Генетическая трансформация растений томата геном preS2-S, кодирующим основной антиген оболочки вируса гепатита B, с целью получения кандидатной съедобной вакцины тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Столбиков, Алексей Сергеевич

• Столбиков, Алексей Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Столбиков, Алексей Сергеевич

клеток в вегетативных органах трансформированных растений поколения Т0 (Табл. 1, 2).

Стабильность генетической трансформации обычно проверяется на растениях поколения Т1. Поэтому из собранных плодов Т0 необходимо было получить жизнеспособные семена.

После извлечения из плодов семена растений поколения То прошли стерилизацию и были высажены на среду МБ. Через 14 дней проростки были перенесены на селективную среду с антибиотиком. Процент растений прошедших селекцию составлял в различных случаях 30-50%, что является вполне приемлемой величиной для поколения Т[. После соответствующей адаптации в связи с тем, что летний период подходил к концу, растения были высажены в камеру фитотрона.

После того как растения адаптировались в новых условиях, был проведен иммуноферментный анализ их листовых пластинок с целью обнаружения основного антигенного белка НВз

§, кодируемого геном Б. Иммуноферментный анализ показал присутствие целевого белка в вегетативных органах растений томата поколения Т1 (рис. 22).

Так как конечной целью работы являлось получение плодов трансформированных растений, содержащих HBsAg белок, то необходимо было провести соответствующие анализы, которые подтвердили бы наличие антигена именно в плодах трансгенных растений поколения Т[. Для этой цели были использованы как прямой, так и подтверждающий иммуноферментный анализы. Прямой иммуноферментный анализ показал значительное содержание основного антигенного белка HBsAg в плодах растений поколения Т).

Относительно высокое содержание основного антигеного белка гепатита В в плодах трансформированных растений вызвало некоторые сомнения в достоверности результатов, которые могли быть искажены в силу ряда факторов, в частности, наличием в полученных из плодов растений экстрактов, некоторых веществ которые могли быть способны неспецифически связываться с подложкой, загрязнением реакционной смеси с субстратом для пероксидазы ионами металлов. Поэтому вторая часть подтверждающего ИФА должна была верифицировать полученные результаты. Обработка данных подтверждающего ИФА показала, что все исследуемые образцы трансформированных растений имели процент подавления сигнала более 50%, что свидетельствует о достоверности результатов прямого иммуноферментного анализа, а значит и о наличии в плодах растений поколения Т1 основного антигеного белка HBsAg. Средний процент подавления среди исследуемых экстрактов составил 78,9%, это довольно высокий результат. Средний процент подавления среди сывороток крови человека больного гепатитом В в разных разведениях составил 84,2%, что сопоставимо со средним показателям у трансформированных растений. При обработке результатов иммуноферментного анализа экстрактов контрольных растений было отмечено, что оптическая плотность при прямом и подтверждающем ИФА практически не изменяется. Процент подавления в случае использования экстрактов из плодов ^трансформированных растений составлял всего 0,9%, что не выходит за пределы допустимой ошибки эксперимента. Это можно объяснить тем, что в плодах контрольных растений не содержится основного антигеного белка гепатита В, поэтому при проведении подтверждающего иммуноферментного анализа показатели оптической плотности практически не меняются. Это дополнительно указывает на корректность результатов. Исходя из полученных данных с большой долей вероятности можно предполагать, что в плодах трансформированных растений поколения Т1 происходит успешная экспрессия целевого гена рге82-8-НЕ)ЕЬ.

Для выяснения изменения содержания белка HBsAg при созревании плодов был проведен иммуноферментный анализ несозревших (светло-зеленого цвета) и созревших (красных) плодов. Сравнительный анализ экстрактов показал, что уровень антигенного белка HBsAg в зрелых плодах значительно ниже, нежели в несозревших. Причина этого не очень ясна, но, возможно, объясняется повышенной активностью гидролитических ферментов на заключительной стадии созревания.