрРР изолятах.

4.1.7. Геномые различия между НрРР и ИрХГ изолятами.

4.1.8. Реконструкции молекулярно-генетических взаимодействий при гастрите и раннем раке желудке.

4.1.9. Анализ фенотипнческой вариабельности Н. pylori при раннем раке желудка.

4.2. Генерация мнкроварнабельности при адаптации Н. pylori к рнфампицнну.

4.2.1. Обоснование модели.

4.2.2. Сравнительный анализ геномов Н. pylori.

4.2.3. Анализ мутаций в геноме Н. pylori 26695m.

4.2.4. Анализа мутаций в клинических изолятах Н. pylori.

4.2.5. Сравнительный анализ мутаций в рифапицинустойчивых штаммах

Н. pylori.

4.2.6. Скрининг мутаций возникающих при адаптации Н. pylori к субмиковым концентрациям рифампицина.

4.2.7. Частота возникновения резистентных мутантов при адаптации к метронидазолу рифампицин-устойчивых клонов Н. pylori.

4.3. Метилирование ДНК как одна из возможных причин изменчивости Н. pylori.

4.3.1. Обоснование модели.

4.3.2. Соответствие иуклеотидов между ОРС штаммов Н. pylori 26695 и J99.

4.3.3. Распределение дипуклеотидов в ОРС штаммов Н. pylori 26695 и J

4.3.4. Соответствие иуклеотидов в тетрануклеотидах ОРС Н. pylori

26695 и J99.

4.3.5. Оценка степени метилирования геномной ДНК штамма Н. pylori J99.

4.3.6. Оценка возможного использования метионина в качестве метилирующего агента ДНК Н. pylori J99.

4.3.7. Оценка частоты транзиций С—»T в зависимости от концентрации метионина с помощью реакции миписеквснировапия с последующей масс-спектрометрисй.

4.3.8. Вклад эпигенетических факторов в гетерогенность Н. pylori.

4.3.8.1. Идентификация активных метилтраисфераз клинического штамма

Н. pylori A4 5.

4.3.8.2. Прямая детекция метилирования ДНК путем анализа хроматограмм, полученных методом секвеннрования.

4.3.8.3. Установление паттернов чувствительности/устойчивости геномной ДНК к обработке различными эндонуклеазами рестрикции.

4.3.8.4. Получение производных штамма А45 Н. pylori, дефектных по генам метилтраисфераз M.HpyAI, M.HpyAIII, M.HpyAIV, M.HpyAVIII.

4.3.8.5. Протеомный анализ профилей мутантных штаммов и штаммов дикого типа Н. pylori.

4.3.8.6. Оценка скорости роста полученных штаммов Н. pylori.

ГЛАВА 5. Микрофлюидиые технологии для оценки функциональной гетерогенности клеточных популяции.

5.1. Обоснование модели.

5.2. Конструирование микрофлюидного чипа.

5.3. Маркерные штаммы, содержащие кодирующую последовательность GFP, находящегося под промоторами генов sodB,ßgB, rocF, artsB.

5.4. Иммобилизация клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Геномно-протеомная характеристика вариабельности Helicobacter pylori»

Актуальность проблемы, цель и задачи работы

Helicobacter pylori - грамотрицательная, микроаэрофильная бактерия, колонизирующая слизистую желудка и ассоциированная с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическими гастритами, аденокарциномой или экстраиодальной В-клеточиой MALT-лимфомой (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) [1-4,7,17,18]. H. pylori является одним из самых распространенных возбудителей инфекционных заболеваний. Согласно некоторым эпидемиологическим оценкам, более половины населения мира инфицированы этим микроорганизмом, однако инфекция Н. pylori часто не имеет клинических проявлений [8,158,226,263,383]. Только у определенной части инфицированных людей (10-15%) с течением времени появляются клинически значимые симптомы заболевания: развивается хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка. В 2005 г первооткрыватели бактерии, австралийские врачи Робин Уоррен (Robin Warren) и Барри Маршалл (Barry Marshall), были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «за открытие бактерии Helicobacter pylori и ее роли в развитии гастрита и язвы желудка» [268, 402].

Интенсивное изучение физиологии Н. pylori и его факторов вирулентности вызвано в первую очередь тем, что у 80% больных, страдающих раком желудка, в анамнезе была зафиксирована инфекция Н. pylori [9,10,11,91,232,318]. В 1995 г Международная ассоциация по изучению рака (IARC, ВОЗ) признала Н. pylori канцерогеном 1 класса. Эпидемиологические и серологические исследования показали, что клиническая картина заболеваний, вызываемых Н. pylori, во многом зависит от факторов вирулентности, таких как CagA, VacA, IceA и BabA [44,45,65,84,194]. Однако до настоящего времени не обнаружено тесной связи между определенным генотипом Н. pylori (различные комбинации аллелей vacA, cagA, babA и iceA) и заболеваниями желудочно-кишечного тракта. С другой стороны, классификация Н. pylori, проведенная с помощью различных молекулярпо-биологических методов (вычитающая гибридизация, амплификация со случайными праймерами, пульс-электрофорез), выявила значительную межштаммовую гетерогенность этой бактерии и показала, что каждый инфицированный индивид является носителем уникального штаммаЯ. pylori [19, 27, 28, 269,270, 382, 390,391].

В отличие от многих других бактерий, в изолятах Н. pylori идентичные аллели генов встречаются очень редко. Экстраординарная генетическая гетерогенность

H. pylori была впервые показана Кансау и соавт. в 1996 г [208]. Было продемонстрировано, что среди 29 клинических штаммов Н. pylori нуклеотидпая последовательность игеС является уникальной для каждого штамма. В настоящее время уникальность нуклеотидных последовательностей Н. pylori подтверждена па большом количестве генов: cagA, vacA, flaA, flaB, cysS, urel, trpC [129, 148, 183, 368], причем для большинства пар генов между неродственными штаммами Н. pylori обычно наблюдается 5%-ая нуклеотидная дивергенция. Для сравнения, гомология ДНК между двумя родственными видами Salmonella typhimurium и Salmonella typhi составляет —98— 99% и -85% между представителями двух разных родов S. typhimurium и Escherichia coli [425]. С помощью ДНК-матриц было показано, что уровень макровариабелыюсти генома Н. pylori на уровне генов может доходить до 25-30% от всех ОРС [163, 172, 191,345].

Таким образом, в настоящее время сложилась парадоксальная ситуация, когда значительная генетическая вариабельность и разнообразие Н. pylori достоверно зарегистрированы, но механизмы, которые обеспечивают генетическое разнообразие в Н. pylori и значение этой вариабельности в адаптации к хозяину и патогенезе еще не полностью понятны. Очевидный дефицит генов в геноме Н. pylori, участвующих в процессах рекомбинации/репарации, предполагает вероятное объяснение генетического разнообразия высокой скоростью мутаций, однако для подтверждения данного предположения необходимо функционально охарактеризовать значительную часть генов этой бактерии. Не выявлены причины, ограничивающие способность Н. pylori импортировать только небольшие фрагменты чужеродной ДНК (Н. pylori - в среднем 417 п.н., S. pneumoniae - 6000 п.н., Е. coli - 14000 п.н.), несмотря на естественную компетентность природных изолятов [128,277].

Скорость дивергенции Н. pylori внутри хозяина в настоящее время остается также предметом острых дискуссий. Если, по данным Д. Фалуша и его коллег [131], штаммы Н. pylori последовательно выделенные через определенные промежутки времени от одного пациента варьируют достаточно сильно, то А. Люндином [255] было показано, что последовательно выделенные штаммы изменяются незначительно или вообще не меняются, по крайней мере за 9 лет. Возможно, что относительная стабильность штаммов Н. pylori показанная А. Люпдипом обусловлена отсутствием смешанной инфекции, вероятность которой изменяется параллельно распространенности инфекции хеликобактера в популяции и оказывает очевидный эффект па межштаммовую рекомбинацию. Другая причина в расхождении оценки скорости мутаций и рекомбинации in vivo может заключаться в отсутствии согласованной процедуры проведения исследований по генетической вариабельности

H. pylori. В большинстве исследований обычно характеризуется только штамм Н. pylori выделенный в определенное время, и поэтому невозможно понять за какое время и какие вариации появились в геноме Н. pylori.

Оценка пределов структурной и функциональной вариабельности Н. pylori, а также описание основных механизмов ее формирования является актуальной задачей, так как позволит оценить связь между генетической вариабельностью и выживаемостью бактерии в организме индивидуального хозяина, а также развитием патологических процессов на слизистой оболочке желудка. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

I. Выявить популяционпую принадлежность штаммов Н. pylori выделенных на территории России.

2. Оцепить структурную и функциональную вариабельность клинических изолятов Н. pylori. Для этого разработать ДНК-макроматрицы для проведения сравнительного геномного и транскрипционного анализа Н. pylori. Разработать теоретический алгоритм предсказания горизонтально перенесенных генов в Н. pylori. Провести сравнительный протеомный анализа клинических изолятов Н. pylori.

3. Разработать и обосновать модели для изучения причин микро- и макровариабельности Н. pylori. Оценить степень гетерогенности Н. pylori, выделенных при раннем раке желудка и хроническом гастрите. Оценить геномные события, происходящие в Н. pylori при адаптации к антибиотику.

4. Исследовать одну из возможных причин генерации генетической изменчивости Н. pylori - метилирование ДНК. Разработать методы оценки степени метилирования геномной ДНК Н. pylori, а также способы инактивации генов в Н. pylori. Оценить вирулентность штаммов Н. pylori дефектных по метилтрансферазам.

5. Для оценки функциональной вариабельности Н. pylori популяции разработать микрофлюидный чип для работы с единичными клетками. Отработать условия для длительного нахождения в них живых клеток, возможность точной регулировки параметров окружающей среды и наблюдения за клетками в режиме реального времени.

Структура изложения материала

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Момыналиев, Куват Темиргалиевич

выводы

1. Выявлена популяцнонная принадлежность штаммов Н. pylori выделенных па территории России. Показано, что выделенные штаммы преимущественно принадлежат к европейской (hpEurope) популяции. Однако, среди штаммов Н. pylori выделенных от пародов, проживающих компактно в Сибири обнаружена новая Н. pylori субпопуляция - hspSiberia и штаммы hspAmerind субпопуляции. Полученные данные позволили предположить пути миграции человека в Северную Америку через Аляску.

2. Описаны границы структурной и функциональной вариабельности клинических изолятов Н. pylori. Показано, что 1271 генов (81% всех генов) в геноме составляют функциональное ядро генома Н. pylori, а 19% являются вариабельными. Изучение транскрипционных профилей клинических штаммов Н. pylori показало, что коэффициент корреляции между суммарными транскрипционными профилями составляет 0.70-0.83. На протеомном уровне зафиксировано изменение экспрессии мажорных белков, в том числе, белков домашнего хозяйства клетки, ферментов инактивации свободных радикалов и пероксида водорода, компонент липопротеина клеточной стенки.

3. Показано, что микро- и макровариабельность Н. pylori является следствием адаптации бактерии к окружающему стрессу. Основную часть вариабельных белков Н. pylori при раннем раке желудка составляют белки-антиоксиданты, белки цикла трикарбоновых кислот и белки теплового стресса. Кроме того, показано, что при адаптации бактерии к рифампицину, как стрессового фактора, происходит накопление мутаций, не связанных и/или не обеспечивающих антибиотикоустойчивость.

4. Для оценки функциональной вариабельности Н. pylori популяции разработан микрофлюидный чип, выполненный из оптически проницаемого полиметилметакрилата, состоящий из сети микрофлюидных каналов с ячейками. Отработаны условия для длительного нахождения в них живых клеток, возможность точной регулировки параметров окружающей среды и наблюдений за клетками в режиме реального времени.

5. В качестве одной из возможных причин возникновения генетической вариабельности геноме Н. pylori исследовано метилирование ДНК. Показано, что в геноме Н. pylori преобладают нуклеотидные замены по типу транзиций над трансверсиями. Преобладание транзиций обусловлено высокой скоростью перехода цитозина в тимин в кодирующей цепи ДНК и некодирующей. Показано, что штаммы Н. pylori с инактивированными метилтрансферазами характеризуется замедленной скоростью роста, чем штамм исходного, дикого типа, что свидетельствует об эпигенетической компоненте регуляции жизнедеятельности бактерии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маев И.В., Момыналиев К.Т., Селезнева О.В. Эффективность эрадикации Helicobacter pylori в зависимости от полиморфизма IL-lß-511. Материалы 10-го юбилейного международного Славяно-Балтийского форума "Санкт-Петербург — Гастро-2008" // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2008.- № 2-3.-С.61.

2. Маев И.В., Момыналиев К.Т., Оганесян Т.С., Казюлин А.Н., Кучерявый Ю.А., Селезнева О.В. Полиморфизм гена интерлейкина-lß в оценке эффективности эрадикационной терапии язвенной болезни, ассоциированной с Н. pylori. II Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения. Материалы VIII Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции. // Под ред. проф. Цуканова В. -Красноярск, - 2008 - С. 127-134.

3. Маев И.В., Оганесян Т.С., Момыналиев К.Т., Кучерявый Ю.А., Белый П.А. -Полиморфизм гена цитохрома Р-450 2С19 и лечение инфекции Helicobacter pylori. II Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2008,- №3. — С.78-85.

4. Momynaliev К.Т., Kashin S.V., Chelysheva V.V., Selezneva О. ., Demina I.A., Serebryakova M.V., Ivanisenko V.A., Aman E., Akopian T., Govorun V. M. Functional divergence of H. pylori related to early gastric cancer. // Helicobacter. -2008,- V.13.- №.5 — P.477.

5. Momynaliev К. T., Chelysheva V. V., Selezneva О. V., Akopian T. A., Govorun V. M. Comparative genome sequencing of H. pylori rifampicin-resistant strains. // Helicobacter. - 2008,- V.13. - №.5 - P.465.

6. Маев И.В., Кучерявый Ю.А., Момыналиев K.T., Говорун В.М., Т.С. Оганесян. Полиморфизм гена CYP2C19 и эффективность антихеликобактериой терапии у больных язвенной болезнью. // Фарматека. -2008.-№13. - С.98-102.

7. Момыналиев К.Т., Лазарев В.Н., Кострюкова Е.С, Челышева В.В., Селезнева О.В., Кравченко Е.В., Говорун В.М. Микрофлюидные технологии для детекции внутриклеточных процессов в бактериальной клетке // Российские нанотехнологии.-2007. - Т.2 - №5-6. - С. 126-132

8. Оганесян Т.С., Маев И.В., Момыналиев К.Т., Говорун В.М., Казюлин А.Н., Моржакова A.A. Влияние полиморфизма IL-lbß-511 на эффективность эрадикации Н. pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки// Росс, журнал гасгроэнтер., гепатол., колопрокт. - 2007. — №5. - Т. 17. - С. 164.

9. Маев И.В., Момыналиев К.Т., Оганесян Т.С., Казюлин А.Н. Моржакова А.А, Кучерявый Ю.А Эффективность эрадикации Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в зависимости от полиморфизма гена CYP2C19. // Росс, журнал гастроэнтер., гепатол., колопрокт. - 2007 — 5,-Т.17.- С.137.

10. Rogov S.I., Momynaliev К.Т., Govorun V.M. Coexprcssionfinder: a new algorithm for finding groups of coexpressed genes // J. Bioinform. Comput. Biol.- 2006. - V.4. -P.853-864.

11. Momynaliev К. Т., Govorun V. M. System level analysis of antibiotic resistance of Helicobacter pylori. II Abst. 3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine. - Novosibirsk. - 2006. - P.32

12. Prokhorenko I.A., Malakhov A.D., Kozlova A.A., Momynaliev K., Govorun V.M., Korshun V.A. Phenylethynylpyrene-labeled oligonucleotide probes for excimer fluorescence SNP analysis of 23S rRNA gene in clarithromycin-resistant Helicobacter pylori strains //Mutat. Res.- 2006. - V.599. - P. 144-151.

13. Момыналиев K.T., Рогов С.И., Говорун B.M. Соответствие нуклеотидов между белок-кодирующими последовательностями штаммов Helicobacter pylori 26695 и J99 // Молекул, биол,- 2005. - Т.39. - №6. -С.945-951.

14. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Комплексная характеристика клинических штаммов Helicobacter pylori II Молекул, мед.- 2005. - Т.4. - С.30-34.

15. Момыналиев К.Т., Рогов С.И., Селезнева О.В., Челышева В.В., Акопиан Т.А., Говорун В.М. Сравнительный анализ транскрипционных профилей штаммов Helicobacter pylori II Биохимия.- 2005. - Т.70. - С.467-475.

16. Момыналиев К.Т., Селезнева О.В., Козлова А.А., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М. A2144G - основная мутация в гене 23S rRNA Helicobacter pylori, ассоциированная с устойчивостью к кларитромицину // Генетика,- 2005. - Т.41. -№10. - С.1338-1344.

17. Момыналиев К.Т., Селезнева О.В., Челышева В.В., Акопиан Т.А., Линц Б., Ахтман М., Говорун В.М. Популяционная идентификация российских штаммов Н. pylori II Генетика.- 2005. - Т.41. - С. 1434-1437.

18. Говорун В.М., Лохов П.Г., Мошковский С.А., Момыналиев К.Т., Селезнева О.В., Кудрявцева Л.В., Серебрякова М.В., Тихонова О.В., Гоуфман Е.И., Арчаков А.И.

Сравнительный анализ различных методов типирования клинических штаммов Helicobacter pylori II Биохимия. - 2004. - Т.69. - С. 536-541.

19. Momynaliev К., Smirnova О., Kudryavtseva L., Govorun V. Helicobacter pylori genotypes in Russia // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. - 2003. - V.22. - P.573-574.

20. Момыналиев K.T.,Смирнова O.B., Челышева В.В., Кудрявцева JI.B., Воробьев А.А. Говорун В.М. Генотипировапие клинических штаммов Н. pylori в России // Вестник РАМН. - 2003. - Т.6. - С. 33-38.

21. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Мошковский С.А., Тихонова О.В., Згода В.Г., Гоуфман Е.И., Серебрякова М.В., Лохов П.Г., Торопыгин И.Ю., Кудрявцева JI.B., Селезнева О.В., Арчаков А.И. Сравнительная характеристика протеомных карт клинических штаммов Helicobacter pylori И Биохимия. - 2003. - Т.68. - С. 42-49.

22. Момыналиев К.Т., Смирнова О.В., Кудрявцева JI.B., Говорун В.М. Сравнительный геномный анализ штаммов Helicobacter pylori II Молекул, биол. -2003. - Т.37. -С.625-633.

23. Momynaliev К.Т., Govorun V.M., Gnedenko О., Ivanov Y.D., Archakov A.I. The use of the resonant mirror biosensor to detect point mutations, as demonstrated with synthetic oligonucleotides // J. Mol. Recognit. - 2003. - V.16. - P. 1-8.

24. Momynaliev K.T., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Global gene expression analysis of Helicobacter pylori clinical isolates. // Helicobacter. - 2003.- V.8. - P.491.

25. Govorun V. M., Momynaliev К. Т., Kudriavtseva L. V. et al. Molccular typing of the Helicobacter pylori clinical isolates in Russia by genome and proteome analysis. // Abst. International Conference "Genomics, Proteomics and Bio informatics for Medicine" St. Petrsburg - Moscow - 24-30 June 2002- PP2-2.

26. Говорун B.M., Момыналиев K.T., Кудрявцева JI.B. и др. Географическое распределение cagA, vacA, iceA и babA Helicobacter pylori типов и субтипов в российской Федерации // Экспер. Клинич. Гастроэнтер. - 2002. - Т.1. - С. 124-125.

27. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Смирнова О.В. и др. Современные подходы к молекулярной диагностике и типированию клинических штаммов Helicobacter pylori в России // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - Т.З. - С.57-65.

28. Govorun V., Momynaliev К., and Lokhov P. Molecular typing of the H. pylori clinical isolates in Russia by genome and proteome analysis. // Molecular & Cellular Proteomics. - 2002. - V. 1№9 p.657.

29. Momynaliev К. Т., Govorun V. М., Isakov V. A., Megraud F. Detection of point mutations associated with Helicobacter pylori resistance to clarithromycin by real-time fluorescence based analysis. // Gut. - 2001. - Suppl. 11 - V.47. - A10.

30. Момыналиев K.T., Говорун B.M., Иванов Ю.Д., Арчаков А.И. Мегро Ф. Использование резонансного зеркала для обнаружения точечных мутаций, ассоциированных с устойчивостью Helicobacter pylori к кларитромицине. // В тезисах 4-го Международного семинара «Российские технологии для индустрии». Санкт-Петербург. - 2000. - С.206.

31. Momynaliev К. Т., Govorun V. М., Isakov V. A., Megraud F., Archakov A.I. Detection of point mutation associated with resistance of Helicobacter pylori to clarithromycin by optical biosensors. // Gut. - 2000,- Suppl. 1. - V.47. - A20.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительная генетическая вариабельность и разнообразие Н. pylori достоверно зарегистрированы многочисленными исследованиями. В отличие многих других бактерий, идентичные аллели генов очень редко встречаются в Н. pylori изолятах. Приблизительно 5%-я нуклсотидная дивергенция обычно наблюдается для большинства генов между парой неродственных Н. pylori. Для сравнения, гомология ДНК между Salmonella typhimurium и Salmonella typhi составляет -98-99% и —85% между S. typhimurium и Escherichia coli. С помощью ДНК-матриц было показано, что уровень макровариабелыюсти генома Н. pylori на уровне генов может доходить до 2530% от всех ОРС.

Действительно, при мультилокусном типировании 673 изолятов Н. pylori нами не было найдено изолятов с идентичными аллелями генов. Более того, в результате проведенной работы была обнаружена новая субпопуляция Н. pylori hspSiberia, входящая в популяцию hpEastAsia. Изоляты Н. pylori с этим гаплотипом были найдены во всех этнических группах, проживающих компактно на азиатской территории России (всего 141 изолят). Кроме того, довольно часто среди выделенных образцов, встречались изоляты Н. pylori, принадлежащие к субпопуляции hspAmerind (174 изолят). Ранее Н. pylori с этим гаплотипом были выделены от индейцев Северной Америки. Вероятно, что отделение субпопуляции hspAmerind произошло еще до миграции человека в Америку через Аляску, примерно 12—15 тыс. лет назад. Другая волна миграции связана с распространением субпопуляции hspSiberia из Монголии в Сибирь, которая также отделилась hpEastAsia популяции и долгое время существовала изолированно от hspAmerind субпопуляции. Таким образом, проведенная популяционная идентификация Н. pylori изолятов позволила детализировать историю расселения человека в Сибири и Америки.

Высокий уровень макрогетерогенпости Н. pylori изолятов был обнаружен нами с помощью разработанных ДНК-макроматриц. Обнаружено, что 1271 генов (81% всех генов) в геноме составляют функциональное ядро генома Н. pylori, а 19% являются вариабельными. Однако существенным недостатком исследований по сравнительной гепомике различных организмов, проводимых с помощью ДНК-матриц является использование для их конструирования только известных геномов соответствующих организмов. При таком варианте исследований не учитываются уникальные гены, которые могут присутствовать только в клиническом изоляте бактерии. Данное обстоятельство может иметь решающее значение при изучении таких вариабельных бактерий как Н. pylori, где уровень макрогетерогенности достаточно существенен. ДНК-матрицы позволяют идентифицировать только известные штаммоспецифические гены Н. pylori, т.е. ограничивают список кандидатных штаммоспецифических генов. Учитывая это обстоятельство, а также то, что накопление данных по определению минимального функционального ядра Н. pylori происходит достаточно медленно (с 2000 г проведено геномное сканирование всего 112 клинических изолятов Н. pylori) нами был разработан алгоритм предсказания потенциальных штаммоспецифических генов в геноме Н. pylori, которые могут определять вирулентность бактерии. Количество ложно-отрицательных результатов составляет, в среднем, 0.4% при поиске чужеродных генов с помощью разработанного классификатора. В результате использование данного алгоритма позволило установить, что теоретически функциональное ядро генома Н. pylori должно состоять всего из 979 генов (61% всего генома). Таким образом, уровень макрогетерогенности Н. pylori, вероятно, значительно больше, чем полученный экспериментальным путем.

Впервые нами была описана функциональная гетерогенность Н. pylori изолятов на уровне мРНК. При изучении транскрипционных профилей клинических штаммов Н. pylori было найдено, что коэффициент корреляции между суммарными транскрипционными профилями составляет 0.70-0.83. Сравнительный анализ транскрипционных профилей по группам генов cag-отрицательных изолятов и cag-положительных изолятов Н. pylori показал, что в 44 из 66 групп генов коэффициент корреляции составляет более 0.70. Для 14 групп коэффициент корреляции составил более 0.90. Можно предполагать, что столь большое количество высококоррелированных групп (44 из 66) обусловлено тем, что гены, входящие в них, кодируют клеточные и метаболические процессы, которые являются безусловно необходимыми для Н. pylori (обеспечивают основную жизнедеятельность микроорганизма). При сравнении протеомных карт клинических изолятов Н. pylori мы обнаружили, что наиболее существенным изменениям подвергаются белкн редокс-системы и инактивации перекиси водорода и активных форм кислорода: SodF, TagD, FrxA. Исходя из этого, можно заключить, что изменение уровня ферментов, участвующих в формировании редокс потенциала клетки представляет собой одну из особенностей физиологии Н. pylori, его чувствительности к антибактериальным агентам, например, таким, как метронидазол, а также концентрации свободного железа во внеклеточном пространстве.

Таким образом, значительная структурная и функциональная гетерогенность Н. pylori изолятов не вызывает сомнения, но механизмы, которые обеспечивают генетическое разнообразие в Н. pylori и значение этой вариабельности в адаптации к хозяину и патогенезе все еще не полностью раскрыты. Можно предположить, что единичный клон Н. pylori быстро дивергирует внутри новой пиши желудка адаптируясь к новым условия окружающей среды и после того как ниша занята, скорость изменений резко падает. Учитывая, что заражение человека Н. pylori происходит в детском возрасте, проследить динамику изменений микроорганизма в период быстрой дивергенции не представляется возможным. Попытки обнаружить генетические изменения в Н. pylori при инфицировании взрослых волонтеров лабораторным штаммом Н. pylori не увенчались успехом. Альтернативная гипотеза заключается в том, что заражение является поликлональным, т.е. в организме хозяина в момент инфицирования присутствуют несколько различных популяций Н. pylori, и конечный клопальный вариант Н. pylori является результатом дивергенции популяции в ходе нескольких делений в организме человека.

На наш взгляд, причиной формирования структурной и функциональной изменчивости Н. pylori de novo может служить стресс, которая испытывает бактерия при смене старого хозяина на нового, так как условия окружающей среды изменяются. По определению автора концепции о биологическом стрессе Ганса Селья: «Стресс — есть неспецифический ответ организма на любые требования извне» [21]. Чтобы понять это определение, необходимо пояснить, что подразумевается под словом "неспецифический". Каждое воздействие на организм в каком-то смысле своеобразно или специфично, однако независимо от того, какого рода изменения в организме они вызывают, все впешпне факторы требуют перестройки. Это требование неспецифично, оно состоит в адаптации к новым условиям. Другими словами, кроме специфического эффекта, все воздействующие внешние факторы вызывают также и неспецнфическую потребность осуществить приспособительные функции и тем самым восстановить нормальное состояние. Неспецифические требования, предъявляемые воздействием как таковым - это и есть сущность стресса.

То, что стресс может служить причиной формирования генетической изменчивости бактерий, т.е., например, усиливать мутагенез, впервые было показано Дж. Кэйрнс с коллегами в 1988 г [80]. Было показано, что в условиях стресса, вызванного голоданием, в культуре Е. coli с фенотипом Lac-, клетки которой не способны утилизировать лактозу, через короткое время появляются клетки, способные использовать лактозу в качестве питательного субстрата. В этих клетках происходит реверсия мутации 1ас~—>1ас+. Авторы назвали такой мутагенез направленным (directed) или адаптивным, так как, по их представлениям, мутировали главным образом только те локусы, изменение которых обеспечивало выживание культуры бактерий на новой среде. Эти результаты были сначала интерпретированы как способность бактерии направлять мутагенез на селективно важные области генома [73, 364]. Позднее была предложена более сложная модель [145, 168, 340, 343], предполагающая существование механизма, который реагирует на стресс индукцией общего (ненаправленного) мутагенеза в небольшой части популяции. Было предложено, что при стрессе гипермутацнн происходят только в субпопуляции, в малой части нерастущих клеток.

Однако следует отметить, что на количественных моделях эта гипотеза не получила чётких доказательств [341,416]. Например, один из самых мощных аргументов в пользу стресс-индуцнруемого мутагенеза является факт увеличения частоты возникновения рифампицин-устойчивых мутантов за счет мутаций в гене гроВ в старой, нерастущей культуре Е. coli [61, 378, 379]. Колонии формируются в течение 1 дня роста на богатой питательной среде. В течение последующих 6 дней число колоний увеличивается незначительно (в 1.2 раза), по частота возникновения рифампцин-устойчивых мутантов увеличивается в 10-100 раз. Увеличение количества рифампицин-устойчивых клеток обусловлено, по предположению И. Бьедова и коллег [63], стресс-ипдуцируемым мутагенезом в нерастущих клетках. Полученные данные были перепроверены М. Врандом и коллегами [416] па двух культурах: Е. coli и Salmonella enterica. Было показано, что действительно, количество рифампицин-устойчивых мутантов увеличивается со временем и зависит от состояния RpoS (сигма-фактор регулирующий активность РНК-полимеразы в стационарной фазе). Однако увеличение количества рифампицин-устойчивых мутантов является результатом селекции, так как мутанты, появившиеся перед истощением среды, растут быстрее, чем родительские клетки. Доказательства мутагенеза найдено не было.

С учетом приведенных исследований, мы предполагаем, что если стресс может и не связан напрямую с мутагенезом, он, по крайней мере, может быть одним из существенных факторов, обусловливающих общее усиление процессов, приводящих к генетическим и функциональным изменениям Н. pylori. Для проверки предположения, что стресс является причиной формирования структурной и функциональной изменчивости Н. pylori de novo, мы исследовали две модели.

В первой модели мы изучали динамику генетических и фенотипических изменений Н. pylori, выделенных из разных участков слизистой оболочки желудка от пациента с ранним раком желудка. В отличие от хронического гастрита (ХГ) или язвы желудка, которые характеризуются общей структурной перестройкой и нарушением функции желудка в целом, ранний рак имеет местное (очаговое) распространение. Таким образом, модель раннего рака желудка позволяет сравнивать Н. pylori, адаптирующегося к новым условиям (стресс), появившихся в результате дисплазии (неоплазии) слизистой оболочки желудка, с этим же штаммом Н. pylori, но выделенным из интактных отделов этого же желудка. Точная локализация опухоли при раннем раке желудка достигается с помощью витальных красителей в процессе эндоскопического исследования (хромоэндоскопня) [154, 162,217,222]. В качестве контроля мы также исследовали Н. pylori из разных отделов желудка от больного, страдающего хроническим гастритом (условия неизменны по всем отделам).

В результате нами было показано, что Н. pylori, выделенные при раннем раке желудка, функционально характеризуются большей степенью гетерогенности, чем Н. pylori выделенные при гастрите. При анализе Н. pylori штаммов выделенных от пациента с хроническим гастритом (НрХГ), было обнаружено 14 пятен, отличающихся по интенсивности более чем в два раза от аналогичных пятен штаммов Н. pylori из разных отделов желудка, из которых было идентифицировано 12 пятен. При анализе штаммов Н. pylori, выделенных от пациента с ранним раком желудка (НрРР), было выявлено 32 пятна, отличающихся по интенсивности, из которых было идентифицировано 18 пятен. Найденные нами отличня не являются случайными, так как среди белков, идентифицированных нами как дифференциально экспрессирующиеся в Н. pylori как внутри желудка, так и при двух разных патологических состояниях желудка, основную часть составляют белки-антиоксиданты (SodB, KatA, AphC/TsaA, TrxA, Pfr), белки цикла трнкарбоновых кислот (Idh, FrdA, FrdB, FldA AcnB) и белки теплового стресса (GroEL и ClpB). Вариации белков-антиоксидантов SodB, KatA, AphC/TsaA, TrxA, Pfr в H. pylori свидетельствуют о вовлечении активных форм кислорода (АФК) в воспаление, вызываемое микроорганизмом. АФК генерируются в большом количестве фагоцитами, в основном, нейтрофилами и макрофагами, которые инфильтрируют субэпителиальный слой gastric lamina propria при гастрите. Экспрессия онкогенов и клеточная пролиферация также влияет на концентрацию АФК. Н. pylori стимулирует гиперпролиферацию клеток желудка, которая является необходимым этапом в развитии аденокарциномы. Н. pylori индуцирует экспрессию протоопкогенов, таких как c-fos и c-jun, и циклооксегеиазу-2 в эпителиальных клетках желудка. Таким образом вероятно, что локальное изменение среды вследствие неопластических процессов слизистой оболочке желудка является причиной функциональной гетерогенности Н. pylori.

Во второй модели мы исследовали геномные события происходящие в микроорганизме при селекции рифампицином. Данное исследование стало возможным благодаря развитию геномных технологий, позволяющих быстро и недорого секвенировать целые геномы микроорганизмов [56, 169]. Секвенирование геномов предоставляет возможность обнаруживать новые механизмы адаптации бактерий к различным агентам, в том числе и антибиотикам [31, 36, 179].

В результате нами было обнаружено, что при селекции Н. pylori рифампцином генерируются мутации, не связанные напрямую с устойчивостью Н. pylori к рифампицииу, так как ни одна из этих мутаций не была найдена ни в одном из Н. pylori клонов, инкубированных с субмиковыми концентрациями рифампицина. Учитывая, что пять мутаций оказались общими для двух мутантных штаммов, причем, частично они были найдены в дополнительно проанализированных рифампицин-устойчивых штаммах Н. pylori, можно предположить, что эти мутации были индуцированы антибиотиком. То есть в популяции Н. pylori появляются некое количество клеток с гипермутабельным фенотипом в ответ на стрессовое воздействие, вызванное добавлением антибиотика. Скорость мутаций в таких клетках увеличена в несколько тысяч раз, например, за счет дефектов метил-опосредованной системы репарации ошибок. Не исключено существование таких гипермутабельных клеток в бактериальной популяции в неселективных условиях окружающей среды, однако они не могут быть зафиксированы, поскольку накапливают "вредные" мутации и имеют пониженный фитнес, чем клетки с устойчивыми геномами. При добавлении антибиотика такие клетки получают преимущество, так как они быстрее адаптируются и как было обнаружено нами, в некоторых случаях гипермутабельный фенотип может быть зафиксирован на уровне популяции клеток. Например, в одном из рифампицин-устойчивых штаммов, а именно штамме Р2, частота возникновения мутантов к метроиидазолу выросла в 700 раз по сравнению с диким типом. Таким образом, можно предположить, что добавление антибиотика индуцирует появление гипермутабельных клеток в популяции, которые имеют шанс пройти через селективный отбор за счет высокой скорости мутационных процессов.

Возникновение гипермутаторных клеток в популяции при неблагоприятных условиях среды была впервые постулировано С. Розенбергом с коллегами в 1998 г [343]. В основу их теории легли исследования, посвященные молекулярным механизмам возникновения мутаций в Е. coli в стационарной фазе (адаптивный мутагенез). Авторы утверждают, что SOS и RpoS ответ на возникший стресс являются основными причинами появления гипермутаторных клеток в популяции. Однако, в отличие от Е. coli, в геноме Н. pylori не обнаружено ортологов LexA [34, 386] а также значительной части генов, участвующих в процессах репарации ДНК, рекомбинации и мутагенезе, таких как miitHL (methyl-directcd mismatch repair), umiiCD (UV-indueed mutagenesis) и SOS-контролируемой error-prone ДНК-полимеразы. Другими словами, H. pylori не имеет типичной SOS системы. Кроме того, в Н. pylori не обнаружены гомологи сигма факторов 32 (heat shock) и os (stress and stationary phase) [386]. Таким образом, возникновение гипермутабельных клеток в популяции Н. pylori при стрессе, вероятно обусловлено другими механизмами, чем Е. coli и их идентификация является задачей следующих исследований.

Здесь бы мы хотели предложить альтернативную гипотезу генерации вариабельности Н. pylori, которую необходимо будет исследовать параллельно. Данное предположение возникло при исследовании поведения так называемых цифровых организмов [242,409]. Предположим, что минимальная задача каждой клетки в популяции - воспроизводство себя самой, а максимальная задача - оставить как можно больше потомства. Преимущества в размножении получают только те клетки, которые выполняют какие-либо функции быстрее, чем остальные, например, быстрее делятся, или быстрее растут. Единственным механизмом за счет которого изначально одинаковые клетки могут получить какие-либо преимущества являются мутации в генах, которые происходят постоянно. Параметром, который можно варьировать является скорость мутаций. В результате использования компьютерных симуляторов, оказалось, что сама по себе способность к очень быстрому воспроизводству хорошо работает только при довольно низком уровне мутаций (survival of the flattest). При высокой вероятности мутации очень быстрое воспроизводство может привести к тому, что большое количество клеток оказывается нежизнеспособным и стремительно деградирует и вымирает. Однако гораздо важнее, что при заданных условиях, когда мутации генерируются в популяции постоянно, хоть и с разной скоростью, образуется «облако», которое содержит множество вариантов генетически близких бактерий. То есть в популяции клеток всегда происходят мутации, вследствие чего она является гетерогенной — и одновременно существует множество генетических вариантов, число которых в неселективных условиях невелико и увеличивается значительно при стрессе, так как меняется скорость мутаций. Именно вследствие стресса могут возникнуть новые генетические варианты Н. pylori, которые могут быть зафиксированы вследствие естественного отбора. Стресс является одновременно стимулирующим и селекционным агентом, так как изменяет скорость мутации в популяции и отбирает наиболее жизнеспособные бактерии с подходящим генотипом в данных условиях.

Для проверки является ли стресс индуктуром гипермутабельных клеток в популяции или же он селекционирует наиболее подходящие в данных условиях генетические варианты Н. pylori, перед нами встала необходимость разработать устройство, которое позволяло бы монитерировать или следить за жизнедеятельность единичных клеток. Кроме того, выше уже указывалось, что изучение процессов, протекающих в живых системах, как правило, часто проводят на большом числе клеток, при этом измеряемый параметр является усреднённым значением и отражает суммарный ответ многих клеток [245]. В ряде случаев подобный подход может приводить к неправильной интерпретации результатов. Например, были рассмотрены работы, посвященные поиску и анализу генов Н. pylori, участвующих в адаптации бактерии к изменению pH среды. Как для бактерий, так и для эукариот было показано, что даже в генетически идентичных и синхронизированных клетках паттерны экспрессии зависят от случайных флуктуаций [42,205], поэтому, чтобы избежать фактора гетерогенности популяции, измерение интересующего параметра можно проводить индивидуально для каждой клетки, что может быть особенно информативным в случае использования репортерных систем на основе флуоресцирующих белков [63, 126]. В связи с вышесказанным был разработан и апробирован микрофлюидный чип для мониторинга единичных клеток и показана возможность регистрации флуоресценции в клетках Н. pylori, иммобилизованных в микрофлюидных каналах чипа с целыо анализа экспрессионные профили отдельных клеток. Данную технологию планируется использовать в дальнейших исследованиях.

При поиске других причин, обусловливающих генетическую вариабельность бактерии, мы бы хотели обратить внимание еще на следующие факты. Если считать, что соответствие нуклеотидных мотивов по положению между двумя гомологичными геномными последовательностями организмов в пределах одного вида отражает нуклеотидные замены, произошедшие в популяции в процессе эволюции, то можно заключить, что в Н. pylori, вероятно, протекают преимущественно мутации С—»T, обусловленные механизмом метилирования-дезаминирования цитознна. С другой стороны, следует принимать во внимание, что некоторые штаммы Н. pylori содержат свыше 20 систем рестрикции-модификации (Р-М), подавляющее большинство которых относится ко II типу. Функция систем рестрикции-модификации у Н. pylori не ограничивается созданием барьера, препятствующего поступлению в клетки чужеродной генетической информации. Основным аргументом в пользу этого можно считать большое число генов систем Р-М, занимающих более 4% всего генома!

Согласно эгоистической (selfish) природе существования систем рестрикции-модификации у прокариот, эти системы, содержащие активный ген. М (метилтрапсферазы) и неактивный ген Р (рестриктазы), могут перемещаться из одного штамма Н. pylori в другой, где ген Р может снова реактивироваться или замещаться на новый активный ген Р. С этой точки зрения Н. pylori может рассматриваться как резервуар для систем Р-М — в процессе эволюции бактерия может случайным образом приобретать и терять системы Р-М. Учитывая повышение скорости превращения цитозина в тимин под влиянием метилирования, 5тС метилтрапсферазы можно рассматривать как потенциальные внутриклеточные мутагены. Поскольку мутации являются относительно редким событием, то их число зависит от продолжительности времени присутствия мутагена. Таким образом, время существования различных систем рестрикции-модификации в клетках бактерии может оказывать влияние на количество мутаций в соответствующих сайтах рестрикции-модификации. Другим фактором, ограничивающим частоту метилирования, является естественный отбор. Сайты системы Р-М могут быть расположены в структуре гена таким образом, что мутации в них понижают приспособляемость микроорганизма, и, как следствие, не наследуются. Этим же объясняются повышенные частоты замен в третьем положении кодона: поскольку транзиции в этом положении оказываются синонимичными, и они с большей вероятностью передаются потомству клетки.

В ходе выполнения данной работы при сравнении открытых рамок считывания (ОРС) штаммов Н. pylori 26695 и J99 было выявлено преобладание нуклеотидных замен по типу транзиций (более 3%) над трансверсиями (менее 1%). Преобладание транзиций обусловлено высокой скоростью перехода цитозина в тимин в кодирующей цепи ДНК (3.5-5.3%) и некодирующей (2.9—3.9%). Доля соответствий по типу трансверсий (А—>С, А—>Т, С—»A, С—>G, G—>С, G—»T, Т—>А и Т—>G) не превышала 0.84%. Наиболее значительна доля соответствий между С и Т в составе ACGT-ATGT

28.3%), сайте метилирования активной метилтрансферазой М.Нру99Х1 в штамме Н. pylori J99. Таким образом, преобладание мутаций С в Т, обусловленные процессами метилирования-дезаминирования цитозина в Н. pylori вполне вероятно. Кроме того, было показано, что у штаммов Н. pylori, дефектных по метилтрансферазам, снижается способность к адгезии, а также скорость роста. Таким образом, вклад эпигентических факторов, обусловленный потоком систем рестрикции-модификации в Н. pylori, в генетическую и функциональную вариабельность может оказаться значимым.

Учитывая эти данные и полученные результаты, мы предлагаем следующую модель формирования микрогетерогенности геномов Н. pylori. Гетерогенность геномов хеликобактера в природе обусловлена спонтанными точечными мутациями или высокой частотой межштаммовых и внутригеномных рекомбинационных событий. По нашему мнению, «спонтанное» образование однобуквенных транзиций, которое может эффективно модулироваться системами рестрикции-модификации, являющихся, в свою очередь, также вариабельной частью генома, делает два вышеуказанных предположения о механизмах формирования гетерогенности элементами одной системы. Нам представляется возможным рассматривать процессы дезаминирования цитозина как химическую реакцию, определяющую формирование микрогетерогенности, с последующим включением рекомбинационных процессов, формирующих множество гетерогенных локусов ДНК у Н. pylori, выщепление фрагментов генома и их горизонтальный перенос, варьирование количества и активности систем рестрикции-модификации.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Момыналиев, Куват Темиргалиевич, 2009 год

1. Аруин Л.И. Helicobacter pylori в патогенезе язвенной болезни: что известно и что узнать предстоит. // 5-я сессия Российской группы по изучению HP. - 1997 — Омск. - С. 3-5.

2. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. //- 1993 Амстердам. С. 151-161.

3. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. // 1998 М.: ТриадаХ. - С. 496.

4. Бельмер С.В., Гасилина Т.В., Зверков И.В. Пилорический хеликобактер и язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки у детей разного возраста. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии 1997 -Том 7-С. 187.

5. Гвоздев В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК. // Соросовский образовательный журнал 1999-№10-С. 11-17.

6. Громова Е.С., Хорошаев A.B. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. // Молекуляр. биология. 2003 -№37-С. 300-314.

7. Ивашкин В.Т. Helicobacter pylori: биологические характеристики, патогенез, перспективы эрадикации. // Рос.журн. гастроэнтерол. гепатол., колопроктол. — 1997-Том 7-С. 21-23.

8. Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л. Роль молекул адгезии в патогенезе инфекции Helicobacter pylori. II Рос. журнал гастроэн. гепатол. колопокт. 1997 - Том 6 — С. 32-37.

9. Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. // 1999 М.: Триада-Х. - С. 255.

10. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. // 2003 М: Медпрактика. -С. 411.

11. Карягина A.C. Генетические детерминанты ферментов систем рестрикции-модификации у бактерий. // Молекул, генетика. 1990 - №7 - С. 1-30.

12. Корсунский А.А., Щербаков П.Л., Исаков В.А. Хеликобактериоз и болезни органов пищеварения у детей. // 2002 М.; Медпрактика. - С. 76-101.

13. Кудрявцева Л.В. Механизмы развития приобретенной антибиотикорезистентности у Н. pylori. II Рос. жури, гастроэнт., гепатол., колопрокт. 2000 - №2 - С. 39-41.

14. Кудрявцева Л.В. Динамика резистентности штаммов Н. pylori у городского населения России 1996-1998 годах и ее клиническое значение. // Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Н. pylori. Уфа 1999 - С. 23-26.

15. Логинов А.С., Аруин Л.И., Ильченко А.А. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии. // 1993 М. Медицина. - С. 230.

16. Пасечников В.Д., Чуков С.З. Значение геномной гетерогенности штаммов Helicobacter pylori в развитии ассоциированной патологии гастродуоденальной зоны. // Рос. Журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2000 — №3 - С. 7-11.

17. Решетников О.В., Курилович С.А., C.Granberg и соавт. Серодиагностика хеликобактериоза в семьях Новосибирска. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 1997 - Том 7, N 5 - С. 234.

18. Селье Г. Стресс без дистресса. // 1979 -М.: Прогресс — С. 122.

19. Филатов А.Э., Сапожников В.Г. Семейная инфицированность при Helicobacter pylori -ассоциированных формах гастродуоденитов у детей. // Материалы V сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. 1997 - Омск. — С. 44-45.

20. Agostini H.T., Yanagihara R., Davis V. et al. Asian genotypes of JC virus in Native Americans and in a Pacific Island population: markers of viral evolution and human migration. II Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1997 - N 94 - P. 14542-14546.

21. Aisenberg, A.C. The Glycolysis and Respiration of Tumors // Academic Press 1961 - New York.

22. Akopyants N., Bukanov N.O., Westblom T.U., Berg D.E. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori. II Nucleic Acids Res. 1992 - N 20 - P. 6221-6225.

23. Akopyants N.S., Clifton S.W., Kersulyte D., Crabtree J.E., Youree B.E., Reece C.A., Bukanov N.O., Drazek E.S., Roe B.A., Berg D.E. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. И Mol. Microbiol. 1998 -N 28 - P. 37-53.

24. Albano C.R., Lu C., Bentley W.E., Rao G. High throughput studies of gene expression using green fluorescent protein-oxidative stress promoter probe constructs the potential for living chips. // J. of Biomolecular Screening. 2001 -N 6 - P. 421-428.

25. Albert TJ, Dailidiene D, Dailide G, Norton JE, Kalia A, Richmond TA, Molla M, Singh J, Green RD, Berg DE. Mutation discovery in bacterial genomes: metronidazole resistance in Helicobacter pylori. И Nature Methods. 2005 - N 2 - P. 951-953.

26. Allan E., Clayton C.L, McLaren A., Wallace D.M., Wren B.W. Characterization of the low-pH responses of Helicobacter pylori using genomic DNA arrays. // Microbiology 2001 - N 147 - P. 2285-2292

27. Alm R.A., Trust T.J. Analysis of the genetic diversity of Helicobacter pylori: the tale of two genomes. // Mol. Med. 1999 - N 77 - P. 834-846

28. Ando T., Xu Q., Torres M., Kusugami K., Israel D.A., Blaser M.J. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain Plasmid transfer. // Mol Microbiol. 2000 -N 37 - P. 1052-65

29. Ang S., Lee C.Z., Peck K., Sindici M., Matrubutham U., Gleeson M.A., Wang J.T. Acid-induced gene expression in Helicobacter pylori: study in genomic scale by microarray.//Infect. Immun.-2001 -N69-P. 1679-1686.

30. Aras R A., Kang J., Tschumi A.I, Harasaki Y., Blaser M. J. Extensive repetitive DNA facilitates prokaryotic genome plasticity. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003 - N 100-P. 13579-13584

31. Aras R.A., Takata T., Ando T., van der Ende A., Blaser M.J. Regulation of the Hpyll restriction-modification system of Helicobacter pylori by gene deletion and horizontal reconstitution. // Mol. Microbiol. 2001 - N 42 - P. 369-382

32. Aras, R.A., Small, A.J., Ando, T., Blaser, M.J. Helicobacter pylori interstrain restriction-modification diversity prevents genome subversion by chromosomal DNA from competing strains. // Nucleic Acids Res. 2002 - N 30 - P. 5391-5397.

33. Arkin A., Ross J., McAdams H.H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage -infected Escherichia coli cells. // Genetics. 1998 - N 149-P. 1633-1648

34. Azuma T., Suto H., Ito Y., Ohtani M., Dojo M., Kuriyama M., Kato T. Gastric leptin and Helicobacter pylori infection. // Gut. 2001 - N 49 - P. 324-329.

35. Bagnoli F., Buti L., Tompkins L., Covacci A., Amieva M.R. Helicobacter pylori CagA induces a transition from polarized to invasive phenotypes in MDCK cells. // Proc Natl Acad Sei US A.-2005-N102-P. 16339-16344.

36. Baiagadde F.K., You L., Hansen C.L., Arnold F.H., Quake S.R. Long-Term Monitoring of Bacteria Undergoing Programmed Population Control in a Microchemostat. // Science. 2005 -N 309 - P. 137-140

37. Bamford K.B., Bickley J., Collins J.S., Johnston B.T., Potts S., Boston V., Owen R.J., Sloan J.M. Helicobacter pylori: comparison of DNA fingerprints provides evidence for intrafamilial infection. // Gut. 1993 -N 34 - P. 1348-1350.

38. Banatvala N., Mayo K., Megraud F., Jennings R., Deeks J.J., Feldman R.A. The cohort effect and Helicobacter pylori. II J Infect Dis. 1993 -N 168 - P. 219-21.53.