Генетический анализ одиночных и множественных карцином желудочно-кишечного тракта человека с различным уровнем микросателлитной нестабильности генома тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Штам, Татьяна Александровна

• Штам, Татьяна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Штам, Татьяна Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. «Супрессорный » путь развития карцином желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека

1.1 Модель Фогельштейна для спорадических колоректальных карцином.

Ф 1.2 Белок р53 и его участие в канцерогенезе ЖКТ человека.

1.2.1. Структура белка р53: домены и их функции.

1.2.2. Роль белкар53 в формировании ответа клетки на стресс.

1.2.3. Повреждения гена р53 в опухолях ЖКТ.

2. «Мутаторный» путь развития карцином ЖКТ

2.1. Система коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО).

2.1.1. Функциональные комплексы белков системы КНО.

2.1.2 Участие белков системы КНО в апоптозе клетки в ответ на повреждения ДНК. ф 2.1.3. Микросателлитная нестабильность генома (МНГ) —маркер дефектной работы системы КНО.

2.2 Нарушения функционирования системы КНО, МНГ и канцерогенез ЖКТ.

2.2.1. Наследственные мутации генов системы КНО и предрасположенность к развитию наследственного неполипозного рака толстой кишки (ННРТК).

2.2.2. Спорадические карциномы ЖКТ и МНГ.

2.2.3. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов системы КНО и их роль в развитии опухолей ЖКТ.

2.2.4. Различный уровень МНГ в опухолях ЖКТ. Маркеры для определения

2.2.5 Гены-мишени дефектной работы системы КНО и их участие в развитии карцином этой этиологии.

3. Альтернативность генетических путей развития злокачественных новообразований ЖКТ

3.1 Генетическая картина заболевания и его фенотипические проявления.

3.2 Диагностические процедуры с использованием МНГ для определения генетического пути развития злокачественного новообразования ЖКТ. Нерешенные вопросы.

4. Множественные злокачественные новообразования ЖКТ

4.1. Критерии диагностики и клиническая классификация первично-множественных опухолей

4.2 МНГ - генетический маркер предрасположенности к полинеоплазии ЖКТ. Образование множественных опухолей ЖКТ путем метастазирования или независимого развития карцином.

4.3 Перспективы генетических исследований множественных злокачественных новообразований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Клинические характеристики исследованных опухолей.

2. Выделение ДНК из парафиновых срезов и клеточных культур.

3. Анализ изменения длины микросателлитных маркеров и мутаций в генах мишенях дефектной работы системы КНО.

3.1. Полимеразная цепная реакция.

3.2. Анализ мутационных повреждений исследуемой ДНК.

3.2.1. Анализ SSCP.

3.2.2. Электрофорез в денатурирующих условиях (ЭФДУ).

4. Идентификация наследственных генетических повреждений в генах hMLHl и HMSH2 системы КНО.

5. Поиск мутаций в гене р53 в опухолях ЖКТ.

6. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск корреляции между уровнем МИГ и повреждениями гена

1.1. МНГ карцином ЖКТ человека и различия в уровне МНГ для индивидуальных опухолей. Определение класса МНГ карцином ЖКТ.

1.2. Уровень МНГ карцином ЖКТ и наличие мутаций в гене р53. Поиск корреляции между уровнем МНГ и мутациями генар53.

1.3. Тест-система для определения генетического пути развития опухоли.

2. Генетический анализ множественные карцином ЖКТ человека.

2.1. Полинеоплазия, инициированная наследственным повреждением системы КНО.

2.1.1. Генетические повреждения в гене р53 и маркерах МНГ. Выявление наследственных мутаций в генах системы КНО.

2.1.2. Генетической схема прогрессии ННРТК, сопровождающегося множественными карциномами ЖКТ.

2.2. Альтернатива при образовании множественных опухолей: метастазирование или независимое развитие. Выявление «природы» множественных карцином на основе их генетического анализа.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический анализ одиночных и множественных карцином желудочно-кишечного тракта человека с различным уровнем микросателлитной нестабильности генома»

Опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) являются одной из наиболее распространенной причиной смерти от злокачественных новообразований как во всем мире, так и в России, и, в частности, Санкт-Петербурге - одном из самых «пожилых» и потому «онкологических» мегаполисов Российской Федерации (Аничков et al, 2004). Обширные программы направлены на разработку диагностики и методов лечения этого заболевания. В настоящее время в связи с пониманием генетической природы рака и развитием молекулярно-биологических подходов разрабатываются различные процедуры идентификации генетических повреждений, определяющих инициацию и развитие онкологического заболевания, а также чувствительность карцином этой локализации к терапевтическим воздействиям.

На сегодняшний день известно несколько десятков генетических детерминант, вовлекаемых в патогенез опухолей ЖКТ. По сложившимся представлениям большинство карцином ЖКТ могут развиваться по двум путям - «супрессорному» и "мутаторному" (Ilyas and Tomlinson, 1996). Первый характеризуется мутациями в генах АРС, K-ras, DCC, С-тус, Bcl-2, р53 и др. Одним из ключевых среди них является ген р53, белковый продукт которого является основным регулятором клеточного ответа на различные стрессовые воздействия, а также участником процесса дифференцировки клетки, поддержания стабильности ее генома и т.д. Инициирование же "мутаторного" пути связано с инактивацией системы коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО), которая проявляется в микросателлитной нестабильности генома (МНГ) различной степени: высокой (МНГ-В), низкой (МНГ-Н) и со стабильными микросателлитами (MCC) (Boland et al, 1998). Особенность повреждения системы КНО состоит в том, что в первую очередь мутации будут возникать в генах, содержащих в своей структуре микросателлит. К настоящему времени известен целый ряд таких генов, белковые продукты которых в норме так или иначе влияют на пролиферацию клеток, и, соответственно, могут вовлекаться в канцерогенез в случае их повреждения или утраты (Boland et al., 1998).

Каждый из двух путей характеризуется разным мутационным профилем, вследствие чего опухоли имеют различия в течении заболевания и чувствительности к разным видам терапии. Колоректальные опухоли с повреждениями системы КНО, как правило, выявляются в более раннем возрасте, склонны к полинеоплазии, являются низкодифференцироваными, чаще локализованы в проксимальном отделе ободочной кишки; есть данные и о более высокой выживаемости пациентов с такими опухолями (Redston, 2001). Мультирезистентность опухолей с повреждениями системы КНО или гена р53 обусловлена потерей клетки способности к апоптозу, который является конечным звеном цитотоксического действия антираковых препаратов на клетку. Белок р53 - один из основных регуляторов запуска апоптотического каскада в клетке в ответ на повреждения ДНК, однако белки системы КНО hMLHl и hMSH2 также участвуют в инициации апоптоза клетки (Fishel, 2001). Различия в спектре узнаваемых повреждений ДНК проявляются в пониженной чувствительности к терапевтическим агентам, определяемой нарушениями в трансформированных клетках системы КНО или гена р53, что продемонстрировано как в экспериментах на ряде клеточных линий, так и в клинических исследованиях (Fink et al., 1998; Manic et al., 2003).

Очевидно, что для выбора эффективной терапии, а также прогнозирования течения конкретного онкологического заболевания ЖКТ полезно определить генетический путь его развития или, как минимум, отделить карциномы с повреждениями в системе КНО или гене р53. МНГ сама по себе является чувствительным маркером, позволяющим идентифицировать карциномы с поврежденной системой репарации КНО. Кроме того, выявление МНГ методически представляет собой простую процедуру генетического анализа. Таким образом, использование МНГ для диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний ЖКТ представляется перспективным. Тем не менее, до сих пор остается неясным, каков тот уровень МНГ, который позволяет полностью исключить возможность развития карциномы по супрессорному пути с повреждением его «ключевых» генов и в первую очередь гена р53. При этом, наибольшие трудности возникают с классификацией карцином МНГ-Н, их клинической, патологической и биологической сущностью. Поэтому актуальной проблемой остается разработка диагностических методов определения генетического пути развития рака ЖКТ с использованием МНГ в качестве генетического маркера, и, в частности, оптимизация панели чувствительных и специфичных микросателлитов для выявления МНГ разного уровня.

Первично-множественные опухоли (ПМО) ЖКТ представляют собой отдельную группу злокачественных новообразований, характеризующуюся сложностью лечения таких больных (Чиссов и др., 2000). При обнаружении множественных карцином у одного пациента для выбора наиболее оптимальной схемы лечения необходимо знать, являются ли опухоли независимыми или они - метастазы первичной опухоли (Карасева, 1996). Для ответа на этот вопрос в мире используются кроме общепринятых клинических молекулярно-биологические методы исследования, т.к. без них невозможно определить клональную природу конкретной полинеоплазии. Кроме того, множественные карциномы, особенно метахронные опухоли метастатического происхождения, позволяют проследить накопление нарушений в структуре ДНК в ходе канцерогенеза. Таким образом, генетический анализ ПМО представляет как теоретический, так и практический интерес.

Все вышесказанное явилось основой для проведения настоящего исследования.

Цели и задачи исследования

Целями данной работы являются поиск простой процедуры генетического анализа, способной выявить принадлежность исследуемой опухоли к одному из двух возможных генетических путей ее развития, а также исследование множественных злокачественных новообразований ЖКТ для определения их генетической «природы».

В задачи исследования входило:

1) Выявить опухоли, инициированные повреждениями в системе КНО, используя как высокочувствительные маркеры МНГ {ВА Т26 и ВА Т40), так и гены-мишени дефектной работы системы КНО. На основе этих данных определить уровень МНГ для каждой исследуемой карциномы.

2) Проанализировать взаимосвязь между уровнем МНГ и наличием повреждений в гене р53. Для этого среди карцином с различным уровнем МНГ исследовать на наличие мутаций пять экзонов гена р53 (с пятого по девятый), наиболее часто вовлеченных в мутационный процесс.

3) Разработать процедуру генетического анализа карцином ЖКТ для идентификации опухолей с поврежденной системой КНО. Оптимизировать панель специфичных микросателлитных маркеров.

4) Исследовать мутационный профиль множественных новообразований ЖКТ по 16-ти микросателлитным маркерам и 5-ти участкам гена р53. На основе этого генетического анализа определить характер полинеоплазии у каждого из исследованных пациентов.

5) Проследить накопление генетических нарушений при развитии наследственного неполипозного рака толстой кишки (ННРТК) путем анализа опухолей, последовательно возникавших у одного пациента в течение многих лет.

Научная новизна полученных результатов

Проведена оценка значимости различных маркеров для определения уровня МНГ. Впервые представлена панель высокоспецифичных микросателлитных локусов, включающая повторы в генах-мишенях дефектной работы системы КНО и позволяющая строго отделить опухоли с повреждениями этой системы репарации.

Впервые на примере синхронных и метахронных опухолей одного пациента с синдромом ННРТК продемонстрировано накопление генетических повреждений в гёнах-мишенях дефектной работы системы КНО в ходе канцерогенеза, инициированного выходом из строя этой системы репарации. При исследовании этого редкого случая полинеоплазии выявлено наследственное повреждение гена hMLHl, не описанное ранее.

Научно-практическая и теоретическая значимость работы

Основным результатом работы, обладающим практической ценностью, является разработка тест-системы генетического анализа опухолей, позволяющей строго определить карциномы ЖКТ с повреждениями в системе репарации КНО или гене р53. Предлагаемый тест становится новым дополнительным источником диагностической информации, полезной врачу для выбора стратегии фармакотерапии онкологических больных и прогнозирования развития заболевания.

Показано также, что синхронные множественные новообразования ЖКТ в исследованных случаях проявляют метастатический характер, причем при развитии заболевания как по «супрессорному», так и по «мутаторному» пути. Данные генетического анализа позволяют уточнить клинические критерии, применяемые к пациентам при постановке диагноза полинеоплазии.

Теоретический интерес представляют впервые описанные для карцином ЖКТ наследственная мутация в гене hMLHl и повреждение гена р53. Кроме того, в исследовании продемонстрированы как накопление мутаций в отдельных карциномах ЖКТ при их прогрессии, так и генетическая гетерогенность гистологически различных фрагментов одного новообразования.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Уровень МНГ опухоли может быть использован как параметр, позволяющий определить один из двух возможных генетических путей развития карцином ЖКТ.

2) Разработана процедура генетического анализа карцином ЖКТ для строгой идентификации опухолей с поврежденной системой КНО с использованием панели специфичных микросателлитных маркеров.

3) Предложена генетическая схема поэтапного развития заболевания ННРТК, сопровождавшегося возникновением множественных новообразований ЖКТ, у пациента с наследственной мутацией в гене hMLHl.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на 2-ом (Санкт-Петербург, 2000г.) и 3-ем (Москва, 2004г.) съездах ВОГИС; на 2-ой научной конференции «Актуальные проблемы генетики», посвященной 115-летию со дня рождения Николая Ивановича Вавилова, Москва, 2003 г.; на 7-ой (2003г.) и 8-ой (2004 г.) международных пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино; на Обществе онкологов Санкт-Петербурга, 2003 г., Санкт-Петербург; на международной школе молодых ученых «Hanseatic Students' Days of Science», Росток, Германия, 2000 г.; а также на конференциях молодых ученых Санкт-Петербургского государственного технического университета (1996-1997гг.) и Петербургского института ядерной физики (1998-2004 гг.). Устные доклады на международных школах-конференциях молодых ученых «Hanseatic Students' Days of Science», Росток, 2000г., а также «Биология - наука XXI века», Пущино 2004г. были удостоены третьей и первой премий, соответственно.

Публикации

По теме работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах

Структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 168 ссылок. Работа содержит 15 рисунков и 17 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Штам, Татьяна Александровна

ВЫВОДЫ

1) Стабильность, а также различные типы нестабильности микросателлитов в ДНК определяют развитие опухоли ЖКТ по супрессорному или мутаторному пути. Следовательно уровень нестабильности микросателлитов может быть использован как основной параметр, позволяющий определить один из альтернативных генетических путей развития злокачественного новообразования ЖКТ.

2) Предложена схема генетической идентификации карцином ЖКТ, предусматривающая последовательное использование двух наборов специфичных микросателлитных маркеров для выявления опухолей с повреждениями в репаративной системе КНО.

3) При исследовании уникального случая (многолетние синхронно-метахронные множественные новообразования ЖКТ) у пациента с синдромом ННРТК выявлен ряд последовательных генетических нарушений, включая исходное, и установлена схема поэтапного развития заболевания.

4) Исследованные синхронные мультицентрические новообразования ЖКТ обладают сходным профилем генетических нарушений, что свидетельствует о моноклональной природе таких опухолей, причем при развитии карцином как по супрессорному, так и по мутаторному пути.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Штам Т.А., Вострюхина О.А., Гуляев А.В., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Генетические повреждения в ходе прогрессии наследственного неполипозного рака толстой кишки.// Доклады РАН, 2004, 395: 126-131.

2) Вострюхина О.А., Никифорова И.Ф., Штам Т.А., Канторов С.Л., Тутаев К.Ю., Шумаков А.Р., Комиссарова С.В., Калиновский В.П., Васильев С.В., Ковалев В.К., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Микросателлитная нестабильность генома в клетках спорадических и наследственных карцином желудочно-кишечного тракта.// Вопросы Онкологии, 1998, 44, №5, стр.509514

3) Вострюхина О.А., Никифорова И.Ф., Штам Т.А. Канторов С.Л., Ковалев В.К., Васильев С.В., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Повреждения рецептора типа II трансформирующего фактора роста TGF|3 и микросателлитная нестабильность генома в клетках карцином желудочно-кишечного тракта.//Вопросы Онкологии, 1998, 44, №6, стр.667-672

4) Вострюхина О.А., Штам Т.А. Мохова Н.В., Чепик О.Ф., Гуляев А.В., Ланцов В.А. Уровень нестабильности микросателлитов и мутации гена р53 в карциномах желудочно-кишечного тракта человека.// Экологическая Генетика, 2004, №4 (в печати)

5) Вострюхина О.А., Штам Т.А., Гуляев А.В., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Накопление мутаций сдвига рамки считывания в кодирующих нуклеотидных повторах при прогрессии наследственного неполипозного рака толстой кишки.// Тезисы докладов Ш-го съезда ВОГиС, Москва, 2004, с.451

6) Штам Т.А. Вострюхина О.А., Мохова Н.В., Чепик О.Ф., Ланцов В.А. Выявление корреляции между мутациями гена р53 и степенью микросателлитной нестабильности генома клеток карцином желудочно-кишечного тракта человека.// Сб. тезисов 8-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2004, с.40

7) Штам Т.А. Вострюхина О.А., Гуляев А.В., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Генетические повреждения в ходе прогрессии наследственного неполипозного рака толстой кишки.// Итоги исследований (научные проекты программы СПб НЦ РАН 2001-2003 гг.), СПб, НИИ Химии СПбГУ, 2004, с.50-52

8) Штам Т.А., Вострюхина О.А., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Генетическая нестабильность в патогенезе первично-множественного ННРТК.// Сб. тезисов 7-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2003, с.50-51

9) Штам Т.А., Вострюхина О.А., Пожарисский К.М., Ланцов В.А. Мутационный профиль карцином при первично-множественном неполипозном раке толстой кишки.// Материалы 2-ой конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики», Москва, 2003, т.2, с.53

10) Вострюхина О.А., Канторов С.Л., Штам Т.А. Сергеев Е.В., Ковалев В.К., Пожарисский К.М. Генетические повреждения в патогенезе спорадических опухолей желудочно-кишечного тракта с фенотипом микросателлитной нестабильности ДНК.// Сб. трудов PNPI XXX (Научная деятельность в последней трети XX века, ОМРБ), Гатчина, 2001, 161-167

11) Штам Т.А. Генетическая нестабильность при развитии наследственного неполипозного рака толстой кишки.// Тезисы докладов И-го съезда ВОГиС, Санкт-Петербург, 2000, т.2, с. 215

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Штам, Татьяна Александровна, 2005 год

1. Аничков Н.М., Кветной И.М. и Коновалов С.С. (2004) Биология опухолевого роста, Санкт-Петербург.

2. Блинов Н.Н. (1998) TNM классификация злокачественных опухолей. "Эскулап", Санкт-Петербург.

3. Гублер Е.В. (1978) Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. "Медицина", Москва.

4. Гублер Е.В. и Генкин А.А. (1973) Применение непараметрических критериев в медико-биологических исследованиях. "Медицина", Москва.

5. Карасева Н. (1996) Первично-множественные опухоли. Санкт

6. Петербургские врачебные ведомости, 1, 39-44.

7. Ланцов В.А. (1998) Репарация ДНК и канцерогенез: универсальные механизмы у про- и эукариотов и последствия их повреждения у человека. Молекулярная биология, 32(5), 1-16.

8. Мерабишвили В., Попова С., Чепик О. и Юрин А. (2000) Регистрация и учет больных с первично-множественными злокачественными новообразованиями. Вопр. онкол. 46, 40-43.

9. Соркин В. (2001) К вопросу о регистрации и учете больных с <вГ первично-множественными злокачественными новообразованиями.1. Онкология, 3, 136-138.

10. Старинский В., Петрова Г., Харченко Н. и Грецова, О. (2001) Основные показатели онкологической помощи населению России в 2000 году, СПб.

11. Херрингтон С. и Макги Д. (1999) Молекулярная клиническая диагностика. Методы. "Мир", Москва.

12. Чиссов В., Трахтенберг А. и Франк Г. (2000) Развитие учения о первичной множественности злокачественных опухолей, Москва.

13. Юрин А. (1999) Первично-множественные опухоли (диагностика, ф. классификация, основные принципы регистрации): пособие для врачей, СПб.

14. Aaltonen, L.A., Peltomaki, P., Leach, F.S., Sistonen, P., Pylkkanen, L., Mecklin, J.P., Jarvinen, H., Powell, S.M., Jen, J., Hamilton, S.R. and et al. (1993) Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 260, 812-816.

15. Aebi, S., Fink, D., Gordon, R., Kim, H.K., Zheng, H., Fink, J.L. and Howell, S.B. (1997) Resistance to cytotoxic drugs in DNA mismatch repair-deficient cells. Clin Cancer Res, 3, 1763-1767.

16. Aebi, S., Kurdi-Haidar, В., Gordon, R., Cenni, В., Zheng, H., Fink, D., Christen, R.D., Boland, C.R., Koi, M., Fishel, R. and Howell, S.B. (1996) Loss of DNA mismatch repair in acquired resistance to cisplatin. Cancer Res, 56, 30873090.

17. Antal, A. and Valient, K. (1997) Cases of multiple tumors in our clinic. OrvHetil, 138,1507-1510.

18. Arzimanoglou, II, Gilbert, F. and Barber, H.R. (1998) Microsatellite instability in human solid tumors. Cancer, 82, 1808-1820.

19. Bacon, B.R. (2001) Hemochromatosis: diagnosis and management. Gastroenterology, 120, 718-725.

20. Ban, C. and Yang, W. (1998) Crystal structure and ATPase activity of MutL: implications for DNA repair and mutagenesis. Cell, 95, 541-552.

21. Baranovskaya, S., Soto, J.L., Perucho, M. and Malkhosyan, S.R. (2001) Functional significance of concomitant inactivation of hMLHl and hMSH6 intumor cells of the microsatellite mutator phenotype. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 15107-15112.

22. Bassam, B.J., Caetano-Anolles, G. and Gresshoff, P.M. (1991) Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 196, 8083.

23. Beck, N.E., Tomlinson, I.P., Homfray, Т., Frayling, I., Hodgson, S.V., Harocopos, C. and Bodmer, W.F. (1997) Use of SSCP analysis to identify germline mutations in HNPCC families fulfilling the Amsterdam criteria. Hum Genet, 99, 219-224.

24. Berardini, M., Mazurek, A. and Fishel, R. (2000) The effect of 06-methylguanine DNA adducts on the adenosine nucleotide switch functions of hMSH2-hMSH6 and hMSH2-hMSH3. J Biol Chem, 275, 27851-27857.

25. Bertram, J.S. (2000) The molecular biology of cancer. Mol Aspects Med, 21, 167-223.

26. Bhattacharyya, N.P., Skandalis, A., Ganesh, A., Groden, J. and Meuth, M. (1994) Mutator phenotypes in human colorectal carcinoma cell lines. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 6319-6323.

27. Billroth, T. (2003) Pathology and therapeutics, in fifty lectures. 1871. Clin Orthop, 4-11.

28. Boland, C.R., Thibodeau, S.N., Hamilton, S.R., Sidransky, D., Eshleman, J.R., Burt, R.W., Meltzer, S.J., Rodriguez-Bigas, M.A., Fodde, R.,

29. Borresen, A.L., Lothe, R.A., Meling, G.I., Lystad, S., Morrison, P., Lipford, J., Kane, M.F., Rognum, Т.О. and Kolodner, R.D. (1995) Somatic mutations in the hMSH2 gene in microsatellite unstable colorectal carcinomas. Hum Mol Genet, A, 2065-2072.

30. Branch, P., Aquilina, G., Bignami, M. and Karran, P. (1993) Defective mismatch binding and a mutator phenotype in cells tolerant to DNA damage. Nature, 362, 652-654.

31. Buyse, LM., Shao, G. and Huang, S. (1995) The retinoblastoma protein binds to RIZ, a zinc-finger protein that shares an epitope with the adenovirus El A protein. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 4467-4471.

32. Cho, K.R., Oliner, J.D., Simons, J.W., Hedrick, L., Fearon, E.R., Preisinger, A.C., Hedge, P., Silverman, G.A. and Vogelstein, B. (1994) The DCC gene: structural analysis and mutations in colorectal carcinomas. Genomics, 19, 525-531.

33. Chung, D.C. and Rustgi, A.K. (2003) The hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: genetics and clinical implications. Ann Intern Med, 138, 560-570.

34. Chung, Y.J., Park, S.W., Song, J.M., Lee, K.Y., Seo, E.J., Choi, S.W. and Rhyu, M.G. (1997) Evidence of genetic progression in human gastric carcinomas with microsatellite instability. Oncogene, 15, 1719-1726.

35. Coomber, D.W. and Ward, R.L. (2001) Isolation of human antibodies against the central DNA binding domain of p53 from an individual with colorectal cancer using antibody phage display. Clin Cancer Res, 7, 2802-2808.

36. Counts, J.L. and Goodman, J.I. (1995) Alterations in DNA methylation may play a variety of roles in carcinogenesis. Cell, 83, 13-15.

37. Cury Mde, S. and Forones, N.M. (2000) Multiple primary neoplasms in colorectal cancer patients. Arq Gastroenterol, 37, 89-92.

38. Duval, A., Gayet, J., Zhou, X.P., Iacopetta, В., Thomas, G. and Hamelin, R. (1999) Frequent frameshift mutations of the TCF-4 gene in colorectal cancers with microsatellite instability. Cancer Res, 59,4213-4215.

39. Duval, A. and Hamelin, R. (2002) Mutations at coding repeat sequences in mismatch repair-deficient human cancers: toward a new concept of target genes for instability. Cancer Res, 62, 2447-2454.

40. Eguchi, К., Yao, Т., Konomoto, Т., Hayashi, К., Fujishima, M. and Tsuneyoshi, M. (2000) Discordance of p53 mutations of synchronous colorectal carcinomas. Mod Pathol, 13, 131-139.

41. Esteller, M., Levine, R., Baylin, S.B., Ellenson, L.H. and Herman, J.G. (1998) MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene, 17, 24132417.

42. Fearon, E.R. and Vogelstein, B. (1990) A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 61, 759-767.

43. Fink, D., Nebel, S., Aebi, S., Zheng, H., Cenni, В., Nehme, A., Christen, R.D. and Howell, S.B. (1996) The role of DNA mismatch repair in platinum drug resistance. Cancer Res, 56, 4881-4886.

44. Fink, D., Nebel, S., Norris, P.S., Aebi, S., Kim, H.K., Haas, M. and Howell, S.B. (1998) The effect of different chemotherapeutic agents on the enrichment of DNA mismatch repair-deficient tumour cells. Br J Cancer, 77, 703708.

45. Fishel, R. (2001) The selection for mismatch repair defects in hereditary nonpolyposis colorectal cancer: revising the mutator hypothesis. Cancer Res, 61, 7369-7374.

46. Fram, R.J., Cusick, P.S., Wilson, J.M. and Marinus, M.G. (1985) Mismatch repair of cis-diamminedichloroplatinum (Il)-induced DNA damage. Mol Pharmacol, 28, 51-55.

47. Genschel, J., Liftman, S.J., Drummond, J.T. and Modrich, P. (1998) Isolation of MutSbeta from human cells and comparison of the mismatch repair specificities of MutSbeta and MutSalpha. J Biol Chem, 273, 19895-19901.

48. Glavac, D. and Dean, M. (1993) Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat, 2, 404-414.

49. Goelz, S.E., Vogelstein, В., Hamilton, S.R. and Feinberg, A.P. (1985) Hypomethylation of DNA from benign and malignant human colon neoplasms. Science, 228, 187-190.

50. Gottlieb, T.M. and Oren, M. (1998) p53 and apoptosis. Semin Cancer Biol, 8, 359-368.

51. Gradia, S., Acharya, S. and Fishel, R. (1997) The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell, 91, 995-1005.

52. Gradia, S., Subramanian, D., Wilson, Т., Acharya, S., Makhov, A., Griffith, J. and Fishel, R. (1999) hMSH2-hMSH6 forms a hydrolysis-independent sliding clamp on mismatched DNA. Mol Cell, 3, 255-261.

53. Gryfe, R., Kim, H., Hsieh, E.T., Aronson, M.D., Holowaty, E.J., Bull, S.B., Redston, M. and Gallinger, S. (2000) Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med, 342, 6977.

54. Haber, J.E. (1998) The many interfaces of Mrel 1. Cell, 95, 583-586.

55. Hanada, M., Delia, D., Aiello, A., Stadtmauer, E. and Reed, J.C. (1993) bcl-2 gene hypomethylation and high-level expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood, 82, 1820-1828.

56. Hayden, J.D., Martin, I.G., Cawkwell, L. and Quirke, P. (1998) The role of microsatellite instability in gastric carcinoma. Gut, 42, 300-303.

57. He, T.C., Sparks, A.B., Rago, C., Hermeking, H., Zawel, L., da Costa, L.T., Morin, P.J., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1998) Identification of c-MYC as a target of the APC pathway. Science, 281, 1509-1512.

58. Hedrick, L., Cho, K.R., Fearon, E.R., Wu, T.C., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. (1994) The DCC gene product in cellular differentiation and colorectal tumorigenesis. Genes Dev, 8,1174-1183.

59. Hesketh, R. (1997) The oncogene and tumour suppressor gene. Academic Press Harcourt Brace and Company, Publishers, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto.

60. Hickman, M.J. and Samson, L.D. (1999) Role of DNA mismatch repair and p53 in signaling induction of apoptosis by alkylating agents. Proc Natl Acad Sci US A, 96, 10764-10769.

61. Hoang, J.M., Cottu, P.H., Thuille, В., Salmon, R.J., Thomas, G. and Hamelin, R. (1997) BAT-26, an indicator of the replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines. Cancer Res, 57, 300-303.

62. Huang, S., Shao, G. and Liu, L. (1998) The PR domain of the Rb-binding zinc finger protein RIZ1 is a protein binding interface and is related to the SET domain functioning in chromatin-mediated gene expression. J Biol Chem, 273, 15933-15939.

63. Iaccarino, I., Palombo, F., Drummond, J., Totty, N.F., Hsuan, J.J., Modrich, P. and Jiricny, J. (1996) MSH6, a Saccharomyces cerevisiae protein that binds to mismatches as a heterodimer with MSH2. Curr Biol, 6, 484-486.

64. Iacopetta, B. (2003) TP53 mutation in colorectal cancer. Hum Mutat, 21, 271-276.

65. Ilyas, M. and Tomlinson, I.P. (1996) Genetic pathways in colorectal cancer. Histopathology, 28, 389-399.

66. Ionov, Y., Peinado, M.A., Malkhosyan, S., Shibata, D. and Perucho, M. (1993) Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature, 363, 558-561.

67. Jamieson, E.R. and Lippard, S.J. (1999) Structure, Recognition, and Processing of Cisplatin-DNA Adducts. Chem Rev, 99, 2467-2498.

68. Jass, J.R., Cottier, D.S., Jeevaratnam, P., Pokos, V., Holdaway, K.M., Bowden, M.L., Van de Water, N.S. and Browett, P.J. (1995) Diagnostic use of microsatellite instability in hereditary non-polyposis colorectal cancer. Lancet, 346, 1200-1201.

69. Jass, J.R., Do, K.A., Simms, L.A., lino, H., Wynter, C., Pillay, S.P., Searle, J., Radford-Smith, G., Young, J. and Leggett, B. (1998) Morphology of sporadic colorectal cancer with DNA replication errors. Gut, 42, 673-679.

70. Jeffrey, P.D., Gorina, S. and Pavletich, N.P. (1995) Crystal structure of the tetramerization domain of the p53 tumor suppressor at 1.7 angstroms. Science, 267, 1498-1502.

71. Jen, J., Powell, S.M., Papadopoulos, N., Smith, K.J., Hamilton, S.R., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1994) Molecular determinants of dysplasia in colorectal lesions. Cancer Res, 54, 5523-5526.

72. Jiang, G., Liu, L., Buyse, I.M., Simon, D. and Huang, S. (1999) Decreased RIZ1 expression but not RIZ2 in hepatoma and suppression of hepatoma tumorigenicity by RIZ1. Int J Cancer, 83, 541-546.

73. Jin, S. and Levine, A.J. (2001) The p53 functional circuit. J Cell Sci, 114,4139-4140.

74. Karran, P. and Bignami, M. (1992) Self-destruction and tolerance in resistance of mammalian cells to alkylation damage. Nucleic Acids Res, 20, 29332940.

75. Karran, P. and Marinus, M.G. (1982) Mismatch correction at 06-methylguanine residues in E. coli DNA. Nature, 296, 868-869.

76. Khanna, K.K. and Jackson, S.P. (2001) DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet, 27, 247-254.

77. Kim, H.S., Cho, N.B., Yoo, J.H., Shin, K.H., Park, J.G., Kim, Y.I. and Kim, W.H. (2001) Microsatellite instability in double primary cancers of the colorectum and stomach. Mod Pathol, 14, 543-548.

78. Kolodner, R. (1996) Biochemistry and genetics of eukaryotic mismatch repair. Genes Dev, 10, 1433-1442.

79. Laird, P.W. (1997) Oncogenic mechanisms mediated by DNA methylation. Mol Med Today, 3, 223-229.

80. Laird, P.W. and Jaenisch, R. (1996) The role of DNA methylation in cancer genetic and epigenetics. Annu Rev Genet, 30, 441-464.

81. Lane, D.P. (1992) Cancer. p53, guardian of the genome. Nature, 358,15.16.

82. Lee, H.S., Choi, S.I., Lee, H.K., Kim, H.S., Yang, H.K., Kang, G.H., Kim, Y.I., Lee, B.L. and Kim, W.H. (2002) Distinct clinical features and outcomes of gastric cancers with microsatellite instability. Mod Pathol, 15, 632-640.

83. Levine, A J. (1997) p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, 88, 323-331.

84. Li, G.M. and Modrich, P. (1995) Restoration of mismatch repair to nuclear extracts of H6 colorectal tumor cells by a heterodimer of human MutL homologs. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 1950-1954.

85. Li, G.M., Wang, H. and Romano, L.J. (1996) Human MutSalpha specifically binds to DNA containing aminofluorene and acetylaminofluorene adducts. J Biol Chem, 271, 24084-24088.

86. Liu,.L., Shao, G., Steele-Perkins, G. and Huang, S. (1997) The retinoblastoma interacting zinc finger gene RIZ produces a PR domain-lacking product through an internal promoter. J Biol Chem, 272, 2984-2991.

87. Lynch, H.T. and de la Chapelle, A. (1999) Genetic susceptibility to non-polyposis colorectal cancer. J Med Genet, 36, 801-818.

88. Lynch, H.T., Harris, R.E., Bardawil, W.A., Lynch, P.M., Guirgis, H.A., Swartz, M.J. and Lynch, J.F. (1977) Management of hereditary site-specific colon cancer. Arch Surg, 112, 170-174.

89. Manic, S., Gatti, L., Carenini, N., Fumagalli, G., Zunino, F. and Perego, P. (2003) Mechanisms controlling sensitivity to platinum complexes: role of p53 and DNA mismatch repair. Curr Cancer Drug Targets, 3, 21-29.

90. Markoff, A., Savov, A., Vladimirov, V., Bogdanova, N., Kremensky, I. and Ganev, V. (1997) Optimization of single-strand conformation polymorphism analysis in the presence of polyethylene glycol. Clin Chem, 43, 30-33.

91. Marsischky, G.T., Filosi, N., Kane, M.F. and Kolodner, R. (1996) Redundancy of Saccharomyces cerevisiae MSH3 and MSH6 in MSH2-dependent mismatch repair. Genes Dev, 10, 407-420.

92. Mello, J.A., Acharya, S., Fishel, R. and Essigmann, J.M. (1996) The mismatch-repair protein hMSH2 binds selectively to DNA adducts of the anticancer drug cisplatin. Chem Biol, 3, 579-589.

93. Menoyo, A., Alazzouzi, H., Espin, E., Armengol, M., Yamamoto, H. and Schwartz, S., Jr. (2001) Somatic mutations in the DNA damage-response genes ATR and CHK1 in sporadic stomach tumors with microsatellite instability. Cancer Res, 61, 7727-7730.

94. Messerini, L., Ciantelli, M., Baglioni, S., Palomba, A., Zampi, G. and Papi, L. (1999) Prognostic significance of microsatellite instability in sporadic mucinous colorectal cancers. Hum Pathol, 30, 629-634.

95. Nakamura, Y. (1993) The role of the adenomatous polyposis coli (APC) gene in human cancers. Adv Cancer Res, 62, 65-87.

96. Ogata, S., Tamura, G., Endoh, Y., Sakata, K., Ohmura, K. and Motoyama, T. (2001) Microsatellite alterations and target gene mutations in the early stages of multiple gastric cancer. J Pathol, 194, 334-340.

97. Olivier, M., Eeles, R., Hollstein, M., Khan, M.A., Harris, C.C. and Hainaut, P. (2002) The IARC TP53 database: new online mutation analysis and recommendations to users. Hum Mutat, 19, 607-614.

98. Orita, M. (1990) Single-strand conformation polymorphism analysis. Nippon Rinsho, 48, 170-175.

99. Palombo, F., Iaccarino, I., Nakajima, E., Ikejima, M., Shimada, T. and Jiricny, J. (1996) hMutSbeta, a heterodimer of hMSH2 and hMSH3, binds to insertion/deletion loops in DNA. Curr Biol, 6, 1181-1184.

100. Peltomaki, P. (2001). Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer. Hum Mol Genet 10, 735-740.

101. Pestell, K.E., Hobbs, S.M., Titley, J.C., Kelland, L.R. and Walton, M.I. (2000) Effect of p53 status on sensitivity to platinum complexes in a human ovarian cancer cell line. Mol Pharmacol, 57, 503-511.

102. Petrini, J.H. (1999) The mammalian Mrell-Rad50-nbsl protein complex: integration of functions in the cellular DNA-damage response. Am J Hum Genet, 64, 1264-1269.

103. Petrini, J.H. (2000) The Mrell complex and ATM: collaborating to navigate S phase. Curr Opin Cell Biol, 12, 293-296.

104. Piao, Z., Fang, W., Malkhosyan, S., Kim, H., Horii, A., Perucho, M. and Huang, S. (2000) Frequent frameshift mutations of RIZ in sporadic gastrointestinal and endometrial carcinomas with microsatellite instability. Cancer Res, 60, 4701-4704.

105. Powell, S.M., Zilz, N., Beazer-Barclay, Y., Bryan, T.M., Hamilton, S.R., Thibodeau, S.N., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1992) APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature, 359,235-237.

106. Prolla, T.A., Pang, Q., Alani, E., Kolodner, R.D. and Liskay, R.M. (1994) MLH1, PMS1, and MSH2 interactions during the initiation of DNA mismatch repair in yeast. Science, 265, 1091-1093.

107. Redston, M. (2001) Carcinogenesis in the GI tract: from morphology to genetics and back again. Mod Pathol, 14, 236-245.

108. Roose, J. and Clevers, H. (1999) TCF transcription factors: molecular switches in carcinogenesis. Biochim Biophys Acta, 1424, M23-37.

109. Salahshor, S., Kressner, U., Pahlman, L., Glimelius, В., Lindmark, G. and Lindblom, A. (1999) Colorectal cancer with and without microsatellite instability involves different genes. Genes Chromosomes Cancer, 26, 247-252.

110. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

111. Samowitz, W.S., Slattery, M.L., Potter, J.D. and Leppert, M.F. (1999) BAT-26 and BAT-40 instability in colorectal adenomas and carcinomas and germline polymorphisms. Am J Pathol, 154, 1637-1641.

112. Sancar, A. (1999) Excision repair invades the territory of mismatch repair. Nat Genet, 21, 247-249.

113. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463-5467.

114. Sharrard, R.M., Royds, J.A., Rogers, S. and Shorthouse, A.J. (1992) Patterns of methylation of the c-myc gene in human colorectal cancer progression. Br J Cancer, 65, 667-672.

115. Shiloh, Y. (2001) ATM and ATR: networking cellular responses to DNA damage. Curr Opin Genet Dev, 11, 71-77.

116. Steingrimsdottir, H., Penhallow, J., Farzaneh, F., Johnson, N. and Tavassoli, M. (1997) Detection of p53 mutations in oral cancer samples using a sensitive PCR-based method. Biochem Soc Trans, 25, 315-318.

117. Strand, M., Prolla, T.A., Liskay, R.M. and Petes, T.D. (1993) Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature, 365, 274-276.

118. Syngal, S., Fox, E.A., Li, C., Dovidio, M., Eng, C., Kolodner, R.D. and Garber, J.E. (1999) Interpretation of genetic test results for hereditary nonpolyposis colorectal cancer: implications for clinical predisposition testing. Jama, 282, 247253.

119. Thibodeau, S.N., Bren, G. and Schaid, D. (1993) Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science, 260, 816-819.

120. Tomoda, H., Baba, H., Taketomi, A., Kohnoe, S., Seo, Y. and Saito, T. (1998) Second primary extracolonic cancers in Japanese hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Oncol Rep, 5, 143-145.

121. Tornaletti, S. and Pfeifer, G.P. (1995) Complete and tissue-independent methylation of CpG sites in the p53 gene: implications for mutations in human cancers. Oncogene, 10, 1493-1499.

122. Toyota, M., Ahuja, N., Suzuki, H., Itoh, F., Ohe-Toyota, M., Imai, K., Baylin, S.B. and Issa, J.P. (1999) Aberrant methylation in gastric cancer associated with the CpG island methylator phenotype. Cancer Res, 59, 5438-5442.

123. Wajed, S.A., Laird, P.W. and DeMeester, T.R. (2001) DNA methylation: an alternative pathway to cancer. Ann Surg, 234, 10-20.

124. Wang, Y., Cortez, D., Yazdi, P., Neff, N., Elledge, S.J. and Qin, J. (2000) BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures. Genes Dev, 14, 927-939.

125. Ward, R., Meagher, A., Tomlinson, I., O'Connor, Т., Norrie, M., Wu, R. and Hawkins, N. (2001) Microsatellite instability and the clinicopathological features of sporadic colorectal cancer. Gut, 48, 821-829.

126. Wheeler, J.M., Bodmer, W.F. and Mortensen, N.J. (2000) DNA mismatch repair genes and colorectal cancer. Gut, 47, 148-153.

127. Wittinghofer, A., Scheffzek, K. and Ahmadian, M.R. (1997) The interaction of Ras with GTPase-activating proteins. FEBS Lett, 410, 63-67.

128. Yamashita, K., Arimura, Y., Kurokawa, S., Itoh, F., Endo, Т., Hirata, K., Imamura, A., Kondo, M., Sato, T. and Imai, K. (2000) Microsatellite instability in patients with multiple primary cancers of the gastrointestinal tract. Gut, 46, 790794.

129. Yan, Т., Berry, S.E., Desai, A.B. and Kinsella, T.J. (2003) DNA mismatch repair (MMR) mediates 6-thioguanine genotoxicity by introducing single-strand breaks to signal a G2-M arrest in MMR-proficient RKO cells. Clin Cancer Res, 9, 2327-2334.

130. Yokozaki, H., Semba, S., Fujimoto, J.Y. and Tahara, E. (1999) Microsatellite instabilities in gastric cancer patients with multiple primary cancers. IntJOncol, 14, 151-155.

131. Yoshitaka, Т., Matsubara, N., Ikeda, M., Tanino, M., Hanafusa, H., Tanaka, N. and Shimizu, K. (1996) Mutations of E2F-4 trinucleotide repeats incolorectal cancer with microsatellite instability. Biochem Biophys Res Commun, 227, 553-557.

132. Zhang, H., Richards, В., Wilson, Т., Lloyd, M., Cranston, A., Thorburn, A., Fishel, R. and Meuth, M. (1999) Apoptosis induced by overexpression of hMSH2 or hMLHl. Cancer Res, 59, 3021-3027.

133. Zhao, R., Gish, K., Murphy, M., Yin, Y., Notterman, D., Hoffman, W.H., Tom, E., Mack, D.H. and Levine, A.J. (2000) Analysis of p53-regulated gene expression patterns using oligonucleotide arrays. Genes Dev, 14, 981-993.