Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма-донора для живых гриппозных вакцин - A/Краснодар/101/35/59(H2N2) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Терехов, Андрей Вадимович

• Терехов, Андрей Вадимович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Терехов, Андрей Вадимович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа

1.1.2 Цикл размножения вируса гриппа

1.1.3 Функции белков

1.1.4 Генетическая изменчивость вируса гриппа

1.2 Живые гриппозные вакцины

1.2.1 Инактивированные вакцины

1.2.2 Живые гриппозные вакцины

1.2.3 История вопроса

1.2.4 Холодоадаптированные вакцины

1.2.5 Классический метод получения ЖГВ

1.3 Обратная генетика

1.3.1 История вопроса

1.3.2 Создание живых гриппозных вакцин (ЖГВ)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Реактивы

2.1.2 Лабораторные штаммы вирусов

2.1.3 Клеточные линии и куриные эмбрионы

2.1.4 Плазмиды

2.2 Методы

2.2.1 Получение реассортантов

2.2.2 Определение инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопление вирусов для последующих опытов

2.2.3 Концентрирование вирусов

2.2.4 Оценка патогенности вирусов для мышей

2.2.5 Определение защитной эффективности ХА реассортантов

2.2.6 Оценка нейровирулентности вирусов для мышей

2.2.7 Реакция задержки гемагглютинации

2.2.8 Выделение вирионной РНК

2.2.9 Получение ПЦР-продуктов для последующего секвенирования

2.2.10 Подбор праймеров для последующего секвенирования

2.2.11 Очистка ПЦР-продуктов

2.2.12 Секвенирование

2.2.13 Компьютерное обеспечение

2.2.14 Подготовка компетентных клеток

2.2.15 Вставка необходимых генов в плазмиды

2.2.16 Выделение макси количеств плазмидной ДНК

2.2.17 Трансфекция клеток плазмидами

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н21Ч2) и эпидемическими штаммами

3.2 Изучение роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2К2) в поддержании его ts, са и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики

ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и эпидемическими штаммами

4.2 Изучения роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2№) в поддержании его ts, са и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список литературы

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

293Т - культура клеток почек человека 293Т

ак - аминокислотные остатки

БОЕ - бляшкообразующие единицы

вРНК - геномная РНК вируса

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

кРНК - +РНК, полностью комплементарная вРНК вируса гриппа

КЭ - куриные эмбрионы

мРНК - матричная РНК

нукл. - нуклеотиды

об/мин - обороты в минуту

ОТ - реакция обратной транскрипции

ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции, проводимая в одной пробирке с ПЦР

ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель

РЗГА - реакция задержки (торможения) гемагглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеин

ХА - холодоадаптированный (о штамме)

ЭИД50/0,1мл - эмбриональная инфекционная доза вируса в 0,1мл ЭПР - эндоплазматический ретикулюм ЦПД - цитопатическая доза

att - attenuated (ослабленный, аттенуированный) (о фенотипе) са - cold adapted (холодоадаптированный) (о фенотипе)

НА - hemagglutinin (гемагглютинин) Ml - matrix protein (матриксный белок)

MDCK - Madine-Darby Canine Kidney cell culture (перевиваемая культура клеток почки коккер-спаниэля) NA - neuraminidase (нейраминидаза) NEP - nuclear export protein (белок ядерного экспорта) NES - nuclear export signal (сигнал ядерного экспорта) NLS - nuclear localization signal (сигнал ядерной локализации) NP - nucleoprotein (белок нуклеопротеида) NS - nonstructural protein (неструктурный белок)

РА - polymerase acidic protein (одна из трёх субъединиц полимеразы вируса)

РВ1 - polymerase basic protein 1 (одна из трёх субъединиц полимеразы вируса)

РВ2 - polymerase basic protein 2 (одна из трёх субъединиц полимеразы вируса)

PKR - protein kinase R (протеинкиназа R)

RCT - reproductive capacity at different temperatures (различие в титрах репродукции при оптимальной и заданной температуре) ts - temperature sensitive (температурочувствительный) (о штаммах или о фенотипе)

WSN - штамм вируса гриппа A/Wisconsin/33 (H1N1)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма-донора для живых гриппозных вакцин - A/Краснодар/101/35/59(H2N2)»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает большой эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. Следует отметить, что в отличие от инактивированных гриппозных вакцин живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами. В настоящее время для получения живой ХА гриппозной вакцины в России используют ХА штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [1] , а в США - ХА штамм А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) [36].

Эти штаммы-доноры аттенуации получены путем пассажей при пониженной температуре обладают ts, са и ait фенотипом, то есть не способны к репродукции при повышенной температуре, хорошо репродуцируются при пониженной температуре и аттенуированы для животных и людей. Генетическая и фенотипическая стабильность ХА штаммов, а также мутации, которые отвечают за их фенотип хорошо изучены [3]. Однако применяемый в России ХА штамм-донор А/Ленинград/134/17/57 оказался генетически гетерогенным [6], и обнаруживал повышенную реактогенность для маленьких детей [1]. Учитывая это обстоятельство в НИИВС им. И.И.Мечникова был получен новый ХА штамм-донор аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) и выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки [4]. Данный штамм обладал приемлемыми фенотипическими характеристиками. Однако до настоящего времени остается неясным, какие гены штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) содержат ключевые генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию данного штамма (ts и att фенотип). Эту проблему мы попытались решить с помощью создания панели

одногенных и полигенных реассортантов, используя методы обратной генетики, с последующим изучением фенотипических и генотипических характеристик сконструированных реассортантов.

Также под вопросом оставалась возможность получения ХА реассортантов - кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/5 9(Н2Ы2), которые обладают хорошими защитными свойствами, необходимыми для живых гриппозных вакцин. Всестороннее изучение биологических свойств реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/5 9(Н2Ы2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А является необходимым условием для оценки перспективности данного штамма как эффективного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение генетических основ аттенуации холодоадаптированного (ХА) штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2М2), а также исследование возможности ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/59(Н2И2) образовывать при скрещивании с эпидемическими штаммами вируса гриппа реассортанты, которые могут быть использованы по своим характеристиками как живые гриппозные вакцины.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить реассортанты путем классического скрещивания ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/5 9(Н2Ы2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А А/Кумам ото/102/02(НЗМ2) и А/Берн/07/95(НШ1), в условиях, которые способствуют формированию реассортантов с поверхностными антигенами от эпидемических штаммов и внутренними генами от ХА штамма.

2. Изучить фенотипические характеристики реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) и

эпидемических штаммов А/Кумамото/102/02(НЗЫ2) и А/Берн/07/95(НШ1): ts, са и аттенуированный фенотип.

3. Проанализировать иммуногенность полученных реассортантов.

4. Провести анализ генома полученных реассортантов с помощью метода секвенирования.

5. Исследовать защитную эффективность реассортантов, полученных между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и эпидемическим штаммом А/Берн/07/95(Н1Ш).

6. Клонировать 8 генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) в плазмиду pHW2000.

7. Получить с помощью трансфекции наборы одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом A/WSN/33(H1N1).

8. Исследовать ts и са фенотип одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и A/WSN/33(H1N1).

9. Изучить att фенотип одногенных и полигенных реассортантов, полученных между вирулентным штаммом вируса гриппа A/WSN/33 и ХА штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш).

Научная новизна работы

Впервые исследованы генетические основы аттенуации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2М2) - нового донора аттенуации для живых гриппозных вакцин. Показано, что РВ1 ген данного штамма содержит ключевые детерминанты, определяющие его ts и att фенотип.

Анализ полученных нами реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att-фенотип, в составе генома реассортантов. Это говорит о безопасности возможного применения живых гриппозных вакцин во время эпидемии гриппа.

Показано, что ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) является перспективным штаммом-донором аттенуации для ХА реассортантов, кандидатов в живые гриппозные вакцины.

Создана панель праймеров, позволяющая определять наследование генов у реассортантов вируса гриппа А сероподтипов Н2М2, НЗШ и НШ1.

Практическая значимость.

Показана возможность использования ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) в качестве штамма-донора для живых рекомбинантных гриппозных вакцин.

Разработаны основные элементы плазмидной технологии для получения живых реассортантных гриппозных вакцин на базе клонированных 6 генов, кодирующих « внутренние» белки ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2Ы2) и 2-х клонированных генов, кодирующих поверхностные белки от любого эпидемического штамма вируса гриппа типа А. Это позволит в более короткие сроки получать вакцинные штаммы, вируса гриппа, минуя трудоемкую стадию анализа генома реассортантов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Все исследованные реассортанты, полученные нами при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентных штаммов А/Берн/07/95 (Н1N1) и А/Кумамото/102/02(НЗ№), обладают генетическими и фенотипическими маркерами, необходимыми для рекомбинантных живых гриппозных вакцин.

2. ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) можно рассматривать как перспективный донор аттенуации при получении ХА реассортантов для живой гриппозной вакцины.

3. Анализ одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью обратной генетики между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом А^8Ы/33(НШ1), свидетельствует о том, что ключевые детерминанты, ответственные за и а и

фенотип, локализованы в РВ1 и N8 гене штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2).

4. Анализ полученных нами реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом АЛУ8]ч[/33(НШ1) указывает на доминирование генов, содержащих генетические детерминанты, ответственные за аи фенотип, в составе генома реассортантов. Этот факт говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа

1.1.1 Общая характеристика вируса гриппа

Вирусы гриппа Л, В и С принадлежат семейству Orthomyxoviridae. Это оболочечные вирусы, обычно сферической формы (реже филаментозной), диаметром около 80 нм. Геном вируса гриппа А (о котором мы будет говорить в дальнейшем) состоит из 8 сегментов (-)РНК, которые кодируют 13 белков [53; 94].

Далее мы рассмотрим строение вириона вируса гриппа А.

Рисунок 1. Строение вируса гриппа [11]

Вирус гриппа имеет липопротеидную оболочку, которая является производной гыазмалеммы клетки-хозяина. В эту оболочку встроены поверхностные белки-антигены гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ЫА), а также ионные каналы (белок М2). Под липидной оболочкой располагается слой М1-белка (матриксного белка). К М1 белку присоединён рибонуклеопротеидный комплекс (РНП), который состоит из (-)РНК, которая

упакована с помощью NP белка, и присоединенных к ним трёх полимеразных белков РВ1, РВ2 и РА [21].

1.1.2 Цикл размножения вируса гриппа

Вирус гриппа присоединяется к N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоте на поверхности клетки-хозяина. Часть сиаловой кислоты узнается НА белком вируса гриппа, который затем к ней присоединяется. Это инициирует эндоцитоз, благодаря которому вирус проникает в клетку. Затем внутри эндосомы начинает повышаться рН, что является частью естественного клеточного механизма пиноцитоза, и осуществляется при помощи протонных помп. При этом протоны из эндосомы пассивно закачиваются внутрь вирусной частицы с помощью М2 белка, что вызывает "разрыхление" внутренних структур вириона, и ослабление связей между вирусными белками. Благодаря закислению среды в эндосоме, конформация НА белка меняется, и он сливается с её оболочкой, тем самым создавая пору, через которую внутрь клетки может выйти РНП-комплекс вируса гриппа.

После освобождения от оболочки, РНП перемещается в ядро клетки с помощью сигналов ядерной локализации белков вируса. В ядре происходят все действия вируса с его генетическим материалом. РНК-зависимая РНК полимераза на основе (-)вРНК синтезирует два типа (+)РНК: матричная -необходима для синтеза вирусных белков, а другая — комплиментарная (кРНК), из который затем будут синтезировать (-)вРНК для потомства вируса. Стоит отметить, что поли(А) конец вРНК получается благодаря тому, что в первоначальной цепочке вРНК имеется последовательность 5-7 урацилов (соответсвенно, полученные из вируса мРНК не нуждаются в полиаденилировании). Однако cap конец отсутствует. Полимеразные белки забирают cap 5' конец у мРНК клетки и присоединяют его к мРНК вируса. Это процесс в англоязычной литературе называется cap snatching ("захватывание кэпа").

Host pre-mRNA

splice

(*) mRNAs

Golgt apparatus

(+) mRNAs

Рисунок 2. Жизненный цикл вируса гриппа [53].

После присоединения cap мРНК готова к транспортировке и трансляции, как и любая мРНК клетки. Однако вРНК транспортируется из ядра с помощью Ml и NS2(NEP) белков. Ml взаимодействет с РНК и NP белком, связывая их с NS2(NEP), и затем полученный комплекс покидает ядро клетки и выходит в цитоплазму.

С помощью мРНК вируса и рибосом клетки в просвет ЭПР синтезируются белки НА, NA и М2, которые затем транспортируются в аппарат Гольджи для пост-трансляционной обработки. Все три полученных белка имеют сигналы апикального сортинга ("apical sorting signals"), которые направляют их к плазмалемме, где впоследствии происходит сборка вирусов.

Отпочковывание новых вирусов инициируется накоплением Ml белка в цитоплазме вблизи плазмалеммы. НА белок всё ещё прикреплен к сиаловой кислоте, когда отпочковывание вирусов уже завершено. За отделение вируса от мембраны клетки отвечает NA белок, который отрезает отпочковавшуюся вирусную частицу от сиаловой кислоты и даже удаляет кусочки этой кислоты от поверхности мембраны вируса [53; 21; 65].

1.1.3 Функции белков

Гемагглютин (НА) - один из поверхностных белков, состоит из двух субъединиц: НА1 и НА2. Они соединяются друг с другом посредством дисульфидных мостиков. НА1 имеет глобулярную конформацию и отвечает за прикрепление вириона к соответствующему рецептору клетки-хозяина. Также НА1 несёт главную антигенную детерминанту молекулы НА. НА2 имеет форму фибриллы и отвечает за слияние мембран вириона и клетки-хозяина.

Общая функция НА заключается в том, что благодаря этому белку вирион соединяется с клеткой-хозяином, а также НА инициирует рецептор-ассоциированный эндоцитоз [44].

Нейраминидаза (NA) - другой поверхностный белок, функция которого заключается в отделении новых вирусных частиц от поверхности клетки-хозяина, путем «разрезания» сиаловой кислоты. Также NA повышает вирулентность вируса, разрушая муцин в респираторном тракте и позволяя проходить сквозь респираторный эпителий [61].

При разговоре о «внутренних» белках вириона в первую очередь стоит упомянуть полимеразный комплекс белков РВ1, РВ2 и РА. Общая функция этого комплекса заключается в транскрипции и репликации вирусного генома. В то же время у каждого белка-субъединицы есть и свои функции. Белок РВ2 отвечает за связывание с "cap" на клеточных мРНК [41]. РА белок отвечает за связывание с промотором кРНК, а также вместе с РВ2 белком за отщепление и присоединение cap к синтезирующейся вирусной мРНК. Стоит отметить, что работа полимераз в отношении вРНК и кРНК немного различается, поскольку РА по большей части контактирует с кРНК, а РВ1 соединяется с промотором вРНК, в то время как РВ2 одинаково связывается с промоторами обоих типов РНК [21]. Также, при попадании в ядро клетки полимеразные белки способны свзявать с клеточной РНК полимеразой II, деактивируя ее и, таким образом, останавливая синтез клеточной мРНК.

NP белок имеет положительный заряд и упаковывает вирусную РНК благодаря электростатическим взаимодействиям с ней. Также он взаимодействует с Ml белком и со всем РНП-комплексом, а на финальной стадии цикла развития вируса гриппа NP отвечает за отпочковывание новых вирусных частиц.

Белки М2 и NS2 также играют большую роль в цикле развития вируса. В частности, М2 белок представляет из себя протонные каналы, благодаря которым в эндосоме инициируется попадание РНП-комплекса в цитоплазму. NS2 белок, как уже говорилось ранее, обеспечивает транспорт свежеобразованных РНП-комплексов из ядра клетки и последующий транспорт к точке отпочковывания вирусов. [21]

Также стоит отметить, что в последние годы, благодаря достижениям молекулярной вирусологии были открыты несколько новых белков вируса гриппа А.

Одним из таких белков является белок названный РВ1-Р2. Предполагается, что его функция заключается в индуцировании апопототических процессов у макрофагов, что существенно снижает их способность к иммунному ответу [94].

Кроме того, были также открыты белки названные РА-Х и РВ1-№0, но на данный момент их функции до конца не ясны [63].

1.1.4 Генетическая изменчивость вируса гриппа

Известно, что вирус гриппа обладает двумя свойствами отвечающими за его антигенную изменчивость: антигенный сдвиг и антигенный дрейф.

Антигенный сдвиг

Антигенный сдвиг основан на способности вирусов гриппа к реассортации. Реассортация - это процесс, напрямую связанный с сегментированностыо генома вируса гриппа, который может происходить при заражении одной и той же клетки как минимум двумя различными штаммами вируса гриппа. При таком совместном заражении дочерние штаммы могут обладать смешанным геном, содержащим сегменты как от одного, так и от другого родительского штамма. Реассортация играет колоссальную роль в изменчивости вирусов гриппа.

Стоит отметить, что вирусы гриппа В и С достаточно однородны по антигенной структуре поверхностных белков, поэтому штаммы данных вирусов отонсят к одному серотипу, в отличие от вируса гриппа А. Этим отчасти обусловлено то, что вирус гриппа А обладает более широким кругом хозяев, т.е. кроме человека он встречается у таких млекопитающих, как свиньи, норки, лошади, собаки, а также среди большого количества видов птиц.

Антигенный сдвиг - способность присущая только вирусу гриппа А, во время которой один вирус обменивается РНК-сегментами, кодирующими белки НА и ИА, с вирусом другого сероподтипа. В случае подобной реассортации между вирусами гриппа человека и других животных может получиться вирус, обладающий совершенно новыми антигенными свойствами, к которым у людей нет иммунитета. При этом, вирус с антигенно новыми для человека НА и/или ЫА может оказаться хорошо адаптированным к репродукции в клетках человека за счёт внутренних генов, унаследованных от второго предкового штамма. Благодаря появлению таких

«новых» вирусов гриппа, могут даже возникать пандемии [21]. Например, считается, что пандемия «Испанки» в 1918-1919 годах была вызвана вирусом сероподтипа H1N1, который возник благодаря антигенному сдвигу [89].

Антигенный дрейф.

Антигенный дрейф также касается генов, кодирующих поверхностные белки НА и NA, и заключается в накоплении мутаций в данных генах, что соответственно ведёт к появлению нового варианта вируса гриппа, который в свою очередь обладает новыми антигенными свойствами. Стоит заметить, что дрейф, в отличие от сдвига, гораздо более медленный процесс [93].

В данном процессе важны мутации именно в эпитопах поверхностных белков. Поскольку мутации могут приводить к изменению сайтов гликозилирования белков, это может привести к экранированию эпитопа, который раньше могло узнавать антитело. В конечном итоге антигенный дрейф может привести к полному отсутствию узнавания со стороны антител к предыдущему антигенному варианту вируса гриппа [19].

Стоит отметить, что, в отличие от антигенного сдвига, антигенный дрейф характерен для всех серотипов вируса гриппа, поскольку дрейф является по сути продуктом ошибок в работе РНК-полимеразы, которая делает примерно 1 ошибочную вставку нуклеотида на 10 000-100 000 оснований и не имеет системы исправления ошибок, которую имеет ДНК-полимераза [83]

1.2 Живые гриппозные вакцины

Важнейшим методом защиты от вируса гриппа является профилактика вакцинами. Существует два основных вида гриппозных вакцин: живые и инактивировапные.

1.2.1 Инактивированные вакцины

Инактивированная - это вакцина, полученная из живого вируса с подавленной активностью. Обычно подавление вирулентности происходит с помощью облучения ультрафиолетом, при воздействии высоких температур (50-60°С) или при воздействии различных химических веществ, таких как формальдегид, гидроксиламин и т.д. Существует два типа инактивированных гриппозных вакцин: сплит-вакцина (расщепленная) и субъединичная. Сплит-вакцина состоит из разрушенных инактивированных вирионов вируса гриппа, при условии того, что в вакцине содержаться все белки данного вириона. Субъединичная, напротив, содержит лишь два белка инактивированного вируса - гемагглютинин и нейраминидаза, поскольку эти поверхностные белки играют наибольшую роль в формировании иммунитета против вируса гриппа [2].

Впрочем, существуют также и другие виды инактивированных вакцин, которые гораздо меньше распространены.

Одним из таких видов являются культуральные вакцины. Отличие данного вида вакцин состоит в том, что их получают на культуре клеток, а не на куриных эмбрионах. Дело в том, что последние могут быть контаминированы ретровирусами, а также вакцины полученные на основе куриных эмбрионов могут вызвать осложнения у лиц, обладающих аллергией на белок куриных яиц [76]. Культуральные вакцины получают и размножают на клетках MDCK или Vero, в присутствии гипоаллергенной среды [71].

Как уже упоминалось раннее, вирус гриппа способен к очень быстрой изменчивости благодаря способности к антигенному сдвигу и дрейфу, что

весьма осложняет производство вакцины, так как всегда есть вероятность, что вакцинные штаммы вируса уже неактуальны для циркулирующих сезонных штаммов. Поэтому необходимо каждый год разрабатывать новые вакцины именно против актуальных штаммов. Из-за этого был предложен метод получения универсальных вакцин против гриппа, на основе различных вирусных белков.

Один из видов универсальной вакцины был основан на эктодомене М2 белка, поскольку данный белок является консервативным, а также сходен по антигенной специфичности у всех вируса серотипа А [66]. Однако возникают опасения, что данный вид вакцин также будет не слишком эффективным, так как после внедрения такой вакцины М2 белок вируса гриппа может начать мутировать вследствие способности к сдвигу и дрейфу [62].

1.2.2 Живые гриппозные вакцины.

Живые гриппозные вакцины являются штаммами вируса гриппа, ослабленными в лабораторных условиях, и сохранившими некоторую способность размножаться в верхних дыхательных путях человека, в то же время вызывая выработку иммунитета против диких штаммов вируса гриппа [1].

Данный вид вакцин вводится интраназально, и в отличии от инактивированных вакцин способен вызывать системный и мукозальный иммунный ответ против нативных гемагглютинина и нейраминидазы благодаря созданию антител в носовой полости, которые очень похожи на антитела создаваемые при заражении «настоящим» вирусом гриппа [15]. ЖГВ ведут к появлению иммунного ответа не только к вакцинным штаммам, но и к родственным им штаммам [70]

В состав ЖГВ входят холодоадаптированные,

температурочувствительные штаммы вируса гриппа, которые сами по себе не могут привести к заболеванию гриппом, поскольку обладают значительно сниженной способностью к размножению. Холодоадаптация данных

вирусов означает, что они приобретают способность эффективно размножаться при и пониженных температурах (<25°С), и при этом не способны размножаться при температурах более 37°С, что предотвращает распространение вируса в нижние отделы дыхательной системы, в том числе, в лёгкие. В ЖГВ включенны 2 штамма вируса гриппа А (сероподтипов H1N1 и H3N2) и 1 штамм вируса гриппа В [15]. Данные вакцинные штаммы созданы путём «классической» реассортации или путём обратной генетики, о которых мы поговорим в последующих главах.

1.2.3 История вопроса

При первых попытках создания ЖГВ применялись не холодоадаптированные штаммы, a ts мутанты, полученные путём химического мутагенеза и /zr-штаммы. Для создания hr-мутантов использовали штаммы вируса, которые после многократных пассажей на куриных эмбрионах изменили генетический признак, отвечающий за специфический круг хозяев для данного подвида вируса гриппа, т.н. hostrange или hr признак [23]. Однако такой способ был крайне неудобен, из-за того что невозможно было рассчитать количество пассажей, необходимых для достаточной аттенуации вируса, и в результате можно было получить штамм либо гипеаттенуированный, либо аттенуированный недостаточно [17].

В последствии была предложена идея создания ЖГВ на основе температурочувствительных (ts) мутантов. Это представлялось возможным, благодаря тому, что ts мутанты, полученные путём ненаправленного мутагенеза (например, химический мутагенез), утрачивали способность размножаться при повышенной температуре и, следовательно, снижали свою вирулентность [59]. Однако проблема в использовании данного типа вакцин возникла из-за генетической нестабильности данных мутантов [92].

Также были попытки создать живые гриппозные вакцины на основе реассортантов эпидемических штаммов с вирусами гриппа птиц. Как и, в

последствии, холодоадаптированиые ЖГВ, подобные «птичьи» вакцины имели поверхностные белки от диких штаммов, в то время как внутренние белки были заимствованы от вируса гриппа птиц серотипов H3N8 и H2N2 [26]. Однако из-за использования подобных доноров аттенуации возникал ряд проблем, поскольку некоторые реассортанты оказались излишне реактогенными. Было предположено, что это может вызвать начало циркуляции генов вируса гриппа птиц у людей, поэтому эксперименты с подобного рода ЖГВ не были продолжены [92].

1.2.4 Холодоадаптированные вакцины

ХА вакцины в России

Наиболее удачным путём получения ЖГВ оказался способ получения холодоадаптированных (ХА) штаммов вируса гриппа. ХА штаммы получают при пассажах вируса гриппа на куриных эмбрионах при пониженной температуре. А затем, из полученных штаммов создают реассортанты. Вакцинные реассортанты должны иметь в своём составе 6 генов от ХА штамма, кодирующие «внутренние» белки вируса (РВ2, РВ1, PA, М, NP и NS) и 2 «поверхностных» гена, унаследованных от дикого эпидемического штамма (НА и NA).

В России первым полученным холодоадаптированным штаммом стал А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш). Для выработки необходимого фенотипа было проведено 20 пассажей при 32°С и 17 пассажей при 25°С дикого штамма А/Ленинград/134/57(Н2М2) с последующем клонированием методом конечных разведений в куриных эмбрионах. Полученный штамм А/Ленинград/134/17/57(H2N2) обладал всеми необходимыми требованиями к холодоадаптированным вирусам, то есть размножался при пониженной температуре (25°С) и не размножался при повышенной температуре (40°С) [1]. После изучения состава генома данного штамма, было выяснено, что в нём имеется 11 мутаций, 8 из которых оказались кодирующими, то есть привели к аминокислотным заменам. Такие мутации оказались в генах,

кодирующих белки РВ2, РВ1, РА, Ml, М2, NS2 и NA [49; 51]. Также был создан ещё один ХА штамм на основе штамма А/Ленинград/134/57(H2N2), прошедший большее количество пассажей при низкой температуре. Для его получения было проведено дополнительно 8 пассажей штамма А/Ленинград/134/17/57(H2N2) при 28°С и 22 пассажей при 25° С с последующим клонированием методом конечных разведений в куриных эмбрионах. Полученный штамм был назван А/Ленинград/34/47/57(Н2Ы2), и он также обладал всеми необходимыми фенотипическими свойствами, а также был менее реактогенен для детей по сравнению со штаммом А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш). В полученном штамме были сохранены все мутации, что и в штамме А/Ленинград/134/17/57(H2N2), но также были приобретены и новые мутации. Всего было обнаружено 17 замен нуклеотидов, 11 из которых привели к аминокислотным заменам. Они находились в генах, кодирующих белки РВ1, РВ2, РА, NP, Ml, М2, NS2, НА и NA [1]. Этот штамм использовали до 2003 года в качестве отдельного штамма-донора аттенуации для детской вакцины, наряду с штаммом А/Ленинград/134/17/57(Н2№), который использовали для взрослых. После 2003 года перешли на использование исключительно штамма А/Лени11град/134/17/57(H2N2) [7]

Тем не менее, штамм А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш) обладает некоторыми недостатками. Было выяснено, что данный штамм обладает генетической гетерогенностью и реактогенностью для детей младшего возраста [1].

Позже были получены и ХА штаммы необходимые для создания ЖГВ против вируса гриппа В. Это были штаммы В/Ленинград/14/17/55 и В/СССР/60/69. Оба приобрели необходимые фенотипы и не размножались при температуре 38°С и размножались при пониженной температуре 25°С [1]. В настоящее время на территории России ФГУП «НПО «Микроген» производит ЖГВ «Ультравак», которая представляет собой рекомбинантные

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Терехов, Андрей Вадимович, 2014 год

Список литературы

1. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа // СПб.: Наука. - 1994. - 151с.

2. Геидон Ю.З. Ин активированная расщепленная гриппозная вакцина ВАКСИГРИПП // Вакцинация. - 2000. - №5(11)

3. Гендон Ю.З. Живая холодоадаптированная гриппозная вакцина: современное состояние // Вопросы вирусологии. - 2011. - №1.

4. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М., Акопова И.И., Ахматова Н.К., Коптяева И.Б. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа // Вопросы вирусологии. - 2013. -№ 1. - С. 11-17

5. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Климов А.И. Определение состава генома реассортантных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа В методом рестриктазного анализа // Вопросы вирусологии. — 2007. - №52(3). -С 16-19.

6. Киселёва И.В., Климов А.И. Анализ мутаций в геноме холодал оптированных штаммов вируса гриппа А с использованием расширенной модификации ПЦР-рестриктного метода. //Вопросы вирусологии. - 2002. - №47. - С 24-27.

7. Киселёва И.В., Климов АЛ., Григорьева Е.П., Ларионова Н.В., Александрова Г.И. и др. Генетический и фенотипический анализ гетерогенной популяции холодоадоптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н21Ч2) и реассортантных гриппозных вакцинных штаммов, подготовленных на его основе. // Вопросы вирусологии. — 2005. -№50.-С 14-18.

8. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУ 3.3.2.1758-03

9. Неведомская Г.Н., Медведева Т.Е., Жихарева И.В., Климов А.И., Александрова Г.И. Оценка степени аттенуации холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А на моделях мышей линии СВА и сирийских хомячков // Вопросы вирусологии. -1992. - №1(37). - С 37-40.

10. Полежаев Ф.И., Гармашова JI.M., Румовский В.И., Александрова Г.И., Смородинцев А.А. Особенности получения атгенуированных термочувствительных рекомбинантов вируса гриппа типа А в конце эпидемического цикла H3N2 // Acta Virol. - 1980. - №24. - С 273-278.

11. Соло1уб T.B., Ледванов М.Ю., Малый В.П., Стукова Н.Ю., Романцов М.Г., Бизенкова М.Н., Полякова Т.Д. Патогенез вирусных инфекций // Фундаментальные исследования. - 2009. - №10. - С 55-60

12. Ханаан Дж. Методы трансформации E.coli. Клонирование ДНК, методы. Под ред. Гловера. // М.: Мир. - 1988. - С 140-174.

13. Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии. Изд 2-е, переработанное и дополненное. // 1954. - 380 с.

14. Ю.З. Гендон, С.Г. Маркушин, T.M. Цфасман, И.И. Акопова, Н.К. Ахматова, И.Б. Коптяева. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа // Вопросы вирусологии. — 2013.- №1.- С 11-17.

15. Ambrose CS, Luke С, Coelingh К. Current status of live attenuated influenza vaccine in the United States for seasonal and pandemic influenza // Viruses. - 2008. - № 2. - P 193-202;

16. Barclay, W. S., and Palese, P. Influenza В viruses with sitespecific mutations introduced into the HA gene // J. Virol. - 1995. - №69. - P 1275- 1279.

17. Beare A, Bynoe M, Tyrrell D. Investigation into the attenuation of influenza viruses by serial passage // Br Med J. -1968. - №4. - P 482.

18. Belshe RB, Mendelman PM, Treanor J, King J, Gruber WC, Piedra P, et al. The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenzavirus vaccine in children // N Engl J Med. - 1998. - №338. - P 14051412;

19. Boni MF. Vaccine. // Suppl. - 2008. - №3. - P 8-14

20. Boulo S, Akarsu H, Ruigrok RW, Baudin F. Nuclear traffic of influenza virus proteins and ribonucleoprotein complexes // Virus Res. - 2007. -№124. -P 12-21

21. Bouvier N.M, Palese P. The biology of influenza viruses. // Vaccine. -2008.- №26.-P 49-53

22. Bracco Neto H, Farhat CK, Tregnaghi MW, Madhi SA, Razmpour A, Palladino G, et al. Efficacy and safety of 1 and 2 doses of live attenuated influenza vaccine in vaccine-naive children // Pediatr Infect Dis J. - 2009. - №28. - P 365371;

23. Burnet F, Bull D. Changes in influenza virus associated with adaptation passage in chick embryos // Aust J Exp Biol Med Sci. - 1943. - №21. -P 55-69.

24. Castrucci, M. R., and Kawaoka, Y. Reverse genetics system for eneration of an influenza A virus mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein // J. Virol. -1995. - №69. - P 2725-2728.

25. Cha T.-A., Kevin K., Zhao J., Fast P.E., Mendelman P.M. et al. Genotypic stability of cold-adapted influenza virus vaccine in an efficacy clinical trial. //Journal of clinical microbiology. - 2000. - №38(2). - P 839-845.

26. Clements M, Sears S, Christina K, et al. Comparison of the virologie and immunologic responses of volunteers to live avian-human influenza A H3N2 reassortant virus vaccines derived from 2 different avian influenza virus donor // J Clin Microbiol. - 1989. - №27. - P 219-223.

27. Collins, P. L., Hill, M. G., Camargo, E., Grosfeld, H., Chanock, R. M., and Murphy, B. R. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 59 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. -№92. -P 11563-11571.

28. Cox N, Kitame F, Kendal A, et al. Identification of sequence changes in the cold-adapted, live attenuated influenza vaccine strain A/Ann/Arbor/6/60 (H2N2) // Virology. -1988. - №167. - P 554-567.

29. Durbin, A. P., Hall, S. L., Siew, J. W., Whitehead, S. S., Collins, P. L., and Murphy, B. R. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA // Virology. - 1997. - №235. - P 323-332.

30. Egorov A., Brandt S., Sereinig S. et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells // Virol. - 1998. - № 72. - P 6437 - 6441.

31. Enami, M., and Palese, P. High-efficiency formation of influenza virus transfectants // J. Virol. - 1991. - №65. - P 2711-2713.

32. Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M., and Palese, P. Introduction of site-specific mutations into the genome of influenza virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - №87. - P 3802-3805.

33. Enami, M., Sharma, G., Benham, C., and Palese, P. An influenza virus containing nine different RNA segments // Virology. - 1991. - №185. - P 291-298.

34. Garcin, D., Pelet, T., Calain, P., Roux, L., Curran, J., and Kolakofsky, D. A highly recombinogenic system for the recovery of infectious Sendai paramyxovirus from cDNA: Generation of a novel copy-back nondefective interfering virus // EMBO J. - 1995. - №14. - P 6087-6094.

35. Hale BG, Randall RE, Ortin J, Jackson D. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses // J Gen Virol. - 2008. - №89 (pt 10). - P 2359-2376

36. Herlocher M.L., Maassab H.F., Webster R.G. Molecular and biological changes in the cold-adapted "master strain" A/AA/6/60 (H2N2) influenza virus // Proceedings of National Academy of Sciences USA. - 1993. -№90. -P 6032-6036.

37. Herlocher ML, Clavo AC, Maassab HF. Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation // Virus Res. - 1996. - №42. - P 11-25.

38. Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - №97. -P 6108-6113.

39. Hoffmann E., Krauss S., Perez D. et al. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines // Vaccine. - 2002. - №20. - P 3165 -3170.

40. Honda A., Mizumoto K., Ishihama A. Two separate sequences of PB2 subunit constitute the RNA cap-binding site of influenza virus RNA polymerase. // Genes to cells. -1999. - №4(8). - P 471-478

41. Honda, A., Mukaigawa, J., Yokoiyama, A., Kato, A., Ueda, S., Nagata, K., Krystal, M., Nayak, D. P., and Ishihama, A. Purification and molecular structure of RNA polymerase from influenza virus A/PR8 // J. Biochem. - 1990. -№107.-P 624-628.

42. http://www.microgen.ru/

43. Iwatsuki-Horimoto K, Horimoto T, Fujii Y, Kawaoka Y. Generation of influenza A virus NS2 (NEP) mutants with an altered nuclear export signal sequence // J. Virol. - 2004. - №78.

44. J. Wilschut, J.E. McElhaney. Influenza // US: Mosby. - 2005. - 216

pp.

45. Jin, H., Lu, В., Zhou, H., Ma, C., Zhao, J., Yang, C. F., Kemble, G. & Greenberg, H. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted А/Энн Арбор/6/60 // Virology. - 2003. - №306. - P 18-24.

46. Kiseleva I, Su Q, Toner TJ, Szymkowiak C, Kwan WS, Rudenko L, Shaw AR, Youil R. Cell-based assay for the determination of temperature sensitive and cold adapted phenotypes of influenza viruses // J Virol Methods. - 2004. -№116(1). -P 71-78

47. Kiseleva, I. V. The bases of influenza virus A attenuation // Doctor thesis. - 2001.

48. Kistner O, Bazzet P, Mundt W, et al. A novel mammalian cell (Vero) derived influenza virus vaccine: development, characterization and industrial scale production. // WienKlin Wschr. -1999. - №111.-P203-221.

49. Klimov A, Cox N, Yotov W, et al. Sequence change in the live attenuated cold-adapted variant of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus // Virology. - 1992. - №186. - P 795-797.

50. Klimov A, Kiseleva I,Desheva J, et al. Live attenuated reassortant influenza vaccine prepared using A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) donor strain is genetically stable after replication in children 3-6 years of age // Options for the Control of Influenza IV.Excerpta Medica. - 2001. - P 951-954.

51. Klimov A, Romanova Y, Egorov A, et al. Nucleotide sequence of the neuraminidase gene of influenza A/Leningrad/134/57/47 (H2N2) virus and two of its live attenuated, cold-adapted variants // Virus Genes. - 1995. - №10. - P 95-98.

52. Klimov A.I., Cox NJ. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted réassortant live influenza vaccines //Virological Methods. - 1995. - №52. - P 41-49.

53. Lamb R.A., Krug R.M. 2001 Orthomyxoviridae. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al.; Fields Virology, 4-th edition. // Lippincott Williams & Wilkins. - 2001.

54. Li Z, Jiang Y, Jiao P, Wang A, Zhao F, Tian G, Wang X, Yu K, Bu Z, Chen H. The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses // J. Virol. - 2006. - №80. - P 11115-11123.

55. Li, S., Xu, M., and Coelingh, K. Electroporation of influenza virus ribonucleoprotein complexes for rescue of the nucleoprotein and matrix genes // Virus Res. - 1995. - №37. -P 153-161.

56. Luytjes, W., Krystal, M., Enami, M., Pavin, J. D., and Palese, P. Amplification, expression and packaging of a foreign gene by influenza virus // Cell. - 1989. - №58. - P 1107-1113.

57. Maassab H, De Borde B. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines // Vaccine. - 1985. - №3. - P 355-369.

58. Maassab HF, Bryant ML. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans // Rev. Med. Virol. — 1999. - №9. - P 237-244.

59. Mackenzie J. Virulence of temperature-sensitive mutants of influenza virus // Br Med J. - 1969. - №3. - P 757-758.

60. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. (A laboratory manual). // Cold spring harbor laboratory. - 1982. - 545 pp.

61. Matrosovich MN, Matrosovich TY, Gray T, Roberts NA, Klenk HD. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium // J Virol. - 2004. - №78(22). - P 12665-12667.

62. Michael Schotsaert, Marina De Filette, Walter Fiers, Xavier Saelens. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments // Expert Rev Vaccines. -2009. - №8(4). - P 499-508

63. Muramoto Y, Noda T, Kawakami E, Akkina R, Kawaoka Y. Identification of novel influenza A virus proteins translated from PA mRNA // J Virol. - 2013. - №87(5). - P 2455-2462.

64. Muster T, Guinea R, Trkola A, Purtscher M, Klima A, Steindl F, Palese P, Katinger H. Cross-neutralizing activity against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence ELDKWAS // J. Virol. - 1994. - №68. - P 4031-4034.

65. Nayak D.P., Baloguna R.A., Yamada H., Zhou Z.H., Barman S. Influenza virus morphogenesis and budding // Virus Research. - 2009. -№143(2). —P 147-161.

66. Neirynck S, Deroo T, Saelens X, Vanlandschoot P, Jou WM, Fiers W., A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein//Nat Med.- 1999. -№5(10).-P 1157-1163.

67. Neumann G, Fujii K, Kino Y, Kawaoka Y. An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - №102. - P 16825-16829.

68. Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P.,Hughes, M., Perez, D., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., and Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999. - №96. -P 9345-9350.

69. Neumann, G., Zobel, A., and Hobom, G. RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNA molecules // Virology. - 1994. - №202. — P 477-479

70. Nichol KL, Mendelman PM, Mallon KP, Jackson LA, Gorse GJ, Belshe RB, Glezen WP, Wittes J. Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial // JAMA. - 1999. - №282(2). -P 137-144.

71. Palach A, Scheepers H, de Regt V, et al. Safety, reactogenicity and immunogenicity of Madin Darby Canine kidney cell-derived inactivated influenza subunit vaccine. A meta-analysis of clinical studies // Dev Biol Stand. - 1999. -№98. -P 115-125.

72. Parks, C. L., Latham, T., Cahill, A., O'Neill, R. E., Passarotti, C. J., Buonagurio, D. A., Bechert, T. M., D'Arco, G. A., Neumann, G. & other authors. Phenotypic properties resulting from directed gene segment reassortment between wild-type A/Sydney/5/97 influenza virus and the live attenuated vaccine strain // Virology. - 2007. - №367. - P 275-287.

73. Parvin, J. D., Palese, P., Honda, A., Ishihama, A., and Krystal, M. Promoter analysis of influenza virus RNA polymerase // J. Virol. - 1989. - №68. -P5142-5152.

74. Paterson D, Fodor E. Emerging roles for the influenza A virus nuclear export protein (NEP) // PLoS Pathog. - 2012. - №8(12)

75. Pekosz, A., He, B., and Lamb, R. A. Reverse genetic of negativestrand RNA viruses: Closing the circle. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999. - №96. - P 88048806.

76. Petricciani J. Regulatory philosophy and acceptability of cell for production of biological // Dev Biol Stand. - 1991. - №75. -P 9-15.

77. Pleschka, S., Jaskunas, R., Engelhardt, O. G., Zurcher, T., Palese, P., and Garcia-Sastre, A. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus // J. Virol. - 1996. - №70. - P 4188-4192.

78. Plotch, S. J., Bouloy, M., Ulmanen, I., and Krug, R. M. A unique cap(m7GpppXm)-dependent influenza virion endonuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription // Cell. - 1981. -№23.-P 847-858

79. Polezhaev FI, Garmashova LM, Polyakov YM, Golubev DB, Aleksandrova GI. Conditions for production of thermosensitive attenuated influenza virus recombinants // Acta Virol. - 1978. - №22. - P 263-269.

80. Rowley, K. V., Harvey, R., and Barclay, W. S. Isolation and characterization of a transfectant influenza B virus altered in RNA segment 6 // J. Gen. Virol. - 1999. - №80. -P 2353-2359.

81. Sereinig S, Stukova M, Zabolotnyh N, Ferko B, Kittel C, Romanova J, Vinogradova T, Katinger H, Kiselev O, Egorov A. Influenza virus NS vectors expressing the Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Thl immune response and protect animals against tuberculosis challenge // Clin. Vaccine Immunol. - 2006. - №13. - P 898-904.

82. Shcherbik S, Sergent SB, Davis WG, Shu B, Barnes J, Kiseleva I, Larionova N, Klimov A, Bousse T. Application of real time RT-PCR for the genetic homogeneity and stability tests of the seed candidates for live attenuated influenza vaccine production // J Virol Methods.- 2014. - №195. - P 18-25

83. Smith D.B., Inglis S.C. The mutation rate and variability of eukaryotic viruses: an analytical review // Journal of General Virologyl987. - №68. - P 27292740.

84. Song H, Nieto GR, Perez DR. A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates // J. Virol. -2007. - №81. - P 9238-9248.

85. Subbarao, E. K., Kawaoka, Y., and Murphy, B. R. Rescue of an influenza A virus wild-type PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-

specific temperature-sensitive and attenuating mutation I I J. Virol. -1993. - №67. -P 7223-7228.

86. Sugiura A., Ueda M. Neurovirulence of influenza virus in mice. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent strains // Virol. -1979. - №101.-P 440-449.

87. Suguitan AL, McAuliffe J, Mills KL, Jin H, Duke G, Lu B, Luke CJ, Mureny B, Swayne DE, Kemble G, Subbarao K. Live, attenuated influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in Mice and Ferrets // PLoS Medicine.-2006. - №3. -P 1541-1555

88. T.M. Tsfasman, S.G. Markushin, I.I. Akopova and Y.Z. Ghendon. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ (non-temperature-sensitive) phenotype of influenza A cold-adapted (ca) virus strains // Journal of General Virology. - 2007. - №88. - P 2724-2729

89. Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, Zeng H, Solorzano A, Swayne DE, et al. Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus // Science. - 2005. - №310(5745). - P 77-80.

90. Watanabe T, Watanabe S, Ito H, Kida H, Kawaoka Y. Influenza A virus can undergo multiple cycles of replication without m2 ion channel activity // J. Virol. - 2001. - №75. -P 5656-5662.

91. WHO Technical Report Series No. 878. - 1998.

92. Wright P, Karzon D. Live attenuated influenza vaccine // Prog Med Virol. - 1987. - №34. -P 70-79.

93. Wright P.F., Webster R.G. Orthomyxoviruses. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al. Fields Virology, 4-th edition // Lippincott Williams & Wilkins. - 2001.

94. Zamarin D, et al. Influenza virus PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1 // PLoS Pathog. - 2005.

95. Zhou, B., Li, Y., Speer, S. D., Subba, A., Lin, X. & Wentworth, D. E. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses // Vaccine. - 2012. - №30. - P 6341-6349