Генетический контроль устойчивости Escherichia coli K-12 к вирулентному фагу Cl тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Самсонов, Виктор Васильевич

• Самсонов, Виктор Васильевич
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Самсонов, Виктор Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

L ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Структуры клетки, вовлеченные в процесс фаговой инфекции и системы транспорта в Escherichia coli.".

1. Компоненты оболочки бактерий, как рецепторы фагов и колицинов.

1.1. Основные компоненты наружной мембраны Escherichia coli.

1.1.1. Основные пориновые белки.

1.1.2. АПС — основной компонент внешней мембраны.

1.1.3. Фосфолипиды.

1.1.4. Энтеробактериальный антиген и капсулярные полисахариды.

1.1.5. Белки — рецепторы фагов и колицинов, участвующие в специфическом транспорте.

1.2. Муреиновый слой.

1.2.1. Молекулярная структура муреина и его связь с внешней и цитоплазматической мембранами.

1.2.2. Строительство муреинового слоя.

1.3. Цитоплазматическая мембрана.

1.3.1. Липидные компоненты.

1.3.2. Белковые компоненты.

1.4. Периплазма и секреция белков.

1.4.1. Структура периплазматическош пространства.

1.4.2. Белки периплазмы.

1.4.3. Машина экспорта. . 231.5. Белки участвующие в специфическом транспорте.

1.5.1.Внешыемембраныые транспортеры.

1.5.2. ABC транспортеры.

1.6. Транспорт аминокислот.

1.6.1. Использование различных систем для транспорта одной АК. 30 1.7. Транспорт витамина В

2. Бактериальные белки используемые фагами и колицинами для проникновения в клетку.

2.1. Транспорт колицинов.

2.2. ТопВ и ТЫА зависимые транспортные системы и импорт макромолекул в Escherichia coli.

2.2.1. Свойства мутантов по гену tonB.

2.2.2. Взаимодействие транспортеров и ТопВ.

2.2.3. Участие белков ЕхЬВ и ExbD в ТопВ зависимом транспорте.

2.2.4. Продукты генов tol и импорт макромолекул в Е. coli.

2.2.5. Механизм транспорта макромолекул системой Tol.

2.2.6. Взаимозаменяемость белков ТопВ — ЕхЬВ — ExbD и

TolA — TolQ — TolR.

2.3. Фаговая инфекция.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактерии, фаги и плазмиды.

2. Среды и химикаты.

3. Генетические методы.

4. Утилизация витамина В12.

5. Методы работы с ДНК.

6. Анализ внутриклеточных белков.

7. Комплементационный анализ.

8. Анализ адсорбции фага С1.

9. Фракционирование компонентов оболочки клеток.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование генов deiA и dcrB.

2. Локализация генов dcrA и dcrB внутри клонированных фрагментов ДНК и на физической карте Е. coli.

3. Анализ нуклеотидной последовательности генов dcrA и dcrB.

4. Оперонная организация экспрессии гена dcrB.

5. Идентификация продукта гена dcrB.

6. Локализация белка DcrB в мембранных фракциях.

7. Влияние наличия или отсутствия гена dcrA в клетке на экспрессию dcrB.

8. Утилизация витамина В12 в мутантах dcrA и dcrB.

9. Плейотропные эффекты, вызванные отсутствием или избытком гена dcrA в клетке.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический контроль устойчивости Escherichia coli K-12 к вирулентному фагу Cl»

В последние годы были предприняты значительные усилия по изучению функций, синтеза, химического состава структурных компонентов оболочки грамотрицательных бактерий, особенно Escherichia coii и Salmonella typhymurium. Одним из способов, позволяющим находить минорные, несущественные в лабораторных условиях белки мембран, является изучение бактериальных мутантов по адсорбции соответствующих фагов и транспорту колицинов.

У энтеробактерий известно более 500 различных фагов, которые подразделяются на несколько групп на основе характеристики их нуклеиновых кислот, особенностей морфологии, антигенных различий, спектра хозяев и резистентности к некоторым агентам, таким, как эфир, хлороформ, нагревание (Ackerman H.W. 1987). Различные хвостовые отростки, длинные (сократимые или несократимые) или короткие, могут иметь разные рецепторные сайты на поверхности клетки. Из 500 проанализированных фагов энтеробактерий, 143 принадлежат к морфологическому типу с длинным несократимым хвостом (Ackeriman H.W. 1987). Это — самая большая группа фагов и у других видов бактерий.

Функция фагового рецептора заключается в опознавании специфических сайтов хвостового отростка фага, что является первым этапом взаимодействия клетки и фага, предшествующим инъекции ДНК вируса внутрь клетки. Обычно 1 фаг узнает только один белок, но существуют и исключения, когда фаг может использовать 2 или 3 различных белка в качестве рецепторов (Morona R. et al. 1984). Изучение фаговых рецепторов грамотрицательных бактерий имеет так же большое значение для практики: — биотехнологии (получение фагорезистентных штаммов продуцентов), эпидемиологии (фаштипирование и таксономия), — инфекционной патологии (при уропатогенной инфекции наблюдается адгезия белка PapF пилей Е. coli, расположенных в конце нитей бактерий, с эпителием хозяина по типу взаимодействия белковых компонентов с рещепторными сайтами бактерий) (Lindberg F. et al. 1987).

Щель ш задачи шсследовашшя. Целью настоящей работы было фенотипическое и генетическое изучение мутаций, сообщающих клеткам штаммов Escherichia coli устойчивость к вирулентному фагу О. Для этого предполагалось исследовать влияние мутаций на функции клетки, клонировать гены, мутации в которых вызывают резистентность к О и установить локализацию продуктов этих генов в клетке.

В связи с этим ставились следующие задачи: исследование фенотипических свойств мутантов по адсорбции С1; клонирование фрагментов хромосомы Е. coli, содержащих гены dcr (deficiency of CI resistance), мутации в которых сообщают бактерии устойчивость к фагу О; локализация генов dcr путем субклонирования фрагментов полученных рекомбинантных фазмид, несущих изучаемые гены, на мультикопийыые векторы; определение нуклеотидной последовательности генов dcrA и dcrB; определение молекулярных весов продуктов генов по предсказанной аминокислотной последовательности и сравнение их с молекулярными весами, полученными при помощи экспериментов с максиклетками; определение местоположения белка DcrB в клетке; проверка возможного участия продуктов генов dcrA и dcrB в транспорте витамина BJ2 в бактериях.

Новюшга ¡результатов* Идентифицировано три гена dcrA, dcrB и dcrC, контролирующих адсорбцию фага С1. Показано, что ген dcrC идентичен известному гену ЫиВ, ответственному за адсорбцию фага BF23, некоторых колицинов и транспорт витамина В12, ген der А идентичен sdaC (транспортер серина), и последовательность dcrB совпадает с рамкой считывания ORFo203, гипотетического гена, описанной Sofia et al. (1994). .

Определена нуклеотидная последовательность участков хромосомы, включающих гены dcrA и dcrB. Показана оперонная организация ORFo221 и dcrB.

Идентифицирован продукт гена dcrB — процессируемый белок с мол. весом 18 кДа. Он локализован в периплазме и внутренней мембране.

Обнаружена супрессия фенотипа С1 резистентности в штаммах с точковыми мутациями в dcrB при введении в них гена dcrA/sdaC на мношкопийной плазмиде.

Показано, что клетки несущие мультикопийнуго плазмиду с геном dcrA/sdaC перестают нормально делиться и образуют филаменты на богатой среде при 42°С. Мутанты по гену dcrA в 3 раза устойчивее к Ь —лактамным антибиотикам, чем родительский штамм, что предполагает возможное dcrA на функционирование пенициллин — связывающих белков.

Предложена модель адсорбции фага С1. шолучюгашшж результатов. Результаты изучения генетического контроля фагорезистентности в клетках Е. coli позволяют: — получить фашустойчивые штаммы продуценты; выявить детали механизма транспорта макромолекул клеткой; более детально представить механизмы взаимодействия хозяин — паразит.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, L Комшогаешппы оболочки бактерий, как решртторы фагов ш колшшрнов.

Клеточная оболочка грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, имеет сложную структуру. Она состоит из внутренней или цитоплазматической мембраны, пептидогликанового слоя и внешней мембраны. Между внутренней мембраной и пептидогликаном имеется пространство, называемое периплазмой, где содержится ряд ферментов гидролиза и "связывающие белки". С оболочкой связаны существенные клеточные функции, такие как деление клетки, размер, репликация и разделение хромосомы, контроль синтеза макромолекул, морфогенез органелл и фагов, транспорт метаболитов и т. д.

Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий интенсивно изучалась в последние годы. Поэтому настоящий обзор может вместить только краткое изложение основных результатов исследований в этой области.

Внешняя мембрана содержит относительно небольшое количество белков. Среди них имеются муреиновый липопротеин, главные мембранные белки, и группа белков, которые служат рецепторами для фагов, колицинов и специфических транспортируемых веществ.

Поскольку порины идентифицированы и описаны для 32 видов бактерий (Hancock R.E. 1987.), а так же для наружных мембран митохондрий и хлоропластов эукариотических клеток (Benz R. 1985.), весьма вероятно, что основные мембранные белки выполняют одинаковые функции. Детальное изучение рецепторных белков фагов помогает исследовать транспорт специфических субстратов, и сделало возможным передачу генетического материала в отдаленные виды микроорганизмов путем фаговой трансдукции, в частности за счет введения гена 1атВ, кодирующего рецепторный белок фага лямбда, в бактерии других видов: Agrjbacterium, Pseudomonas, Rizobium и др. (Ludwin R.A. 1987).

Порины кодируются генами отр¥, отрС и phoE Е. coli. Их продукты образуют относительно неспецифические поры или каналы, через которые могут проникать маленькие гидрофильные молекулы, преодолевая барьерный эффект внешней мембраны. Ген phoE уникален тем, что экспрессируется только в условиях голодания по фосфору. Таким образом, в обычных условиях синтезируются только QiripF и QnipC, но их относительные количества находятся под эффективным контролем осмотической активности среды и температуры. Общее количество поринов велико и относительно постоянно. Имеются обширные гомологии между нуклеотидными последовательностями генов отр¥, отрС и phoE. Белок OrnpF является рецепторным компонентом для фагов Tula и Т2, a OnipC — Tulb и Т4. Мутанты, резистентные к фагу Т2, имеют сниженное количество белка OrnpF. Фаг Т2 инактивируется in vitro смесью QixipF и ЛПС (липополисахарид). Отдельно OrnpF или АПС не обладают нейтрализующей активностью. Однако для инактивации мутантов по кругу хозяев нужен только белок OmpF. Недавно было выяснено, что фаг Т2 может пополнить список фагов, способных узнавать больше одного рецептора. Известно, что мутанты, резистентные к фагу Т2, возникают с низкой частотой. Это наблюдение заставило предположить, что фашрезистентность является следствием одновременных мутаций в нескольких генах. Было обнаружено, что мутация во вторичном локусе, кроме отрЕ, необходима для полной резистентности к фагу Т2. Этот локус назвали ttr (Т — two resistant). При дальнейших исследованиях установили, что он идентичен гену fadL, кодирующему мембранный белок, участвующий в транспорте длинноцепочечных жирных кислот Е. coli.

Предполагается, что более важным рецептором для фага Т2 является продукт гена fadL, а не белок OnipF (Morona R. et al. 1986.). Существует выраженная альтернатива выбора Т — четными фагами более одного рецепторнош сайта на поверхности хозяйской клетки, что может определяться более чем одним фаговым геном.

Кроме фагов Т —четной группы, некоторые лямбдоидные фаги также могут использовать пориновые белки в качестве рецепторов. Было замечено, ' что штаммы Е. coli, в которых отсутствует ОтрС, резистентны к лямбдоидному фагу 434. Очищенный белок ОтрС обладает способностью инактивировать фаги 434 и A,virh434. Добавление АПС не приводит к усилению нейтрализующей активности белка (Hamtke К. 1978). Штамм Е. coli В, в котором отсутствует этот порин, резистентен к фагу 434, что дополнительно указывает на то, что рецептором фага и является ОпарС. Интересно, что ген J фага X, который кодирует белок хвостовой нити фага, на 90% гомологичен J — гену лямбдоиднош фага 434. Однако фаг 434 не взаимодействует с рецептором фага X, белком — LaniB. Изменение по крайней мере 10% аминокислотной последовательности белка хвостовой нити фага существенно влияет на рецепторные взаимодействия с клеткой.

Другой лямбдоидный фаг, РА—2, имеющий много общего с фагом 434, также использует в качестве рецептора белок OnipC (Bassford P. et al. 1977). Некоторые пориновые белки могут выполнять взаимозаменяемые рецепторные функции. Так, белок LamB, являющийся рецептором фага X, может взаимодействовать с мутантами по кругу хозяев фага Tula — TPI, хотя в норме рецептором фага Tula является белок OnipF.

Белок LarnB секвенирован. Он имеет большое сходство с пориновыми белками: LainB образует тримеры, не вымываемые из мембраны SDS (тогда как другие белки экстрагируются детергентами), имеет обширные участки "b — sheet" структуры и может быть связан с пептидогликаном.

Основной мембранный белок ОтрА, является мономером. Он похож на порины, но выходит из мембран при обработке SDS при низкой температуре. Мутанты по гену отрА имеют уменьшенную скорость транспорта различных веществ. Это трансмембранный белок, осуществляет связь с пептидогликановым слоем и образует комплекс с АПС (ЛПС защищает OnipA от случайного гидролиза), участвует в поддержании целостности наружной мембраны (Schweizer М. et ai 1978.). OimpA осуществляет не только барьерную функцию, но и служит рецептором для некоторых фагов Т —четной группы: Ох2, TuIP и КЗ (Hancock R.E. et al. 1978). Белок также необходим при конъюгативном скрещивании бактерий. Он определяет чувствительность клеток к колицинам К и L (Skurray R.A. et al. 1974). Увеличение дозы гена отрА приводит к падению уровня основных мембранных белков OimpF и ОпгрС, а также белка LaniB и липопротеина в наружной оболочке клеток. Дальнейшее увеличение продукции ОтрА является летальным для клетки. Наружные мембраны многих грамотрицательных бактерий содержат основной белок, который серологически родственен белку ОпарА из Е. coli К12. Белок ОтрА из Serratia marcescens и Enterobacter aerogenes определяет чувствительность к фагам КЗ и ОхЗ, но не активен в конъюгации. Ген отрА из Salmonella typhimurium так же клонирован в Е. coli. При этом, синтезируемый белок ОтрА, который по своей функции в конъюгации бактерий и восприятию колицинов не отличается от белка Е. coli, не может служить в качестве рецептора для специфических фагов КЗ и TuIP (Freudl R. et al. 1983).

Структурный ген белка PhoE локализован на 6 —й минуте хромосомы Е. coli (Tommassen J. and Lugtenberg В. 198L). По крайней мере три гена, pAoB, R, и М, участвуют в регуляции экспрессии гена phoE. Белок PhoB является активатором транскрипции структурных генов. В свою очередь, на выражение гена phoB влияют продукты генов phoR и рАоМ. Мутанты по гену phoE резистентны к фагам Тс45 и Тс23 (Chai TJ.,Foulds J. 1978). Эти фаги имеют морфологию, схожую с морфологией Т —четных фагов, но отличаются по морфологии бляшек, урожайности на клетку и другим признакам.

Другим пориновьш белком является белок Le (lysogenic convertion). Если штамм Е. coli К12 лизогенизируется фагом РА—2, то синтез OrnpC репрессируется (рецептор для фага РА—2). Le —белок фага РА—2 на 97 — 98% гомологичен NmpC —белку (new membrane porine). Последний впервые обнаружен в псевдоревертантах мутантов Е. coli, у которых отсутствуют пориновые белки OnipF и OmpC (Highon P.I. et. al. 1985). Недавно показано, что структурный ген для этого белка находится в дефектном лямбдоидном профаге qsr', расположенном на 12 мин. хромосомы.

Порины и фаги рецепторами которых они являются указаны' в Табл.1— 1.

Таблица 1—1. Порины Е. coli К12 , В и S. Typhimurium LT2¿

Назв. Мол. Позиция Присутствие Диам. Рецепторы для вес на карте В К12 LT2 пор(нм) фагов/колиц.

Е.соМS.typhim.

1.16 Tula, Т2,ТР1,

ТР2, ТР5, ColA 1.08 Tuto, Mel, PA2, PH42, PH105 434, SSI, TP2, PH221

TP5, TP6

PH42, PH51 1.16 TC23. TC45L

Оо2о ЛПС - ©атавшгай пздмптошешт вшешшией мембраны, АПС — уникальная составная часть внешней мембраны. Он отсутствует в других компонентах клетки. ЛПС состоит из трех частей: проксимального

OmpF 38.3 21 + + +

OmpC 37.1 47 - + +

OmpD 38.0 28 — 4

PhoE 36.8 6 ? + + гидрофобного участка — липида А; дистального гидрофильного О — антигенного полжсахариднош фрагмента, который выступает в среду; и ядерного полисахаридного участка, который связывает два первых. Липид А необычен тем, что структура соответствующая глюкозаминил—b — (1 — 6) глюкозамину замещена шестью или семью остатками жирных кислот, которые являются насыщеными. Более проксимальная часть ядра богата заряженными группами (особенно отрицательно заряженными). Свойства мутантов продуцирующих дефектные АПС указывают на различные биологические функции выполняемые его частями. Потеря О —антигена приводит к потере вирулентности, что предполагает важность этого участка во взаимодействии хозяин— паразит. Потеря более проксимальной части ядра приводит к чрезвычайно высокой чувствительности клеток к гидрофобным веществам. Таким образом участок, содержащий большое количество заряженных групп, необходим для поддержания барьерных свойств внешней мембраны. Мутанты по липиду А изолируют только как условно летальные. Вероятно он необходим для успешной сборки внешней мембраны.

Мутанты Е. coli К12 с повышенной чувствительностью к новобиоцину имеют повреждения в структуре АПС и резистентны к фагам Т4, Т7, PI и Muí. Электронно — микроскопическое изучение клеток Е. coli С показало, что при адсорбции, фаг ФХ174 находится на поверхности клеток, взаимодействуя с АПС рецепторными сайтами. Связывание и инъекция ДНК ФХ174 происходят и с очищенными препаратами АПС. Клетки Е. coli К12 резистентны к этому фагу, так как не имеют рецепторного сайта в ядре олигосахарида АПС. Получены мутанты Е. coli К12 ter— 21, которые становятся чувствительными к фагу ФХ174 за счет изменения структуры ядра олигосахарида. Фаг ФШ и мутант по кругу хозяев Ф5 требуют для адсорбции целостности вторичной и третичной структуры липида А. Проводились работы по химическому анализу остатков Сахаров АПС из оболочек бактерий Е. coli К12, которые выполняют рецепторные функции для различных ЛПС — специфических фагов: 6SR, BR2, С21, R210, FP1, В8. Некоторые мутанты обладали интересными свойствами: становясь резистентными к одному фагу, они приобретали чувствительность к другому. Это объясняется тем, что дефект по какому-нибудь сахарному остатку повреждает рецептор для одного фага, но демаскирует рецептор для другого. Все мутанты, устойчивые к большинству фагов (С35, F65, Т4338), были не способны расти на средах с солями желчи, что по —видимому, связано с увеличением проницаемости наружной мембраны. Кроме того, эти штаммы устойчивы к фагам ТЗ и Т7, которые имеют рецепторы в АПС. Установлена некоторая специфичность фагов в отношении рецепторной функции тех или иных остатков Сахаров. Мутанты, дефектные по галактозе, резистентны к фагу U3, по глюкозе —к Вг2 и Т4, по гептозе - к С21, BrlO, PI и 17.

АПС— структура, широко распространена среди энтеробактерий. Этим можно объяснить широкий спектр хозяев для фага PI, который может размножаться на 8 видах бактерий: Erwinia, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Agrobacterium, Myxobacteria, Alealigens, Flavobacterium, что отличает его от фагов, имеющих более специфические рецепторы. Ранее считалось, что низкая выживаемость фага X на лизогенах по фагу PI связана только с рестрикцией. Однако было установлено, что фаг Xvir не инактивируется целыми клетками Е. coli, лизогенньши по фагу Plcmts (Tomas J.M., Kay W.W. 1984.). Фаг Ä,vir, меченный P32, не адсорбируется на Plcmts —лизогенах. В этих бактериях также повреждены системы транспорта мальтозы. Все вышеперечисленные особенности не наблюдаются в клетках, излеченных от Plcmts. Было показано, что возникающие в лизогенах изменения в составе АПС связаны с появлением дефекта в гептозе. Таким образом, авторы пришли к выводу, что наличие в клетках фага Plants в состоянии профага, влияет на биосинтез ЛПС и, как следствие, приводит к изменению функции белка LaniB, несмотря на достаточное количество его копий на клетку. Использованный в работе фаг X имел делецию в "Ь" — районе, область ORF —314. Предполагалось, что белок ORF —314 может представлять собой часть коротких хвостовых нитей фага X (Katsura I. 1983). Этот белок может заменить полипептид фага Т4 (белок 38 участвует в сборке длинных хвостовых нитей). Ген X ORF —314 области был назван tfa (tail fiber assembly). Видимо, система ORF— tfa играет некоторую вспомогательную роль в фаговой инфекции, стабилизируя комплекс фаг — бактерия.

Рецепторная функция обычно проявляется в 'шероховатых' штаммах, таких как Е. coli К12, которые не имеют О —антигенной части ЛПС. Но в большинстве природных штаммов (гладкие колонии) имеются длинные О —антигенные цепи (Van der Ley Р. et al. 1986), которые препятствуют доступу фагов и колицинов к их рецепторам, что защищает клетку от гибели.

Муреиновый липопротеин — маленький (7.200 Да) белок, который обнаруживается в большом количестве копий (7 х 1Q5 на клетку). Около трети популяции этого белка существует в ковалентно связанной форме с пептидогликановым слоем через е — аминогруппу его С —концевого лизина, тогда как оставшийся белок не связан. N — концевой остаток, цистеин, необычно модифицирован. Его сульфгидрильная группа замещена на диглицерид, а аминогруппа замещена на остаток жирной кислоты через амидыую связь. Муреиновый ЛПП существует как тример (Yu, F., et al. 1984). Мутанты имеющие делецию в структурном гене липопротеина (1рр) жизнеспособны при нормальных условиях. Тем не менее у этих штаммов наблюдается образование пузырьков на внешней мембране и вытекание периплазматических белков в среду (Hirota, Y. et al. 1977.) Предполагают, что продукт гена 1рр стабилизирует комплекс внешняя мембрана — пептидогликан. Кроме того, было идентифицировано несколько минорных липопротеинов (Ichihara, S., et al. 1981). Их функции неизвестны.

LL3. Фосфолишидм, фосфолипидный состав внешней мембраны сходен с составом цитоплазматической при небольшом избытке фосфатидилэтаноламина во внешней (Osborn, M.J., et al. 1972). При введении меченных молекул фосфолипида во внешнюю мембрану интактных клеток Jones и Osborn (1977) показали, что существует быстрый обмен фосфолипидами между внутренней и внешней мембранами. Остается неясным, как этот обмен осуществляется. LL4o Эштеробактершалыяыи ашгагаш ш пштсуляршые полисахариды.

Энтеробактериальный общий антиген — кислый полисахарид содержащий N — ацетил— D — глгокозамин, N — ацетил— D — маннозаминуроновую кислоту, и 4 — ацетамидо — 4, 6 — дидеокси — D — галактозу (Lugowsky, et al. 1983.) Он составляет 0.2% сухого веса Е. coli и является встроенным во внешнюю мембрану через ковалентно связанные фосфолипиды (Mayer, Ы., & G. Schmidt. 1979).

В бактериях обнаружено два типа капсулярных полисахаридов. Один из них М —антиген (колановая кислота) широко распространен среди микроорганизмов (Grant, W. D. et al. 1969). Этот полисахарид экспрессируется только при определенных условиях, таких как высокая осмотичность среды, низкая температура и небольшая влажность (Anderson, E.S. & A.H.Rogers. 1963). Другой полисахарид это серотипспецифический К— антиген. Он имеется у большинства изолированных штаммов Е. coli, но отсутствует в S. typhimurium. Он также отсутствует в широко используемых лабораторных штаммах Е. coli К12 и В. К — антиген заякорен во внешнюю мембрану через липидные хвосты (Schnaidt, М. А., & К. Jann. 1982.). В Е. coli К —антигены являются первичными рецепторами для некоторых фагов (ФК5 и ФК20). Показано, что при адсорбции, эти фаги не только узнают свои К —антигенные рецепторы, но и деполимеризуют капсулярный полисахарид, т.е. имеют на хвосте деполимеризугощуго энзиматическую активность (Nimniich,W. et.al. 1991).

LL5. Белки, рещетгторы фагов ш кшшпршов, учшствушщмке в специфическом траигашорте,, Кроме поринов, существуют наружные мембранные белки, участвующие в транспорте специфических субстратов. Они, в то же время, выполняют роль рецепторов фагов и колицинов (Lugtenberg В., & Van Alphen L.1983). К таким белкам относится Tsx, рецептор для фага Т6 и колицина К (Manning P.A., & Reeves P. 1976). Его молекулярная масса 26 кД. Белок необходим для оптимального транспорта адеыозина и некоторых других нуклеозидов через наружную мембрану. Необходимость Tsx для нуклеозиднош транспорта становится существенной только при концентрации субстрата менее 1 мкМ, при более высокой концентрации белок Tsx становится несущественным, так как транспорт нуклеозидов осуществляется через неспецифические порины (Van Alphen L., et al. 1978). Синтез рецептора фага Т6 регулируется, подвергаясь действию белков системы катаболитной репрессии. Биологически активный рецептор содержит комплекс белка и АПС. Мутанты по кругу хозяев фага Т6 способны к росту на бактериях tsx~ (Heuzenroeder M.W., & Reeves P. 1981). Показано, что белок Tsx образует поры во внешней мембране, на которых специфически связывания нуклеозиды. Наличие нуклеозид — специфических пор может создавать значительные преимущества для роста бактерий в среде с большим разнообразием субстрата (Maier С., et al. 1988).

Мутации в гене ДтА картируются в районе 4 — й минуты генетической карты хромосомы Е. coli. Мутантные штаммы резистентны к фагам Т5, Т1, Ф80 и колицину М (Hantke К., Braun V., 1978). Белок FhuA с молекулярной массой 80 кДа имеет 1Q3 копий на клетку, локализуется в наружной мембране, выполняя специфическую функцию по транспорту, как железа, так и феррохрома.

Другой мембранный белок, BtuB, участвует в транспорте витамина В12, молекулярная масса которого слишком велика для успешного прохождения через поры наружной мембраны. Белок BtuB имеет молекулярную массу 66 кДа, соответствующий ген картируется на 89 минуте генетической карты хромосомы Е. coli (Kadner R.J., & Liggins G.L. 1973). Мутанты по гену ЫиВ утрачивают способность связывать В12- Этот белок необходим для утилизации экзогенного кобаламина при низких концентрациях. Белок BtuB является рецептором для фагов BF23, С1 и колицинов El, Е2, ЕЗ (Buxton R.S. 1971). Обычно белок BtuB обнаруживается в мембранах Е. coli в низких концентрациях, 200 — 300 копий на клетку, если В12 удален из кулътуральной среды. Некоторые белки включенные в специфические процессы диффузии описаны в табл. 1 — 2.

Таблшшр 1=2. Белки внешней мембраны включенные в специфический транспорт.

Назван. Позиц. Мол. Рецепт, для фагов, TonB Транспортир. мин.) вес колицинов зависим. в — ва

LamB 91 47.3 X, К10, TP1.TP5.SS1 — Мальтоза, мальтодекстрин

Tsx 9 26 Т6, СоЖ ■ — Нуклеозиды

BtuB 89 66,4 BF23, ColE + Витамин В12

Cir 44 74 ColI,V ? Ионы железа

Int 74.5 ColDF13 + Аэробацин — Ре3+

FhuE 16 76.0 + Капроген— Ре3+

FhuA 3 78.0 Т1,Т5,ф80, ColM + Феррохром

FecA 7 80.0 + Цитрат железа

FepA 13 81.0 ColB, D + Энтеробацин — Ре3+

Fiu 18 83.0 ? Ионы железа

1.2. Муреииовыш слой» 1.2=1. Молекулярная структура муреииа ш его связь с внешней и щитотлазматмгаеской мембранами. Муреиновый слой является уникальным примером молекулярной архитектуры, поскольку его размеры изменяются во время цикла клеточного деления, в то же время он остается связанным ковалентными связями. Последние двадцать лет большое внимание было уделено изучению структуры муреина и ферментов включенных в его синтез. Тем не менее остается много неясного в биохимии морфогенеза муреина.

Форму клеточной стенки бактерии определяет сложный полимер, состоящий из двух аминосахаров и, по крайней мере, четырех аминокислот. Так как полимер состоит из приблизительно равных количеств полисахарида и пептида, он принадлежит к классу полимеров называемых пептидогликанами. Таким образом, муреин ' представляет большую группу близкородственных пептидогликанов, находящихся исключительно в клеточной стенке.

Муреиновый слой состоит из N — ацетилглюкозамина, N — ацетилмурамовой кислоты, Ь —аланина, В — глутаминовой кислоты, мезо — диаминопимелиновой кислоты (ПАР), и О — аланина в эквимолярных количествах. Он находится в периплазме, между внешней и цитоплазматической мембранами. Внешняя мембрана прочно встроена в муреиновый слой и ковалентно связана с молекулами липопротеина. Предполагают, что многие сайты связывания внешней и внутренней мембран представляют места, где к муреиновому слою ковалентно прикреплены новые цепи муреина, тогда как их растущие концы связаны с бактопренолпирофосфатом, компонентом цитоплазматической мембраны. В растущих клетках существует около 100 таких связей между муреином и цитоплазматической мембраной. Другие места связывания внешней и внутренней мембран могут образовывать места синтеза липополисахаридов и других компонентов клеточной стенки.

L2.2. Строштежьста® мурешшговог® слоя.

Во время цикла клеточного деления бактерия Е. coli удваивается в длине и образует перегородку, которая разделяет дочерние клетки. В процессах, элонгации строительства муреинового слоя и образовании септы, необходим синтез муреина, осуществляющийся различными системами. В элонгации принимают участие так называемые пенициллинсвязывающие белки (РВР). РВР la, 1Ь и 3 полимеризуют гликановые цепи и образуют перекрестные сшивки при транспептидации. РВР 4, 5 и 6 имеют карбоксипептидазную активность, шдролизуя D — аланил—D — аланиновые связи присутствующие в пентапептидном предшественнике и вновь образованных цепях муреина. РВР 4 так же действует как эндопептидаза, гидролизуя соединение между D — аланином и аминогруппой D —изомерного центра DAP. Кроме того, в Е. coli имеются нечувствительные к пенициллину полимеразы и пептидазы.

Септация очень сложный процесс включающий как временной, так и топологический контроль. В этом процессе должны образоваться два совершенно новых полярных колпачка муреина, и муреиновый слой двух дочерних клеток должен разделиться на две части без потери целостности клетки. В процессе образования септы участвуют около 15 генов (Bonachie, W.D., et al. 1984.) Продукт гена ftsZ образует кольцо вокруг внутренней стороны клеточной стенки во время деления. Связанные с мембраной белки (продукты генов ftsL, I, W, Q, А и др.) обладают ферментативными активностями транспептидаз . и трансгликозилаз. Работа этих ферментов приводит к образованию двухслойной септы в месте деления клетки. Расщепление связей между двумя комплементарными слоями завершает процесс деления.

1.3. Цштошлазматчкесщм мембраиа.

Во внутренней мембране содержится около 75 % клеточных фосфолшхидов (остальные найдены во внешней мембране), и от 6 до 9 % общего белка (около 60% белка оболочки клетки). В ней локализованы белки включенные в электронный транспорт, трансдукцию энергии, синтез фосфолипидов и пептидогликана, активный транспорт, синтез липополисахаридов, подвижность, хемотаксис и другие.

OoL Лшишдшме жомшошентЫо Главная функция липиднош бислоя цитоплазматической мембраны, это гидрофобный барьер для внутриклеточных белков и молекул. Кроме того, мембрана должна обеспечивать функционирование транспортных систем, и белков включенных в биоэнергетические и биосинтетические реакции.

Барьерная функция цитоплазматической мембраны в основном зависит от физического состояния липиднош бислоя. фосфолипидный бислой претерпевает обратимые изменения состояния в зависимости от температуры и состава. Фазовые изменения фосфолипидов могут происходить в очень узком диапазоне температур (1—2°С) в модельных бислоях образованных из одного вида синтетического фосфолипида. В биологических мембранах, таких как цитоплазматическая мембрана Е. coli,. фазовый переход происходит в широком интервале температур (10 —20°С) (Kleenian.W., et al. 1974). Это связано с большим разнообразием классов фосфолипидов содержащихся в мембране. L3.2. Белжовые кошммшешгем.

Цитоплазматическая мембрана содержит весь аппарат необходимый для переноса энергии и окислительного фосфорилирования (Ingledew, W.S., and R. К. Poole. 1984.). Он включает в себя аэробную дыхательную цепь и АТФ — синтазу, а так же белки транспорта электронов, работающие в анаэробных условиях. Главная особенность респираторной системы — ее модульность. Обнаружены модули следующих типов: ферменты, которые окисляют субстраты такие как, КАОЫ, В —лактат или сукцинат и восстанавливают квинон; ферменты окисляющие квинон и восстанавливающие водорастворимые конечные акцепторы электронов, такие как, кислород, фумарат или нитрат; АТф — синтаза и другие белки, необходимые для переноса субстратов с использованием протон — движущей силы.

Энзиматические активности связанные с ферментами первой группы исследуют при помощи водорастворимых оксидантов, таких как дихлорфенолиндофенол или феррицианид. Эти активности называют дегидрогеназньши. Они не зависят от присутствия других компонентов дыхательной цепи. Дешдрогеназы, в основном, это флаво— или металлофлавопротеины. Ферменты второй группы это металлопротеины с различными простетическими группами, включая геммы. Они объединяются в единую сложную систему. В этой системе обнаружено около 20 различных ферментов, индуцибельных или экспрессирующихся конститутивно. Белки этой системы физически разобщены. Они функционально связаны через маленькие диффундирующие молекулы, такие как убихинон —8 и менаквинон — 8 (выполняют функции переносчиков электронов внутри мембраны). Окислительное фосфорилирование дешдрогеназами и терминальными редуктазами, находящимися в цитоплазматической мембране, охватывает очень большую группу разнообразных субстратов доступных при различных условиях роста.

Цитоплазматическая мембрана образует гидрофобный барьер для большинства гидрофильных молекул. Проникновение большинства таких молекул в клетку требует специфических белков внутренней мембраны, которые осуществляют специфический транспорт. Некоторые белки просто облегчают диффузию субстрата через мембрану (Lin, Е.С. 1976.), другие осуществляют активный транспорт веществ. Для последних обнаружено три механизма транспорта: активный транспорт, движущая сила которого хемоосмотический градиент (например транспорт лактозы (Qveratti, P., and J. Wright. 1983.)); транспорт зависящий от связывающихся с субстратом белков (перенос шстидина (Ames, G., and С. Higgins. 1983.)); и группа транслокации (фосфоенолпируватзависимая фосфотрансферазная система Сахаров PTS (Saier, М. 1977).

Бактериальный хемотаксис еще одна функция внутренней мембраны близкая к транспорту. Белки отвечающие за чувствительность к химическому градиенту (сенсоры) и белки движущие флагелы (флагелярные моторы) являются мембранными белками. Не ясно какие клеточные сигналы индуцируют клеточные моторы, но известно около 30 генов, мутации в которых, вызывают дефекты в подвижности клетки (Parkinson, J. S., 1993).

1.4. Першшлазма ш секрещшш белков.

Периплазматическое пространство лежит между внутренней и внешней мембранами. Из —за такого расположения оно вероятно представляет собой несколько микропространств разделенных мембранами и пептидогликановым слоем. Периплазматические белки, локализованные внутри этих регионов, выполняют важные функции в процессинге метаболитов, их транспорте, и биогенезе клеточной оболочки. Периплазматические полисахариды и другие маленькие молекулы защищают клетку от изменений осмотичности и ионного состава окружающей среды.

1.4.1. Структура теришплазматвстеског© пространства.

Внутренняя и внешняя мембраны имеют толщину примерно 7.5 nm и находятся на расстоянии около 14 nm друг от друга, что составляет толщину периплазмы. На расстоянии 7.5 nm от внутренней стороны внешней мембраны находится пептидогликановый слой, толщина которого около 2 um. Далее идет внутренняя область периплазмы толщиной около 4 nm. Эта структура усложнена наличием зон адгезии между внешней и внутренней мембранами, где находятся участки, через которые проходят вещества, необходимые для строительства внешней мембраны. В растущих клетках таких участков от 200 до 400. Их совсем нет в бактериях находящихся в стационарной фазе (Bayer, М.Е. 1979).

Физиологические и электронно — микроскопические измерения показали, что периплазматическое пространство Е. coli занимает от 20 до 40% общего объема клетки при нормальных условиях роста. Установлено, что объем периплазмы и осмотичность зависят от среды в которой находится бактерия. Периплазма и цитоплазма изоосмотичны. Осмотическая сила этих двух компонентов в воде составляет около 170 mosM и около 300 rnosM в минимальной среде М63 (Stock,J.B.,et al. 1977). Колебания внутриклеточной осмотичности происходят за счет изменения объема клетки, а не за счет потери внутриклеточных компонентов.

L4.2. Бели мерппшшзмы.

Белки периплазмы вероятно располагаются дифференцировано в периплазматическом пространстве, поскольку имеются белки связанные с внешней, внутренней мембранами и пешгидогликановым слоем, а так же свободно диффундирующие внутри этого пространства. Известные периплазматические белки можно разделить на несколько групп: связывающие белки (функция — транспорт маленьких молекул и хемотаксис; функционирующие в биогенезе клеточной стенки; инактивирующие токсичные молекулы; другие белки (не входящие в названные группы).

Периплазматические связывающие белки составляют относительно гомогенную группу, которая наиболее интенсивно изучена. Многие связывающие белки для

Сахаров, аминокислот, витаминов, и ионов охарактеризованы. Их относительно много и они имеют большое сродство к своим субстратам (Km= Ю-7— Ю-6 М). Связывающие белки взаимодействуют с их внутримембранными пермеазами, способствуя транслокации маленьких молекул через внутреннюю мембрану.

Периплазматические белки, подобно другим оболочечным белкам, имеют предшественников, содержащих сигнальный пептид (20 — 40 аминокислот) на N —конце, который отрезается в процессе экспорта белка в периплазму. Сигнальные пептиды имеют по крайней мере три общие черты: на N —конце имеется одна или две положительно заряженных аминокислоты; за N —концом следует 14 — 20 нейтральных аминокислот (гидрофобное ядро); далее имеется структура (примерно 6 аминокислот) образующая обратное вращение и заканчивающаяся последовательностью АХВ: где В— Ala, Gly или Ser; А— Ala, Gly, Ser, Leu, Val, Ile (Chou, P.Y., and G.D.Fasman. 1978).

L4.3. Машшгашш экспорта.

Существование сложной машины экспорта, необходимой для секреции многих белков оболочки, обнаружено биохимически и генетически. Системы секреции белков In vitro были получены в экспериментах по синтезу белка in vitro и секрецией в инвертированные пузырьки, приготовленные из мембран (Muller, M., and G.Blobel. 1984.).

Было ' идентифицировано и очищено два фермента, участвующих в процессе секреции из внутренней мембраны Е. coli. Их гены картированы, клонированы и секвенированы. Сигнальная пептидаза I (ген lepB), оказалась ферментом, общим для процессинга белков внешней, внутренней мембраны и периплазмы. Сигнальная пептидаза II (ген IspA) (липопротеинспецифическая сигнальная пептидаза) является ферментом, процессирующим липопротеиновые предшественники (Yamada,H.,et al. 1984). Сейчас выявлено более 20 генов, продукты которых так или иначе участвуют в процессе секреции.

L5. Белки участвующие в сиещшфшгаесвшм трашстюрте.

Бактерии содержат стереоспецифичные системы транспорта различных метаболитов, которые могут так же использоваться фагами для осуществления инфекции и бактериоцинами для проникновения в клетку. Причем фаги и колицины могут использовать одну и ту же систему для проникновения в клетку.

Все транспортеры можно разделить на три типа: белки устойчивости к медикаментам MFS — суперсемейство ( major facilitator superfamily) (Marger, M.D., and M.H.Saier. 1993.); экспортеры белков или пептидов ABC — суперсемейство ( ATP —binding cassette) (Higgins, C.F. 1992); и экспортеры медикаментов, катионов и олишсахаридов RND — семейство (the heavy metal resistance/nodulation/cell division family) (Saier, M.H., 1994). Транспортные системы этих типов функционируют вместе с белками находящимися во внутренней мембране и выступающими в периплазму, где они возможно взаимодействуют с внешней мембраной (Lewis, К. 1994.).

1.5.1. Вгаешшнемембрашвые трашютортеры.

Хотя внешняя мембрана является барьером для проникновения неполярных веществ, она хорошо преодолевается маленькими полярными молекулами, поскольку в ней содержится большое количество диффузных каналов и специфических транспортных систем. Свойства проницаемости этих транспортных систем (ограниченные размером и зарядом) определяют диапозон веществ, которые могут быть использованы организмом. Большинство субстратов проходит через внешнюю мембрану к их специфическим транспортным системам в цитоплазматической мембране при неспецифической диффузии через каналы образованные поринами (Benz, R.1988). В Е. coli К12 относительный уровень поринов OmpF и ОтрС изменяется в зависимости от осмотичности среды и температуры. Эти белки агрегируют как тримеры, образуя водопроницаемые поры с эффективным диаметром 1.2 и 1.1 нм, соответственно. Транспортные свойства поринов были исследованы как посредствам реконструированных липидных пленок или пузырьков, так и при сравнении скорости гидролиза Ь — лактамов периплазматическими Ь — лактамазами в интактных клетках (М1ка1с!о, Н. 1989).

Порин РЬоЕ, синтез которого индуцируется при голодании по фосфору, пропускает преимущественно органофосфаты и другие анионы. Все порины функционируют как каналы и пропускают вещества только по градиенту концентрации.

Транспорт другого рода происходит через специфические каналы. Наиболее хорошо изученным белком участвующим в этом типе транспорта является мальтопорин ЬатВ, который участвует в транспорте мальтодекстринов. ЬатВ усиливает транспорт мальтозы при низких концентрациях и необходим для переноса мальтодекстринов с четырьмя и более гликозильными единицами, которые являются слишком большими для прохождения через каналы образованные поринами. ЬатВ специфически связывает как мальтодекстрины, так и периплазматический мальтозосвязывагощий белок, Ма1Е. Взаимодействие ЬатВ с Ма1Е необходимо для эффективного прохождения мальтодекстринов через внешнюю мембрану и вероятно блокирует прохождение через нее других веществ. Нет доказательств того, что этот процесс требует затрат энергии. Аналогичный процесс происходит при транспорте нуклеозидов системой Тзх.

Внешнемембранные транспортные белки третьего класса отличаются от поринов тем, что они связывают субстраты с высокой специфичностью и осуществляют активный транспорт метаболитов через ■ внешнюю мембрану. Членами этого класса транспортеров и их субстратами являются РерА (энтеробактин железа), ИшА (ферихромное семейство седерофоров), РЬиЕ капроген железа и родоторуловая кислота), lutA (аэробактин железа), FecA (дицитрат железа), Cir (комплексы железа с катехолами), и BtuB ( витамин BJ2 и другие кобаламины). Кроме физиологической функции транспорта, большинство из этих 'белков внешней мембраны выполняют функцию рецепторов для бактериофагов и колицинов. Специфические белковые комплексы энергизуют активный транспорт, осуществляемый этими белками. ( Kadner, R.J. 1990).

1.5.2. ABC трашгапюртерм,, Известно около 50 ABC транспортеров. Обычно для их функционирования необходима энергия гидролиза АТФ которая затрачивается на протаскивание субстрата через мембрану против градиента концентрации. Каждый ABC транспортер весьма специфичен к субстрату. Охарактеризовано большое количество транспортеров для • различных классов веществ, таких как аминокислоты, сахара, ионы неорганических веществ, полисахариды, пептиды, и даже белки. Некоторые ABC транспортеры являются системами импорта, тогда как другие системами экспорта. Не обнаружено ни одной системы работающей в обоих направлениях. ABC транспортеры требуют функционирования многих доменов специфически организованного белка. Типичный транспортер состоит из четырех доменов связанных с мембраной. Два из них весьма шдрофобны, и каждый состоит из шести встроенных в мембрану сегментов. Эти домены образуют пору, через которую субстрат проходит мембранный барьер и, как полагают, они определяют субстратспецифичность. Другие два домена, расположенные на внутренней стороне мембраны, связывают АТФ и используют ее энергию для осуществления процесса транспорта. При сравнении аминокислотной последовательности трансмембранных доменов одного транспортера с такими же доменами другого не обнаруживается каких бы то ни было значительных шмолошй. АТФ — связывающие домены транспортеров являются наиболее консервативными. При сравнении различных транспортеров наблюдается от 30 до 50% гомологии в этих участках. (Higgins, C.F. 1992). Первыми охарактеризованными ABC транспортерами были протеин — зависимые транспортеры грамотрицательных бактерий. Свойством, отличающим их от других систем активного транспорта было свойство хладочувствительности при осмотическом шоке. В таких условиях из периплазмы терялись специфические белки связывающиеся с субстратом. Последующие генетические исследования показали, что эти периплазматические белки абсолютно необходимы для функционирования многих транспортных систем. Связывающиеся белки имеют молекулярные массы от 25 до 59 кДа и не обнаруживают значительных гомолошй между собой. Некоторые из них были кристаллизованы и их трехмерная организация изучена. Все они имеют схожую структуру с двумя глобулярными доменами соединенными участком, в котором расположен сайт связывания с субстратом. Периплазматические белки служат начальными рецепторами для транспорта, перенося субстрат к компонентам связанным с мембраной. Важно, что специфичность связывания и сродство, измеренные in vitro, для очищенных белков находятся в хорошем соответствии с характеристиками in vivo транспортных процессов, из чего следует, что связывание белков самая медленная ступень транспорта (Miller, D.M.,et al. 1983). Белки претерпевают конформационные изменения при связывании с субстратом (Мао,В., et al. 1982). Эти конформационные изменения дают возможность периплазматическому связывающему белку взаимодействовать с мембранными белками, что не происходит в отсутствии субстрата (Prossnitz, Е., et al. 1989).

Хотя периплазматические компоненты требуются для функционирования транспортера с которым они связаны, они не участвуют в самой транслокации субстрата через мембрану. Многие ABC транспортеры, включая все известные эукариотические системы, не требуют эквивалентного компонента. Кроме того, можно изолировать мутанты по бактериальным системам переноса, которые функционируют без периплазматическош компонента (Speiser, D. М., & G. F. Ames 1991). Таким образом, периплазматические белки лучше рассматривать как вспомогательные компоненты специфической адаптации. L®» Транспорт аминокислот» В зависимости от используемой в процессе переноса вещества через мембрану энергии, наличия или отсутствия специального транспорта механизмы транспорта АК можно разделить на 3 группы: 1) простая (пассивная) диффузия; 2) вторичный транспорт; 3) первичный транспорт.

При простой диффузии движение АК происходит по градиенту ее концентрации. Так транспортируются в основном гидрофобные АК, например, триптофан, фенилаланин (Chakrabarti, & Deamer, 1992.) и хуже изолейцин и лейцин (Driessen et al. 1987). Перенос АК по механизму простой диффузии может осуществляться как в клетку, так и из клетки, и в некоторых случаях служит для выделения гидрофобных АК из цитоплазмы.

Вторичный транспорт АК осуществляется за счет электрохимической энергии самой АК или сопряженных веществ посредством одного белка — переносчика. Системы вторичного транспорта не инактивируются в условиях осмотического шока, как правило обладают низким сродством к субстрату, высокой скоростью переноса. Вторичный транспорт АК осуществляется по трем механизмам: симпорта, антипорта и унипорта.

При симпорте белок — переносчик транспортирует АК по направлению движения сопряженного субстрата. При этом сопряженный субстрат, чаще всего ионы Na+ или Н+, движутся по градиенту концентрации. Это наиболее часто встречающийся механизм вторичного транспорта. С помощью симпорта может осуществляться транспорт положительно заряженных АК, например, аргинина и лизина, отрицательно заряженных, таких как глутамат и аспартат, и нейтральных; пролин и разветвленные АК (Poolmam and Koning, 1993).

При антипорте AK переносится в направлении, противоположном движению сопряженного субстрата. Такие системы встречаются относительно редко. В качестве примеров можно привести аргинин/ орыитиновый антипорт (Verhoogt et al. 1992), гистидин/ мстаминовый антипорт ( Poolman, and Koning 1993), лизин/ аланиыовый антипорт ( Broer, and Kramer 1990). Транспорт субстратов с помощью антипорта в некоторых случаях может даже способствовать накоплению энергии. Например в случае гистидин/ гистаминовош обмена, описанного выше, происходит движение положительного заряда из клетки, а следовательно, восстановление ее электрохимического потенциала.

При унипорте переносчик транспортирует только один субстрат по направлению градиента его концентрации. В качестве примера можно привести транспорт лизина и аргинина в В. stearothermophilus (Heyne et al. 1991). Этот механизм называют еще "облегченной" диффузией и относят к вторичному транспорту, так как в отличие от "простой" диффузии, он предполагает наличие специфического транспортера. В настоящее время у различных видов бактерий известно несколько десятков белков —переносчиков, осуществляющих вторичный транспорт. Предполагается, что, как и в случае "простой" диффузии, транспорт с помощью белка — переносчика способен обеспечивать движение субстрата как внутрь клетки, так и наружу.

При первичном транспорте перенос АК осуществляется комплексом состоящим из нескольких белков за счет химической энергии АТФ. Одним из белков комплекса является связывающий белок, поэтому системы первичного транспорта часто называют BPD — системами (binding protein —depending). Помимо связывающего белка, локализующегося в периплазме, в переносе АК этой транспортной системой участвуют также два гидрофобных мембранных белка — пермеазы и два гидрофильных белка, осуществляющих гидролиз АТФ. Четыре последних белка ассоциированы между собой в мембранный комплекс, причем белки, шдролизующие АТФ, находятся с внутренней стороны цитоплазматической мембраны. Некоторые BPD —системы включают также дополнительный белок — специальный порин, который облегчает прохождение АК через внешнюю мембрану. Системы первичного транспорта характеризуются высоким сродством к субстрату, относительно невысокой скоростью переноса и чувствительностью к осмотическому шоку. В большинстве случаев, все компоненты каждой из первичных систем транспорта кодируются генами, организованными в один оперон. Примерами этих систем могут служить транспорт мстидина (Higgins, & Ames, 1981) и ЛАО —система для лизина, аргинина, орнитина (Urban, & Gelis, 1990).

L®.L Иотюшьзованше разлитых систем ддяз трашсшорта одшой АК»

Изучение транспорта у бактерий показало, что одна и та же АК может транспортироваться несколькими транспортными системами. Это разнообразие определяется доступностью данной АК из среды, ее значением для клетки, соотношением энергетических затрат на ее транспорт и биосинтез, и рядом других причин. Так, например, вторичная система транспорта разветвленных АК у Е. coli —ЛИВ —II обладает низким сродством к субстрату и создает определенный базальный уровень включения лейцина, изолейцина и валина. Соответственно, она не подвержена значительной регуляции. Система ЛИВ —I, напротив, является первичной системой с высоким сродством к субстрату и регулируется лейцином. Когда внутриклеточный пул лейцина снижается, происходит экспрессия ЛИВ —I (Templeton and Savageau, 1974). Для транспорта пролина у Е. coli существуют 3 системы (Wood, 1989), для транспорта глутамата и аспартата, по крайней мере, 5 различных систем (Kramer, 1994).

Escherichia coli, растущая в богатой среде, синтезирует две L—серии — деаминазы, L —SD1 и L —SD2, кодируемые очень схожими генами sdaA и sdaB (Shao.Z.Q., E.B.Newman 1993). Более изученный из них, sdaA, экспрессируется так же в минимальной среде. Регуляция его экспрессии изменяется в зависимости от условий роста, и контролируется, по крайней мере, одним глобальным регулятором, лейцин/LRP регулоном (Newman, Е. В., et al. 1992). L —SD2, продукт гена sdaB, синтезируется только в богатой среде (Su, Ы., Е.В. Newman 1991). Недавно показано, что его экспрессия подвержена контролю САР и сАМР, тогда как экспрессия sdaA не зависит от этой системы, что указывает на участие sdaB, главным образом, в процессах деградации и накопления энергии.

Для использования серина, как основного источника энергии, бактерии необходима эффективная транспортная система проникновения его в клетку. Главная система транспорта серина энергизуется градиентом ионов натрия и переносит как серии, так и треонин. Перенос серина в этой системе является треонин — чувствительным. Вторая, -недавно описанная, система переноса является много более специфичной для L—серина, как движущая сила в ней используется градиент протонов, и нет иншбирования треонином (Kayahara,T.,et al. 1992). Newman и Shao секвенировали новый ген sdaC, находящийся выше sdaB по направлению транскрипции, и показали, что эти два гена считываются с общего промотора и составляют оперон. В клетках, несущих плазмиду с геном sdaC транспорт серина не иншбируется треонином. Предположили, что ген sdaC входит в специфическую систему переноса серина, которая энергизуется электрохимическим потенциалом протонов. Этот оперон, состоящий из двух генов, имеет сходство с трехгенным опероном tdcCAB, в котором tdcC кодирует транспортер треонина и серина, tdcA — активатор и tdcB кодирует треониндеаминазу (Wu,Y., P. Datta 1992). На экспрессию sdaC влияет, по крайней мере, три глобальных регулятора: Сгр, IHF и Lrp. Гены sdaC В не экспрессируются в минимальной среде, содержащей глюкозу (Shao, Z.Q.,et al. 1994).

Таким образом, многообразие транспортных систем позволяет клетке получать из окружающей среды необходимые ей питательные вещества, затрачивая при этом минимум энергии.

L7o Трашсшорт вштамшнш ®12

Кобаламины используются Е. coli для синтеза метионина, утилизации этаноламина и синтеза модифицированных оснований tRNA (Kadner, R.J. 1990). Витамин Bj2 переносится в клетку при помощи чувствительной к осмотическому шоку транспортной системы, которая требует внешнемембранного рецептора (Holroyd, C.D., and C.Bradbeer. 1984.)

Рецептор витамина В12 (BtuB белок) исключительно важен для транспорта при низких концентрациях экзогенного кобаламина (<Ш~7 М; Kd BtuB для Bi2 равна 0.3 nM; (Kenly, J.S.,et al. 1978.)). Ген, кодирующий этот белок, картирован на 89 мин. хромосомы Е. coli (Bassford, P.J. & R.J. Kadner 1977). Он клонирован и секвенирован.

Комплексы седерофоров железа и Bi2 переносятся против градиента концентрации системами, для работы которых требуется затрата энергии. Для транспорта кобаламина необходимы две системы активного транспорта: одна во внешней мембране (протон—движущая сила), вторая в цитоплазматической (поставщик энергии пул АТФ). Большинство транспортных систем (кроме фосфотрансферазных систем Сахаров) требуют одного источника энергии (Kadner, R. J. 1990).

Продукт гена tonB также включен в перенос кобаламина (Reynolds, P.R., et al. 1980). Ыуклеотидная последовательность этого гена определена и он локализован на 28 мин. генетической карты Е. coli. Транспорт ТопВ — зависимых субстратов через цитоплазматическую мембрану происходит по механизму, аналогичному транспорту гистидина, мальтозы (Ames G.F.L.1986) и т. д. Эти однонаправленные транспортные системы состоят из, по крайней мере, четырех белков: двух весьма гидрофобных мембранных белков, одного или двух периферальных мембранных белков и периплазматическош субстратсвязывающеш белка (системы транспорта цитрата железа —fee и энтерохелина железа — /ер). Система белков участвующих в ТопВ — зависимом транспорте субстратов имеет много общего с описанной выше, но не идентична ей (существование специфического субстратсвязывающеш периплазматическош белка остается под вопросом). В системе fhu имеется только один интегрированный мембранный белок, FhuB, который в два раза тяжелее его гомологов. Идентифицированы только два Btu белка находящихся во внутренней мембране: BtuC имеющий сходство с половиной FhuB и BtuD являющийся нуклеотид — связывающим компонентом (Kadner, R.J. 1990). Гены ЫиСED, которые локализованы на 37.7 мин. хромосомы, кодируют компоненты транспортной системы кобаламина, находящиеся во внутренней мембране. В мутанте по ЫиС витамин накапливался в периплазматическом пространстве (De Veaux L. С., et al. 1986).

Периплазматический белок (M 22.000) связывает кобаламин с Kd 5пМ, что указывает на возможное включение его в энергозависимую стадию транспорта В12. Он частично очищен. Другими доказательствами его участия в энергозависимой стадии переноса кобаламина является чувствительность транспортной системы к осмотическому шоку и арсенат — чувствительность переноса. Оказалось, что этого белка только три копии на клетку (White, J.C., et al. 1973). В транспорт витамина В12 (цианокобаламин) в Е. coli включен ряд компонентов клеточной стенки. Кроме ТопВ в этот процесс вовлечены рецептор на внешней мембране, периплазматическжй кобаламин — связывающий белок, и два белка, BtuC ж BtuD, отвечающих за транспорт через цитоплазматическую мембрану. Современная модель высокоэффективного транспорта включает следующие этапы: на первом этапе кобаламин связывается с рецептором витамина В12г BtuB (энергонезависимая стадия), далее переносится через периплазму при помощи ТопВ и предполагаемого кобаламин — связывающего белка и окончательно переносится через цитоплазматическую мембрану при помощи продуктов генов МиСЕО оперона (для этих последних стадий требуется энергия) (Riox, C.R., RJ. Kadner.1989). Bradbeer. С. et al. (1986) показали, что связывание кобаламина с BtuB требует присутствия кальция, особенно при низких рН. При нейтральных рН, связывание и транспорт В12 иншбировались после обработки клеток ЭДТА и восстанавливались при добавлении кальция. Прямое участие кальция в транспорте В]2 показали Bradbeer, С., and А. Gudimmdsdottir (1990) получив мутанты, по гену btuB, связывающие кобаламин при концентрациях кальция Ю-5 М, тогда как в родительском штамме связывание происходит при Ю-7 М Са2+. Они так же обнаружили явление кобаламинзависимого связывания кальция на BtuB. Неизвестно влияет ли связывание кальция на конформацию BtuB или связывание и освобождение иона рецептором — часть процесса транспорта.

Система транспорта кобаламина обнаруживает много интересных свойств. В ней используется минорный белок внешней мембраны, который имеет высокое сродство к субстрату и переносит его через мембрану. Перенос требует затраты энергии, которая поставляется различными накапливающими энергию белками (ТопВ —ExbB —ExbD, TolA—TolQ — TolR и возможно другие системы). Источником энергии для транспорта кобаламинов через внешнюю мембрану является перенос протонов через внутреннюю. Это необычное свойство, поскольку активный транспорт осуществляется при переходных контактах белок —белок, с энергизутощим белком, работающим в нескольких системах. Как происходит энершзация остается неясным.

2 о Бажтершальшые беляш шотользуемые фагами ш колжщриамш для трожшпшовеншш в клешу» 2.L Траиысшортг колшшртгоВо Известно много белков, которые необходимы для нормальной фаговой инфекции и успешного транспорта колицинов к их мишеням. Поэтому при изучении механизмов проникновения колицинов в клетку проясняются детали механизмов адсорбции фагов и наоборот.

Сегодня исследование колицинов является активной областью молекулярной генетики и биофизики мембран. Колицины классифицируют в соответствии с устойчивостью к ним различных мутантов, что отражает скорее свойства бактерий, чем колицинов. Колицины — белки с молекулярными массами от 5х104 до 8х104. Показано, что гибель клетки от колицина происходит без участия дополнительных молекул (эффект действия только колицина). Современная модель ранних этапов действия колицинов включает: прикрепление к специфическим рецепторам, за которым следует разрушение большинства молекул колицина, в то время как, небольшая часть проходит через внешнюю мембрану и достигает цитоплазматической. Эти немногие молекулы вероятно атакуют рецепторы расположенные в так называемых сайтах Байера (Bayer, М. 1979), где цитоплазматическая и внешняя мембраны находятся в соприкосновении. Все колицины, невзирая на их биохимическое действие, адсорбируясь на деэнершзованных бактериях не повреждают их, но при реэнершзации происходят повреждения вызванные колицинами (Jetten, А.М., and M.E.R. Jetten. 1975). Это может быть следствием необходимости наличия трансмембранного потенциала для внедрения колицина в цитоплазматическую мембрану, как это показано для некоторых эндогенных бактериальных белков (Date, Т., et al. 1980).

Биохимические эффекты колицинов на чувствительные бактерии можно разделить на три класса (Nomura, М. 1964). Колицины одного класса, например Е2, вызывают повреждения ДНК; второго класса (колицин ЕЗ и клоацин DF13) синтез белка; третьего класса (Е1 и 1а) повреждают

2о2о ТотВ и TolA зависимые транспортные системы и импорт макромолекул в Escherichia colL Escherichia coli имеет по крайней мере две энергозависимые системы переноса, через которые транслощирутотся субстраты большого размера концентрация которых в среде низка. Перенос колицинов группы В, сидерофоров железа, витамина В12 и инфекция фагами, такими как Т1 и ф80 осуществляется через систему TonB — ЕхЬВ — ЕхЬО, перенос колицинсв группы А и инфекция нитчатыми фагами М13, £1 и fd происходит через систему TolA — TolQ — TolR. Перенос начинается со связывания макромолекулы со специфическими рецепторами на внешней мембране. Для дальнейшего переноса (необратимой адсорбции) требуется затрата энергии. В роли поставщиков энергии для транспорта веществ через внешнюю мембрану выступают белки внутренней мембраны ТопВ и TolA (Braun V., and С. Herrmann. 1993).

2o2„L Свойства мутантов ппо гену fern®.

Мутанты по гену tonB имеют множество характерных фенотипических свойств: плохой рост, чувствительность к хрому, высокую экскрецию энтерохелинов, устойчивость к фагам Т1 и ф80, многим колицинам, дефекты в транспорте комплексов седерофоров железа и кобаламинов. Все эти фенотипы можно • объяснить утратой механизма поставки энергии транспортным белкам внешней мембраны. Оказалось, что для ТопВ — зависимых систем транспорта необходима энергия электрохимического потенциала (протонный градиент через цитоплазматическую мембрану) (Kadner, R.J. 1990). транспортеров показало, что все они имеют весьма консервативный участок (семь аминокислот) около N конца, который назвали ТопВ —боксом. Мутации в этом участке приводят к потере белками — рецепторами ТопВ — зависимых транспортных функций (Pressler, et al. 1988). ТопВ —бокс характеризует следующая аминокислотная последовательность: кислая — Thr — гидрофобная — гидрофобная — Val — полярная — Ala. Оказалось, тем не менее, что в этом консервативном участке можно заменять многие аминокислоты без ущерба для функции. Простейшим объяснением этого феномена является то, что ТопВ —бокс необходим для запаса энергии способом не требующим строгой комплиментарное™ аминокислотных цепей, а взаимодействием вторичных структур.

2,2.3. Участие белков ЕхЫВ и ExlbD в Той® зависимом транспорте,

В то время, как роль ТопВ в транедукции энергии очевидна, функция белков ЕхЬВ и ExbD не совсем ясна. ЕхЬВ расположен на 65 мин. хромосомы Е. coli первым из двух генов, ехЬВ и exbD (Eick — Helmerich,К., and V.Braun. 1989). ExbB является белком с мол. массой 26 кДа, который пересекает цитоплазматическую мембрану три раза, причем основная его часть находится в цитоплазме (Kampfenkel, К., and V.Braun. 1993). ExbD является белком цитоплазматической мембраны с мол. весом 17.8 кДа. Он имеет один трансмембранный регион на N — конце и в основном находится в периплазматическом пространстве (Kampfenkel,К., and V. Braun. 1992). Предполагают, исходя из такого

2.2. Взаимодействие трашгатортеров и ТотВ» аминокислотных последовательностей ТопВ — зависимых

Зй о топологического расположения, что эти белки могут функционировать, как сигнальная молекула трансдукции. Процесс регуляции транскрипции этих генов не ясен.

В мутантах ехЬЪВ, белок ТопВ нестабилен (Karlsson, M.,et al. 1993). Показано, что существует, по крайней мере, два различных взаимодействия между ЕхЬВ и ТопВ: промежуточное чаперон — подобное взаимодействие, которое осуществляется в цитоплазме и взаимодействие, включающее трансмембранный сегмент ТопВ, при котором вероятно образуется стабильный комплекс в мембране, необходимый для функционирования ТопВ и его защиты от протеолизиса ( Ahmer, В.М.М., et al. 1995).

2.2.4. Продукты гевгав toi и импорт макромолекул в £ coli.

Получен ряд мутаций в генах, названных toi, которые делают бактерию нечувствительной к колицинам группы А, при нормальном связывании колицинов на их рецепторах и предотвращают инфекцию некоторыми нитчатыми фагами. Основными белками данной транспортной системы являются продукты генов toîQ, R и А. Остальные белки Toi необходимы для транспорта отдельных колициов к их мишеням. Например TolC, а не ТоШ, требуется для переноса колицина El, но он не нужен для инфекции клетки нитчатыми фагами. Мутации в toTL необычны тем, что сообщают бактерии устойчивость к отдельным колицинам группы А и В. Это происходит из —за возможного участия TolZ в установлении электрохимического протонного градиента. Мутанты по генам toi имеют ряд плейотропных фенотипов (сверхчувствительность к SDS, DOC, EDTA и определенным антибиотикам). Многие из этих фенотипов объясняются повреждением мембран. Мутанты по TolC показывают дополнительные фенотипы (секреция хемолизина из клетки, сегрегация хромосомы, нарушение контроля продукции OrnpF (R.E. Webster. 1991).

Гены toîQ, R, А и В были клонированы и секвенированы. Они локализованы на 17 мин. хромосомы и расположены в следующем порядке: tolQ, R, А и В. Ген tolC картирован на 66 мин. Продукты этих генов идентифицированы и локализованы внутри клетки. TolQ является мембранным белком с мол. весом 25.5 кДа. TolR (15.5 кДа) вероятно является мембранным белком. TolA (44.2 кДа) — мембранный белок, который имеет, как минимум, три функциональных домена. N —концевой домен (34 аминокислоты) имеет мембрансвязывающий регион, который связан с внутренней мембраной. Оставшаяся часть локализована в периплазме. С —концевой домен (около 120 аминокислот) требуется для функционирования TolA и третий домен, образующий длинную L —спираль, соединяет функциональную часть с встроенным в мембрану доменом. Последовательность folB региона имеет только одну рамку считывания, но оказалось кодирует два белка. Больший (TolB) содержит потенциальный участок связывания с мембраной и связан с ней. Меньший (TolB*) локализован в периплазме. TolC (52 кДа) выделен из внешнемембранной фракции. Импорт макромолекул через систему Toi включает: (I) связывание макромолекулы на специфическом внешнемембранном рецепторе, (II) взаимодействие этого комплекса с белками транспортной системы, (III) транспорт молекулы. Последний этап может состоять из нескольких ступеней, на которых функционируют другие белки (возможно не идентифицированные пока продукты toi генов). Текучесть мембраны играет важную роль в транспорте определенных колицинов. При температурах ниже 15° С колицины адсробируются на рецепторах, но не транслоцируются через мембрану J.P., et al.

2.2.5. Механизм транспорта макромолекул системой ToL При сравнении последовательностей колищинов, перенос которых зависит от системы Toi, обнаружили G —богатый пентапептид в позиции эквивалентной " ТопВ — боксу" для ТопВ зависимых колицинов и рецепторов. Он состоит из аминокислот DGSGW и называется "TolA—бокс". Этой последовательности не найдено в рецепторах Toi — зависимых систем переноса, что свидетельствует о различном механизме переноса макромолекул в системах Toi и Топ. Еще одним доказательством участия предполагаемого "TolA—бокса" в транспорте колицинов являются результаты работ по изучению инфекции клетки фагом fl. Белок III фага fl содержит последовательность EGGGS в двух местах, где она повторена четыре раза. Этот белок определяет устойчивость fl — инфецированных клеток к Toi — зависимым колицинам. Продукция кодируемого плазмидой N —концевого фрагмента (98 аминокислот), который содержит один из тандемных повторов, делает бактерию устойчивой к Toi — зависимым колицинам, но не к Топ — зависимым. Клетки становятся чувствительными к дезоксихолату, устойчивыми к fl, и освобождают Ь —лактамазу из периплазмы в среду Эти фенотипы являются типичными для toi мутантов. Предположили, что последовательность EGGGS белка III конкурирует с TolA—боксом колицинов, так что колицины оказываются неспособными взаимодействовать с TolA. Несмотря на функциональную схожесть между системами Toi и Ton, TolA действует отлично от ТопВ, что отражено так же в их различной структуризации в клетке (Pisl, H., and V. Braun. 1995).

2.2о@о Взаимозаменяемость белков Tom®=Exlb]B=ExlbD и ToHA-TolQ-ToliL TolQ и TolR имеют много гомологичных участков с ЕхЬВ и ExbD, соответственно. Это предполагает, что обе системы транспорта биополимеров Топ и Toi функционируют схожим образом и, что TolQ\ExbB и TolR\ExbD происходят от общих древних генов, которые дуплицировались и изменялись

-WOHÄCKÄS

41 fiey^APCTBSHM независимо, образовав современные гены tolQ\exbB и toIR\exbD. Мутанты по exbB exbD показывают остаточную чувствительность к колицинам группы В и становятся полностью устойчивыми после введения мутаций в tolQ toIR. Кроме того, мутанты exbB exbD более устойчивы к инфекции Т1 и ф80, но становятся полностью резистентными при введении мутации в toîQ. Этот результат указывает на функциональную близость между TolQ\ExbB и TolR\ExbD. Протеолитическая деградация клонированного на экспрессионной плазмиде ТопВ предотвращается при суперэкспрессии белков TolQ и ToIR, так же как и ExbB, что предполагает взаимодействие TolQ и ToIR с ТопВ. Стабилизация ТопВ белком ExbB наблюдается если белки кодируются с хромосомы, тогда как стабилизации ТопВ белком TolQ не наблюдается. Это не является неожиданностью, так как при нормальных физиологических условиях белки Toi и ТопВ — ExbB — ExbD образуют различные системы. Показано, что суперэкспрессия ExbBD делает двойной мутант по tolQR почти полностью чувствительным к колицинам группы А, а суперэкспрессия белков TolQR восстанавливает чувствительность мутанта exbBD к колицинам группы В. Но TolA не заменяет функции ТопВ и наоборот. Это свидетельствует о том, что в гетеролошчной комплементации ExbBD действует через TolA и TolQR через ТопВ (Braun, V., and С. Herrmann. 1993).

2.3. фаговая шшфекпряя.

Внешняя мембрана Е. coli создает барьер для гидрофильных субстратов с молекулярным весом более 700 Да. Рецепторные белки для фагов и колицинов облегчают прохождение определенных субстратов через внешнюю мембрану. Известно много агентов использующих один и тот же белок внешней мембраны: фаги Т1, Т5, колицин M и ферохромный хелат железа (tonA), колицины В, I, V и энтерохелин (feuA, feuB), фаг лямбда и мальтоза (larnB) и т.д. Резонно допустить, что белки внешней и внутренней мембраны исходно обнаруженные как рецепторы фагов и колицинов, включены в перенос субстратов, для которых мембраны представляют барьер по проницаемости. (Hantke, К. 1976.).

Изолировано большое количество лямбдоидных фагов, но обнаружено только три специфичности по кругу хозяев: ф80, 1 и 434. Рецептором ф80 является белок FtiuA, функционирование которого является ТопВ — зависимым. Он необходим для переноса комплексов ферихрома железа и адсорбции. Рецептором фага X является белок внешней мембраны LaniB, который функционирует как специфическая пора для диффузии мальтозы и мальтодекстринов через внешнюю мембрану. LarnB так же служит рецептором для производных X по кругу хозяев и некоторых других фагов. Штаммы Е. coli в которых отсутствует ОтрС устойчивы к лямбдоидному фагу 434. Очищенный белок ОтрС инактивирует фаги 434 и X virh434 (Hantke, К. 1978).

Штаммы устойчивые к фагу Т2 трудно изолировать. Они получаются с очень низкой частотой. Hantke (1978) идентифицировал белок QnipF, как рецептор для Т2 и предположил, что для успешной адсорбции так же требуется липополисахарид. Из — за низкой частоты встречаемости Т2 — устойчивых штаммов предположили, что устойчивость к бактериофагу Т2 может быть результатом двухступенчатого мутационного процесса. Концепция двухступенчатого мутационного процесса дающего устойчивость к Т2 находится в соответствии с гипотезой Lima, который предположил, что устойчивость к Т2 возникает из —за комбинации двух или более мутаций в хромосоме. Morona, BL, и U. Henning (1986) идентифицировали новый локус ttr который, подобно OnipF, кодирует рецепторную активность для Т2.

Оказалось, что ttr является известным геном fadh на 50 мин. карты Е. coli, который кодирует белок внешней мембраны, необходимый для роста на длинноцепочечной жирной кислоте олеате (Black, P.N. 1988).

Бактериофаг N4 является вирулентным фагом специфическим для Е. coli К12. Он уникален среди других содержащих ДНК фагов, поскольку транскрипция ранних генов его хромосомы независима от активности хозяйской РНК полимеразы. Каждый вирион содержит кроме двухцепочечной ДНК (72 т.п.н.), ДНК — зависимую РНК полимеразу (320 кДа) ответственную за транскрипцию ранних генов. Поэтому первым этапом инфекции является транслокация не только генома, но и очень большого полипептида. Было изолировано 6 мутантов Е. coli К12 дефектных по адсорбции N4 и определена локализация 4 генов. Гены mir А и iifrB были тесно сцеплены и картированы на 12 мин. генетической карты Е. coli. Ген nfrC был картирован на 85 мин., a nfrD между 44 и 58. Продуктом гена nfrA оказался белок внешней мембраны с мол. весом 96 кДа, ген nfrВ кодирует белок внутренней мембраны с массой 69,5 кДа. Предположено, что NfrA кодирует структурный рецептор для N4, a NfrB требуется для необратимой адсорбции и инъекции генома фага и РНК — полимеразы через цитоплазматическуго мембрану (Kiino.D.R., and L.B. RoÜinian — Denes. 1989).

Мультифункциональный рецепторный белок внешней мембраны FlrnA требуется для переноса ферихрома железа, антибиотика альбомицина, колицина М и для инфецирования клетки фагами Tl, Т5 и ф80. Транспорт альбомицина, ферихрома, колицина К через внешнюю мембрану, и инфекция фагами Т1 и ф80 зависят, кроме того, от функционирования белка цитоплазматической мембраны, ТопВ, на который влияют белки ExbBD или TolQR в мутантах по генам exbBD. Предполагается прямое взаимодействие FhuA и ТопВ при котором ТопВ переводит FhuA в активное состояние, так что связанные на внешней поверхности ферихром, альбомищин и колищин М переходят в периплазму, а ДНК фагов Т1 или ф80 освобождается из фаговых головок (Killmann, Н., and V.Braun. 1992).

Адсорбция бактериофага Т5 на поверхности Е. coli F является двухступенчатым процессом: обратимое связывание с полиманнозой О —антигена и необратимое связывание с рецепторным белком FhuA, включенным в транспорт ферихрома железа. Связывание с О — антигеном происходит на хвостовых отростках. Связывание с FhuA происходит при участии хвостового белка pb5 (Snyder, С.Е. 1984). Хромосома фага Т5 проникает в клетку в два этапа. После прикрепления и прокола хвостом фага оболочки клетки, осуществляется первая ступень переноса FST (first —step —transfer). Около 8% ДНК проникает в клетку и становится доступной для машины синтеза РНК и белка хозяина. Проникновение FST —ДНК очевидно происходит без затраты энергии хозяина. Механизм отвечающий за остановку переноса ДНК остается неизвестным. Когда фаг инкубируется с изолированным рецептором вся ДНК выходит из капсида. Предположили, что остановка инъекции происходит при взаимодействии ДНК Т5 с другими компонентами оболочки. Это предположение было подтверждено экспериментами Labedan, В. (1978) с иммобилизованными оболочками клеток. В экспериментах наблюдалась остановка инъекции, тогда как при обработке оболочек детергентом Тритон —Х100, который растворяет компоненты внутренней мембраны хозяина, такой остановки не происходило. Возможно остановка переноса хромосомы происходит из —за необычной структуры ДНК Т 5.

Механизм второй стадии переноса неизвестен. Среди 10 полипептидов кодируемых FST —ДНК, белок А2 необходим для проникновения остальной ДНК в клетку, А1 так же принимает участие в процессе деградации хозяйской ДНК и терминации экспрессии генов Т5 локализованных на FST участке. Оказалось, что для второй ступени проникновения ДНК Т5 не требуется метаболической энергии хозяина. Показано, что продукт гена А2 изменяет структуру оболочки хозяина, облегчая тем самым проникновение ДНК в клетку (Snyder, С. Е. 1984).

IL МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

L Бактерии, фаги и шлазмпяды. Описаны в таблицах II— 1,2,3. Таблица II—1. Штаммы Escherichia coli S02 „

Штамм

Генотип

Источник или ссылка

F galKT rpsL Smr

ВКПМ

N99 dcrA55 Cl1 агдА21 mut53 lysA thil mtl2 xyl7 tonA21 tsxl

S455 dcrA55 Cl1 эта работа

AB2463 recA Smr Rif leu ihr pro arg Ms

B4021

N99 dcrB5 Tcr Cl1

ABl 127 recB21 recC22 sbcB15

B6556 N99 dcrB20::RSM (Km*) KL209 metEv.TnlO Hfr sup53 malB k1 эта работа

B6619

F~ btuBl Clr BF23r purD38 thi lacYl galK2 mtlt xy!5 tsx29 sup48 KL209 btuBl

B6622

B6288 metEr.TnlO

B6621

В 6630 ABl 157 dcrB20::RSM (Kmr)

HS 244 tonB aroB thi malT tsx recA эта работа V. Braun et. al V. Braun et. al

W3350 dcrA60::CAT эта работа

В 6884 dcrB20:

В 6861 В 6817 metö::Tni0

В 5395 ptsG ptsM galK rpsL recAr.TntO A{srl-recA} ВКПМ

Штамм

Генотип

Источник или ссылка

В 6857

V3350 гесА::Тп10

Эта работа

В6858

В6817:

Тп 10

Таблица II — 2. Фаги.

Фаги

Пометки

Источник или ссылка

Р1лгаг

ВКПМ

Т4д17

С1 -"

ВР23 -" ф80

Т2, Т4, Т5, Т7,

Тп1а, Ти1Ь,Ти1Г -"X р5Ь5 X С1857 Арг оп Со1Е1 -" -X р5Е36 X рБЬ5::йсгА -" -1р8Е43 Хр §15::(1сгВ -"-9А10, №3, 8В9, 10В5, 8С5, 9А12, ШВ6, ЗСП,

5А10, 8НЗ 60 шп ¥.Ко11ага(1987)

12Е4, 6А4, 10010, 5Р2, 7Н7, 1В6, 5В10, 10Р5,

16А5, Е5В4, Е4Е4, 76.5пип -"

2 ЮЗ, 6СЗ, 6С9, ЗС5, 9В9, 7В7, Е11С11, 4С11, 8Н10 89 тш

Таблица II —3. Плазмиды.

Плазмиды Характеристики Мол. вес Источник или ссылка pUC19::dcrA

15 kb И kb 9.0 kb 5.3 kb эта работа рВС762 pUC19::dcrß

17 kb 9.2 kb

5.8 kb

6.9 kb 6 kb 3.5 kb 2.7 kb 4.1 kb

Bradbeer ВКПМ

Штаммы E. coli выращивали при температуре 37°C (штаммы несущие производные фазмиды A,pSL5, при 30°С) в жидкой или агаризованной среде LB (Maniatis, Т., et. al., 1982) или на минимальной среде М9 и М63 [Maniatis, Т., et. al.,1982] с необходимыми добавками — глюкоза (0.4%), аминокислоты (40 мкг/мл), тиамин (10 мкг/мл), витамин BJ2 ( от 1 до 10 нг/мл), стрептомицин (Sm) — 50 мкг/мл, ампицилин (Ар) — 100 мкг/мл, канамицин (Km) —100 мкг/мл, тетрациклин (Тс) — 10 мкг/мл, хлорамфеникол (Cm) — 20 мкг/мл, циклосерин (Cs) — 100 мкг/мл. Белки метили 60 мин. (35S)— Met (Обнинск) с активностью 400 MBq/mi

9V

IV

В 5 в?

Зо Геиетшгаескше методы» Для траысдукции Plvir (Miller, J.H., 1972) и T4gt7 (Wilson, G.G., et.al, 1979) были использованы стандартные методы. Вставки в гены dcrA и dcrB были получены, как описано ранее (Winans, S.C., et. al, 1985). Для этого мы использовали плазмиды pUC4K (Vieira, J., & J.Messing. 1982) (содержит RSM (restriction site mobilizing Kmr элемент) и pCM7 (Timothy, J.С., & R.L. Rodriguez 1982) (содержит CAT (chloramphenicol acetyltransferase) Cmr элемент. Сконструированные плазмиды, pBC764 с RSM в гене dcrB и рВС45 с CAT в гене dcrA были введены в штамм JC623 (recBC sbcB). Клоны устойчивые к фагу С1 были отобраны среди Kmr, Aps или Cmr, Aps трансформантов (в которых плазмида была потеряна). Полученные штаммы B663Q и В6817 были использованы, как доноры для Plvir трансдукции аллелей dcrAv.Cm и dcrB::Km в штаммы N99 и W3350. 4» Утшшзщшш вшпгамшнш Во»

Для изучения утилизации витамина В]2 в мутантах по генам dcrA или dcrB были сконструированы, при помощи T4gt7 трансдукции, соответствующие штаммы с дополнительной мутацией в гене metE (В6619, В6621 и В6821). Мутанты metE могут расти на минимальной среде содержащей 1 нг/мл витамина В12 (в отсутствии метионина) только при наличии активного транспорта В|2, поскольку В12не синтезируется в аэробных условиях (Di Girolamo, P.M., et. ai, 1971).

So Методы работы с ДНК»

Выделение ДНК плазмид, фазмид и реплекативной формы производных фага М13 проводили по методике Холмса и Квигли (Maniatis, Т., et. al., 1982). Для очистки от хромосомной ДНК и РНК использовали изопикническое центрифугирование в присутствии интеркалятора бромистого этидия (Maniatis, Т., et. al.,1982).

Реакции рестрикции, лидирования, затупления концов ДНК, фосфорилирования и дефосфорилирования проводили согласно методикам, описанными Маниатисом с соавторами (Maniatis, Т., et. al.,1982) ' и в соответствии с протоколами, разработанными фирмой "Proniega". В работе использовались ферменты НПО "Фермент" (Вильнюс), "Promega" (США), "Amerstiaim" (Англия) в условиях, рекомендованных изготовителем.

Электрофорез ДНК проводили в агарозных гелях в трис — ацетатном буфере с бромистым этидием (1 мкг/мл). Фрагменты ДНК выделяли из легкоплавкой агарозы по методике, описанной в сборнике (Maniatis, Т., et. al.,1982).

Подбор условий для частичного гидролиза хромосомной ДНК и последующее разделение фрагментов в градиенте сахарозы проводили согласно (Maniatis, Т., et. al.,1982).

Трансформацию клеток Е. coli плазмидной и фазмидной ДНК проводили кальциевым методом согласно методике (Maniatis, Т., et. al.,1982).

Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили методом Сэнгера (Sanger, F., et. al., 1977) на секвенаторе ДНК фирмы "Applied Biosystems" модель 370А с использованием праймеров, меченных Р33 или Р32 NTP. Фрагменты ДНК размером 100 — 1500 н.п. клонировали в векторах серии pUC или производных фага М13. Выделение ДНК и проведение реакций секвенирования проводили в соответствии с протоколами, разработанными фирмой "Applied Biosystems". В реакциях использовали различные ферменты: — Кленовский фрагмент ДНК — полимеразы I Е. coli, —модифицированную Т7 ДНК — полимеразу (секвеназа) (НПО "Фермент"), —модифицированную Taq — полимеразу фирмы "Applied Biosystems". Для уменьшения G/C компрессии вместо dGTP использовали деазо —7 —dGTP фирмы "Boehringer Mannheim". Секвенирующий электрофорез проводили в денатурирующих условиях (8М мочевина) в 6% полиакриламидном геле при мощности источника питания 24 Вт и 42°С. Анализ последовательностей проводили с помощью компьютерных программ DNASIS, PCGENE, DNASUN.

Для введения метки в ДНК использовали метод синтеза комплементарной цепи с гексонуклеотидными затравками, со статистической последовательностью. В работе использовался набор "Мечение ДНК" НПО "Фермент" и радиоактивные dATP и dCTP (г.Обнинск). Реакции проводили согласно инструкции изготовителя.

Гибридизацию ДНК проводили по методике описанной Маниатисом с соавторами (Maniatis, Т., et. al., 1982). Для переноса ДНК из агарозыых гелей использовали прибор "Multiplier П" фирмы "Pharmacia" и нейлоновые фильтры "Hybond — N" фирмы "Amersham". Меченную ДНК зонда, с удельной активностью до 100 млн.расп/мин на мкг, шбридизовали со связанной на фильтрах ДНК при температуре 42°С в течении 12 часов. Условия предгибридизации, гибридизации, отмывки и авторадиографии выполняли по методикам (Maniatis, Т., et. al., 1982).

6. Ашалшз виутршклеточшьж белков.

Для идентификации и определения размеров белков, кодируемых генами лежащими на фрагментах хромосомы, использовали систему макси — клеток. Эксперименты выполняли по методике (Sanear, A., et. al., 1979), разработанной для лабораторного штамма E.coli АВ2463 (гесА). Время ультрофиолетовош облучения, необходимого для разрушения хромосомной ДНК, составило 90 — 120 сек. с расстояния 30 см от лабораторной Уф — лампы.

Включение метки в белки проводили при обработке культуры клеток облученных ултрафиолетом [35S] — метионином (Обнинск). Электрофорез белков проводили в 10 — 15 % полиакриламидных гелях с SDS по Лемли (Laemmli, U.K. 1970). Гели окрашивали кумаси R250 ("Sigma"), обрабатывали реактивом Amplife

Amersham) для усиления сигнала, высушивали и экспонировали 2—10 суток с рентгеновской пленкой РМ1 при температуре — 70°С.

Для проверки способности плазмид комплементировать деффект адсорбции фага С1, мы трансформировали соответствующие плазмиды в мутанты dcrA и dcrB. Комплементация анализировалась при помощи адсорбционного анализа и высева на газон с О. 8. Анализ адсорбшри CL

Адсорбция фага С1 измерялась, как описано ранее (Roa,M. 1979). Ночная культура бактерий была разбавлена в свежем бульоне Luria — Bertani и выращена при 37°С до 5x108 клеток/мл., центрифугирована и ресуспендирована в среде М63, предварительно нагретой до 37° С, как для фага К10 (Roa,M. 1979). Фаг С1 в титре 106 фага/мл. среды М63, был инкубирован 20 мин. при 37°С с равным объемом клеток. После инкубации было отобрано 0,1 мл образца, охлаждено во льду с хлороформом и без него. Хлороформ добавляли для убийства инфецированных клеток, что позволяло измерить количество неадсорбированнош фага оставшегося в среде. Количество неадсорбированных фаговых частиц сравнивалось с титром фага посчитанным по образованию бляшек на чувствительном газоне.

Для выделения белков из мембран мы использовали метод описанный Zaror et al. (1988). Бактерии выращивали в 250 мл колбах содержащих LB —бульон с соответствующими антибиотиками до. поздней экспоненциальной фазы роста, осаждали, ресуспендировали в 3 мл 10 мМ Tris —HCL (рН 8.0), и разрушали ультразвуком. Лизат клеток был отделен от интактных клеток центрифугированием при 12000 х g в течении 20 мин. Супернатант далее подвергли ультрацентрифугироваыиго при 40000 х д, 12 мин. (BeckiJiam Ti65 rotor). Осадок мембранных белков был тщательно ресуспендирован в 10 мМ Tris —НС1 (рН 8.0), содержащем 10 мМ МдС12 и 2% Triton X—100, и затем инкубирован при 37°С 45 мин. с постоянным встряхиванием. Суспензия была центрифугирована при 80000 х д 90 мин. Осадок внешних мембран был окончательно суспендирован в простом буфере для электрофореза. Белки внутренней мембраны были осаждены в 2,5 объемах этанола, и осадок растворен в простом буфере. Мы так же использовали методику одновременного получения фракций мембран и периплазматической фракции меченных белков для небольшого количества меченных клеток, которая подробно описана в (Ко, К., Т. Sato, and Т. Yura. 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение фашрезистентности является одним из способов обнаружения несущественных бактериальных генов, контролирующих фаговую рецепцию и одновременно выполняющих другие клеточные функции, такие как, транспорт специфических субстратов. В грамотрицательных бактериях, фаговые рецепторы обычно локализуются во внешней мембране, которая является физическим барьером между внешней средой и клеткой. (Bremer, Е., et. al. 1990, Killmann, Ы., et. al. 1992). Тем не менее, для необратимой адсорбции некоторых фагов требуются белки цитоплазматической мембраны (Hancock, R. W., & ¥. Braun. 1976, Kiino,D.R., & L.B. Rothman — Denes. 1989). Имеются экспериментальные данные о том, что фаговая адсорбция может контролироваться несколькими генами (Morona, R., and U. Menning. 1986).

Ранее в нашей лаборатории были получены несколько мутантов Escherichia coli деффектных по адсорбции фага С1. Мутации, исходно названные "cor", локализовали в трех локусах, на 60, 76.5 и 89 мин. генетической карты (Liktiactieva, N. A., et. al.). В настоящей работе, эти локусы переименованы в dcrA, dcrB и dcrC, соответственно (deficiency of CI resistance). Один из локусов, dcrC, оказался идентичен с геном btuB, продукт которого необходим для успешной адсорбции фага BF23 и для транспорта витамина В12 (Bradbeer, С., et. al. 1976).

Мы клонировали, физйчески картировали и охарактеризовали два других гена ответственных за адсорбцию фага CI (dcrA и dcrB). Согласно данным секвенирования, локус dcrA оказался идентичен с геном sdaC, недавно идентифицированным, как ген кодирующий белок внутренней мембраны и являющийся чистым транспортером серина (Shao, Z., et. al. 1994). Второй изучаемый нами ген, dcrB, локализованный на 76.5 мин. генетической карты соответствует открытой рамке считывания между генами ttsY и nikA недавно описанной Sofia et al. (1994). Также мы представили данные по идентификации и локализации белка DcrB и новым свойствам штаммов с мутацией в гене dcrA/sdaC, или амплифицированным геном.

Для клонирования генов Е. coli ответственных за адсорбцию фага С1, мы получили банк ЕсоШ фрагментов хромосомы штамма W3350, использовав в качестве вектора фазмиду A,pSL5 (Yankovsky, N. К., et. al. 1989). Поиск фрагментов, несущих нужные участки ДНК осуществлялся при выявлении С Is трансформантов в соответствующие штаммы dcrA55 (В3694) или dcrBS (В4021). Такие клоны были чувствительны к С1 на L —среде содержащей 108 фага С1. Среди 800 Арг трансформантов В3694, было найдено пять Dcr+ (О — чувствительных) клонов. Все они содержали одинаковый фрагмент бактериальной ДНК рестрикционная карта которого была идентична карте фрагмента Kohara расположенного на 60 мин. хромосомы Е. coli, где ген dcrA был локализован генетически. Этот участок хромосомы перекрывается фагами Kohara с номерами 10В5, 9А12 и 8С5. Мы предположили, что ген dcrA локализован в клонированном фрагменте. Для дальнейшей работы была использована фазмида названная XpSL36.

Из 800 Арг трансформантов в штамм В4021, 5 независимо отобранных клонов, содержащих ЕсоШ фрагменты ДНК, комплементировали мутацию dcrB5. Оказалось, что они имеют два различных типа вставок. Вставки первого типа были идентичны ЕсоШ фрагменту несущему dcrA ген, второго имели рестрикционную карту идентичную с участком карты Kohara в районе 76,5 мин. хромосомы Е. coli, где был локализован генетически локус dcrB. Этот участок хромосомы перекрывается фагами Kohara 10В10, 5F2 и 7Н7. Мы предположили, что мутация derB5 может быть фенотипически супрессирована при увеличении дозы гена dcrA в клетке, или при введении интактнош гена dcrB, как во втором случае. Для дальнейшего анализа была использована фазмида, названная ApSL43, которая несла фрагмент с геном dcrB.

Для субклонирования генов dcrA и dcrB на плазмиду pUC19, фазмиды A,pSL36 и Ä,pSL43 были обработаны рестриктазой BamHl, лигазой, и затем трансформированы в клетки Е. coli, мутантные по генам dcrA и dcrB соответственно. Полученные плазмиды назвали рВСЗб (dcrA) и рВС605 (dcrB).

Локзшшзашрш генов dcrA ш dcrB внутри клонированных фрагментов ДНК ш на физвиеской карте Е. colL

Мы получили детальные рестрикщионные карты фрагментов бактериальной ДНК клонированных на плазмидах рВСЗб и рВС605, использовав рестриктазы ВатШ, EcoRV, Hindill, BglII, Pvull, EcoRl, Kpnl и Pstl. Карты полностью совпадали с участками 60 и 76.5 мин. рестрикционной карты Kohara (Фиг. III—1 и III —2.). Локализацию минимальных фрагментов ДНК, кодирующих гены dcrA и dcrB, проводили минимизацией плазмид, при помощи соответствующих рестриктаз, в несколько этапов (Фиг.Ш—1 и 2.).

Для локализации гена dcrA минимизацию фрагмента хромосомы несущего этот ген осуществляли по следующей схеме. Из рВСЗб была получена рВС15 путем удаления 4 т.п.н. Kpnl фрагмента, рВС2 при удалении из рВС15 EcöRI фрагмента, рВС25 содержащая 2.5 т.п.н. EcoRV фрагмент из рВС2 на векторе pUC19 обработанном рестриктазой Smal. Плазмида рВС25, при трансформации в штамм с мутацией dcrA55, делала его чувствительным к фагу С1, тогда как рВС45 ( сконструированная введением CAT элемента из рСМ7 в Hindlll сайт рВС25) оставляла штамм устойчивым к С1 (Фиг.Ш — 1).

Фет,ИМ Локализация rem dcrA на Я мин, хромосомы Е. coli, В верзшей часш рмсуша п сказаны фрагмент« ДНК зсясифшаише i фагах КоЬагаМШ!, ЙМ2 и tac. же кластер гшш flmcOAMIJL Представлена схема суйслажрованш и результаты кошлемемадиа-щаго ашлша, (Способность плажшд коютемекш раваяь мутгщшо daASS обшшнеж. аш&ом +, отсутствие юашлемедаации' -'.

Плазмида рВС55 была сконструирована in vivo при двойной рекомбинации мижду плазмидой рВС2 и хромосомой штамма В6817. При введении этой плазмиды в мутанты dcrA55 не происходило комплементации по адсорбции и поддерживался фенотип Сшг (Фиг.Ш— 1).

Штаммы с мутацией dcrB5~, в которые были введены плазмиды рВСУ62 (сконструированная при делетировании EcoRV фрагмента из рВС605) и рВС763 (сконструированная при делетировании Smal — Есо105 фрагмента рВС605) становились С Is, тогда как при введении плазмиды рВСУ64 (сконструированная при инактивации гена dcrB введением в Avalll сайт рВСУбЗ гена кап из pUC4K) фенотип СIs не наблюдался (Фиг.Ш —2). рВС US 4-рВС 7G2 Hb рВ€ 7G3 ■«■

Ш j V ^ рвсти =

Фиг. 11-2, Атттл1щя гена dcrB s® 76,5 юш, ^рамостш Е, coli, В зержей час,ш рисунка накаашщ фрагмешы ДНК клш-жрсмш-зшs за фагаз; Kdhara 7Н7, 5Р2и 8С5 | а так же кластер генов ftsXEY, Представлена сжема субклсжирозания и результаты ксютлементацкгоннсго анализа, (Способность плазмзд комплемента ршатъ мутэджо der BS обштчена. знаком + ,-отсутствие камплеметащая1 —',

Локализация генов dcrA и dcrB на физической карте Е. coli была подтверждена гибридизацией фрагментов ДНК 2.5 т.п.н. клонированного в pdcrA+ (рВС25) и 3.1 т.п.н. клонированного в pdcrB4" (рВС763) с фагами Kohara содержащими соответствующие регионы хромосомы Е. coli (Табл.П — 1). Плазмида pdcrA+ гибридизовалась с фагами Kohara 10В5 (456) и 8С5 (457), но не с другими. ДНК плазмиды pdcrB+ гибридизовалась с фагом 7Н7 (612), но не с другими (Фиг. III-1 и 2).

Мутации dcrA20::CAT (Cmr) и dcr.S6Q::RSM (Kmr) из плазмид dcrAr.CAT (рВС45) и derÄM)::RSM (рВС763) были введены в хромосому Е. coli. При этом полученные штаммы становились устойчивыми к О. Результаты экспериментов по адсорбции С1 в соответствующие штаммы сведены в Табл. III—1. Комплементационные анализы с использованием клонированных генов dcrA, стВ и ЫиВ показали, что мутации АхА20::САТ и с!сгВ60::К8М комплементирутотся только плазмидами содержащими йсгА и йсгВ, соответственно, хотя, как показано ранее, исходная точковая мутация йстВ,5 комплементировалась, как йсгА так и ёсгВ содержащими плазмидами. Тем не менее, мутации д.сгВ5 и £1сгВ60::КВМ сильно сцеплены генетически, и вероятнее всего инактивируют один и тот же ген. Различные результаты с мутациями йстВ5 и йсгЖМ)::К8М могут отражать частичную (<1сгВ5) и полную (с!сгВ60::К8М) инактивацию гена йсгВ.

Таблица III — 1. Эффективность адсорбщши фага СЁ „

Штамм аллель % адсорбции

W3350 wild

В 6817 dcrA60::CmT О

В 6884 dcrB20::KmT О

Таким образом, мы локализовали фрагмент с геном dcrA (2.5 т.п.н.) между кластерами metZ и fucOADIKR и dcrB (3.1 т.п.н.) между генами ftsYEX и nikA. генов йстА и

Нуклеотидная последовательность генов dcrA и dcrB была определена стандартными методами (см. Методы и материалы.). При сравнении результатов с данными EMBL/GeixBank/ DDBJ при помощи программы DNA—SUN (ГНИИ Генетика, Москва, 1994, версия 3.30) обнаружена идентичность между генами dcrA и sdaC (EMBL, ЕС233) и идентичность между геном dcrB и открытой рамкой считывания ORFo203, лежащей между генами ftsY и nikA (EMBL, YHHR — ECOLI) и кодирующей гипотетический белок с мол. весом 19.8 кДа. Эти последовательности физически локализованы в тех же регионах, что dcrA и dcrB. Анализ аминокислотной последовательности, полученной из секвенса dcrB показал (рис.Ш —3), что DcrB вероятно содержит сигнальный пептид (19 аминокислот) на N —конце, который отщепляется во время экспорта через внутреннюю мембрану. Предполагаемый сигнальный пептид содержит три типичных участка: I) на N —конце имеются два заряженных аминокислотных остатка, R —2 и К —6; II) далее расположено гидрофобное ядро (от Y—7 до А— 19); III) сигнальный пептид имеет следующую вторичную структуру alpha — helix, beta

Charged Hydrophobic

Segment Segment +1

MRNLVK|YVGIGLLVMGLAA/CDDKDTNATA. beta-sheet alfa-helix

Рис.Ш —3. Аминокислотный состав предполагаемого сигнального пептида белка DcrB. ета dcrB.

При расшифровке секвенса фрагмента хромосомы (76 мин.) Е. coli Sofia et. al. (1994) показали, что ген QRFo203/dcrJ? является вторым геном, считываемым с одного промотора совместно с ORFo221. Для выяснения возможного влияния продукта гена ORFo221 (название по Sofia et. al. (1994)) на адсорбцию фага С1 и проверки оперонной структуры изучаемого кластера генов мы сконструировали мутанты со вставкой RSM (Ктг) в ген ORFo221, где транскрипция RSM совпадала с транскрипцией ÖRFo221 (ORFo221::MSM+) и наоборот (ORFo221::MSM-) (Фиг.Ш-4). Мутант ORFo221::RSM- вел себя как точковый мутант dcrBS. Он был резистентным к С1 с плазмидой содержащей QRFo221 и без нее, а при введении на многокопийной плазмиде dcrA или dcrB становился чувствительным к фагу С1. Мутант ORFo221::RSM+ был С1 чувствительным. Из всех вышеизложенных фактов мы заключили, что ORFo221 вероятнее всего не включен в процесс адсорбции фага С1, и что ORFo221 и dcrB образуют оперон считываясь с одного промотора, как и предполагали Sofia et. al. (1994).

ТХЗ PI Р2 Т2 РЗ „J/MJLi--VJ---4Í>---- -?Ц

JSL

Kii

W3350j¡jSicirB::K.ml юг.ООВ-4. Оргшигазашцумя экспрессии] сот а стер а геи но в растшишэсеинниьвх иа 7Е.Б мюи. хртмтсомм Е. coin. PI, 2,3 - рромиплгтры!, ТИ,2,3 - термгаматгтры траискргаАщмм. Стгрелкасмва указанны иагорашэтеимя трамскрюбцюм С"3— ) м тграмстяедмва^!^^^)-Ргасумок вшпшшем ото дамшиым Soffla et» aD.pS

СИ

Идеитшфшжащиш продукта гею dcrB.

Для идентификации продукта гена dcrB, мы поставили эксперименты с максиклетками (Sanear, A, et. al. 1979), используя плазмиды pdcrB+ и pdcrB::RSM с интактным и инактивированным вставкой геном dcrB. Мы трансформировали штамм АВ2464 этими плазмидами. В клетках несущих pdcrB4" были обнаружены белки с мол. весом 20.0 —кДа и 18.0 —кДа. Эти белки отсутствовали в штамме несущем плазмиду pdcrB::RSM (Фиг.Ш —5). Из этого мы заключили, что dcrB может кодировать белок подвергающийся процессингу, (две полосы на радиоафтографе представляющие непроцессированный предшественник и зрелый белок), что согласуется с данными секвенса. i * 3 vr

36 • 2B

2Ü-»

Ъсг}0>

ФшГо Ш-5. Анализ три томищи макстклеток продукта гена dcrB. Линия 1, вектор pUC19 без вставки; линия 2, рВС764, содержащая инактивированный ген dcrB; линия 3, рВС763. DcrB", непроцессированный предшественник; DcrB, процессированный белок.

Локализация белка DcrB в мембранных фрашршх.

Поскольку продукт гена dcrB эффективно определяется при помощи анализа максиклеток, мы фракционировали максиклетки с меченным DcrB, для определения его внутриклеточной локализации. Мы подтвердили, что максиклетки фракционируются сходно с жизнеспособными клетками по процедуре описанной ранее Kiino and Rothnaan — Denes (1989), в которой фракционированные образцы максиклеток и жизнеспособных бактерий сравниваются при помощи гель — электрофореза окрашенного Coomassie blue.

Авторадиографическая визуализация электофорезированных образцов максиклеток несущих плазмиду с геном dcrB показала, что DcrB в основном находится в периплазме и фракциях внутренней мембраны (Фиг.Ш — 6, линии 3 и 4). Во внутренней мембране так же обнаружены следы непроцессированпого DcrB4". Обнаружение DcrB в периплазме подтверждает идею, что продукт гена dcrB процессируемый белок экспортируемый в периплазму. г з ч

Ъсчв* А

14

Фиг. Ш=®. Внутриклеточная локализация] белка DcMB. ' Линия 1, фракции внутренних и внешних мембран; линия 2, внешнемембранные фракции; линия 3, периплазматические фракции 4, внутремембранные фракции.

Влияние налймия или отсутствия ¡гена йстА в клетке на эксшрессшш dcrB.

Используя плазмиду pdcrB + , мы показали прямо, что хромосомальная мутация dcrA6Q::CAT не предотвращает экспрессию клонированного в максиклетках гена dcrB или процессинг его продета (Фиг.Ш —7).

3<

29 го i 2 3 г 6 ье*к Ъсхб* сп & фшГс 111=7. Экспрессная йсшВ в мутантах сЗстА^САТо Экстракты максиклеток были проанализированы при помощи электрофореза в следующих штаммах. Линия 1, В6858 dcrA60::CAT/pBC763dcrB + ; линия 2, В6858 dcrA60::CAT/pBC764 dcrB20::Km; линия 3, В6857 der + /рВС763 dcrB +.

Утшлшзащшш .вштамина В12 в мутантах dciA и dcrB.

Мы обнаружили ранее, что продукт гена ЫиВ является единственным рецептором фага О (Likhacheva, N.A., et. al. 1990). Белок внешней мембраны Е. coli, BtuB, является мультифункциональным белком, ответственным, как за активный транспорт B12i так и за адсорбцию фагов BF23, С1 и колицинов группы Е (Bradbeer, С., et. al. 1976, Di Masi, D. R., et. al 1973). Поэтому было интересно выяснить участвуют ли продукты генов dcrA и dcrB, необходимые для адсорбции О, в транспорте В12.

Известно, что ауксотрофные мутанты Е. coli, metE-, могут расти аэробно в отсутствии метионина только при добавлении, по крайней мере, 1 нг витамина m hS 36

Bj2 (который не может быть синтезирован) на мл среды. Это происходит из за того, что в одной из стадий синтеза метионина принимает участие два изофермента, активность одного из которых MetE не зависит от наличия Bj2, тогда как второго кодируемого теШ, требует В12 (Lundrigan, M.D., et. al. 1987). Поэтому metE мутанты Е. coli являются удобным инструментом для определения влияния других мутаций на транспорт витамина BJ2. Мы измеряли утилизацию В12 в dcrA60::Cm metE:: TnlO, btuBl metE:: TnlO и dcrB20::Km roeffi::TnlO штаммах. Аллель metE::TnlO был введен при трансдукции с фагом T4gt7, из донорского штамма KL209 в штаммы В6817 (dcrA), В6556 (dcrB), и В2568-(ЬШВ). Для контроля мы использовали штамм В6-619—ЫиВ-теШ::Т-п-Ш—с плазмидой pAGl, несущей ген ЫиВ. Известно, что мультикопийные плазмиды, несущие ген ЫиВ сильно увеличивают количество рецепторов связывающих В!2. В таких штаммах перенос BJ2 не прекращается даже если клетки растут в среде с чрезвычайно малыми концентрациями В)2 (Aufrere, R., et. al. 1986, Kadner, R.J. 1978., Moir, P.D., et. al. 1987). Рост metE производных, с мутациями в трех генах определяющих устойчивость к фагу С1, был проанализирован на минимальной среде М9 в присутствии витамина В12 в концентрации 1 или 10 нг/мл (Табл.111 — 2). MetE- dcrA- и metE- dcrB- мутанты росли хорошо даже при концентрации В12 1 нг/мл, что указывает на нормальный транспорт Bj2. Мутант. ЫиВ- metEr.TnlO, наоборот, не рос даже при концентрации 10 нг/мл Bj2, хотя он начинал расти после трансформации плазмидой pAGl, несущей ген ЫиВ (Табл.111 — 2).

Таблица III — 2. Влвюние концентрации витамин® В12 на рост ауксотрофов теШ.

Рост на среде М9 с добавлением

Штамм Генотип = met В12 В12 20mg/ml lng/ml 10ng/ml

В6619 btuB~ metE::TnlO +

B6620 btuB~{pAGl) metE::TnlO Hb Hb Hb

B6621 dcrB~ meffr.Tniö + + +

B6622 dcrA~ metE'.fTnlO + + +

B6861 dcrA~ metEv.TiitO:±±±

Рост (Hb), нет роста (-).

Так как во вставочных мутантах dcrA и dcrB происходит полная инактивация соответствующих генов, без заметного влияния на транспорт В12, мы заключили, что продукты генов dcrA и dcrB не включены в транспорт В12 в Е. coli.

ЗПленвдтрошшме эффекты вызываемые отсутствием шли избытком гена dcrA в клетке»

Клетки несущие мультикопийную плазмиду с геном dcrA перестают делиться и образуют филаменты на богатой среде при температуре 42°С. Инактивация гена dcrA вставкой в него CAT приводит к увеличению устийчивости бактерий к Ь — лактамным антибиотикам. Мутант dcrA60::CAT устойчив к 4 мкг/мл ампициллина, тогда как штамм dcrA+ чувствителен уже к 1,5 мкг/мл. Локализация белка DcrA/SdaC во внутренней мембране и специфическая устойчивость мутанта dcrA60::CAT к Ь —лактамным антибиотикам предполагает возможное влияние белка DcrA/SdaC на активность пенициллин — связывающих белков или на образование комплекса ампициллин — пенициллин — связывающий белок. Если отсутствие DcrA уменьшает скорость образования комплекса, то при увеличении количества DcrA может усиливаться активность пенициллин — связывающих белков, и как результат, дискоординация пептидогликанового синтеза и других ступеней клеточного деления, вероятно приводящая к филаментащии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ,

Бактериофаг С1 является вирулентным фагом, найденным в природе. Он. принадлежит к морфотипу B1 (Reanney, D.C., & H.W. Akermann 1982), и родственен фагам BF23, Т5 (Likhacheva, N.A., et. al. 1990, Saigo, К. 1987) и 1. Эти фаги используют различные клеточные рецепторы, которые кодируются несколькими бактериальными генами.

Ранее были выделены и описаны мутанты с повреждениями в трех локусах контролирующих адсорбцию фага С1. Один из генов ответственный за адсорбцию фагов С1 и BF23, ЫиВ, хорошо изучен. Белок кодируемый этим геном также является рецептором при транспорте через внешнюю мембрану сидерофоров железа и витамина В12 (кобламин) (Bradbeer, С., et. al. 1976). Два других гена, dcrA (60 мин.) и dcrB (76.5 мин.) необходимы только для адсорбции

С1, но не BF23.

В этой работе мы представили результаты клонирования, физического картирования и характеристике генов dcrA и dcrB. При сравнении нуклеотидных последовательностей этих генов с последовательностями GenBank оказалось, что dcrA идентичен недавно описанному sdaC, кодирующему транспортер серина вероятно находящийся во внутренней мембране (Shao, Z., et. al. 1994). Ген dcrB, идентичен с открытой рамкой считывания ORFo203, недавно описанной Sofia et al. (1994), кодирующей белок (приблизительно 20 кДа) с неизвестной функцией. При анализе экспериментов с максиклетками подтвердилось, что продуктом гена dcrB является процессируемый периплазматический белок, вероятно заякоренный во внутреннюю мембрану. Эти данные совпадают с данными по анализу нуклеотидной и аминокислотной последовательностей.

Из всего вышеперечисленного мы' можем заключить, что адсорбция фага С1 контролируется, по крайней мере, тремя бактериальными белками: BtuB во внешней мембране, DcrB в периплазме, и DcrA/SdaC во внутренней мембране. Хотя при суперпродукции OcrA/SdaC восстанавливалась чувствительность к С1 в точечном мутанте dcrBS, штамм с инсрерционной мутацией dcrB::RSM оставался устойчивым к О, что указывает на необходимость обоих генов dcrA и dcrB для нормальной адсорбции фага С1 и на их взаимодействие.

Анализ промоторнош региона dcrA/sdaC предполагает сложную регуляцию транскрипции, поскольку имеется много инвертированных повторов, и по данным (Shao, Z., et. al. 1994.) он подвержен контролю лейцин/Lrp регулона.

Представленные данные предполагают, что роль dcrA/sdaC плейотропна. Клетки несущие мультикопийную плазмиду с dcrA прекращают делиться и образуют филаменты на богатой среде при 42°С, а инактивация dcrA приводит к увеличению устойчивости клетки к ампициллину. Локализация белка OcrA/SdaC во внутренней мембране и специфическая устойчивость мутанта dcrA60::CAT к Ь — лактамшым антибиотикам предполагает возможное влияние белка DcrA/SdaC на активность пенициллин — связывающих белков или на образование комплекса ампициллин — пенициллин — связывающий белок. Если отсутствие DcrA уменьшает скорость образования комплекса, то при увеличении количества DcrA может усиливаться активность пенициллин — связывающих белков, и как результат, дискоординация пептидогликановош синтеза и других ступеней клеточного деления, вероятно приводящая к филаментации.

Включение белка внутренней мембраны в фаговую адсорбцию необычно, но не беспрецидентно. Аналогичный мультигенный контроль адсорбции был недавно описан для фага N4 (Kiino, D. R., and L. В. Rothman — Denes. 1989).

Из локализации белков DcrA/SdaC, DcrB и BtuB можно сделать некоторые выводы о их возможной роли в адсорбции фага С1. Как внешнемембранный белок, BtuB вероятно является рецептором для С1, также как и для BF23 (Bradbeer, С., et. al. 1976). Функция DcrB, периплазматическош белка, вероятно заякоренного во внутреннюю мембрану, в адсорбции может быть схожей с функцией ТопВ, требуемого для адсорбции некоторых фагов (Т1 и ф80). ТопВ включен во многие энергозависимые транспортные системы поставляя энергию на внешнемембранные рецепторы, включая BtuB (Heller, К. J., et. al. 1988., Kadner, R. J. 1990, Postie, K. 1993).

DcrB вероятно может быть также включен в процессы энершзации, хотя его отсутствие не влияет на BtuB зависимый транспорт Bi2. Интересно, что третий белок ответственный за адсорбцию Cl, DcrA/SdaC, который вероятно взаимодействует с DcrB, как полагают является весьма специфическим транспортером серина. В рабочей модели, мы предполагаем, что DcrB влияет на конформацию BtuB делая его доступным для адсорбции С1, хотя обе конформации являются одинаковыми для других известных функций BtuB.

Кроме ТопВ схожую роль энергизующего периплазматическош белка играет TolA, являющийся существенным для чувствительности клетки к некоторым колицинам и нитчатым фагам (Vianney, А., et. al. 1994, Webster, R. E. 1991). ТопВ и DcrB имеют различные активности. ТопВ несущественен для адсорбции Cl, a DcrB не требуется для транспорта витамина Bi2» который контролируется ТопВ и BtuB, или для адсорбции ТопВ — зависимых фагов ф80 и Т1 (Hancock, R. W., & V. Braun. 1976, Jaskula, J.C., et. al. 1994, Kadner, R. X, & K. J. Heller. 1995). На фиг. III —8 схематически иллюстрируются роли ТопВ и TolA совместно с внешнемембранньши рецепторами ÖnipF, ТопА и BtuB в различных процессах, включая перенос колицинов ColA, ColM и витамина Bj2, а также инфекцию фагами Tl, Т5, ф80 и BF23. Мы также представили предполагаемый путь проникновения фага С1 в клетку, определяемый белками BtuB, DcrB и DcrA/SdaC. TolA и ТопВ, также как DcrB, периплазматические белки встроенные во внутреннюю мембрану, могут взаимодействовать в этих процессах с белками внешней и внутренней мембран (Ahmer, В., et al. 1995, Braun, V., et. al. 1991, Killmann, H., & V. Braun. 1992, Levengood, S., et. al. 1991). етЛШшйрашме fieura существмиьве дая гафегарм ютеткм фагами TS, 11, Ф8И 0F23, €1 ез шпщешамга CelÄ и СоИВ, м тиерешса сер ми а м амтамща 012 . Стрелками указа им матрашиешя шрощсссм» ОМ-имешия мшИрша ; PS першшггазматмесгае рростраистм; СУ [рташазкштотет

Некоторые интересные вопросы пока остались без ответа. Участвует ли ОсгВ в транспорте серина? Аналогична ли функция ОсгВ функции ТопВ, активатора и транслокатора энергии на рецепторы внешней мембраны? Входит ли ОсгВ в состав других транспортных систем, и взаимодействует ли он с другими белками внешней мембраны подобно ТопВ и То1А.

1. Идентифицировано три гена dcrA, dcrB и dcrC контролирующих адсорбцию фага С1.

2. Показано, что ген dcrC идентичен известному гену ЫиВ, ответственному за адсорбцию фага BF23, транспорт витамина В12 и некоторых колицинов, ген dcrA идентичен sdaC (транспортер серина), и dcrB совпадает с рамкой считывания ORFo2Q3, гипотетического белка, описанной Sofia et al. (1994).

3. Определена нуклеотидная последовательность участков хромосомы включающих гены dcrA и dcrB.

4. Показана оперонная организация ORFo221 и dcrB.

5. Идентифицирован продукт гена dcrB — процессируемый белок с молекулярным весом 18 кДа.

6. Определена локализация DcrB. Он обнаружен в периплазме и внутренней мембране.

7. Обнаружена супрессия точковых мутаций в dcrB при введении в соответствующие штаммы гена dcrA/sdaC на многокопийной плазмиде.

8. Показано, что клетки несущие мультикопийную плазмиду с геном dcrA/sdaC перестают нормально делиться и образуют филаменты при росте на богатой среде при 42°С. Мутанты по гену dcrA в 3 раза устойчивее к Ь — лактамным антибиотикам, исходный штамм, что предполагает возможное влияние dcrA на функционирование пенициллин — связывающих белков. 9.' Предложена модель адсорбции фага С1.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ackeimomim IHLWo amd ML DmIow. 1987. Viruses of prokaryotes, v.II. CRC Press, Boca Ration, FL. p. 116

2. Aimer, B. M. ML, M. G. TSnomas, 1* A„ Larsean, arnd K, Posltle. 1995. Characterisation of the exbBD operon of Escherichia coli and role of exbBD in TonB function and stability. J. Bacterid. 177: 4742-4747.

3. Ames GJFJL 1986. Bacterial periplasmic transport systems: structure, mechanism, and evolution. Annu Rev. Biochem. §5: 397 — 425.

4» Amies,, Go, amd C„ H!§cptm§ol983. The organization, mechanism of action, and evolution of periplasmic transport systems. Trends Biochem. Sei. ®>: 97—100 5. Andeir§om„ Eo§»„ amd AJHL Mogers. 1963. Slime polysaccharides of the Enterobacteriaceae. Nature (London) 19<8: 714 — 715.

6. Aunffireire, M.„ ML Tempete, anndl J. P. BoMim. 1986. Regulation of expression of the gene for vitaxnin B12 receptor cloned on a multicopy plasmid in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 2®5: 358-365.

7. Bassffoid P., Dfiedirficlh Di., Scteafiftmaini C=L,f Iteeves P. 1977. Outer membrane proteins of Escherichia coli . IV. Protein alteration in bacteriophage — resistent mutants. J. Bacteriol. 131: 608-622

8. Bassffoirdt PJL amd RJL Kadmesr. 1977. Genetic analysis of components involved in vitamin B12 uptake in Escherichia coli. J.Bacteriol. 132: 796 — 805.

9. ®ayeirt MLEo 1979. The fusion sites between outer membrane and cytoplasmic membrane of bacteria: their role in membrane assembly and virus infection, p. 167 — 202. In M. Inouye (ed.) Bacterial outer membranes. John Wiley & Sons, Ins., New York.

10. Berns M. 1985. Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes.- Crit. Rev. Biochem. 1»: 145-190.

11. Bern, Mo 1988. Structure and function of porins from Gram — negative bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 42: 359-393.

12. Black» P.N. 1988. Hie fadh gene product of Escherichia coli is an outer membrane protein required for uptake of long —chain fatty acids and involved in sensitivity to bacteriophage T2. J. Bacterid. 117®; 2850-2854

13. B©MffdmeaMdl„ J. P., §. P. Howard, amid C. LazdmimskL 1989. Localization and assembly into the Escherichia coli envelope of a protein required for entry of colicin A. J. Bacteriol. 11 h 2458-2465.

14. Bradllbeeir, C.„ M. IL Woodlffow, amid I«!. SOMEMal. 1976. Transport of vitamin B12 in Escherichia colt common receptor system for vitamin B12 and bacteriophage BF23 on the outer membrane of the cell envelope. J. Bacteriol. 125s 1032— 1039.

15. Bradbeenv C., № Ifeymolds, G.M. Borate, amd MX Femamdez. 1986. A requirement for calcium in the transport of cobalamin across the outer membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 2®1: 2520-2523.

16. Bradlbe©ir„ C.„ amd Ao GMdrnmmidsdloMnir. 1990. Interdependence of calcium and cobalamin binding by wild — type and mutant BtuB protein in the outer membrane of Escherichia coli. J. Bacteriol. 172; 4919-4926.

17. Branny Vo„ IK. ScflnnleiTf amd H. Wolff. 1973. A common receptor protein for phage T5 and colicin M in the outer membrane of Escherichia coli B. Biochim. Biophys. Acta 323; 87 — 97.

18. BranMSj V.„ K, Gmtar, amd IK. Harnftke. 1991. Transport of iron across the outer membrane. Biol. Metals 4:14 — 22.

19. Brai]im„ V.„ amd C Heramamm. 198)3. Evolutionary relationship of uptake systems for biopolymers in Escherichia coli: cross — complementation between the TonB — ExbB-ExbD and the TolA - TolQ - TolR proteins. Mol. Microbiol. ffl: 261-268.

20. Bremen E„, A. Mlddemdoiifp J. Maurtimumeffl, amd P„ VaJemtSim-HaiiseinL 1990. Analysis of the tsx gene, which encodes a nucleoside — specific channel — forming protein (Tsx) in the outer membrane of Escherichia coli. Gene. 59 — 65.

21. ®iroeirt §o„ & R„ KrameiL 1990. Lysine uptake and exchange in Corynehactermm giutamicum. J. Bacteriol. H2i 7241-7248.

22. Bmixtom MoSo 1971. Genetic analysis of Escherichia coli K 12 mutants resistant to bacteriophage BF23 and the E — group colicins. Molec. gen. Genet. 113; 154—156

23. CUnan TJL, & FoiaMs J- 1978. Two bacteriophages which utilize a new Escherichia coli major outer membrane protein as part of their receptor. J. Bacteriol. 1978 135; 164-170.

24. Clialkralbaiiltl, AoC„„ amd D.W. Deameir. 1992. Permeability of lipid bilayers to amino acids and phosphate. Biochem. Biophis. Acta. Oils 171 — 177

25. CTaafffoM, A., Co WertSr V. MicM, P. E„ KfleMia, P. Qmlairdtet„ M. Hoffinmamg. 1994. A role for residue 151 of LamB in bacteriophage lambda adsorption possible steric effect of amino acid substitutions. J. Bacteriol. I7®s 3204-3209.

26. QnoTiij P„Y„„ amd GoOoEasmamio 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv. Enzymol. 41% 145— 148.

27. Clemmemltj J„ M., E„ Lepomice,, C„ MauncM, amd M. Hoifmniimgo 1983. Genetic study of a membrane protein: DNA sequence alterations due to 11 lamB point mutations affecting adsorption of phage lambda. EMBO J. 2°J7 — 80.

28. DatefTof XMoGoodmam, amd W.ToWictaieir. 1980. Procoat, the precursor of M13 coat protein, requires an electrochemical potential for membrane insertion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111 4669-4773.

29„ DeVeamx LoCoB Cleveimsom D.§„t Bradlbeer C„ Kadmeir 1J. 1986. Identification of the BtuCED polypeptides and evidence for their role in vitamin BJ2 transport in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1 ©7° 920-927 .

30. Dl Glrolammoj P= M.„ Mo J„ Kadmeir,, amd C Biradlbeeir„ 1971. Isolation of vitamin B12 transport mutants of E. coli. J. Bacteriol. 751 — 757.

31. M Mas! D„ E., J. C. Wlite, C. A. Sctomefiftnmam,, amd C. Bradlbeeffo 1973. Transport of vitamin B12 in Escherichia coli common receptor sites for vitamin B12 and the E colicins on the outer membrane of the cell envelope. J. Bacteriol. 115s5Q6 — 513.

32. DomacMe, W.D„„ SLX Begjg, amd NoFoSualltvamo 1984. Moiphogenes of Escherichia coli, p.27 —62. In R.Losick and L.Shapiro (ed.), Microbial development. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

33. Dirtessem,, A„ Jo M., SL J. Hellnngweirft, amd Wo No KommgSo 1987. Mechanism of energy coupling to entry and exit of neutral and branched chain amino acids in membrane vesicles of Streptococcus cremonis. J.Biol. Chem. 2<8>2i 12438— 12443.

34o Efick=Helmeirtd]nf]]L|, amd VoBramunio 1989. Import of biopolymers into Escherichia coli: nucleotide sequences of the exbB and exbB genes are homologous to those of the tolQ and MR genes, respectively. J.Bacteriol. 171; 5117 — 5126. 35o Ftmdlay JJ.C. 1990. Purification of membrane proteins, p.59 —82. In E.L.V. Harris (ed.), Protein purification applications a practical approach. 1990. IRL PRESS at Oxford University press Oxford New York Tokyo.

36o Freund! M„„ Cole §„To 1983. Cloning and molecular characterization of the ompA gene from Salmonella typhimurium. Europ. J.Biochem. 134s 497 — 502 37. Girami W.D., LW. Smtteirlamd^ amd JJ.F„ WnlMnnsonn» 1969. Exopolysaccharide colanic acid its occurrence in the Enterobacteriaceae. J. Bacteriol. 1®©; 1187— 1193.

38. Hamcock„ Mo W„„ amndl ¥. BrammSo 1976. Nature of the energy requirement for the irreversible adsorption of bacteriophages T1 and

39. Hanacock KJE. 1987. Role of porins in outer membrane permeability. J. Bacteriol. 1@9: 929-933

40. Hknnftk©, 1L 1976. Phage T6 — Colin K receptor and nucleoside transport in Escherichia coli. FEBS Lett. 7©; 109-112.

41. Hamttke EL 1978. Major outer membrane proteins of E. coli K12 serve as receptors for the phage T2 (Protein la) and 434 (Protein lb). Molec. Gen. Genet. 104: 131 -135.

42. Hamitke SL, Branam V„ 1978. Functional interaction of the tonA/tonB receptor system in Escherichia coli. J. Bacteriol. 135:190—197

43. Heller, EL Jo, R„ Jo Kadmeff, amdl EL

44. Hellmniami„ ML, G„ VMeiov, Go Jurng,, Ho Sclfowara, & V« IBrammL 1995. Identification of receptor binding sites by competitive peptide mapping: phages Tl, T5, and (J?8Q and colicin M bind to the gating loop of FhuA. J. Bacteriol. 111% 694 — 698.

45. Heyme, ®L L ELt Wo Devirfi|5 W. CMe!aairdlt amd Wo No Konnnimgs.1991. Sodium ion — dependent amino acid transport in membrane vesicles of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 173: 791-800.

46. Htgcpims,, C.F» 1992. ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell Biol. & 67-113.

47. Hnggfims, C. F., amdl C5. Eo AmeSo 1981. Two periplasniic transport proteins which interact with a common membrane receptor show extensive homology: complete nucleotide sequences. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78; 6038-6042.

48. HfigMoan P* L, Clamg Go„ MacCoMe Wo E„s SdännnaHttmaiffi CA. 1985. Evidence that the outer membrane protein gene nmpC of Escherichia coli K12 lies within the defective qsf prophage. J. BacterioL 1®2; 256 — 262.

49. Hlrotot Yo„ Ho Snasimlkii, YoNfisMmiiiira,,. SoYasadlao 1977. On the process of cellular division in the Escherichia coli: a mutant of E. coli lacking a murein — lipoprotein. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74; 1417-1420.

50. Hoflroydl, Co Dof & Co Biadlbeeiro 1984. Cobalamin transport in Escherichia coli, p.21 —23. In L.Leive and D. Schiessinger (ed.), Microbiology — 1984. American Society for Microbiology, Washington,D.C.

51. IcMIhara, MoHsmalm, §„ MiizmisMmau 1981. Characterization of new membrane lipoproteins and their precursors of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 25i 3125 — 3129.

52. IimgjledleWi, W„§„„ amdl Ro JL Poole» 1984. The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiol. Rev. 4®; 222-271.

53. Ito, Koj To §afo„ amdl To YMffau 1977. Synthesis and assembly of membrane proteins in Escherichia coli. Cell, ll; 551 — 559.

54. Jastafla, Jo Co, To Eo Leftaim, JL Mooff5 Jo To §kairef amdl IL Postfe 1994. The role of the TonB aminoterminus in energy transduction between membranes. J. BacterioL 2326-2338.

55o Jefttemij A.M., anadl MoEoMoJefttem, 1975. Energy requirement for the initiation of colicin action in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Acta. 3®7; 12 — 22. 56o Jomes, No„ <& Mo Ostoom.,1977. Translocation of phospholipids between the outer and inner membrane of Salmonella tjpMmurium. J. Biol. Chem. 252;7405 —7412.

57. IKadmeir Ur.F & Lflggims G„L. 1973. Transport of vitamin B12 in Escherichia coli: genetic studies. J. Bacteriol. 115: 514-521.

58. Kadlmer, EL X 1978. Repression of synthesis of the vitamin B12 receptor in Escherichia coli. J. Bacteriol. 130:1050- 1057.

59. Kadmeir, SL X 1990. Vitamin B12 transport in Escherichia coli: energy coupling between membranes. Molecular Microbiology 4: 2027 — 2033.

60. Kadteeir, SL J., amd 5L X HeMeir. 1995. Mutual inhibition of cobalamin and siderophore uptake systems suggests their competition for TonB function. J. Bacteriol. Uli 4829-4835.

61. Kampffemkel, 5Lt amd Braum. 1993. Topology of the ExbB protein in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J. Biol.Chem. 2®B: 6050-6057.

62. Kampff©mteIlfKs amd V. Mmm. 1992. Membrane topology of the Escherichia coli ExbD protein. J. Bacteriol. 174: 5485-5487.

63. Kairlssomij ML, K. Hammawy, amid CJF. Häggims» 1993. ExbB acts as a chaperone - like protein to stabilize TonB in the cytoplasm. Mol. Microbiol. 8: 389-396.

64. EarSsomip M., SL Hammavy amd C, F. ffiggamSo 1993. A sequence - specific function for the N —terminal signal —like sequence of the TonB protein. Molecular Microbiology. 8: 379-388.

65. Kafeura L Lambda II. Cold Spring Habor, N.Y., 1983. p. 331-346.

66. KayaHaaraX, P. TSsetem, W. Ogawa, KJmatoa, MLIsmda, E.B.Q®Mto®r®, T. TsmcMya. 1992. Properties of recombinant cells capable of growing on serine without NhaB Na+/H+ antiporter in Escherichia coli J. Bacteriol. 174: 7482-7485.

67o Kemly, X§,f MXdgMom, amd CBradtoeeir. 1978. Transport of vitamin B12 in Escherichia coli. Corrinoid specificity of the outer membrane receptor. J. Biol. Cheat. 253: 1341 — 1346.

68o Km®, Do Ro, amd L„ B„ Kotttomam-Deiaes. 1989. Genetic analysis of bacteriophage N4 adsorption. J. Bacteriol. 171: 4595-4602.

69. SOlmairm HLf amd V. Bitot®. 1992. An aspartate deletion mutation defines a binding site of the multifunctional FhuA outer membrane receptor of Escherichia coli K12. J. Bacteriol. 174: 3479-3486.

70. Kleemaim,, W.„ ansd 1. M. McConanneL1974. Lateral phase separations in Escherichia coli membranes. Biochem. Biophys. Acta 345: 220 — 230.

71. Rulsara Y.„ IL AMyam®, and EL Isom®. 1987. The physical map of the whole Escherichia coli chromosome: application of a new- strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library. Cell 5©: 495 — 508. ■

72. Insiei, M. 1994. Systems and mechanisms of amino acids uptake and excretion in prokaryotes. Arch. Microbiol. 1§2: 1 — 13. ■

73. Latoedamp®<. 1978, In vitro study of the phage T5 DNA injection process: use of columns of Escherichia coli membranes immobilized on kieselguhr. Virology. 85: 487 — 493.

74. LaemmM, U. SL 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

75. Ie¥emgood„ S. W. E. Beyer, aasd EL E. 1. E. Wefostter. 1991. TolA: a membrane protein involved in coli cm uptake contains an extended helical region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5939 - 5943.

76. Lewi§„ EL 1994. Multidrug resistance pumps in bacteria. Trends Biochem. Sci. 19: 119- 123.

77. LMifflclhievffl, N. A., E. A. KHairemovap amdl §. P. Stimeoky. 1990. Genetic control of Escherichia coli K—12 cells resistance to bacteriophage CI. Molec. genet., microbiol. and virology. 12: 12— 15, in Russian.

78. Lin,, E. C.C.1976. Glycerol dissimilation and its regulation in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 3©? 535-578.

79. Ltmdlbeirg, F.„ Lmmsdl B.„ Jolamssom L,, Noirmak §<, 1987. Localization of the receptor—binding protein adhesion at the tip of the bacterial pilus. Nature. 328s p. 84-87.'

80. Lmdlwiim E. A. 1987. Gene tandem — mediated selection of coliphage 1— receptive Agrobacterium, Pseudomonas, and Rbizobium strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84; 3334 - 3338.

81. Lmigowslky, C, E„ Itomaifflowslka, 3L Kemime, amd B„ Lmdilseffg. 1983. Identification of a trisaccharide repeating unit in the enterobacterial common antigen. Carbohydr. Res. 118: 173-181.

82. Lmgfemtoeffg Bo, & IL Vara Alpines^ 1983. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram — negative bacteria. Biochem. biophys Acta. 737; 51 - 115.

83. Lramdirigam, M. Do„ I. C. De Veainx, Bo J« Mamas, amd M. X Madmen 1987. Separate regulatory systems for the repression of the metE and btuB by vitamin B12 in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 2®©; 401 — 407.

84. Maner C, Bremer E=„ ScBamM Ao„ Bern K„ 1988. Pore —forming activity of the Tsx protein from the outer membrane of Escherichia coli. Demonstration of a nucleoside — specific binding site. J. Biol. Chem. 2©3; 2493-2499.

85. MamiaftiSp T», Eo Fo Fritecla, & X Sambmok. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. i I

80, Mamttimg P„ A., Reeves P. 1375. Outei membrane of Escherichia coli Kl 2: tsx mutants ¡resistant to bacteriophage T5 and coliein K) lack an outer membrane protein. Bioeiiem. biaph, Res. Commun. 7i: 456 — 471.

87. E., M. IL Peer, Jo Ao McCaimaoüi, F. A. Qrafoclice. 1982. Hinge bending in L— arabinose — binding protein: the Venus's flytrap model. J, Biol. Chem. 257: 1131- 1133.

88. yifflE'geir, M., & M. Seles, 1993. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport Trends Biochem. Sei. Iii: 13 — 20,

89. Mayes, EL, afflö G. Schmidt. 1979. Chemistry and ¡biology of the enterobacterial common antigen (EGA). Curr. Top. Microbiol. 85°, 69—153.

90. Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

91. Milter, Do Mo„ X §. Olson, IFo A, Quiocho. 1983. Rates of iigand binding to periplasmic proteins involved in bacterial transport and die mot ax is. J, Biol. Chem. 258: 13665-13672.

92. Most, F.„ M, Hotter, Jo AraasSmag, & K. Gilass, 1987. Studies on the gene for the multivalent B12 receptor of Escherichia coli. Fe ms Microb. Left, 4-1: 103— 108.

93. Moroirna, K.r amd U. Memnieg, 1986. New locus |ttr) in Escherichia coli K—12 affecting sensitivity to bacteriophage T2 and growth on oleate as the sole carbon source. J. Bacterial. 188: 534-540.

34. Morons, It, M, Klose, V, Hemmlag» 1984. Escherichia coli K—12 outer membrane protein (OmpAJ as a bacteriophage receptor: analysis of mutant genes expressing altered proteins. J. Bacterial. 150; 570 — 578.

95. Muiilleir, Mo, & G. BlolbeL 1984.In vitro translocation of bacterial proteins across the plasma membrane of Escherichia coli requires a soluble activity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 7737 — 7741.

96o Newmam, Eo Bo, Mo D'Aiä, M. T« 111. 1992 The leucine —Lrp regulon in E. coli: a global response in search of a raison d'etre. Cell. Ms 617 —619.

97. Nlkaid®, Ho, amd Mo Vaara. 1987. Outer membrane, p.7 —22. In J. L. Ingraham (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1987. American society for Microbiology, Washington, D.C.

98. Nimmtcla W., Go SclamMtt mK5 and €>K20. FEMS Microbiology Letters. 82? 137 - 142.

99. Nommira, M. 1964. Mechanism of action of colicines. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 52° 1514-1521.

100. Oslboinm, MoX, JoEo Gamdeir, Eo Paris!, & Jo Cairsoim. 1972. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J. Biol. Chem. 247s 3962 — 3972.

10L Overall, P., amd Jo WirigM„ 1983. Lactose permease: a carrier on the move. Trends Biochem. Sei. & 404 - 408.

102. Pairlkiiimsom, J„ 1993. Signal transduction schemes of bacteria. Cell. 857-871.

103. Pis!, H„ aimd Vo Brarai. 1995. Novel colicin 10: assignment of four domains to TonB— and TolC — dependent uptake via the Tsx receptor and to pore formation. Mol. Microbiol. № 57-67.

104. Poolmam, Bo, amd Wo No Komiags. 1993. Secondary solute transport in bacteria. Biochim. Biophys. Acta 1183: 5-39.

105» Fo§ttSep SL 1993. TonB protein and energy transduction between membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 25; 591 — 601.

106. Piresslteir, ILL, Ho Staumdemmiaiieir, L„ ZfimmeraBaiaiiffii, amd V. Bram» 1988. Genetics of the iron dicitrate transport system of Escherichia colt J. Bacteriol. 17©o°2716 — 2724.

107. ProssMfa, E„„ Ao Gee, GeAmeSo 1989. Reconstruction of the histidine peripiasmic transport system in membrane vesicles. Energy coupling and interaction between the binding protein and the membrane complex. J. Biol. Chem. 2@40° 5006 —5014.

108. Kearney, R Co, amd Ho W„ AakesmaMo 1982. Comparative biology and evolution of bacteriophages. Advanc. in virus Res. 2h 205 — 280.

109. Keymolds, P« Ko, GoPoMoMrar, amd Co ftadfoeeiTo 1980. Transport of vitamin B12 in Escherichia coli. Some observations on the roles of the gene products of MuC and TonB. J. Biol.Chem. 255; 4313-4319.

110. Mfios, CSL, RJ. Kadmeirol989. Vitamin B12 transport in Escherichia coli K12 does not require the btuE gene of the btuCED operon. Mol. Gen. Genet. 217; 301 — 308.

111. Moa, Mo 1979. Interaction of bacteriophage K10 with its receptor, the LamB protein of Escherichia coli J. Bacteriol. 14®; 680 — 686.

112. Saieir, M. HoP 1994. Computer — aided analyses of transport protein sequences: gleaning evidence concerning function, structure, biogenesis, and evolution. Microbiol. Rev. 58; 71-93.

113. Safer, Mo 1977. Bacterial phosphoenolpyravate: sugar phosphotransferase systems: structural, functional, and evolutionary relations. Microbiol. Rev. 4L°856 —871.

114. Sango, EL 1978. Isolation of high —density mutants and identification of nonessential structural proteins in bacteriophage T5: dispensability of L —shaped tail fibbers and secondary major head protein. Virology. &5i 422 — 433.

115o Samcar, A», A. M. Hack, amd Wo Do Rnipp. Simple method for identification of plasmid — coded proteins. J. Bacteriol. 07»° 692 — 693.

116. Samgei, F., NnckSem, amd Ao A. Coualsomo 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci USA 74: 5463-5467

117. ScbmMft, MA, amdl Ko Jammu 1982. Phospholipid substitution of capsular (K) polysaccharide antigens from Escherichia coli causing extraintestinal infections. FEMS Micribiol. Lett. £4: 69-74.

118. Sctowekeir Mo, Hmdemnaacta L„ Gairtem W., Hesmmg U. 1978. Major proteins of Escherichia coli outer cell envelope membrane. Interaction of protein IP with lipopolysaccharide. Europ. J. Biochem. 1978. 82: 211-217

119o §toao,ZoQ>o, & E. Bo Newnaa 1993 Sequencing and characterization of the scfoB gene from Escherichia coli К12. Eur. J. Biochem. 212: 777—784.

120. Siia®, Zo, M» To Ltm, amdl E. Bo Newmmaimo 1994. Sequencing and characterization of the sdaCB operon in Escherichia coli K — 12. Eur. J. Biochem. 222: 901 — 907.

121. §Smom E., Ro X Hraflom, М» Jo Ward, No A Co Bmmce, Jo To Amnmsteomg, A. Jo Po Eleftclieir, amd Ro E, Glass. Structure — function analysis of thé vitamin B12 receptor of Esherichia coli by means of informational suppression. Molecular Microbiology. 15: 381-393.

122. Skaire, J» To, Bo M. Mo АЬшшевг, Co 3L Seaelhoird, Ro Po Daweii, amd JL Posftfe 1993. Energy transduction between membranes: TonB, a cytoplasmic membrane protein, can be chemically crosslinked in vivo to the outer membrane receptor FerA. J. Biol. Chem. 208: 16302-16308.

123o §кшпгау 1A, Hamomck RoE,, Reeves P. 1974. Con —mutants: class of mutants in Escherichia coli K—12 lacking a major cell wall protein and defective in conjugation and adsorption of a bacteriophage. J. Bacteriol. 119: 726 — 735

124. Smydeir,, C„ E„ 1984. Bacteriophage T5 gene A2 protein alters the outer membrane of Escherichia coll J. Bacteriol. 1191-1195.

125. S©fffia„ Ho J., Vo Bmiirfamd,, D. L. DamSels, G, PHuumBsefti, amd F, M. BlattaeiL Analysis of the Escherichia coli genome. V. DNA sequence of the region from 76.0 to 81.5 minutes. Nucleic Acid Res. 22: 2576-2586.

126o Speiseir, D.M,( GoF. Ames 1991. Salmonella typhimurium histidine periplasmic permease mutations that allow transport in the absence of histidine — binding protein. J. Bacteriol. 173: 1444-1451.

127. Stock,, 11., Bo Manuel!, amd §« Mosemamio 1977. Periplasmic space in Salmonella typhimurium and Escherichia coli. J. Biol. Chem. 252: 7850 — 7861.

128. leraipMoi, 1A, amd MA Savage®he. 1974. Transport of biosynthetic intermediates: regulation of homoserine and threonine uptake in E. coli. J. Bacteriol. 12®: 114-120.

129» Timni©ttyp J» C, amd ®L Lo IRodiragieZo 1982. Construction and characterization of the chloramphenicol — resistenee gene cartridge: A new approach to the transcriptional mapping of extrachromosomal elements. Gene 2®: 305 — 316.

130„ Tomas JJ/L, & Kay W.W. 1984. Lacking a major cell wall protein and defective in conjugation and adsorption of a bacteriophage. J. Bacteriol. 159: 1047— 1052.

131. T©nrnnmas§emt Jo & Lmgiennlbeirgj Bo 1981. Localization of phoB, the structural gene of outer membrane protein in Escherichia coli K12. J. Bacteriol. 147: 118— 123

132. Traraib„ L„ Do Ga!§§eirt amd V» Braunmio 1993. Activity domains of the TonB protein. Mol. Microbiol. 8: 409-423.

133» Ufftofflnn,, Co, amd R. T.Gelns. 1990. Purification and properties of a kinase from E. coli K12 that phosphorylates two periplasmic transport proteins. J. Biol. Chem. 2@5: 1783-1786.

134. Vans Alptoem L., Selm N., Lusgtemlberg B. 1978. Pores in the outer membrane of Escherichia coli K12. Molec. Gen. Genet. 150:75-83.

135. Vans der ley, P„, P. de Graaffff, J. Tomassen. 1986, Shielding of Escherichia coli outer membrane proteins as receptors for bacteriophages and colicins by o — antigenic chains of lipopolysaccharide. J. Bacterid 1@8: 449 — 451.

136. Verls oogft, H. J. C., H. Smii, T. Albee, M. Gamper, A. J. M. Messern, D. Haas, & W. N. Konstmigs. 1992. A arcD, the first gene of the arc operon for anaerobic arginine catabolism in Pseudomonas aeruginosa, encodes an arginine — ornithine exchanger. J. Bacteriol. 174: 1568-1573.

137. Vnammey, A., T. M. Lewnns, W. F. Beyer, J. C. Lazzaromfi, BL Portaler, aisd M. E. Webster. 1994. Membrane topology and mutational analysis of the TolQ protein of Escherichia coli required for the uptake of macromolecules and cell envelope integrity. J Bacteriol. 17@: 822-829.

138. Vieira J., asad J. Messmg. 1982. The pUC plasmids, an M13 mp7 —derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. IS): 259-268.

139. Webster, M. E., 1991. The tol gene products and the import of macromolecules into Escherichia coli. Mol. Microbiology. 5: 1005— 1011.

140. Weitester R.E. 1991.The tol gene products and the import macromolecules into Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5: 1005—1011.

141. Weitester M.E. 1991.The tol gene products and the import macromolecules into Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5: 1005-1011. a© o

142» WMte, Jo Co„ Po M„ Dfi Gtrolamm©, Mo 1L Fun, Yo Ao Piregfom, amd C BffadtoeeiL 1973. Transport of vitamin B12 in Escherichia coli. Location and properties of the initial B,2- binding site. J. Biol. Chem. 24B; 3978-3986.

143. Wnlsom, Go Got K. 5L Yo Yoiimg, Go Jo Edlm, amid Wo KoMgstarg. 1979. High frequency, generalized transduction by bacteriophage T4. Nature. 28(D); 80 — 82.

144. Wfimams, §o C.f Jo Eledge, Jo H. Kraegeir, asnd G. C. Walker. 1985. Site - directed insertion and deletion mutagenesis with cloned fragments in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1219-1221.

145o Wood, J» Mo 1989. Prolin porters effect the utilization of proline as nutrient or osmoprotectant for bacteria. J. Membrane Biol. 1©®: 183 — 202. 146. Wui^Y., Po Dffltta 1992. Integration host factor is required for positive regulation of the tdc operon of Escherichia coli. J.Bacteriol. 174; 233-240.

147oYamada, Ho, Ho Yamagafa, amd §. MragMimao 1984. The major outer membrane lipoprotein and new lipoproteins share a common signal peptidase that exist in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. FEBS Lett. 1

14®. Ytui, Fo, HLFmnnmkaw®, SLNakamnira, SoMkmsMma 1984. Mechanism of localization of major outer membrane lipoprotein in Escherichia coli. Studies with the OmpF — lipoprotein hybrid protein. J. Biol. Chem. 25§;6013 — 6018.

150. Zairor, L, L Gomes, G. CasMlo, A. Yindelevlcli, amd Ao Vemegas., 1988. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a Salmonella typhimurium porin gene. FEBS 229:77-81.