Генетические дефекты и полиморфизм гена каппа-казеина у племенного молочного скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Никифорова, Екатерина Геннадьевна

• Никифорова, Екатерина Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Никифорова, Екатерина Геннадьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика основных продуктивных показателей молочного скота Ленинградской области

1.2. Обзор молекулярно-генетических маркеров, используемых в селекции

1.3. Преимущества полимеразной цепной реакции в сравнении

с другими методами анализа

1.4. История выявления вредных рецессивных мутаций у крупного рогатого скота

1.5. Использование полимеразной цепной реакции в выявлении

мутаций ВЬАР, СУМ и ОЦМ8 у крупного рогатого скот

1.6. Использование полимеразной цепной реакции в выявлении аллельных вариантов гена каппа-казеина

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Выделение и определение качества ДНК из проб крови

36

2.2. Оптимизация процедуры полимеразной цепной реакции для выявления рецессивных мутаций и аллелей гена каппа-казеина

39

2.3. Проведение полимеразной цепной реакции для выявления рецессивных мутаций BLAD, СУМ и DUMPS

41

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции для выявления генотипов по гену каппа-казеина

44

2.5. Анализ фрагментов ДНК в агарозном геле

44

2.6. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Встречаемость мутации ВЬАБ и СУМ в различных хозяйствах Ленинградской области

3.2. Типы гена каппа-казеина и их частота встречаемости у коров Ленинградской области

3.3. Связь генотипов гена каппа-казеина и продуктивных качеств коров 79 ВЫВОДЫ 88 ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 90 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ И УСЛОВНЫХ

ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК SflS - додецилсульфат натрия ЭДТА - этилендиаминтетраацетат SNP - однонуклеотидный полиморфизм

RAPD - полиморфизм ДНК, выявляемый случайными праймерами

BLAD - дефицит адгезивности лейкоцитов

CVM - комплексное уродство позвоночника

DUMPS - дефицит фермента уридинмонофосфатсинтетазы

л

X - критерий Пирсона соответствия наблюдаемой частоте встречаемости генотипа в популяции теоретически ожидаемой частоте

мМ, цМ - миллимолярная и микромолярная концентрация, соответственно

Праймер - олигонуклеотид, служащий затравкой в ПЦР

Олигонуклеотид - короткая последовательность дезоксинуклеотидов одноцепочечной ДНК

Полимеразная цепная реакция - молекулярно-генетический метод, позволяющий многократно амплифицировать изучаемый участок ДНК

Генотипирование - молекулярно-генетические методы, позволяющие выявит различия между индивидами на уровне генов или ДНК

Ферменты рестрикции - ферменты, расщепляющие ДНК в строго определенных участках, позволяющие выявить однонуклеотидные полиморфизмы в этих участках.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические дефекты и полиморфизм гена каппа-казеина у племенного молочного скота»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Летальные рецессивные мутации могут наносить большой экономический ущерб отрасли животноводства во многих странах мира, в том числе в России. В племенных хозяйствах Ленинградской области их распространение практически не изучено. Актуальность проведенных исследований определяется необходимостью выявить вредные рецессивные мутации в популяциях племенных животных Ленинградской области, особенно у быков-производителей с целью ограничения их распространения в процессе разведения. Своевременный мониторинг позволит снизить частоту встречаемости этих дефектов и, таким образом, повысить воспроизводительные качества племенных животных, повысить резистентность к бактериальным инфекциям. Генотипирование по гену каппа-казеина даст возможность определить структуру стад по типам этого гена и идентифицировать животных-носителей определенных аллелей. Связь аллелей гена каппа-казеина с удоями, содержанием жира и белка в молоке исследовали многие авторы, однако выводы из этих работ носят противоречивый характер. Поэтому изучить этот вопрос на примере высокопродуктивных племенных животных Ленинградской области является актуальной задачей для современного молочного скотоводства. Целью является преимущественное использование носителей благоприятных аллелей в селекционном процессе.

Цель и задачи исследования. Цель представленной работы заключается в выявлении распространенности вредных рецессивных мутаций и типов каппа-казеина в племенных стадах черно-пестрой голштинизированной и айрширской пород в Ленинградской области.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- модифицировать способ выделения геномной ДНК, пригодной для генотипирования методом ПЦР;

- оптимизировать процедуру проведения ПЦР на предмет выявления мутаций ВЬАЭ СУМ и БЦМ8, а также типов каппа-казеинов;

- провести генотипирование на предмет носительства вредных рецессивных мутаций и выявления аллельных вариантов гена каппа-казеина у животных 6-ти хозяйств Ленинградской области, а также быков племпредприятия ОАО «Невское» по племенной работе;

- обеспечить быстрый ответ специалистам хозяйств касательно результатов генотипирования;

- выявить связь между аллельными вариантами гена каппа-казеина и рядом продуктивных признаков у коров (удой, содержание жира и белка), а также у коров-дочерей быков в сравнении со сверстницами (удой, содержание жира и белка).

Объект исследования. Объектом исследования служили образцы ДНК, выделенные из крови либо спермы племенных животных из племпредприятия ОАО «Невское по племенной работе» или 6-ти племенных хозяйств Ленинградской области - ЗАО ПЗ «Рабитицы», ЗАО ПЗ «Петровский», ОАО ПЗ «Лесное», ЗАО ПЗ Ленинский путь», ЗАО ПЗ «Гражданиский», ОАО ПЗ «Новол адожский».

Методы исследования. Основным методом исследования была полимеразная цепная реакция со специфическими праймерами с последующим расщеплением продуктов амплификации ферментами рестрикции (ПЦР-ПДРФ). Результаты генотипирования обрабатывали общепринятым статистическим анализом по традиционному критерию достоверности и с использованием пакетного анализа программы MS Excel 2007 (t-тест, гетероскедастический анализ).

Основные положения, выносимые на защиту:

- оптимизация процедуры быстрого выделения ДНК и проведения ПНР;

- профили аллелей мутаций BLAD, CVM и DUMS у племенных животных;

- необходимость проведения генотипирования в современных условиях индустриального животноводства;

- анализируемые популяции молочного скота находятся в равновесии по частотам аллелей (равновесие по Харди-Вайнбергу);

- существует связь генотипов по гену каппа-казеина с продуктивными признаками у коров.

Научно-практическая значимость. Проведенный ПЦР-ПДРФ анализ на предмет выявления мутаций BLAD, СУМ и DUMS позволяет понять степень распространенности этих мутаций у племенных животных. Эти знания позволяют проводить эффективный контроль частоты встречаемости мутаций в процессе селекционной работы с целью недопущения фенотипического проявления этих мутаций, наносящих существенный экономический ущерб хозяйствам. Выявленная связь аллели «В» с молочной продуктивностью позволит проводить селекцию с учетом этого показателя.

Научная новизна. Оптимизированы методы выделения ДНК" и проведения полимеразной цепной реакции для выявления летальных рецессивных мутаций и аллелей гена каппа-казеина. Выяснена частота летальных рецессивных мутаций BLAD, СУМ, DUMPS среди быков -производителей и ремонтных бычков. С целью снижения частоты этих мутаций и распространения их в потомстве впервые проведен скрининг и выделены быкопроизводящие коровы - носители генетических дефектов. Определены частоты аллелей гена каппа-казеина среди племенных животных и состояние генетического равновесия в популяции молочного скота. Установлен повышенный удой у коров-носителей аллели «В» гена каппа-казеина и повышенное содержание белка в молоке дочерей быков-носителей аллели «В».

Достоверность научных результатов. Достоверность полученных результатов подтверждена общепринятым статистическим анализом по традиционному критерию достоверности и по пакетному анализу программы MS Excel 2007. Данные достоверны либо по первому (р<0,05), либо по второму порогу (р<0,01) достоверности.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.М. Лебедева «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных

(Санкт-Петербург, 2009), на Международной конференции «Вопросы образования и науки: теоретические и методические аспекты», 2012 г., Тамбов, на отчетных сессиях Ученого совета Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных 2007-2012 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных статей

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, предложения производству, список использованной литературы. Работа содержит 111 страниц машинописного текста, 18 таблиц, 7 рисунков. Библиография включает 169 наименований, в том числе 114 на иностранных языка.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика основных продуктивных показателей молочного скота Ленинградской области

Ленинградская область занимает лидирующие позиции в Российской Федерации по молочной продуктивности черно-пестрого голштинизированного скота. Голштинская порода оказала большое влияние на черно-пестрый скот страны, в частности, в Ленинградской области. Интенсивное использование генофонда голштинской породы началось с 70-х годов прошлого века и продолжается по настоящее время. В результате в стране были созданы высокопродуктивные зональные и заводские типы: Ленинградский, Московский, Уральский и т.д. Ленинградский тип создан методом поглотительного скрещивания и индивидуального подбора быков-производителей голштинской породы к маточному поголовью черно-пестрого скота (Прохоренко, 2012).

Коровы Ленинградского типа за 2010 год имели продуктивность 9993 кг молока за лактацию. Наивысшая продуктивность была достигнута в следующих племзаводах области: «Рабитицы» (10775 кг, п=1330), «Гражданский» (9980 кг, п=1200) и «Гомонтово» (9485 кг, п=1200). В целом, по Ленинградской области средний годовой удой приблизился к 7000 кг молока за лактацию. Данный показатель превышает средний удой в племенных заводах в целом по России -6450 кг (Амерханов, 2012). Рекордистка среди коров Ленинградского типа стала корова «Пазуха» №284 из племзавода «Рабитицы», которая дала 19012 кг молока за 305 дней лактации (Прохоренко, 2012). Несмотря на высокие показатели молочной продуктивности коров в отдельных племзаводах Ленинградская область все еще отстает по этому показателю от передовых стран. В частности, средняя продуктивность молочного скота в Израиле достигла в 2011 г. 11775 кг (таблица 1).

Таблица 1. Продуктивные качества коров в трех странах-лидерах (Прохоренко, 2012)

Страна Средний удой Содержание жира % Содержание белка %

Израиль 11775 3,66 3,24

США 10607 3,66 3,07

Канада 9975 3,79 3,19

Несмотря на широкое использование импортных генетических ресурсов, существуют планы по наращиванию реализации отечественного племенного молодняка до 80% от потребности. Сейчас в России работают 1478 племенных хозяйств, число племенных коров достигает 965,5 тыс. (Амерханов, 2012). По молочному скоту в стране действует 378 племенных заводов и 944 племенных репродукторов (Дунин, 2010).

В племенных хозяйствах Ленинградской области в результате использования голштинских быков-производителей сложилась определенная генеалогическая структура, основанная на трех линиях голштинской породы -В. Айдиал 933122, Р. Соверинг 198998 и М. Чифтейн 95679. В линии Монтвик Чифтейн большое влияние на черно-пеструю породу в области оказал бык-производитель K.M. А. Белл 1667366, который был улучшателем по содержанию жира и белка. К сожалению, этот бык оказался носителем летальных рецессивных мутаций, которые были переданы потомкам и получили широкое распространение во многих странах мира (Барсукова, 2012).

1.2. Обзор молекулярно-генетических маркеров, используемых в селекции

Молекулярно-генетические маркеры получили в настоящее время широкое распространение не только при решении фундаментальных задач биологии, но и в повседневной практической работе в животноводстве (Глазко, 2010; Зубец, 2001; Долматова с соавт., 2004; Ковалюк с соавт., 2007; Исламова

с соавт., 2007; Сулимова, 2004). Различают монолокусные и мультилокусные ДНК-маркеры. К мультилокусным относятся методы ПЦР сл случайными праймерами (RAPD-PCR), полиморфизм амплифицированной ДНК (AFLP) и ДНК-фингерпринтинг.

В основе RAPD-PCR лежит использование коротких праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов (Welsh & MacClelland, 1990; Williams et al., 1990; Vignal, 2002). Методом проб и ошибок подбираются такие праймеры, которые дают четко различимые амплификаты и которые позволяют выявить различия в числе и распределении фрагментов ДНК между животными (Харченко, 2006). Несмотря на широкое использование данного метода в генетическом анализе сельскохозяйственных животных (Сулимова, 2006; Долматова с соавт., 2000), он имеет серьезные недостатки - плохая воспроизводимость внутри и между лабораториями, чувствительность к малейшим изменениям условий проведения реакции. Это объясняется наличием в геноме участков, частично комплементарных случайным праймерам. В этом случае результат реакции определяется степенью комплементарности и в большом геноме животного имеется множество таких участков. Небольшие изменения, например, в температуре могут приводить к амплификации различных участков генома (Atienzar 2000; Dodgson 1997).

Полиморфизм амплифицированной ДНК (AFLP) проводится с целью генотипирования животных, когда нужно добиться высокой разрешающей способности метода. Метод позволяет одновременно получить несколько десятков фрагментов, некоторые из которых будут полиморфными, т.е. отличаться у разных животных. Впервые данный подход был разработан в 1995 году (Vos et.al., 1995). Считают, что AFLP является доминантным биаллельным маркером. Он является «золотым стандартом» при генотипировании ряда микроорганизмов (Teneva, 2009). Метод широко используется при выяснении родственности между породами, при построении генетических карт и идентификации генов у сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи ( De Marchi, 2006; Marsan, 2007; Luikart, 2003).

Некоторые авторы подвергают сомнению воспроизводимость метода и призывают исследователей уделять больше внимания этому вопросу (Crawford et al., 2012). AFLP основан на расщеплении геномной ДНК двумя ферментами рестрикции, лигировании двух адаптеров и постановки реакции амплификации с двумя праймерами, комплементарными адаптерам. Продукты амплификации анализируют в полиактиламидном геле либо в капиллярном электрофорезе. Метод можно частично автоматизировать, что увеличивает производительность и позволяет анализировать большое число образцов одновременно.

ДНК-фингерпринтинг также позволяет анализировать достаточно большое число локусов одновременно. Метод хорошо зарекомендовал себя при выяснении генетической структуры популяций животных и при решении ряда других вопросов (Потапов, 1997; Рысков 1988). ДНК-фингерпринтинг основан на расщеплении геномной ДНК ферментом рестрикции, электрофорезе фрагментов ДНК в агарозном геле, переносе разделенных фрагментов на нейлоновый фильтр и молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Используются как радиоактивные метки, так и другие способы мечения ДНК (дезоксигени, биотин, флуоресцентные красители).

Микросателлитная ДНК относится к однолокусным генетическим маркерам и представляет собой короткие (2-4 нуклеотида) повторяющиеся элементы, разбросанные по всему геному. Такие элементы в геномах впервые были выявлены в 1989 году Таутцем (Tautz, 1989). Размер каждого повторяющегося элемента обычно составляет до 200 пар оснований. Установлено, что повторы в три нулеотида длиной встречаются каждые 300500 тысяч пар оснований в геноме и их частота в 10 раз ниже, чем у динуклеотидных повторов типа GT (Глазко с соавт., 2001). Микросателлиты имеют ряд преимуществ в сравнении с другими маркерами. Прежде всего, они легко выявляются в полимеразной цепной реакции и идентифицируются. Весь процесс можно легко автоматизировать. Они покрывают практически весь геном. Это позволяет устанавливать их генетическое сцепление со многими

генами, формирующими продуктивные качества животных. Исследования, выполненные с помощью микросателлитов, позволили ответить на ряд вопросов, касающихся структуры популяций животных, оценить генетические расстояния между породами и отдельными популяциями, определить степень инбредности в группах животных, идентифицировать животных (определить происхождение). Эти свойства микросателлитов сделали их достаточно популярным маркером в настоящее время ( Озеров и др., 2003; Киселева с соавт., 2010; Chaudhari, 2009; Naicy, 2008; Freeman et al., 2006). До недавнего времени микросателлитные маркеры использовались для картирования локусов количественных признаков (QTL) у сельскохозяйственных животных (Hiendleder et al., 2003; Kühn et al., 2003). Сейчас для этой цели все большее распространение получают маркеры однонуклеотидного полиморфизма - SNP (произносится «снип»). У крупного рогатого скота микросателлитные повторы были описаны в 1990 году и к настоящему времени их число превышает 2000. Имеется несколько коммерчески доступных наборов для идентификации и подтверждения животных, основанных на использовании микросателлитной ДНК. Наиболее известны и широко применяются наборы StockMarks для различных видов сельскохозяйственных животных (фирма Applied Biosystems). К преимуществам генотипирования с помощью микросателлитов относят: Малое количество необходимой ДНК (10-100 нг)

> Полная пенетрантность

> Равномерное распределение маркера по геному

> Высокий уровень полиморфизма индивидуальных микросателлитов

> Кодоминантная природа маркера

> Высокая воспроизводимость метода

> Возможность постановки мультиплексной реакции

> Возможность автоматизации

К недостаткам микросателлитного генотипирования можно отнести следующие:

> значительная стоимость анализа

^ иногда гетерозиготы принимают за гомозиготы (нулевые аллели при появлении мутации в сайте комплементарного связывания праймера

^ появлении дополнительных неспецифических ампликонов в реакции

> эффект гомоплазии, проявляющийся в разной скорости прямых и обратных мутаций, что приводит к недооценке генетической дивергенции

Другим представителем однолокусного маркера является метод ПЦР-ПДРФ. В этом методе объединяются два подхода - полимеразная цепная реакция (ПЦР) и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). После завершения ПЦР продукт амплификации подвергается расщеплению ферментом рестрикции. Фермент подбирается таким образом, чтобы его сайт перекрывался с сайтом, содержащем мутацию. В этом случае появляется возможность различить дикий и мутантный типы. После проведения расщепления фрагменты ДНК анализируют в обычном агарозном геле и по количеству и положению фрагментов судят о наличии или отсутствии мутации у данного животного. Особую популярность метод получил при анализе мутаций в генах, связанных с хозяйственно-полезными признаками либо контролирующих важные биологические свойства организма (Калашникова с соавт., 2001; Иолчиев, 2002). Например, такой подход используется при диагностике летальных рецессивных мутаций (ВЬАЭ, СУМ, БЦМЗ), анализе полиморфизма генов каппа-казеина, бета-лактоглобулина, пролактина, миостатина и т.д. Необходимым условием для проведения анализа является известная нуклеотидная последовательность гена а также местоположение мутации в гене.

Однонуклеотидный полиморфизм (8ЫР) приобретает в настоящее время особую популярность вследствие появления на рынке научного приборостроения высокотехнологичного оборудования, способного производить синтез олигонуклеотидов непосредственно на матрице. Причем

количество олигонуклеотидов достигает 1 миллиона. Одновременно появились приборы, способные производить учет флуоресцентного сигнала с матрицы. Все это сопровождалось разработкой компьютерных программ анализа данных. Имеется несколько крупных международных игроков на рынке матричного анализа SNP. Прежде всего, это фирмы Affimetrix и Illumina. SNP - это однонуклеотидные локусы в геноме, для которых существуют аллельные варианты, т.е. один нуклеотид замещен другим, причем редкий аллель должен иметь частоту не менее 1% в популяции. По каждому локусу существует всего две аллели, таким образом SNP - это биаллельный маркер. SNP является самым высокоинформативным маркером в силу высокой частоты встречаемости в геноме. Например, у человека описано более 6 миллионов снипов, а у крупного рогатого скота сейчас известно около 1 миллиона таких полиморфизмов. Однонуклеотидные полиморфизмы находят как в кодирующей части генов, так и в интронах, а также в межгенных участках ДНК. Для целей генотипирования крупного рогатого скота на предмет установления связей аллельных вариантов и хозяйственно-полезных признаков фирма Illumina предлагает несколько типов матриц:

1. «Bovine SNP54K Bead Chip»

2. «Bovine SNP3K Bead Chip»

3. «Bovine SNP6K Bead Chip»

4. «Bovine HD (777 K) Bead Chip»

Самой простой является матрица с 3000 локусов («Bovine SNP3K Bead Chip»), а самая сложная матрица содержит 777000 сайтов («Bovine HD (777 К) Bead Chip»). Фирма Affimetrix также продает матрицу собственного производства, содержащую 649000 олигонуклеотидов для выявления SNP: «Axiom Genome-Wide Bos 1 Array Plate (649K)». Матричная технология является основой проведения геномной оценки племенных качеств животных (Яковлев с соавт., 2011; Смарагдов, 2009). Такая оценка проводится у крупного рогатого скота, свиней и птице. Технология позволяет в раннем возрасте

прогнозировать племенные качества и уменьшить число проверяемых животных. Точность прогноза племенной ценности животного с применением геномной оценки повысилась вдвое.

Вкратце, особенности каждого метода генотипирования представлены в таблице 2.

Таблица 2. Методы генотипирования животных и их основные

характеристики

Особенности ПЦР-ПДРФ ДНК-фингерпринт -ИНГ RAPD микросателлиты SNP

Основан на ПЦР гибридизация ПЦР ПЦР ПЦР

Праймер/проба Праймер ы проба праймер праймер праймер

Покрытие генома низкое высокое высокое высокое высокое

Уровень полиморфизма низкий высокий средний высокий высокий

выражение ко-доми нантное доминантное доминантное ко-доми нантное ко-доми нантное

Возможность автоматизации да нет да да да

Недостатком SNP является низкая информативность индивидуального снипа в сравнении, например, с микросателлитами, однако этот недостаток полностью компенсируется большим числом сайтов, участвующих одновременно в анализе (Werner et al., 2004).

1.3. Преимущества полимеразиой цепной реакции в сравнении с другими методами анализа

Полимеразная цепная реакция была предложена в 1985 году (Saiki et al., 1985). С помощью этого метода можно в течение 2-х часов размножить

определенную последовательность ДНК, находящуюся между двумя праймерами, в количестве, превышающем исходное в 108 раз (Сайки с соавт., 1990). Стандартная ПЦР включает следующие этапы: денатурация ДНК при 95°С, отжиг праймеров (55-65°С° в зависимости от эксперимента), удлинение праймеров (72°С). Такие циклы повторяются 30-40 раз. При этом происходит эксроненциальное увеличение количества амплифицируемой ДНК. Обычно перед первым циклом выдерживают смесь 5 минут при 95°С, а после последнего цикла амплификат инкубируют 5минут при 72°С для завершения достройки праймеров. ПЦР-смесь содержит следующие компоненты:

0.25 шМ каждого праймера

0.2 шМ каждого ёАТР, ёСТР, сЮТР, ёТТР

50 гаМ КС1

10 шМ Тпб, рН 8.4

1.5ШММВС12

2.5 е.а. Taq-пoлимepaзы

102 - 105 копий ДНК мишени

25 |х1 реакционная смесь, доводится до этого объема водой

Во многих случаях фирмы при продаже Тац-полимеразы включают также оптимальный для ее работы буфер. В этом случае постановка реакции упрощается. Для проведения ПЦР необходимо иметь два праймера ограничивающих (фланкирующих) изучаемую последовательность (Рыбчин, 1999).

ПЦР имеет множество преимуществ в сравнении с другими методами анализа. Для ее проведения необходимо крайне малое количество ДНК (10 нг ДНК обычно вполне достаточно). Теоретически даже одной молекулы ДНК может хватить для амплификации фрагмента до уровня, когда его можно увидеть в полиакриламидном или агарозном геле. Постановка анализа ПДРФ требует как минимум 1 мкг геномной ДНК, т.е. для рестрикционного анализа

требуется в тысячи раз больше аналита. Другим преимуществом ПЦР является возможность работы даже с частично деградированной ДНК. Объясняется это тем, что размер амплификата обычно не превышает 500 пар оснований, а чаще составляет всего 50-200 пар оснований. Таким образом, ДНК может быть значительно фрагментирована и тем не менее она будет пригодна для амплификации. Еще одним преимуществом ПЦР является скорость. Стандартная реакция идет 1,5-2 часа, в то же время другие методы анализа ДНК требуют значительно большего времени. ПЦР нашла свое применение и в животноводстве. Данный метод значительно упростил тестирование генома сельскохозяйственных животных (Зиновьева с соавт., 2002; Калашникова с соавт., 1999).

1.4. История выявления вредных рецессивных мутаций у крупного рогатого скота

У крупного рогатого скота выявлено большое число врожденных аномалий (мутаций), определяемых летальными и не летальными аллелями генов. К настоящему времени выявлено 46 аномалий, которые включены в Международный список летальных дефектов. Частота встречаемости отдельных мутаций в каждой породе или популяции может быть различной. Например, известно, что в костромской породе, наиболее часто регистрируется генетическая аномалия головы — укорочение челюсти, в ярославской породе — синдактилия, в холмогорской — контрактуры мышц, в черно-пестрой — пупочные грыжи. Часть нарушений связана с мутациями, вызывающими не дефекты развития, а нарушение обмена веществ и другие аномалии, выявление которых возможно с использованием лабораторных методов исследования. Важную роль в распространении генетических аномалий у крупного рогатого скота играют быки-производители (Скек е1 а1., 2004). От одного быка при искусственном осеменении в год можно получить тысячи телят. Если такой производитель окажется носителем мутантой аллели, то она может быстро распространиться в породе. Поэтому необходим постоянный контроль с целью

своевременного выявления носителей рецессивных мутаций. Особенно важно проводить такой контроль у быков-производителей (Ruse et al., 2007).

Некоторые генетические дефекты (таблица 3) имеют значительное распространение и поэтому включены в каталоги племенных животных (Яковлев с соавт., 2007).

Таблица 3. Регистрируемые в племенных каталогах генетические

дефекты крупного рогатого скота.

Сокращенное обозначение в каталогах Английская транскрипция Фенотипическое выражение

TV Tested free of Complex Vertebral Malformation (CVM). Свободен от дефекта Complex Vertebral Malformation (СУМ).Уродства, аборты.

CV Complex Vertebral Malformation (CVM). Носитель Complex Vertebral Malformation (CVM)

BD Bulldog Бульдогообразие.

HL Hairless. Облысение

MF Mule-Foot (Syndactelism). Сросшиеся мулоподобные копыта.

PG Prolonged Gestation. Удлиненная стельность.

DF Dvarfism. Карликовость.

IS Imperfect Skin. Складчатость кожи.

BL Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency - BLAD. Лейкоцитарная адгезия, пониженная резистентность к бактериальным инфекциям.

PT Pink Tooth (Porphiria) Розовые зубы.

DP Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMS). Дефицит монофосфатсинтазы. Эмбриональная гибель.

TM Recessive Tested for Mulefoot. Тестирование по потомкам на носительство Mulefoot.

TD Tested free of DUMS Проверено и свободен от DUMS.

TL Tested free of BLAD. Проверено и свободен от BLAD.

RC It is carrier of recessive for Red Hair Color. Носитель рецессивной красной масти.

Молекулярная основа большинства летальных и вредных рецессивных мутаций еще не известна, поэтому методы их выявления на ранней стадии с использованием ПЦР не разработаны. В настоящее время исследованы мутантные гены только для нескольких наследственных дефектов. К таким дефектам относят BLAD, СУМ и DUMPS и некоторые другие (Nagahata et al., 1987; Kehrli et al., 1992; Konersman et al., 2003).

BLAD (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency) - дефицит адгезивности лейкоцитов - генетическое заболевание телят голштинской породы (Pareek et al., 1996; Zsolnai et al., 1996; Arnaout, 1990; Nagahata et al., 2004; Nagahata et al., 1997). Аномалии определяют действием гена ITGB2 (Czarnik et al., 2007a). BLAD - это генетически обусловленное заболевание с рецессивным типом наследования, которое определяется мутацией в гене CD 18, контролирующим синтез гликопротеида В-интегрина. Данный белок играет ключевую роль в обеспечении миграции нейтрофилов к очагу воспаления. В случае мутации, приводящей к изменению структуры белка нейтрофилы теряют способность проникать в ткани для уничтожения патогенов. При развитии этого заболевания биохимическим исследованием обнаруживается дефицит в экспрессии на поверхности лейкоцитов гетеродимера бета-2 интегрина, отвечающего за адгезию. Этот дефицит ведет к множественным дефектам функции лейкоцитов и к нарушению способности миграции в межклеточных пространствах. Впервые синдром дефицита адгезивности лейкоцитов описан у крупного рогатого скота в 1983 году под названием «гранулоцитарный синдром» (Hagemoser et al., 1983; Kehrli et al., 1990). Молекулярная основа возникновения BLAD - точечная замена (аденин заменяется на гуанин) в положении 383 кодирующей ДНК (кДНК) гену CD 18. Эта мутация приводит к замене аминокислоты аспарагиновая кислота на аминокислоту глицин в положении 128. Аминокислотная замена приводит к потере функции белка. Мутация располагается внутри нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотный блок длиной в 26 аминокислот, который идентичен у неносителей мутации разных видов: крупный рогатый скот,

человек и мышь (Kishimoto et al., 1989). Имеются отдельные сообщения о различиях между нормальными животными и носителями мутации в гетерозиготном состоянии на цитогенетическом уровне. В частности, показано, что у гетерозиготных быков головка сперматозоидов больше по площади, чем у нормальных быков (Kumar et al., 2009; Steinholt et al., 1994). Эксперименты, направленные на выяснение связи между аллелями BLAD и молочной продуктивностью (удой, жир, протеин) показали отсутствие связи за исключением содержания белка (Powell et al., 1996). Эксперимент, проведенный в Таиланде, показал преимущество гетерозиготных носителей мутации BLAD в плане повышения молочной продуктивности, при этом был также повышено число соматических клеток в молоке (Kumar et al., 2009). В Венгрии также была сделана попытка связать продуктивные качества с носительством мутации. Оказалось, что здоровые быки превосходили быков-носителей по племенной ценности (Janosa et al., 1999).

Фенотипически мутация BLAD проявляется только у гомозиготных по мутантному аллелю телят. Впервые мутация BLAD проявилась в потомстве голштинского быка Осборндейла Айвенго 1189870 (линия М. Чифтейна 95679) в США. Мутация получила наибольшее распространение в голштинской породе вследствие особенностей разведения и воспроизводства в этой породе. Особую роль в распространении мутации сыграл сын вышеупомянутого быка -K.M.А. Белл 1667366 (Жигачев с соавт., 2008). После обнаружения мутации и разработке ПЦР-теста на носительство, частота мутации в США составляла 23% (Shuster et al., 1992; Powell et al., 1996). В последующем в процессе выбраковки животных, ее частота значительно снизилась (Жигачев с соавт., 2002; Powell et al., 1996). Клинические симптомы проявления заболевания включают в себя предрасположенность к респираторной инфекции, диареи и низкую естественную резистентность организма к бактериальным инфекциям (Яковлев с соавт., 2009, Кийко соавт., 2008; Gilbert et al., 1993). Телята, гомозиготные по мутации гибнут в первые месяцы своей жизни - 50% гибнет

по достижении возраста 2 месяца и 100% не доживают до 1 года (Kumar et al., 2009).

CVM (Complex vertebral malformation - комплексное уродство позвоночника. Заболевание ассоциировано с точечной мутацией в гене SLC35A3). CVM - широко распространенный рецессивный генетический дефект голштинского и голштинизированного скота, который встречается во многих странах мира, например Великобритании (Revell et al., 2001), США (Duncan et al., 2001), Швеции (Berglund et al., 2004), Японии (Nagahata et al., 2002). Мутация проявляется в виде мертворожденных телят, абортов, деформированных позвонков у новорожденных, общей недоразвитостью телят, укороченной шеей, и деформацией суставов передних и задних конечностей (Agerholm et al., 2001; Mohamed et al., 2008; Malher et al., 2006). Отмечаются также пороки сердца. О наследственной природе заболевания впервые сообщили датские специалисты. Было найдено 2 элитных производителя, вследствие широкого использования спермы этих производителей мутацию распространили во многих странах мира. Родоначальником распространения мутации считают быка Осбондэйл Айвенго 1189870, который родился в Голландии в 1952 году (Schuster et al., 1992).

Одним из носителей этого дефекта являлся известный бык-улучшатель А.К.М. Белл 1667366, который одновременно был носителем и мутации BLAD. В США от этого быка было получено более 79 тыс. дочерей, оцененных по продуктивности, и более 1200 сыновей, оцененных по дочерям. Таким образом, очевиден веерный тип распространения летального дефекта по всему миру (Коновалов, 2011). Позже американскими учеными была изучена молекулярная основа мутации. Выяснилось, что происходит замена G/T в гене SLC35A3 в позиции 559. На основании этих исследований японскими учеными были подобраны праймеры для выявления мутации CVM у крупного рогатого скота (Kanae et al., 2005).

ДНК-маркерная идентификация мутации и генетический тест для выявления скрытых носителей СУМ разработаны в 2002 г. Применение теста

показало, что в США - 18% быков-производителей - скрытые носители CVM, Германии около 13% (Konersmann et al., 2003), в Японии - 32% (Nagahata et al., 2002), в Швеции - 23% (Berglund et al., 2004), Дании - 31% (Thomsen et al., 2006) . Из 605 польских черно-пестрых быков 150 голов оказались носителями мутации CVM, включая 118 быков-сыновей уже известных быков-носителей мутации (Rusc et al., 2007). Использование ПЦР-теста и элиминация животных-носителей из племенного процесса позволяет снизить частоту встречаемости нежелательных аллелей (Schütz et al., 2008). Например, частота носителей CVM в США у быков, рожденных после 2002 года снизилась до 1% (vanRaden et al., 2006).

В России достаточно подробно проанализирован путь иммиграции мутации CVM в генофонд российских пород (Яковлев, 2004). Доля быков -скрытых носителей CVM - на племпредприятиях России составляет 3,7% (Коновалов, 2011).

DUMPS (deficiency of urudine monophosphate synthetase) - дефицит фермента уридинмонофосфатсинтетазы, представляет собой третий генетический дефект, молекулярная основа которого была выяснена и сконструированы ПЦР праймеры для быстрой идентификации мутации.

Впервые мутация была описана в 1983 году как моногенный аутосомно-рецессивный признак (Robinson et al., 1983). С помощью специального теста у фенотипически нормальных гетерозиготных животных можно диагностировать снижение активности фермента (Harden & Robinson, 1987). У лактирующих гетерозиготных коров можно обнаружить в молоке и моче ' наличие оротовой кислоты (Robinson et al., 1984). После того, как у коров был выделен и описан ген уридинмонофосфатсинтазы (Schober et al., 1993; 1994), установлено, что заболевание обусловлено точечной мутацией в кодирующей части этого гена, а точка мутации обозначена как R405Stop (Schwenger et al., 1993).

Болезнь обусловлена нарушением последнего этапа синтеза пиримидина, т.е. превращение оротовой кислоты в уридин-5'-монофосфат (UMP)

в результате дефицита фермента уридинмонофосфатсинтазы (UMPS). Ген PTPN18 локализован в первой хромосоме. Точковая мутация в гене привела к замене в 405 положении цитозина на тимин и это, в свою очередь, привело к изменению аминокислотной последовательности в белке и нарушению его функции. Недостаток активного фермента является аутосомно-рецессивным признаком и приводит к неправильному синтезу ДНК, и ранней эмбриональной смертности. У гомозигот летальность начинает проявляться на ранней стадии эмбрионального развития (до 40 дней), поэтому гомозиготы DUMPS до сих пор не идентифицированы (Коновалов, 2011; Snanks et al., 1992; Snanks et al., 1989).

Заболевание было выявлено в США (Meydan et al., 2010). В США среди 287 наиболее интенсивно используемых быков - четыре производителя были носителями данной мутации. Исследования зарубежных авторов выяснили, что частота животных-носителей данной мутации в голштинской породе составляет 2,34% (Ghanem et al., 2006) .

Цитрулинемия является еще одним генетическим заболеванием, молекулярная природа которого расшифрована и разработаны ПЦР-тесты для диагностических целей. Мутантный аллель был выявлен у человека в 1977 году (Carrit, 1977). Впервые заболевание у крупного рогатого скота было описано в Австралии (Harper et al., 1986; Robinson et al., 1993; Dennis et al., 1989). Мутация распространилась в Австралии через импорт спермы из США от быка Линмак Крис Кинг (Healy et al., 1991; Healy, 1996). После рождения телята выглядят здоровыми, первые признаки заболевания появляются на 2-й день жизни в виде угнетенного состояния и отказа от приема молока. Клинические признаки нарастают и гомозиготные особи погибают к 7-дневному возрасту. Ген картирован у крупного рогатого скота на хромосоме 11 (Patel et al., 2006; Grupe et al., 1996). Заболевание обусловлено дефицитом фермента аргининсукцинатсинтазы, который обеспечивает синтез в организме цитруллина. Заболевание в конечном итоге приводит к нарушению синтеза мочевины и накоплению в крови аммония (Харченко с соавт., 2006). В гене идентифицировано две мутации. Одна из этих мутаций находится в кодоне 86

(С/Т). При этом происходит замена кодона CGA (аминокислота аргинин) на кодон TGA, являющийся нонсенс-кодоном, терминирующий синтез. ПЦР-тест основан на амплификации фрагмента ДНК, включающего мутантный сайт. Если мутация отсутствует, то амплификат длиной в 194 пары оснований можно расщепить ферментом рестрикции Avail на два фрагмента 118 и 72 пары оснований. Таким образом, у гомозигот по мутации будет один фрагмент 194 пары оснований, у гетерозигот - 194, 118 и 72 пары оснований, у нормальных гомозигот - 118 и 72 пары оснований. Вторая точечная мутация, выявленная в этом гене находится в кодоне 175 и также характеризуется заменой дезоксинуклеотида С на Т (ССС/ССТ).В случае этой мутации замены синтезируемой аминокислоты пролина не происходит, так как вследствие вырожденности генетического кода оба кодона определяют одну и ту же аминокислоту, в данном случае пролин.

Фактор XI свертываемости крови является одним из 12 белков, вовлеченных в процесс свертывания крови у млекопитающих (Gentry et al., 1984; Gentry et al., 1980; Brush et al., 1987). Мутация в гене может приводить к кровотечению и анемии из пуповины. Кроме того, такие обычные хирургические процедуры как кастрация или удаление рогов могут сопровождаться сильными кровотечениями. Коровы-носители мутации часто дают молозиво, окрашенное в розовый цвет. Окраска молозива послужила основанием впервые дать определение этому заболеванию у коров в Великобритании. Помимо этих симптомов у коров снижается воспроизводительная функция и животные становятся более восприимчивыми к пневмонии, маститам и метритам. Таким образом, наличие этого генетического дефекта связано с существенными экономическими потерями в молочном скотоводстве (Ghanem et al., 2005; Citek et al., 2008). Иногда животные-носители мутации живут в течение многих лет без явных клинических признаков, хотя у них повышенная частота встречаемости болезней и более высокая смертность. Молекулярная основа заболевания была установлена Марроном в 2004 году (Marron et al., 2004) в работе, где было

показано, что в 27 хромосоме крупного рогатого скота в 12-й экзон гена фактора XI свертываемости крови произошла вставка сегмента в 76 пар оснований ДНК.

1.5. Использование полимеразной цепной реакции в выявлении мутаций BLAD, СУМ и DUMPS у крупного рогатого скота

К настоящему времени единственным методом, позволяющим безошибочно определять носительство рецессивных мутаций в гетерозиготе, является амплификация методом ПЦР участка гена с помощью специально подобранных праймеров. Секвенирование участков генома, которые были генетически связаны с проявлением мутаций и локализация ответственных за данный фенотипический признак генов позволили провести дизайн праймеров ПЦР для разработки быстрого теста на носительство этих мутаций. Мутации находятся в кодирующей части генов (экзонах), поэтому они изменяют аминокислотную последовательность в синтезируемом белке, нарушая функцию последнего. Информация о последовательности нуклеотидов всех известных генов у всех изученных видов животных и микроорганизмов обеспечивается доступом к базам данных, таких как GenBank. Например, кодирующая часть гена CD 18 (код доступа Y12672), мутация в котором определяет синдром BLAD представлена 1640 нуклеотидами (Рисунок 1).

1 ctgaacttcacagggcaaggggagcccgactccattcgctgtgacacacgagcggagct 61 ctgtcaaagggctgcccagctgatgacatcatggaacccaagagcctcgctgagacccg 121 gacagccaggcgggcagtcggaagcagctgtccccacaggaagtgacgctctacctgag 181 ccaggtaggcttggctggctaggggtgggccggccctaatggcgcgtgtatccatgtgt 241 cctgccccaggaggatgtccccaacgccccatctgcagctggtgcctagtctcgctttt 3 01 gcactgagttctgcgtcctaaaaaaaagggagaataaaccatctggaaaacactcctta 361 ccctctctcagaagatgaggtattttttggctgagtgaaggctctgataaggcctgtaa 421 ctagaaacacaagtaaacctttgaatcaatgttgcccacctgacttaaccacagaccga 481 gtataggacacagctctctgttagcactccaagaaacatccttcaggaaggtggcttgg 541 ggaacagcagggggttatggtggatggccatgggcagggctggggtagccacatggggg 601 gctgatgctggaaggtgggctggcagaggggacttgatggtcatggctttgtcgagcac 661 aggcatctacctgagagctggggacacaggctatttgtattgacaaggaaagaagtcgt 721 acaagtgcaggtggtgattaagatgacgaggagcagaaactagggcagctgggattgag

781 aagtgggggggggtgtcccaggatggccagggagcccttttggggccctggcagtttgc 841 tagcagctggtggtagagaaggccttaccagagagaccagagagatagtagaatgatta 901 cagtgtgataacatgacactctatatctctgtatccagcacatatgtatccagatgttt 961 tatgtcagaacgtgtgcttgcctgaaatggaatctgaataggcatcctgcatcatatcc 1021 ccagcataagagaatggggagagtcctgaggttctgaggcctgacaagatgccataagt 1081 cccatgaaccccccccacccccagaccagatagtacaccctgactatctcccaaatcct 1141 gcaggtcaggcagttgcgttcaacgtgaccttccggagggccaagggctaccccatcga 1201 ctgtactacctgatggacctctcctactccatggtggatgacctcgtcaacgtcaagaa 1261 ctggggggtgacctgctccgggccctcaatggcatcaccgagtcgggccgcattggtga 1321 gcagctactccatcttcccctgaaaccccaagccccggtcccaggcacctctgcacctc 1381 gcaccccaagggcagggcgccaggcccctccccacgtgccgggccttcctacccctctc 1441 ggtaagaggctcacggcccctcactgtcccccaggtttcgggtccttcgtggacaagac 1501 gtgctccccttcgtcaacacgcaccccgagaagctgcggaacccctgccccaacaagga 1561 aaggagtgccagcccccgttcgccttcaggcacgtgttgaagctcactgacaactccaa 1621 acagttcgagacagaagtcg

Рисунок 1. Кодирующая часть (экзоны) гена CD18, взятая из базы данных GenBank

Зная положение мутации (в случае с ВЬАО это позиция 383, где произошла замена нуклеотида А на Г) можно провести дизайн праймеров, которые бы обеспечивали синтез участка ДНК с этой мутацией. Различные авторы предложили ряд пар праймеров для амплификации участка гена СО 18 ^ЬпМег е1 а1., 1992; Ташшеп ег а1., 1996; 8с1ГГегН е1 а1., 2000; Глазко с соавт., 1999; Мдгск е1 а1., 1995). После проведения ПЦР амплификат подвергается расщеплению ферментом рестрикции Тад! или НаеIII. Ферменты имеют сайт узнавания и расщепления, который затрагивается мутацией. При этом появляется возможность по продуктам расщепления различить дикий и мутантный генотип. В гене СБ 18 обнаружена и другая точечная мутация в положении 775, однако эта мутация является молчащей, т.е. не обнаруживается фенотипически (81ш81ег е1 а1., 1992).

ПЦР была также успешно использована для выявления другой широко распространенной летальной рецессивной мутации - СУМ. В этой мутации происходит замена нуклеотида О в положении 559 на нуклеотид Т в гене БЬС35АЗ (код доступа в ОепЬапк АУ160683). Замена нуклеотида приводит

к замене аминокислоты с валина на фенилаланин в 180 положении в белке (Wang et al., 2011). Белок, кодируемый геном SLC35A3 находится в аппарате Гольджи и при его изменении нарушается процесс гликозилирования белков в тканях организма (Thomsen et al., 2006).

К настоящему времени единственным методом, позволяющим безошибочно определять носительство мутации DUMPS в гетерозиготе и на ранней стадии развития организма, является амплификация участка гена уридинмонофосфатсинтазы (ген PTPN18, год доступа к последовательности гена в GenBank ВС 126693.1) с помощью специально подобранных праймеров (Schwenger et al., 1993). Затем проводится обработка полученных продуктов рестриктазой Aval и анализ полиморфизма длин фрагментов, образующихся после рестрикции. У гетерозиготных особей вследствие замены С/Т кодон CGA, кодирующий аминокислоту аргинин, заменяется стоп-кодоном TGA. При этом происходит терминация синтеза аминокислотной последовательности и белок теряет свою активность. Обе цепи ДНК здоровых животных режутся с помощью фермента Aval в двух местах. В итоге на электрофорезе мы видим три фрагмента - 40, 36 и 19 п.н. Т.к. мутация ведет к исчезновению одного сайта рестрикции для Aval, то ДНК животного, гетерозиготного по этой мутации будет представлена в виде четырех фрагментов 76, 40,36 и 19 п.н.

Модификации праймеров, используемые для такого анализа могут быть различны. Точковая мутация в гене привела к замене в 405 положении цитозина на тимин. Для гетерозигот характерно 50% снижение ферментной активности в крови и повышено содержание уротата в молоке. Очевидно, что столь значительное снижение ферментативной активности у гетерозиготных дочерей быков-носителей приводит к более длинному межотйльному периоду (Коновалов, 2011).

Помимо традиционной ПЦР в последние годы стали появляться работы, где показаны возможности использования реал-тайм ПЦР для диагностики рецессивных мутаций, в частности CVM (Yi et al., 2012). Реал тайм ПЦР представляет собой метод, позволяющий выявить количество образующегося

ПЦР-продукта в реальном времени, т.е. с каждым ПЦР-циклом. В сравнении с традиционной ПЦР реал-тайм ПЦР имеет определенные преимущества:

* Не чувствительна к неспецифической амплификации

* Амплификация определяется в режиме реального времени

* Отсутствие манипуляций после проведения ПЦР

(большая производительность, меньше риски контаминации)

10

* Более широкий динамический диапазон (10 )

* Требуется в 1 ООО раз меньше РНК, чем в обычных методах (минимум 6 пг = один геном)

* Выявление даже 2-х кратного изменения количества продукта

* Возможность температурного анализа кривой плавления

* Более специфичная и воспроизводимая

* Не дороже, чем обычная ПЦР (за исключением оборудования)

Имеется разные методы проведения реал-тайм ПЦР:

1). Гибридизационный метод реал-тайм Лайтциклер (LightCycler® Roche). Этот метод основан на том, что, два специально синтезированных специфических олигонуклеотида метятся флуоресцентными красителями. Первый зонд несёт флуоресцентную метку на своём 3' конце, а второй зонд несёт другую метку (LC Red) на 5" конце. Последовательности двух олигонуклеотидов подбираются из расчёта полного их соответствия выбранному фрагменту ДНК. При гибридизации этих двух олигонуклеотидов два флуоресцентных красителя оказываются очень близко друг к другу. Один из них (флуоресцин) излучает зелёное свечение. Энергия, которая выделяется в результате, передаётся другому красителю (LC Red). Этот переход энергии, известный как FRET, является высоко зависимым от расстояния между двумя красителями. Энергия передаётся с высокой эффективностью только когда расстояние между двумя молекулами соответствует интервалу 1-5 нуклеотидов. Интенсивность свечения красителя LC Red определяется с помощью инструмента LightCycler®. Усиление флуоресценции

пропорционально образованию ДНК при ПЦР. Измерение степени флуоресценции проводится сразу после того, как получен сигнал от красителя о гибридизации нуклеотидов. Один из зондов связан с полиморфным основанием в центре, другой же должен находиться рядом, чтобы произошёл перенос энергии. Хорошо известно, что ошибочное спаривание пары оснований вёдет к уменьшению температуры отжига олигонуклеотидов. Степень уменьшения напрямую зависит от того, какова длина олигонуклеотидного фрагмента, и места, где произошло неправильное спаривание. Для измерения изменений в температуре отжига строят кривую отжига. Таким образом, данный метод также можно использовать при гибридизации, выявляя мутантов и устанавливая ошибки спаривания оснований. Одновременно можно генотипировать более одного SNP, с использованием разных флуоресцентных меток на разных температурах отжига. Главное достоинство этого метода - это его чувствительность.

2). Молекулярные маячки (molecular beacons). Молекулярные маячки представляют собой олигонуклеотидные зонды, которые имеют два конца, фланкирующих комплементарный участок ДНК. На 5'-конце у них имеется флуоресцентный краситель, на 3"-конце - гаситель. Зонд, находясь в форме «шпильки», не гибридизуется, а краситель «тушится» с помощью гасителя и, таким образом, флуоресценции не происходит (Рисунок 2)

PCR Product-Specific Nucleotides

Fluorescent -

Reporter Dye R Quencher Dye

Рисунок 2. Схема молекулярного маячка, используемых в реал-тайме

ПЦР.

Когда молекулярный маячок присоединяется к полностью комплементарному участку, краситель и гаситель оказываются далеко друг от друга, в результате возникает флуоресценция. Для типирования SNP используются два молекулярных маячка. Один специфичен для дикого аллеля, другой - для полиморфного варианта. Каждый из них маркирован разными красителями, которые позволяют дискриминировать аллели за один цикл ПЦР. Разные мишени могут быть детектированы в одной реакции. Это достигается использованием разным молекулярных маячков для каждой мишени и присоединением флуоресцентных красителей с разными спектрами флуоресценции. Число различных красителей, которые могут быть использованы в одной реакции, ограничено определяющей способностью современных аппаратов. Аппараты, использующие технологию ПЦР в реальном времени с одновременным флуоресцентным анализом, используют монохромный источник света, такой как лазер или диоды. С использованием меняющих длину волны молекулярных маячков данная проблема становится решённой. Эти зонды испускают флуоресцентное излучение в индивидуальном диапазоне, хотя возбуждаются одним монохромным источником. Этот подход увеличивает способность мультиплексного типирования SNP.

3). TaqMan® анализ (Applied Biosystems). TaqMan® анализ основан на 5"-нуклеазной активности Taq-полимеразы, которая отщепляет нуклеотиды от олигонуклеотидных зондов, гибризованных с ДНК, вызывая флуоресцентный импульс. Необходимо два TaqMan® зонда с разными полиморфными сайтами. Один зонд должен быть комплементарен дикому аллелю, другой - полиморфному варианту. Эти зонды имеют разные флуоресцентные красители на 5'-конце и гасители флуоресценции на 3\ Когда зонды неактивны, то гасители взаимодействуют с красителем с помощью механизма FRET, блокируя флуоресцентную активность. На этапе отжига праймеров в процессе ПЦР TaqMan® зонды гибридизуются с молекулой ДНК. На этапе расплетения 5'-конец красителя отщепляется, благодаря 5"-нуклеазной активности Taq-полимеразы, что приводит к увеличению уровня

флуоресценции красителя. Ошибочное спаривание оснований в зондах приводит к отщеплению целого зонда без высвобождения красителя. Генотип образца определяется отношением интенсивностей свечения двух разных красителей. Другой метод детекции, который может применяться с использованием 5'-нуклеазного анализа, называется флуоресцентной поляризацией. Фирма Applied Biosystems выпускает наборы для детекции возбудителей инфекционных заболеваний и для проведения генотипирования.

Схематически использование метода TaqMan для целей генотипирования геномной ДНК животных представлена на рисунке 3. Обычно применяют два флуоресцентных красителя - FAM (зеленый) и VIC (желтый). Используются две TaqMan пробы, отличающиеся одним нуклеотидом. Одна проба точно соответствует последовательности ДНК в норме, а другая - последовательности с однонуклеотидным полиморфизмом. При температуре отжига и элонгации праймера, проба, имеющая не полное соответствие не будет комплементарно связана с ДНК-матрицей и флуоресценция не будет выявляться. Такой подход с двумя пробами широко используется в пробах TaqMan.

Аллель 1

G С

9

Аллель 2

А Т

Т

Рисунок 3. Применение реал-тайм ПЦР для выявления однонуклеотидного полиморфизма.

1.6. Использование полимеразной цепной реакции в выявлении и аллельных вариантов гена каппа-казеина

В молоке коров имеется шесть основных белков, полиморфизм которых изучался на протяжении длительного времени и сейчас хорошо известны все их варианты. Согласно современной классификации варианты белков можно представить следующим образом (Farrell et al., 2004):

1) Alphas 1-casein: А, В, C, D, E, F, G, H;

2) Alphas2-casein: А, В, C, D;

3) Beta-casein: Al, A2, A3, В, C, D, E, F, G, HI, H2,1;

4) Kappa-casein: А, В, С, E, Fl, F2, Gl, G2, H, I, J;

5) Beta-lactoglobulin: А, В, C, D, E, F, G, H, I, J, W;

6) Alpha-lactalbumin: А, В, C.

Известно, что у крупного рогатого скота имеется несколько типов казеинов (Caroli et al., 2009; Eigel et al., 1984), которые кодируются тесно сцепленными генами, находящимися в кластере длиной 250 тыс. пар оснований в 6-й хромосоме. (Threadgill and Womack, 1990). Расстояние между отдельными генами составляет примерно 20 тыс пар оснований (Rijnkels et al., 1997). В связи с тем, что гены сцеплены, потомкам они передаются не по отдельности, а совместно как гаплотип (Ginger and Grigor, 1999). Структура генов каппа-казеина изучена достаточно подробно, в том числе отечественными учеными (Городецкий с соавт., 1987; Капелинская с соавт., 1989). На долю казеина приходится до 80% белков молока и 80% всей матричной РНК в железистых клетках вымени. Каппа казенны по составу и некоторым свойствам отличаются от остальных казеинов. Прежде всего, каппа-казеины стабилизируют мицеллярную структуру молока (Kethireddipalli et al., 2011; Hallen et al., 2007). В этом отношении они напоминают гамма-цепь фибриногена (Vallas et al., 2012). Казенны формируют большие коллоидные агрегаты - мицеллы, определяющие в значительной мере свойства молока. Типичные мицеллы содержат около 10000 молекул казеина, связанных между собой гидрофобными

и электростатическими силами (Харченко с соавт., 2006). В литературе имеются множество подтверждений, что варианты гена каппа-казеина оказывают влияние на технологические свойства молока в плане повышения количества (выхода) и качества сыра (Гладырь с соавт., 2000; Гладырь, 2001; Bonfatti et al., 2011; Comin et al., 2008; Kubarsepp et al., 2005; Ng-Kwai-Hang, 1998). Опубликованы данные, где доказывается связь между генотипами каппа-казеина и молочной продуктивностью (Павлова с соавт., 2011; Калашникова с соавт., 2006; Tsiaras et al., 2005; Bartonova et al., 2012; Bech et al., 1990; Алипанах с соавт., 2006). Нужно отметить, что в ряде исследований связь между генотипами каппа-казеина и молочной продуктивностью по удою не установлена (Мачульская Е.В., 2009), а некоторые публикации указывают на отсутствие связи между генотипами и содержанием жира и белка (Bobe et al., 1999).

К настоящему времени ген каппа-казеина достаточно хорошо изучен. Известно, что ген CSN3 имеет в длину 13062 пар оснований, большинство однонуклеотидных полиморфизмов находятся в 4-м экзоне. У крупного рогатого скота известно 11 аллелей гена каппа-казеина, однако наиболее часто встречаются аллели «А» и «В», которые различаются двумя аминокислотными заменами (Thrl36/Iso и Asp/Ala), вызванными точковыми мутациями в позициях 5309 и 5345 нуклеотидов гена (Pinder et al., 1991; Калашникова с соавт., 2007). Считают, что генотип «ВВ» обусловливает большее содержание белка и жира в молоке (Сулимова с соавт., 2007). Аллель «В» ассоциирован с лучшими коагуляционными свойствами молока. С другой стороны, есть данные, указывающие на то, что аллель «А» связан с повышенной молочной продуктивностью (Gonyon et al., 1987; Curi et al., 2005). В некоторых работах доказывается, что генотип «АВ» дает не только более высокий уровень молочной продуктивности (удой) по итогам наивысшей лактации, но более высокое содержание жира и белка. Коровы с наиболее распространенным генотипом «АА» уступают животным генотипа «АВ» по удою на 236 кг и имеют более низкий процент жира (Павлова с соавт., 2011). Примерно

к такому же выводу приходит и другой исследователь, который показал, что аллель «В» связан с повышенной молочной продуктивностью как у первотелок, так и у коров по 2-й и 3-й лактациям (Грашин, 2011). Суммируя сказанное выше, можно прийти к выводу, что к настоящему времени нет однозначного понимания, как аллели «А» и «В» каппа-казеина влияют на признаки количества и качества молока у крупного рогатого скота. Возможно, их связь с признаками молочной продуктивности зависит от исследуемой популяции независимо от породы животных. Очевидно, признак «молочная продуктивность» определяется большим числом генов и в разных популяциях закономерности могут быть разными в силу наличия комбинаций генов и их взаимодействия.

Разработано достаточно много тест-систем для выявления полиморфных вариантов гена каппа-казеина (Глазко с соавт., 1997; Дерюшева, 1993; Кириленко с соавт., 1995; Сулимова с соавт., 1991). Авторы используют различные комбинации праймеров для амплификации участка, содержащего однонуклеотидные замены. Например, амплификат длиной 935 пар оснований образуется при использовании следующих праймеров (Soria et al., 2003): Kappa-casein Forward Primer : 5 '-AGCGCTGTGAGAAAGATG-3 ' Kappa-casein Reverse Primer : 5 ' -GTGC A AC AAC ACTGGTAT-3 '

Использование эндонуклеазы рестрикции HinàlW позволяет выявить у гомозигот «АА» один фрагмент 935 пар оснований, у гетерозигот «АВ» - три фрагмента 935, 520 и 415 пар оснований, у гомозигот «ВВ» - два фрагмента 520 и 415 пар сонований. Рестриктаза Нае III не различает гомозиготы и гетерозиготы, однако идентифицирует редкую аллель «Е» в гене каппа-казеина (Soria et al., 2003).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Выделение и определение качества ДНК из проб крови

Исследования проводили в период 2007-2009 годы в лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИГРЖ. Объектом исследований была ДНК, выделенная из крови быков-производителей племпредприятия ОАО «Невское по племенной работе» (далее - «Невское»), ремонтных бычков и коров 6-ти племенных хозяйств Ленинградской области. Генотипировали 275 быков и 359 коров, таким образом, общее число животных в анализе составило 634 головы.

Использовали два метода выделения геномной ДНК, пригодной для генотипирования методом ПЦР. В качестве начального материала для выделения ДНК были использованы кровь и сперма быков. Кровь брали из яремной вены в пробирки, содержащие антикоагулянт. В качестве антикоагулянта были испытаны цитрат натрия, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и гепарин. Оказалось, что гепарин иногда ингибирует полимеразную цепную реакцию, поэтому от этого антикоагулянта пришлось отказаться. Данное свойство гепарина было отмечено и другими исследователями. Цитрат натрия обладает хорошими антикоагуляционными свойствами, однако его применение связано с большим объемом (до 20% от объема крови), в некоторых случаях это было неудобно. Поэтому в данной работе предпочтение было отдано антикоагулянту ЭДТА. Это вещество широко используется в молекулярной генетике благодаря своим уникальным свойствам связывать двухвалентные катионы и тормозить практически все ферментативные реакции. Известно, что большинство ферментов, используемых в лабораторной практике, требуют наличия ионов магния или кальция, которые могут быть эффективно удалены при введении в раствор ЭДТА. Таким образом, при взятии крови для предотвращения свертывания в пробирку вносили 1-2 капли 0,5М раствора ЭДТА. Хранение образцов крови проводили путем замораживания при в морозильной камере. Кровь в таком состоянии можно хранить в течение многих месяцев. Замораживание также

приводит к лизису эритроцитов, что облегчает дальнейшее выделение ДНК. Для генотипирования быков ДНК было удобно выделять из спермы. При этом сперма была в пайетах, одной дозы было достаточно для получения необходимого количества ДНК. Хранение спермы в пайетах проводили в морозильнике при -20°С так же как и кровь.

В лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИГРЖ отработаны две методики выделения геномной ДНК - классический фенольный метод и метод, основанный на использовании наборов ДНК-сорб-В ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Подготовка образцов для выделения ДНК из спермы быков:

> Внести в пробирку 200 мкл разбавленной спермы

> Добавляем 1 мл буфера: ЮОмМ трис-20мМ ЭДТА-ЮмМ ЫаС1, рН =8,0 перемешиваем, центрифугируем 10000 об/мин 5 минут

> Суспендируем осадок в 100 мкл буфера: ЮОмМ трис-20мМ ЭДТА-ЮмМ №С1 + 8 мкл меркаптоэтанола. Перемешать, оставить на 30 минут при комнатной температуре

> 100 мкл смеси использовать в наборе ДНК-сорб-В согласно инструкции к набору

Подготовка образцов для выделения ДНК из крови быков или коров:

> 1,5 мл оттаянной крови центрифугируем при 8000 об/мин 5 минут

> Суспендируем осадок (лейкоциты) в 1 мл буфера ЮОмМ трис-20мМ ЭДТА-ЮмМ ИаС1, рН =8,0

> Снова центрифугируем при 8000 об/мин 5 минут

> Суспендируем осадок (лейкоциты) в 100 мкл буфера 1 ООмМ трис-20мМ ЭДТА-ЮмМ ЫаС1, рН =8,0

Выделение геномной ДНК с использованием ДНК-сорб-В: перед работой прогревали лизирующий раствор и раствор для отмывки №1 из набора ДНК-сорб-В в течение 1 часа при 65 °С или до полного растворения. В пробирки с лизирующим раствором из набора ДНК-сорб-В вносили 100 мкл подготовленного, как описано выше, образца. Образец тщательно перемешиваем на вортексе и прогреваем 5 мин при температуре 65°С. Центрифугировали 5 секунд при 5000 об/мин на микроцентрифуге. В каждую пробирку затем вносили 25 мкл универсального сорбента из набора. Перемешивали на вортексе, оставляли инкубироваться 2 минуты, затем еще раз перемешивали на вортексе, инкубировали дополнительно 5 минут. Осаждали сорбент центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 секунд. Удаляли надосадочную жидкость, затем вносили по 300 мкл раствора для отмывки №1. Перемешивали на вортексе, осаждали сорбент центрифугированием, удаляли надосадочную жидкость. Вносили 500 мкл раствора для отмывки №2, перемешивали на вортексе, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость. Повторяли процедуру отмывки с использованием раствора для отмывки №2. Подсушивали сорбент универсальный после удаления надосадочной жидкости в термостате при 65°С в течение 5-10 минут. В пробирки вносили по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешивали на вортексе, инкубировали в термостате при 65°С в течение 5 минут с периодическим встряхиванием. Центрифугировали пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 минуты. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК, которую в последующем использовали в постановке реакции ПЦР.

Выделение геномной ДНК с использованием классического фенольного метода (8атЬгоок е1 а1., 1989):

после подготовки образцов (кровь или сперма) как описано выше, к 100 мкл образца прибавляем 400 мкл буфера ЮОмМ трис-20мМ ЭДТА-ЮмМ ЫаС1, рН =8,0. Затем вносим в суспензию 5 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и 25 мкл

10% раствора додецилсульфата натрия (ДСН). Осторожно перемешиваем. Инкубируем при 55°С в течение 3 часов. Затем добавляем фенол (РН 8,0) в равном объеме и полученную смесь встряхиваем 15 минут, затем центрифугируем при 5000 § 15 минут и осторожно отбираем верхнюю водную фазу, содержащую ДНК. При этом содержимое центрифужной пробирки разделяется на 4 фазы: 1) осадок на дне - остатки клеток, 2) фаза фенола с растворенными в нем белками, 3) интерфаза - денатурированные белки не растворимые в феноле, 4) верхняя фаза - водный раствор очищенной ДНК. Экстрагирование фенолом повторяем два раза до полного исчезновения следов белка в интерфазе. К полученному водному раствору ДНК прибавляем 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и два объема холодного этанола. ДНК переходит в видимое состояние и может быть промыта 70° этанолом для удаления остатков солей и фенола. ДНК слегка подсушиваем при комнатной температуре и растворяем в буфере ТЕ (10 мМ трис НСЬ - 1 мМ ЭДТА, рН 7,4). После выделения ДНК анализируем на спектрофотометре. Отношение поглощения А260/А280 во всех случаях должно превышать значение 1,8, что говорит о хорошем качестве препарата ДНК. Выход ДНК обычно составлял 20 мкг на 1 мл крови. Количество выделенной ДНК определяем на спектрофотометре, учитывая, что 1 оптическая единица поглощения раствора двуцепочечной ДНК при длине волны в 260 нм соответствует концентрации ДНК в 50 мкг/мл.

Полученную ДНК можно хранить в холодильнике при 4°С в течение нескольких недель. Если есть необходимость хранения образцов ДНК более длительное время, тогда необходимо замораживание при -20°С.

2.2. Оптимизация процедуры полимеразной цепной реакции для выявления рецессивных мутаций и аллелей гена каппа-казеина

В связи с тем, что разными авторами используются различные варианты проведения генетического анализа на предмет выявления вредных рецессивных мутаций и аллелей каппа-казеина, нами была поставлена задача найти

оптимальный вариант генотипирования в наших условиях. В частности, были протестированы различные комбинации праймеров, концентрации ионов Mg2+ в реакционной смеси, состав буферов. Оказалось, что в некоторых случаях предпочтительно использовать определенные ферменты, буфера и праймеры. Удалось найти оптимальные сочетания всех компонентов, что позволило разработать надежную систему генотипирования по указанным выше локусам с применением коммерчески доступных реактивов. Например, было выяснено, что оптимальный буфер для проведения ПЦР является буфер «5х ПЦР-буфер blue», поставляемый фирмой Интерлабсервис (производитель ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Преимуществом этого буфера является то, что он обеспечивает оптимальную концентрацию ионов Mg (конечная концентрация в реакционной смеси 3 мМ) и содержит в своем составе

компоненты, необходимые при нанесении на лунки в агарозном геле).

2+

При введении ионов Mg самостоятельно, было выявлено, что с повышением концентрации свыше 3 мМ происходит существенное снижение количества ПЦР-продукта. Пониженные концентрации давали много продукта, но при этом сильно увеличивалось количество неспецифических продуктов амплификации, что затрудняет интерпретацию результатов.

Параллельно определяли оптимальное количество праймеров в реакции. Было установлено, что лучшие результаты получаются при внесении в ПЦР-смесь 1 мкл каждого праймера с концентрацией 5 о.е./мл. Превышение этого количества дает неспецифическое связывание и повышенный фон, состоящий из множества фрагментов ДНК. Были использованы Taq-полимеразы нескольких фирм, все они оказались идентичными по своей активности. В работе использовали, в основном, Taq-полимеразу фирмы Сибэнзим.

Выявление мутации BLAD проводили с использованием различных праймеров. Оказалось, что праймеры предложенные в работе Schifferli (Schifferli С. et al, 2000) давали более четкий сигнал, чем методика по Shuster (Shuster et al., 1992).

Использование праймеров, предложенных в работе Medrano (Medrano et al., 1990) приводило к амплификации ПЦР-продукта, который нужно было для выявления типов гена каппа-казеина расщеплять рестриктазой Hinñ. Для подтверждения результатов мы использовали другую комбинацию праймеров, предложенных в работе словацких ученых (Vasícek et al., 1995).

2.3. Проведение полимеразной цепной реакции для выявления рецессивных мутаций BLAD, СУМ и DUMPS

Выявление мутации BLAD.

Для проведения полимеразной цепной реакции были использованы праймеры: прямой 5'-AGGCAGTTGCGTTCAACGTGA-3', обратный 5'-CCGACTCGGTGATGCCATTGA-3' (Schifferli С. et al, 2000), синтезированные НПАО "Силекс М", г.Москва.

ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1 ед. Taq -полимеразы, по 0,25 шМ каждого dNTP, 67 mM трис -НС1 рН 8,6, 2,5 шМ MgCl2, 16,6 mM NH4OH, по 0,5 мкм каждого праймера и 100-150 нг ДНК. В последнее время используем буфер из набора фирмы Интерлабсервис «5х ПЦР-буфер blue».

Программа включала в себя первоначальную денатурацию (95° С, 1 мин), 40 циклов, состоящих из следующих повторяющихся друг за другом этапов -денатурация - 95° С, 1 мин, отжиг праймеров - 62° С, 1 мин, синтез - 72° С, 1 мин; финальный синтез - 72° С, 5 мин.

Полученный амплификат резали при помощи 3-4 ед. рестриктазы Taql (Fermentas) при температуре 56°С в течении 2 часов. Обе цепи ДНК здоровых животных режутся с помощью указанного фермента. В итоге на электрофорезе мы видим два фрагмента - 100 п.н и 58 п.н. Так как мутация ведет к исчезновению сайта рестрикции для Taq I, то ДНК животного, гетерозиготного по этой мутации будет представлена в виде трех фрагментов 158 п.н., 100 п.н., 58 п.н.

Выявление мутации СУМ.

Использовался метод ПДРФ анализа ПЦР продуктов. В связи с тем, что выявляемый фрагмент ДНК длиной в 233 п.о. (101 п.о. 4-го экзона и 132 п.о. 4-го интрона) в месте нахождения точечной мутации не имеет сайтов рестрикции, необходимо искусственно ввести сайты путем использования специфических праймеров (Lien et al., 1992; Kanae et al., 2005) . Замена G (дикий тип аллели) на Т (CVM-аллель) приводит при использовании праймеров к исчезновению сайта для рестриктазы PstI (Kanae et al., 2005): прямой Pst 5'- CAC AAT TTG TAG GTC TCA CTG CA, обратный 5'- CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG При использовании праймеров появляется сайт рестрикции для ЕсоТ22, выявляющий мутантную аллель:

прямой ЕсоТ22 5'- С AC AAT TTG TAG GTC TCA ATG С A, обратный 5 ' - CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG

Оба праймера комплементарны последовательности начиная с нуклеотида № 537 до 554 гена SLC35A3, однако 2 нуклеотида в 4-й и 5-й позиции с 3D-конца праймеров являются различными. Три нуклеотида на ЗП-конце обоих праймеров являются комплементарными нуклеотидам 556-558 как к дикой, так и к CVM мутантной аллели. Условия проведения ПЦР-реакции:

Начальная денатурация 94°С - 1 минута, денатурация 94°С - 30 секунд, отжиг 56°С - 30 секунд, удлинение 72°С - 30 секунд, конечная инкубация 72°С - 2 минуты. Всего проводится 30 циклов (Kanae et al., 2005). Для ускорения анализа на большом поголовье животных, нами были использованы аллель-специфичные праймеры (Chrenek et al., 2011; Зиновьева с соавт., 1996; Huang et al., 1992; Rust et al., 1993) для выявления точечной мутации СУМ: прямой № 1 5'- С AC AAT TTG TAG GTC TCA CTG GAT прямой №2 5'- CAC AAT TTG TAG GTC TCA CTG GAG обратный 5 ' - CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG

ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1 ед. Taq -полимеразы, по 0,25 шМ каждого dNTP, 67 mM трис -НС1 рН 8,6, 2,5 шМ MgCl2, 16,6 mM NH4OH, по 0,5 мкм каждого праймера и 100-150 нг ДНК.

В последнее время используем буфер из набора фирмы Интерлабсервис «5х ПЦР-буфер blue». При использовании аллель-специфических праймеров ставится две реакции ПЦР: прямой №1 + обратный и прямой №2 + обратный. В случае если амплификация произойдет в комбинации прямой №1 + обратный, можно говорить о наличии мутации (замена G на Т).

Выявление мутации DUMPS.

Ген PTPN18, мутация в котором ответственна за развитие симптомов DUMPS, локализован в первой хромосоме. Точковая мутация в гене привела к замене в 405 положении цитозина на тимин. Для проведения полимеразной цепной реакции были использованы праймеры: прямой 5GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT - 3', обратный 5'- GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT - 3' (Schober, et al, 1993)

ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1-2 ед. Taq -полимеразы (Биолаб, Санкт-Петербург), по 0,25 шМ каждого dNTP, 67 шМ трис -HCl pH 8,6, 2,5 шМ MgCl2, 16,6 mM NH4OH . по 0,5 мкм каждого праймера и 100-150 нг ДНК. В последнее время используем буфер из набора фирмы Интерлабсервис«5х ПЦР-буфер blue». Программа ПЦР включала в себя первоначальную денатурацию (94°С, 1 мин), 30 циклов, состоящих из следующих повторяющихся друг за другом этапов - денатурация - 94° С, 1 мин, отжиг праймеров - 60°С, 1 мин, синтез - 72°С, 1 мин; финальный синтез -72°С, 5 мин. Полученный амплификат резали при помощи 3-4 ед. рестриктазы Aval (Fermentas) при температуре 37°С в течении 2 часов. Обе цепи ДНК здоровых животных режутся с помощью указанного фермента в двух местах. В итоге на электрофорезе мы видим три фрагмента - 40, 36 и 19 п.н. Так как мутация ведет к исчезновению одного сайта рестрикции для Aval, то гетерозигота по этой мутации будет представлена в виде четырех фрагментов 76, 40,36 и 19 п.н.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции для выявления генотипов по гену каппа-казеина

При типирования гена каппа-казеина использовали праймеры: прямой 5'-GCT GAG CAG GTA ТСС TAG ТТА Т-3' обратный 5'-СТТ СТТ TGA TGT СТС СТТ AGA G-3'

Продукты амплификации подвергались расщеплению с помощью эндонуклеазы рестрикции Hindill (Vasicek et al., 1995). Использовали 5 e.a. фермента, реакцию проводили 3 часа при 37°С. ПЦР-смесь содержала 200мкМ концентрацию праймеров и 1 е.а. Taq-полимеразы. Начальная денатурация проводилась при 95°С в течение 5 минут. Использовали 35 циклов: денатурация 94°С в течение 40 секунд, отжиг 53°С в течение 40 секунд, удлинение праймеров 72°С в течение 40 секунд.

2.5. Анализ фрагментов ДНК в агарозном геле

Фрагменты ДНК, полученные в результате амплификации и расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции разделяли в 2% агарозном геле. Гель заваривали в 0,5-кратном трис-боратном электрофорезном буфере в микроволновой печке. Сразу после приготовления в горячую агарозу вносили бромистый этидий в количестве 5 мкл (10 мг/мл) на 100 мл агарозы. Молекула этого вещества содержит плоскую группу, которая интеркалирует между соседними основаниями ДНК. В результате такой интеркаляции в непосредственной близости от оснований краситель связывается с ДНК, что сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции. УФ-излучение, поглощаемое ДНК в области 260 нм и передаваемое на краситель (или же излучение, поглощаемое самим -красителем при длинах волн 300 и 360 нм), испускается затем в красно-оранжевой области видимого спектра (590 нм).

После остывания агарозы до примерно 50°С ее заливали на подложку в заливочном столике. Застывала агароза в течение 40 минут. После этого осторожно удаляли гребенки и гель с подложкой устанавливали

в электрофорезный аппарат. Перед работой в электрофорезный аппарат вносили буфер для электрофореза. Наиболее удобно пользоваться 0,5-кратным трис-боратным буфером. Он обладает высокой буферной емкостью и позволяет проводить несколько электрофорезов, не меняя буфер. Кроме того, считается, что трис-боратный буфер лучше разделяет небольшие фрагменты ДНК, такие как продукты ПЦР.

Электрофорез проводили при напряжении электрического поля в 150 вольт в течение 30 минут. Этого времени достаточно для разделения фрагментов ДНК. В одну из лунок геля вносили маркер длин фрагментов ДНК. Использовали коммерчески доступные маркеры молекулярных масс pBR322M/wI (908, 659/656, 521, 403,281, 257, 226, 100, 90 пар оснований) и pUC 19/Mspl (501/489, 404, 331, 242, 190, 147, 111/110, 67, 34/34). Маркеры вносили в лунки в количестве 2 мкл.

После завершения электрофореза гель просматривали в трансиллюминаторе под ультрафиолетовым светом и, если, результат был положительным, гель фотографировали в системе гель-документации для дальнейшего анализа. Рисунки сохраняли в формате Jpg или Jpeg.

2.6. Статистическая обработка данных

Частоту встречаемости генотипов рассчитывали по формуле: пЛА

где Ра - частота встречаемости особей генотипа АА в популяции, пАА - число выявленных особей с генотипом АА N - общее число особей в эксперименте

Заключение диссертации по теме «Генетика», Никифорова, Екатерина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована методика выделения ДНК из периферической крови и спермы, разработаны оптимальные схемы постановки полимеразной цепной реакции на предмет выявления рецессивных генетических дефектов у крупного рогатого скота.

2. ПЦР-диагностика носительства мутации ВЬАГ) у быков-производителей, содержащихся на племпредприятии «Невское» позволили выявить гетерозиготных носителей в трех линиях быков - Вис Айдиала, Рефлешн Соверинга и Монтвик Чифтейна. Быки линии Пабст Говернор были свободны от мутации.

3. Ремонтные бычки племенных заводов «Лесное», «Рабитицы», «Гражданский» и «Петровский» по данным ПЦР-тестирования в 2008 и 2009 годах были свободны от мутации ВЬАБ. В племзаводе «Ленинский путь» выявлен только один носитель - бык №522.

4. Выявлено 2 носителя мутации СУМ среди ремонтных бычков в племзаводе «Ленинский путь» и 1 носитель в племзаводе «Петровский» по данным тестирования в 2009 году.

5. У племенных коров установлен ряд носителей вредных рецессивных мутаций ВЬАЭ и СУМ по данным тестирования в 2009 году. В частности, в племзаводе «Гражданский» обнаружено 2 носители мутации ВЬАБ и одна - мутации СУМ. В племзаводе «Лесное» выявлена высокая частота встречаемости вредных рецессивных мутаций: 8 носителей мутации СУМ и 2 носителя мутации ВЬАБ. У 6 животных из 8 носителей мутации СУМ отцом был бык-производитель Момент 5747, который одновременно оказался гетерозиготным по мутации СУМ.

6. Установлено снижение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа «АВ» гена каппа-казеина у быков черно-пестрой породы племпредприятия «Невское» с 67,3% в 1995 году до 6,7% в 2007 году. Параллельно идет нарастание частоты генотипа «АА».

7. Генотип «АВ» у коров 6-ти племенных хозяйств Ленинградской области встречается чаще, чем у быков плепредприятия «Невское» и его частота составляет почти 24%. Высокая частота гетерозигот «АВ» отмечается у айрширских животных ОАО ПЗ «Новоладожский» - почти 33%.

8. Несмотря на более низкую частоту встречаемости гомозиготных генотипов «ВВ» по гену каппа-казеина как в голштинской, так и в айрширской породе, в изученных популяциях равновесие частот аллелей по критерию %2 не нарушено.

9. Выявлена связь (р = 0,014) между гетерозиготным генотипом «АВ» по гену каппа-казеина и удоем коров на примере племзавода «Рабитицы».

10. Доказана статистически достоверное превышение отдельных продуктивных признаков дочерей, таких как содержание белка в молоке (р=0,026), разность в удое со сверстницами (р=0,040) с наличием в генотипе отца аллели «В» гена каппа-казеина.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Результаты представленной к защите работы рекомендуется использовать при планировании селекционной работы с племенными животными Ленинградской области, прежде всего, в плане ограничения использования быков-носителей вредных рецессивных мутаций. Рекомендуется при подборе быков для воспроизводства учитывать аллельный состав гена каппа-казеина в генотипе этих быков как дополнительный благоприятный фактор. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе для студентов сельскохозяйственного и ветеринарного профилей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Никифорова, Екатерина Геннадьевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алипанах М. Влияние полиморфизма гена каппа-казеина на признаки продуктивности коров / М. Алипанах, Г.В. Родионов. // Практик.-2006.-№4. С. 59-61.

2. Амерханов X. Состояние и преспективы развития племенного животноводства в Российской Федерации / Амерханов X. // Молочное и мясное скотоводство.-2012.-№2.-С.7-10

3. Барсукова O.E. Рецессивные генетические дефекты в голштинской породе / Барсукова O.E. //Бюлл. ГНУ ВНИИГРЖ.-СП6.-2012.-в. 151 .-С. 15-17

4. Гладырь Е.А. ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы, ВИЖ, 2001.20с.

5. Гладырь Е.А. Использование генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина в качестве генетических маркеров для крупного рогатого скота / Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Марзанов B.C., Брэм Г. // Материалы II Междунар. Науч.конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». М.: ВНИИСХБ.-2000.-С.86-88

6. Глазко В.И. Динамика распространения мутации BLAD (иммунодефицит) у крупного рогатого скота / Глазко В.И., Филенко А.П. // Доклады РАСХН.-1999.-№2.-С.41 -43

7. Глазко В.И. ДНК-штрихкодирование сельскохозяйственных видов животных / Глазко В.И., Столповский Ю.А., Глазко Т.Т. // Вестник Российской академии наук.-2010.-№1.-С.107-113

8. Глазко В.И. Полиморфизм каппа-казеина у пород крупного рогатого скота / Глазко В.И., Журавль Е.В. // Вестник аграрной науки.-1997.- №5.-С.78

9. Глазко Г.В., Калашникова Л.А. Введение в ДНК-технологии.- М: ФГНУ Росинформагротех.-2001 .-436с.

10. Городецкий С.И. Анализ нуклеотидной последовательности к-ДНК каппа-казеина коровы / Городецкий С.И., Каледин A.C. // Генетика.-1987.- № 4.- С.596-604

11. Грашин A.A. Влияние генотипов каппа-казеина на хозяйственно-полезные признаки скота самарского типа чёрно-пёстрой породы автореф. дис. канд. биол. наук. Лесные Поляны, Московская обл..- 2011.-18с.

12. Дерюшева С.Е. Определение генотипа к-казеина у коров бестужевской породы методом полимеразной цепной реакции / Дерюшева С.Е. // Бюлл. ВНИИ генетики и разведения с/х животных.-1993.- Вып.137.- С.36-39

13. Долматова И.Ю. RAPD-анализ генетического полиморфизма уток. Межлинейные различия /Долматова И.Ю., Саитбаталов Т.Ф., Гареев Ф.Т. //Генетика.-2000.-№5.-С.532-539

14. Долматова И.Ю. Молекулярно-генетические маркеры и их использование в селекции сельскохозяйственных животных /Долматова И.Ю. // Вестник Башкирского государственного университета.-2004.-№4.-С.34-36

15. Дунин И. Племенные и продуктивные качества молочного скота в Российской Федерации / Дунин И., Кочетков А., Шаркаев В. // Молочное и мясное скотоводство.-2010.-№6.-С.2-5

16. Жигачев А.И. Наследственные аномалии и их контроль у КРС / Жигачев А.И., Суллер И.Л. // Практик.-2002.-№3-4.-С.46-53

17. Жигачев А.И. О наследовании груза мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым показателям / Жигачев А.И., Эрнст Л.К., Богачев A.C. // Сельскохозяйственная биология.-2008.-№6.-С.25-32

18. Зиновьева H.A. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Зиновьева H.A., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К., Брем Г. // М.: ВИЖ.-2002.-112с.

19. Зиновьева H.A. Диагностика различных аллельных вариантов ДНК "single tube" методом аллелеспецифической полимеразной цепной реакции / Зиновьева H.A., Васичек Д., Айгнер Б., Попов А.Н., Брем Г. // Биотехнология. -1996.-№6.-С.45-49

20. Зубец М.В. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма трех пород крупного рогатого скота / Зубец М.В. // Цитология и генетика.-2001.-Т.35 .-№4.-С.З-11

21. Иолчиев Б. С. Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных / Иолчиев Б.С. // М.: ВИЖ.-2002.-С.53-61

22. Исламова С. Применение ДНК технологии в селекции / Исламова С., Исламов Ф., Долматова И., Биккинин Р. // Молочное и мясное скотоводство. - 2007. - №5,- С. 2-4

23. Калашникова JI.A. Влияние генотипа каппа-казеина на молочную продуктивность и технологические свойства молока коров холмогорской породы / Калашникова Л.А., Труфанов В.Г. // Доклады РАСХН.-2006.-№4.-С.43-44

24. Калашникова Л.А. ДНК-технология оценки сельскохозяйственных животных / Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. с соавт. // М.: ВНИИплем.-1999,- 148с.

25. Калашникова Л.А. Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей. Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве».- Санкт-Петербург.-2007.- С. 295-298

26. Калашникова Л.А. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий / Калашникова Л.А. // 2-е изд. испр. и доп. М.: ВНИИплем.-Лесные поляны.-2001 .-34с.

27. Капелинская Т.В. Гены казеинов Bos taurus. Выделение и характеристика гена каппа-казеина / Капелинская Т.В., Ткач Т.М., Смирнов И.К., Городецкий С.И. //Генетика.-1989.-№ 1.-С.15-23

28. Кийко Е.И. Оценка аллелофонда быков-производителей по каппа-казеину и BLAD-синдрому / Кийко Е.И., Кургузкин В.Н., Саморуков Ю.В., Марзанов Н.С. // Ветеринарная патология.-2008.-№3.-С.38-40

29. Кириленко С.Д. Идентификация генотипов по каппа-казеину и BLAD мутации с использованием полимеразной цепной реакции у крупного рогатого скота / Кириленко С.Д., Глазко В.И. // Цитология и генетика.-1995.-№ 6.-С. 60-62

30. Киселева Т.Ю. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота / Киселева Т.Ю., Подоба Б.Е., Заблудовский Е.Е., Терлецкий В.П., Воробьев Н.И., Kantanen J. // Сельскохозяйственная биология.-2010.-№6.-С.20-25

31. Ковалюк Н.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. // Зоотехния.-2007.-№8.-С.2-4

32. Коновалов B.C. Проблемы и решения на пути создания новой системы сбора и обработки селекционной информации в животноводстве Украины / Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологической безопасности» // Сборник научных статей / Под общ. ред. доктора с.-х. наук А.А.Афонина. -Брянск: Издательство «Курсив», 2011. - С. 78-87

33. Мачульская Е.В. Уровень молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти разных генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина: Автореф. дис. канд. биол. наук. Ставрополь, СНИИЖК, 2009., 23с.

34. Михайлова М.Е. Использование ДНК-технологий для генетического маркирования хозяйственно-ценных признаков и идентификации скрытых носителей иммунодефицита крупного рогатого скота / Михайлова М.Е., Белая Е.В., Голенченко С.Г.. Волчок Н.М., Камыш H.A. // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве» Санкт-Петербург.-2007.- С. 267-272

35. Озеров М.Ю. Генетический профиль у различных пород овец по микросателлитам / Озеров М.Ю., Марзанов Н.С., Насибов М.Г., Кантанен Ю., Тапио М. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук.-2003.-№5.-С.72-75

36. Павлова И.Ю. Полиморфизм быкопроизводящих коров холмогорской породы по генам молочных белков / Павлова И.Ю., Калашникова JTA., Ялуга В.Л., Рухлова Т.А. // Зоотехния.-2011.-№6.-С.6-7

37. Потапов С.Г. Диагностические возможности мультилокусных маркеров ДНК в систематике диких копытных животных (Artiodactyla) / Потапов С.Г., Токарская О.Н., Семенова С.К., Данилкин A.A., Марков Г.Г., Рысков А.П. // Генетика.-1997.-Т.ЗЗ.-С.961-966

38. Прохоренко П.Н. Интенсификация молочного скотоводства на основе использования голштинской породы / Прохоренко П.Н. // Бюлл. ГНУ ВНИИГРЖ.-СП6.-2012.-в. 151 .-С.3-6

39. Рыбчин, В.Н. Основы генетической инженерии. / В.Н.Рыбчин // СПб: изд-во СПбГТУ, 1999 г. - 522 с.

40. Рысков А.П. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп: использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13 / Рысков А.П., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И. // Генетика.- 1988.-Т.24.-С.227-238

41. Сайки, Р. Анализ генома. / Р.Сайки, У.Гилинстен, Г. М.Эрлих // М.:Мир. -1990.-248с.

42. Смарагдов М.Г. Тотальная геномная селекция с помощью SNP как возможный ускоритель традиционной селекции // Генетика.-2009.-№6.-С.725-728

43. Сулимова Г.Е. Генотипирование локуса каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции / Сулимова Т.Е., Шайхаев Г.О., Берберов Э.М., Маркарян А.Ю., Кандалова Л.Г. // Генетика.-1991.- №12.- С.2053-2062

44. Сулимова Г.Е. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина у Российских пород крупного рогатого скота и его информативность как генетического маркера / Ахани Азари М., Ростамзадех Д., Мохаммад Абади М.Р., Лазебный O.E. // Генетика.-2007.- № 1.-С.88-95

45. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Сулимова Г.Е. // Успехи современной биологии.-2004.- № 3.- С. 260-271

46. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в изучении генофонда пород крупного рогатого скота // В кн. Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России. М.:Наука.-2006.-С.138-168

47. Танана Л. А., Епишко Т. И., Мостовой Д. Е., Трахимчик Р. В. Мониторинг генетической устойчивости быков - производителей Гродненского племпредприятия к синдрому иммунодефицита крупного рогатого скота // Вестник ФГОУ ВПО Брянская ГСХА.-2009.-№3 URL: http://cyberleninka.ru/article/n/monitoring-geneticheskoy-ustoychivosti-bykov-proizvoditeley-grodnenskogo-plempredpriyatiya-k-sindromu-immunodefitsita-krupnogo

48. Усенбеков Е.С. Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казенна, бета-лактоглобулина и мутации ВЬАЭ: автореф. Дис. Канд. Биол. наук. Санкт-Петербург.- 1995.-17с.

49. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии // М. :Воскресенье.-2006.-480с.

50. Эрнст Л.К. Мониторинг генетического груза в черно-пестрой, голштинской и айрширской породах крупного рогатого скота / Эрнст Л.К., Жигачев А.И., Кудрявцев В.А. // Зоотехния.-2007.-№Э.-С.5-10

51. Эрнст Л.К. Профилактика генетических аномалий крупного рогатого скота / Эрнст Л.К., Жигачев А.И. // Л.-1990.-240с.

52. Яковлев А. Определение носителей генетических дефектов среди быков-производителей // Яковлев А., Терлецкий В., Митрофанова О., Дементьева Н. Молочное и мясное скотоводство.-2004.-Т.6.-С.31-32

53. Яковлев А.Ф. Использование полиморфизма ДНК и генов в селекции сельскохозяйственных животных / Яковлев А.Ф., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Митрофанова О.В., Сексте Э.А. // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве».- Санкт-Петербург.-2007.- С. 18-23

54. Яковлев А.Ф. Рекомендации по использованию ДНК-технологии для элиминации скрытых генетических дефектов и определения типов гена каппа-казеина в молочном скотоводстве Ленинградской области / Яковлев А.Ф., Дементьева Н.В., Митрофанова О.В., Тыщенко В.И. Методические рекомендации ГНУ ВНИИГРЖ.- 2009,-Санкт-Петербург.-С.1-8

55. Яковлев А.Ф. Значительное повышение точности оценки племенной ценности животных в молочном скотоводстве / Яковлев А.Ф., Смарагдов М.Г. // Зоотехния.-2011 .-№ 5.-С.2-4

56. Agerholm J.S. Complex vertebral malformation in Holstein calves / Agerholm J.S., Bendixen C, Andersen O, Arnbjerg J. // Journal Veterinary Diagnosis Investigation.-2001 .-v. 13. P.283-289

57. Arnaout M.A. Leukocyte adhesion molecules deficiency: its structural basis pathophysiology and implications for modulating the inflammatory response / Arnaout M.A. // Immunology Review.-1990,-v. 114.-P. 145-180

58. Atienzar F. Optimised RAPD analysis generates high-quality genomic DNA profiles at high annealing temperature / Atienzar F., Evenden A., Jha A., Savva D., Depledge M.H. // Biotechniques.- 2000.-V.28.-P.52-54

59. Bartonova P. Association between CSN3 and BC02 gene polymorphisms and milk performance traits in the Czech Fleckvieh cattle breed / Bartonova P., Vrtkova I., Kaplanova K., Urban T. // Genet Mol Res.- 2012,-v.l 1.-1058-1063

60. Bech A. M. Milk protein polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of genetic variants on milk yield / Bech A.M., Kristiansen, K.R. // Journal of Dairy Research.-1990.-v.57.-P.53-62

61. Berglund B. Effects of complex vertebral malformation on fertility in Swedish Holstein cattle / Berglund B., Persson A., Stalhammar H. // Act vet Scand.-2004.-V.45.-P.161-165

62. Bobe G. Individual proteins and fatty acids in bovine milk as determined by correlations and factor analysis / Bobe G., Beita D.C., Freeman A.E. , Lindberg, G.L. // Journal of Dairy Research.- 1999.-V.66.-P.523-536

63. Bonfatti V. Effect of k-casein B relative content in bulk milk k-casein on Montasio, Asiago, and Caciotta cheese yield using milk of similar protein composition / Bonfatti V., Cecchinato A, Di Martino G, De Marchi M, Gallo L, Carnier P. // Journal of Dairy Science.-2011.-V.94.-P.602-613

64. Brush P.J. Identification of factor XI deficiency in Holstein-Friesian cattle in Britain / Brush P.J., Anderson P.H., Gunning R.F. // The Veterinary Record.-1987.-v. 121.-P. 14-17

65. Caroli A.M. Invited review: Milk protein polymorphisms in cattle: Effect on animal breeding and human nutrition / Caroli A.M., Chessa A., Erhardt G.J. //Journal of Dairy Science.-2009.-v.92.-P.5335-5352

66. Carrit B. Somatic cell genetic evidence for the presence of a gene for citrullinemia on human chromosome 9 / Carrit B. // Cytogenetics and Cell Genetics.-1977,-v. 19.-P.44-48

67. Chaudhari M. V. Molecular characterization of Kenkatha and Gaolao (Bos indicus) cattle breeds using microsatellite markers / Chaudhari M. V., Parmar, S. N. S., Joshi, C. G., Bhong, C. D., Fatima, S., Thakur, M. S., Thakur, S. S. // Animal Biodiversity and Conservation.-2009.-v32.-P.71-76

68. Chrenek P. Identification of bovine k-kasein C allele using allele-specific polymerase chain reaction / Chrenek P., Vasicek D. // Journal of Animal Breeding and Genetics.-2011 .-v. 115.-P.491 -495

69. Citek J. Recessive disorders - serious health hazard? / Citek J., Blahova B. // Journal of Applied Biomedicine.-2004.-v.2.-P.187-194

70. Citek J. Sporadic incidence of factor XI deficiency in Holstein cattle / Citek J., Rehout V., Hanusova L., Vrabcova P. // Journal of the Science of Food and Agriculture.-2008.-v.88.-P.2069-2072

71. Comin A. Effects of composite beta- and kappa-casein genotypes on milk coagulation, quality, and yield traits in Italian Holstein cows / Comin A., Cassandro M, Chessa S, Ojala M, Dal Zotto R, De Marchi M, Carnier P, Gallo L, Pagnacco G, Bittante G. // Journal of Dairy Science.-2008.-v.91.-P.4022-4027

72. Crawford L.A. A call for more transparent reporting of error rates: the quality of AFLP data in ecological and evolutionary research / Crawford L.A., Koscinski D., Keyghobadi N. //Molecular Ecology.-2012.-V.21.-P.5911-5917

73. Curi R.A. Effects of CSN3 and LGB gene polimorphisms on production traits in beef cattle / Curi R.A., Oliveira H.N.D., Gimenes M.A., Silveira A.C., Lopes C.R. // Genet Mol Biol.-2005.-v.28.-P.262-266

74. Czarnik U. Effectiveness of a program aimed at the elimination of BLAD-carrier bulls from Polish Holstein-Friesian cattle / Czarnik U., Grzybowski G., Kaminski S., Prusak B., Zabolewicz T. // Journal of Applied Genetics.- 2007b.-V.48.-P.375-377

75. Czarnik V. Study of SNP 775 C>T polymorphism within the bovine ITGB2 gene in Polish black -and- White cattle and local breeds of cattle / Czarnik V., Galinski M., Zabolewicz T., Pareek C.S. // Czeck Journal of Animal Science.-2007a.-v.52.-P.57-61

76. De Marchi M. Assessing genetic diversity in indigenous Veneto chicken breeds using AFLP Markers / De Marchi M., Dalvit C., Targhetta C., Cassandro M. // Animal Genetics.-2006.-v.37.-P. 101-105

77. Dennis J.A. Molecular definition of bovine agrinin osuccinate synthetase deficiency / Dennis J.A., Healy P.J., Beaudet A.L., O'Brien W.E. // Proceedings of the National Academic Science.-1989.-v.86.-P.7947-7951

78. Dodgson J.B. DNA marker technology: a revolution in animal genetics / Dodgson J.B., Cheng H.H., Okimoto R .// Poultry Science.-1997.-v.76.-P.l 108-1114

79. Duncan R.B. Brief communications. Complex vertebral malformation in a Holstein calf: report of a case in the USA / Duncan R.B., Carrig C.B., Agerholm J.S., Bendixen C. // Venerinary Diag Invest.-2001.-v.l3.-P.333-336

80. Eigel W.N. Nomenclature of proteins of cow's milk: Fifth revision / Eigel W.N., Butler J.E., Ernstrom C.A., Farrell H.M., Harwalkar V. R., Jenness R. // Journal of Dairy Science.-1984.-v.67.-P. 1599-1631

81. Farrell, H.M. Nomenclature of the proteins of cows' milk - sixth revision / Farell H.M., Jimenez-Flores R., Bleck G.T., Brown E.M., Butler J.E., Creamer L.K. //Journal of Dairy Science.-2004.-v.87.-P.1641-1674

82. Freeman A.R. Combination of multiple microsatellite data sets to investigate genetic diversity and admixture of domestic cattle / Freeman A.R., Bradley D.G., Nagda S., Gibson J.P., & Hanotte O. // Animal Genetics.-2006.-v.37.-P.l-9

83. Gentry P.A. Prevalence and inheritance of factor XI (plasma thromboplastin antecedent) deficiency in cattle / Gentry P.A., Black W.D. // Journal of Dairy Science.- 1980.-v.63.-P.616-620

84. Gentry P.A. The relationship between factor XI coagulant and factor XI antigenic activity in cattle / Gentry P.A. // Canadian Journal of Comparative Medecine.-1984.-V.48.-P.58-62

85. Ghanem M.E. Deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS) and X-chromosome deletion in fetal mummification in cattle / Ghanem M.E., Nakao T., Nishibori M. // Animal Reproduction Science.-2006.-91.- P. 45-54

86. Ghanem M.E. Factor XI mutation in a Holstein cow with repeat breeding in Japan / Ghanem M.E., Nishibori M., Nakao T., Nakatani K., Akita M. // Journal of Veterinary Medecine Science.-2005.-v.67.-P.713-715

87. Gilbert R.O. Clinical manifestations of leukocyte adhesion deficiency in cattle: 14 cases (1977-1991) / Gilbert R.O., Redhun W.C., Kim C.A., Kehrli M.E., Schuster D.E., Ackermann M.R. // Journal of American Veterinary Medicine Association.-1993 .-V.202.-P.445-449

88. Ginger, M.R. Comparative aspects of milk caseins / Ginger M.R., Grigor, M.R. // Comparative biochemistry and physiology part B.-1999.-V.124P.133-145

89. Gonyon D.S. Association of bovine blood and milk polymorphism with lactation traits in Holstein / Gonyon D.S., Mather R.E., Hines H.C., Haenlein

C.F.W., Arave C.W., Gaunt S.N. // Journal of Dairy Science.-1987.-v.70.-P.2585-2598

90. Grupe S. Population survey of citrullinemia on German Holsteins / Grupe S., Diet G., Schwerin M. // Livestock Production Science.-1996.-v.45.-P.35-38

91. Hagemoser W.A. Granulocytopathy in a Holstein heifer / Hagemoser W.A., Roth J.A., Lofstedt J., Fagerland J. A. // Journal of American Veterinary Medicine Association.-1983.-v.183.- P. 1093-1094

92. Hallen E. Effect of genetic polymorphism of milk proteins on rheology of chymosin induced milk gels / Hallen E., Allmere T., Naslund J., Andren A., Lunden A. // International Dairy Journal.-2007.-v.17.-P.791-799

93. Hallen E. Effect of beta-casein,kappa-casein and beta-lactoglobulin genotypes on concentration of milk protein variants / Hallen E., Wedholm A., Andren A., & Lunden A. // Journal of Animal Breeding and Genetics.-2008.-v. 125.-P.119-129

94. Harden K.K. Characterisation of UMFS in dairy cattle heterozygous for a lethal recessive trait / Harden K.K., Robinson J.L. // Biochememical Genetics.-1987.- v.25.- P.465-475

95. Harper P.A.W. Citrullinaemia as a cause of severe neurological disease in neonatal Holstein-Friesian calves / Harper P.A.W., Healy P.J., Dennis J.A. // Australian Veterinary Journal.-1986.-v.63.-P.378-379

96. Healy P.J. Bovine citrullinaemia traced to the sire of Linmack Kriss King / Healy P.J., Dennis J.A., Camilleri L.M., Robinson J.L., Stell A.L., Shanks R.D. // Australian Veterinary Journal.-1991.-v.68.-P. 155

97. Healy P.J. Testing for undesirable traits in cattle: An Australian perspective / Healy P.J. // Journal of Animal Science.-1996.-V.74.-P.917-922

98. Heck J. M. L. Effects of milk protein variants on the protein composition of bovine milk / Heck J.M.L., Schennink A., van Valenberg H. J. F., Bovenhuis

H., Visker M.H. P. W., van Arendonk J. A. M. // Dairy Science.-2009.-v. 92.-P.l 192-1202

99. Hiendleder S. Mapping of QTL for body conformation and behaviour in cattle / Hiendleder S., Thomsen H., Reinsch N., Bennewitz J., Leyhehorn B., Looft C., Xu N., Medjugorac I., Russ I., Kühn C., Brockmann G.A., Blümel J., Brenig B., Reinhardt F., Reents R., Averdunk G., Schwerin M., Förster M., Kalm E., Erhardt G. //Journal of Heredity.-2003.-v.94.-P. 496-506

100. Huang M.M. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR // Huang M.M., Arnheim N., Goodman M.F. // Nucleic Acids Research.-1992.-v.20.-P.4567-4573

101. Jann O.C. Geographic distribution of haplotype diversity atthe bovine casein locus / Jann O.C., Ibeagha-Awemu E.M., Özbeyaz C., Zaragoza P., Williams J.L., Ajmone-Marsan P. // Genetic Selection Evolution.-2004.-v.36.-P.243-257

102. Jánosa A. Comparison of milk production of the progeny of BLAD-carrier and healthy Holstein bulls in Hungary / Janosa A., Baranyai B., Dohy J. // Acta Veterinaria Hungarica.-1999.-V.47.-P.283-289

103. Kanae Y. A method for detecting complex vertebral malformation in Holstein calves using polymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis / Kanae Y., Endoh D., Nagahata H., Hayashi M. // Journal of Veterinary Diagnosis Investigation.-2005.-v.l7.-.-P.258-262

104. Kehrli M.E. Leukocyte adhesion deficiency among Holstein cattle / Kehrli M.E., Schuster D.E., Ackermann M.R. // Cornell Veterinarian.-1992.-v.82.-P. 103-109

105. Kehrli V.E. Molecular definition of the bovine granulocytopathy syndrome: identification of deficiency of the Mac-1 (CD1 lb/CD 18) glycoprotein / Kehrli V.E., Schmalstieg F.C., Anderson D.C., Van der Maaten V.J. // American Journal of Veterinary Research.- 1990.-v.51.-P. 1826-1936

106. Kethireddipalli P. Interaction between casein micelles and whey protein/k-casein complexes during renneting of heat-treated reconstituted skim milk powder and casein micelle/serum mixtures / Kethireddipalli P., Hill A.R., Dalgleish D.G.// J Agric Food Chem.-2011.-V.59.-P. 1442-1448

107. Kishimoto T.K. The leukocyte integrins / Kishimoto T.K., Larson R.S., Corbi A.L., Dustin M.L., Staunton D.E., Springer T.A. // Advances in Immunology.-1989.-v.46.-P. 149-182

108. Konersman Y. Origin, distribution and relevance of the CVM defect within the Holstein-Friesian population / Konersman Y., Wemheuer W., Brenig B. // Zuchtungskunde.-2003.-v.75.-P.9-15

109. Kubarsepp I. Effect of k-casein and lactoglobulin genotypes on the milk rennet coagulation properties / Kubarsepp I., Henno M., Viinalass H., Sabre D. // Agronomy Research.-2005.-v.3.-P.55-64

110. Kühn C. Quantitative trait loci mapping of functional traits in the German Holstein cattle population / Kühn C., Bennewitz J., Reinsch N., Xu N., Thomsen H., Looft C.,Brockmann C.A., Schwerin M., Weimann C., Hiendleder S., Erhardt G., Medjugorac I., Förster M., Brenig B., Reinhardt F., Reents R., Russ I., Averdunk G, Blümel J., Kalm E. // Journal of Dairy Science.-2003.-v.86.-P.360-368

111. Kumar V. Bovine leukocyte adhesion deficiency syndrome (BLAD): a recessive disorder in Holstein Friesian cattle - a review / Kumar V., Sharma A. // Agricultural Review.-2009.-v.30.-P.293-300

112. Lien S. Comparison of milk protein allele frequencies in Nordic cattle breeds/ Lien S., Kantanen J., Olsaker I., Holm L-E., Eythorsdottir E., Sandberg, K. // Animal Genetics.-1999.-V.30.-P.85-91

113. Luikart G. The power and promise of population genomics: from genotyping to genome typing / Luikart G., England P.R, Tallmon D. // Nature Reviews Genetics.-2003.-v. 4, P. 981-994

114. Malher X. Effects of sire and dam genotype for complex vertebral malformation (CVM) on risk of return-to-service in Holstein dairy cows and heifers / Malher X., Beaudeau F., Philipot J.M. // Theriogenology.-2006.-v.65.-P.1215-1225

115. Marrón B.M. Identification of a mutation associated with factor XI deficiency in Holstein cattle / Marrón B.M., Robinson J.L., Gentry P.A., Beever J.E. // Animal Genetics.-2004.-v.35.-P.454-456

116. Marsan P. Differentiation of European cattle by AFLP fingerprinting / Marsan P., Lenstra J. // Animal Genetics.-2007.-v. 38.-P. 60-66

117. Medrano J.F. Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification / Medrano J.F., Aquilar-Cordova E. // Biotechnology.-1990.-V.8.-P. 144-146

118. Meydan H. Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency, deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey //Meydan H., Yildiz M.A., Agerholm J.S. // Acta Veterinaria Scandinavica.-2010.-V.7.-P.52-56

119. Mirck M.H. Optimization of the PCR test for the mutation causing bovine leukocyte adhesion deficiency / Mirck M.H., Von Bannisseht-Wijsmuller T., Timmermans-Besselink W.J., Van Luijk J.H., Buntjer J.B., Lenstra J.A. //Cell Mol. Biol.-1995.-v.41.-P.695-698

120. Mohamed E. Complex vertebral malformation in Holstein cows in Japan and its inheritance to crossed generation / Mohamed E., Masashi A., Toshihiko S., Asako H.,Masahide N. // Animal Reproduction Science.-2008.-v.- 103.-P.1250-1254

121. Mukhopadhyaya P.N. A method for the simulation of normal, carrier and affected controls for PCR-RFLP screening of a genetic disease in dairy cattle / Mehta H.H., Rathod R.N. // Mol. Cell. Probes.-2000.-v.l4.-P.381-384

122. Nagahata H. Bovine granulocytopathy syndrome. Neutrophil dysfunction in Holstein Friesian calves / Nagahata H., Noda H., Takahashi K., Kurosawa T., Sonoda M. // Journal of Veterinary Medicine.-1987.-V.34.-P.445-451

123. Nagahata H. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD): a review / Nagahata H. // Journal of Veterinary Medecine Science.-2004.-v.66.-P.1475-1482

124. Nagahata H. Complex vertebral malformations in a stillborn Holstein calf in Japan / Nagahata H., Oota H., Nitanai A., Oikawa S., Higuchi H., Nakade T. // Journal of Veterinary Medecine Science.-2002.-v.64.-P.l 107-1112

125. Nagahata H. Prevalence and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) in Holstein-Friesian cattle in Japan / Nagahata H., Miura T., Taggaki K., Ohtake M., Noda H., Yasuda T., Nioka K. // Journal of Veterinary Medecine Science.-1997.-v.59.-P.223-238

126. Naicy T. Genetic Characteristics of Five Microsatellite Markers Associated with Milk Production Traits in Crossbred Dairy Cattle of Kerala / Naicy T., Anilkumar KM Veterinary World.-2008.-v. 8.-P. 245-247

127. Ng-Kwai-Hang K. F. Genetic polymorphism of milk proteins: relationship with production traits, milk composition and technological properties / Ng-Kwai-Hang K. F. // Canadian Journal of Animal Science.-1998.-v.78.-P.131-147

128. Pareek C.L. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) and its worldwide prevalence / Pareek C.L., Kamifiski S. // Journal of Applied Genetics.-1996.-V.37.-P. 299-311

129. Patel R.K. Lack of carriers of citrullinaemia and DUMPS in Indian Holstein cattle / Patel R.K., Krishna M.S., Kalpesh J.S., Jenabhai B.C., Krothapalli R.S., Sambasiva R. // Journal of Applied Genetics.-2006.-v.47.-P.239-242

130. Patel R.K. Low incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) carriers in Indian cattle and buffalo breeds / Patel R.K., Singh K.M., Soni K.J.,

Chauhan J.B., Sambasiva Rao K.R. // Journal of Applied Genetics.- 2007.-48,-P.153-155

131. Pinder S.J. Analysis of polymorphism in the bovine casein genes by use of the polymerase chain reaction / Pinder S.J., Perry B.N., Skidmore C.J., Sawa D. // Animal Genetics.-1991.-V.22.-P.11-20

132. Powell R.L. Relationship of bovine leukocyte adhesion deficiency with genetic merit for performance traits / Powell R.L., Norman H.D., Cowan C.M. // Journal of Dairy Scince.-1996.-v.79.-P.895-899

133. Revell S. Complex vertebral malformation in a Holstein calf in the UK / Revell S. // Vet Rec.-2001.-v.24.-P.659-660

134. Rijnkels M. Organization of the bovine casein gene locus. /Rijnkels M., Kooiman, P.M., de Boer, H.A., and Pieper, F.R. Mammalian genome.-1997.-V.8.-P.148-152

135. Robinson J.L. Consequences of UMP synthase deficiency in cattle / Robinson J.L., Drabik M.R., Dombrowski D.B., Clark J.H. // Proceedings of the. National Academic Sciences of USA.-1983.-V.80.-P.312-323

136. Robinson J.L. Low incidence of citrullinemia carriers among dairy cattle of the United States / Robinson J.L., Burns J.L., Magura C.E., Shanks R.D. // Journal of Dairy Science.-1993 .-V.76.-P.853-85 8

137. Robinson J.L. Oratate in milk and urine of dairy cows with a partial deficiency of UMFS / Robinson J.L., Dombrowski D.B., Clark J., Shanks R.D. // Journal of Dairy Sciences.-1984.-v.67.- P.1024-1029

138. Ronningen K. Change in the frequency of recessive gene due to selection of males in artificial insemination / R0nningen K. // Acta Agric. Scand.-1973.-V.23.-P.157-164

139. Ruse A. Prevalence of complex vertebral malformation carriers among Polish Holstein-Friesian bulls / Ruse A., Kamiriski S. // Journal of Applied Genetics.-2007.-V.48.-P.247-252

140. Rust S. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection / Rust S., Funke H., Assman G. // Nucleic Acids Research.-1993.-v.21.-P.3623-3629

141. Saiki R.K. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / Saiki R.K., Scharf S, Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. // Science.-1985.-v.230.-P. 1350-1354

142. Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. / Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Cold Spring Harbor Laboratory.-1989.-v.3.- New York, USA.

143. Schober S. Sequence of the cDNA encoding bovine uridine monophosphat synthase / Schober S., Simon D., Schwenger B.S. // Gene.-1993.-v.124.-P.307-308

144. Schober S., Isolierung und Charakterisierung des bovine Uridinemonophosphat synthase-Gens. / Hannover, Univ., Fachber. Biologie, Diss., 1994

145. Schütz E. Implication of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency DNA-based testing on disease frequency in the Holstein population / Schütz E., Scharfenstein M., Brenig B. // Journal of Dairy Sciences.-2008.-v.91 .-P.4854-4859

146. Schwenger B.S. DUMPS cattle carry a point mutation in the uridine monophosphat synthase gene / Schwenger B.S., Schober S., Simon D. // Genomics.-1993.-v. 16.- P.241-244

147. Scifferli G. Obtencion de DNA pera el estudio de BLAD en toros de Argentina y Espana / Scifferli G., Villaroel M., Arruga M.V. // Archivos de zootechnia.-2000.-v.49.-P. 1505-1508

148. Shuster D.E. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle / Shuster D.E., Kehrli M.E.,

Achermann M.R., Gilbert R.O. // Proceedings of the National Academic Science of USA.-1992.-V.89.-P.9225-9229

149. Snanks R.D. Embryonic mortality attributed to inherited deficiency of uridinemonophosphate synthase / Snanks R.D., Robinson J.L. // Journal of Dairy Science.-1989,-v.72.-P.3035-3039

150. Snanks R.D. Identification of the homozygous recessive genotype for the deficiency of uridinemonophosphate synthase in 35-day bovine embryos / Snanks R.D., Popp R.G., McCoy G.C., Nelson D.R., Robinson J.L. // Journal of Reproduction and Fertility.-1992.-v.10.-P.945

151. Soria L. A. A PCR-RFLP test to detect allelic variants of the bovine kappa-casein gene / Soria L.A., Iglesias G.M., Huguet M. J., Mirande S. L. Animal Biotechnology .-2003 .-v. 14.-P. 1 -5

152. Steinholt H.C. Chromosome and sperm size of Holsteins with and without bovine leukocyte adhesion deficiency / Steinholt H.C., Chandler J.E., Baron R.A., Adkinson R.W. // Journal of Dairy Scince.-1994.-v.77.-P.1239-1250

153. Tammen I. Am impoved DNA test for bovine leukocyte adhesion deficiency / tammen I., Klippert H., Kuczka A., Treviranus A., Pohlenz J., Stober M., Simon D., Harlizlizius B., // Research in Veterinary Science.-1996,-v. 60.-P.218-221

154. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers / Tautz D. // Nucleic Acids Research.-1989.-v.17.-P. 6463-6471

155. Teneva A. Molecular markers in animal genome analysis / Teneva A. // Biotechnology in Animal Husbandry.-2009.- v.5-6.-P. 1267-1284

156. Thomsen B. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation / Thomsen B., Horn P, Panitz F, Bendixen E, Petersen AH, Holm LE, Nielsen

VH, Agerholm JS, Arnbjerg J, Bendixen C. // Genome Research.-2006.-v.16.-P.97-105

157. Threadgill D.W. Genomic analysis of the major bovine milk protein genes / Threadgill D.W., Womack, J.E. // Nucleic Acid Research.-1990.-v.18.-P. 6935-6942

158. Tsiaras A.M. Effect of kappa-casein and beta-lactoglobulin loci on milk production traits and reproductive performance of Holstein cows / Tsiaras A.M., Bargouli G.G., Banos G., Boscos C.M. // Journal of Dairy Science.-2005.-v.88.-P.327-334

159. Vallas M. Composite (3-k-casein genotypes and their effect on composition and coagulation of milk from Estonian Holstein cows / Vallas M., Kaart T., Varv S., Parna K., Joudu I., Viinalass H., Parna E. // Journal of Dairy Science.-2012.-95.-P.6760-6769

160. vanRaden P.M. Effects of nonadditive genetic interactions, inbreeding, and recessive defects on embryo and fetal loss by seventy days / vanRaden P.M., Miller R.H. // Journal of Dairy Science.-2006.-v.89.-P.2716-2721

161. Vasicek D. Genotyping of k-casein in different cattle breeds in Slovakia / Vasicek D., Uhrin P., Chrenek P., Bauerova M., Oberfranc M., Bulla J. // Zivocisna Vyroba.-1995 .-v.40.-P.241 -244

162. Vignal A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics/ Vignal A., Milan D., Sancristobal M., Eggen A.// Genet.Sel. Evol.-2002.- v.34.-P. 275-305

163. Vos P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper MM Nucleic Acids Research.-1995.-V.23.-P.4407-4414

164. Wang C. Identification of complex vertebral malformation carriers in Holstein cattle in south China / Tong Q., Hu X.Z., Yang L.G., Zhong X.Q., Yu Y., Wu

cn ^

J.J., Liu W.J., Li X., Hua G.H., Zhao H.Q., Zhang S.J. // Genetics and Molecular Research.-2011.-V.10.-P.2443-2448

165. Welsh J. and McCleland G.M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Research.-1990.-v.l8.-P.7213-7218

166. Werner F.A.O. Detection and characterization of SNPs useful for identity control and parantage testing in major European dairy breeds / Werner F.A., Durtsewitz G., Habermann F.A., Thaller G., Krämer W. //Animal Genetics.-2004.-V.35.-P.44-49

167. Williams J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. // Nucleic Acids Research.-1990.-V.18.-P.6531-6535

168. Yi Z. A novel method for rapid and reliable detection of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle / Xuehua F., Dongxiao S., Yachun W., Ying Y., Yan X., Shengli Z., Yuan Z. // Journal of Animal Science and Biotechnology.-2012.-v.3.-P.24-30

169. Zsolnai A. Simultaneous analysis of bovine K-casein and BLAD alleles by multiplex PCR followed by parallel digestion with two restriction enzymes / Zsolnai A., Fesiis L. // Animal Genetics.- 1996.-V.27.-P.207-209