Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Шиков, Андрей Николаевич

• Шиков, Андрей Николаевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Шиков, Андрей Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация вирусов гриппа

1.2. Морфология вируса гриппа А

1.3. Сегменты генома и кодируемые ими белки

1.4. Репликативный цикл вируса гриппа

1.5. Генетическая и антигенная изменчивость вируса гриппа А

1.6. Молекулярные детерминанты патогенности, рецепторной специфичности и лекарственной резистентности вируса гриппа А

1.7. Особенности пандемии, вызванной вирусом гриппа А (НШ1)рс1т09

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и наборы реагентов, использованные в работе

2.1.2. Культуры клеток

2.1.3. Развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ)

2.1.4. Оборудование

2.1.5. Образцы для исследования и выделения вирусных штаммов

2.2. Методы

2.2.1. Выделение вируса из клинического и секционного материала

2.2.2. Реакция гемагглютинации

2.2.3. Получение иммунных сывороток

2.2.4. Определение титра противовирусных антител в сыворотке крови инфицированных мышей в реакции торможения гемагглютинации

2.2.5. Выделение вирусной РНК из исследуемых образцов

2.2.6. Реакция обратной транскрипции

2.2.7. Полимеразная цепная реакция

2.2.8. Электрофоретический анализ и выделение из агарозного геля фрагментов ДНК

2.2.9. Секвенирование ДНК

2.2.10. Анализ нуклеотидных последовательностей

2.2.11. Визуализация позиций аминокислотных остатков

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение штаммов пандемического вируса гриппа A (HlNl)pdm09

3.2. Изучение антигенных свойств штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 методом РТГА

3.3. Филогенетический анализ генов НА и NA штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09

3.4. Изучение генетической изменчивости штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09

3.5. Анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09

3.6. Изучение генетической гетерогенности выделенных штаммов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВАЖ - вируссодержащая аллантоисная жидкость

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

вРНК - вирусная рибонуклеиновая кислота

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФН - интерферон

кРНК - комплементарная рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

н.о. - нуклеиновое основание

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РТА - реакция гемагглютинации

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза

CDC - Center for Disease Control and Prevention (Центр по контролю и предотвращению заболеваний)

CPSF4 - cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 4 (фактор специфичности связывания и полиаденилирования, субъединица 4)

ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфат

4

DNA - deoxyribonucleic acid (дезоксирибонуклеиновая кислота)

dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

НА - гемагглютинин

Ml - матриксный белок М2 - мембранный белок

MDCK - Madin Darby canine kidney (культура клеток эпителия почки собаки) NA - нейраминидаза

NCBI - National Center for Biotechnological Information (Национальный центр биотехнологической информации США)

NP - нуклеопротеин

NS - неструктурный белок

ORF - open reading frame (открытая рамка считывания)

РА - полимеразный белок РВ1 - полимеразный белок 1 РВ2 - полимеразный белок

PCR - polymerase chain reaction (полимеразная цепная реакция) RBS - receptor-binding site (рецептор-связывающий участок) RNP - ribonucleoprotein complex (рибонуклеопротеиновый комплекс) TNF - tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли)

WHO - World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации»

ВВЕДЕНИЕ

Грипп - острое респираторное вирусное заболевание, вызываемое РНК-содержащими вирусами, относящимися к родам Influenzavirus А, В и С семейства Ortomyxoviridae. Способность вируса гриппа типа А к эпидемическому и пандемическому распространению вызывает особую обеспокоенность международного сообщества.

В связи с этим Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) проводит ряд мероприятий, направленных на усиление контроля за распространением гриппа, которые включают в себя: глобальный мониторинг гриппа с целью оптимизации состава вакцин, работу по развитию и усилению национальных и региональных систем противодействия распространению заболевания, поддержку государств в их усилиях по разработке стратегий профилактики и борьбы с гриппом (ВОЗ, 2009 (б)).

Оправданность этих мероприятий подтверждена предыдущими пандемиями и ежегодными эпидемиями гриппа, которые приводят к 3-5 миллионам случаев заболевания с тяжелым течением и в среднем к 250 000-500 000 случаев смерти (ВОЗ, 2009 (б)).

О новом варианте вируса гриппа A (H1N1) стало известно в конце апреля 2009 года, когда в Мексике и США были зафиксированы первые случаи вызванного им заболевания (CDC, 2009 (Ь)). Обеспокоенность вызывало то, что появившийся вирус был реассортантным, как и возбудители трех предыдущих пандемий гриппа (Garten et al., 2009; WHO, 2009 (d)), и ранее никогда не циркулировал среди людей. Распространение заболевания быстро приобрело глобальные масштабы, в связи с чем ВОЗ 11 июня 2009 года объявила о начале пандемии гриппа (WHO, 2009 (i)). Пандемия охватила более 200 стран мира, новым вариантом вируса гриппа в некоторых регионах было инфицировано от 20 до 40% населения (WHO, 2010 (b)).

Однако к августу 2010 года эксперты на основании данных, поступающих из различных регионов мира, отметили явные признаки того, что характер распространения гриппа во всем мире стал сезонным, а заболеваемость

6

была ниже уровня, регистрируемого в 2009 году и начале 2010 года. Все это дало основание объявить об окончании пандемии и начале постпандемического периода (WHO, 2010 (b)).

Благодаря своевременному проведению мер по противодействию пандемии гриппа ее последствия оказались не столь катастрофичными: пандемия унесла жизни более 18 тыс. человек, но худший вариант ожидаемого сценария развития пандемии не подтвердился (WHO, 2009 (f)).

Новый вариант вируса гриппа A (H1N1), вызвавший пандемию 20092010 годов, генетически отличался от всех известных штаммов. Установлено, что изменчивость вируса гриппа типа А связана с молекулярными событиями, происходящими по двум механизмам. Один из них - шифт генов, представляющий собой обмен сегментами генома между различными субтипами вируса гриппа типа А, что приводит к появлению нового реассортантного варианта, к которому еще не существует коллективного иммунитета в популяции хозяев. Именно этот механизм изменчивости вируса и привел к возникновению пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 (Garten et al., 2009).

Другой механизм изменчивости - дрейф генов - заключается в возникновении точечных замен (транзиций и трансверсий) в нуклеотидной последовательности генов, кодирующих вирусные белки. Вирусы гриппа, как и другие РНК-содержащие вирусы, являются генетически нестабильными структурами. Процесс репликации вирусов, как правило, сопровождается возникновением ошибок в нуклеотидной последовательности генов, что приводит к гетерогенности гомологичных последовательностей вирусного генома внутри популяции вируса (Watanabe et al., 2011; Kuroda et al., 2010). Постоянно возникающие в их геноме точечные мутации могут приводить к возникновению не способных к полноценному репликативному циклу дефектных вирионов. Закрепляющиеся в популяции мутации чаще носят нейтральный характер (Кимура, 1985), т.е. не приводят к изменению общей структуры полипептидной цепи и функциональных или антигенных свойств белка (Murphy, Webster, 1996).

В ряде случаев результатом несинонимичных замен нуклеиновых кислот являются такие аминокислотные замещения, которые приводят к конформа-ционным и функциональным изменениям вирусных белков, в результате чего могут изменяться свойства самих вирусов, например, чувствительность к действию противовирусных препаратов или скорость репродукции вируса в организме хозяина. Возникновение точечных мутаций, или дрейф генов, лежит в основе механизма ускользания вируса от иммунной системы организма-хозяина, а также является механизмом адаптации при смене вида хозяина (Murphy, Webster, 1996; Ilyushina et al., 2010). Кроме того, есть данные о прямой зависимости адаптации к новым условиям и выживания вирусной популяции от степени ее гетерогенности и количества возникающих при репликации вирусной РНК ошибок (Vignuzzi et al., 2006).

Таким образом, молекулярно-генетические исследования, наряду с изучением биологических (антигенных) свойств вируса гриппа, являются важной составляющей мониторинга вирусной изменчивости, поскольку позволяют отслеживать появление мутаций, отвечающих за изменение антигенных, функциональных свойств вирусных белков, а также за чувствительность к противовирусным препаратам.

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось изучение генетической изменчивости и биологических свойств штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, циркулировавшего в 2009-2010 годах на территории Российской Федерации.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать клинические и секционные образцы на наличие генетического материала пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Выделить штаммы пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 из клинических и секционных образцов и изучить их антигенные свойства.

3. Определить нуклеотидные последовательности генов, кодирующих

вирусные белки выделенных штаммов пандемического вируса гриппа

8

A (H1N1) pdm09, провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и анализ соответствующих им аминокислотных последовательностей.

4. Провести анализ генетической гетерогенности вирусной популяции отдельных штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09.

Научная новизна и практическая значимость работы

Из клинического и секционного материала в период пандемии гриппа 2009-2010 годов выделены 40 штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, из которых 11 штаммов депонированы в Государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ГНЦ ВБ «Вектор».

Проведен анализ антигенных свойств 4 штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных на территории РФ в период пандемии 2009-2010 годов.

Определены нуклеотидные последовательности полноразмерных геномов у 10 штаммов вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии, а также последовательности генов НА и NA клинического изолята вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенного в постпандемический период в 2011 году, проведен их молекулярно-генетический анализ. В международную базу данных GeneBank депонировано 96 нуклеотидных последовательностей сегментов генома выделенных штаммов вируса гриппа А (H1N1) pdm09.

Проведен детальный анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии 2009 года, на наличие у них детерминант па-тогенности и устойчивости к противовирусным препаратам.

Проведен анализ генетической гетерогенности вирусной популяции отдельных штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии 2009-2010 годов.

Предложены и апробированы праймеры, послужившие основой для разработки средств диагностики в рамках выполнения Федеральной целевой

9

программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)».

Положения, выносимые на защиту

1.В период пандемии гриппа 2009-2010 годов на территории Российской Федерации циркулировал вирус гриппа A (H1N1) филогенетически подобный штамму вируса гриппа A/California/04/2009(H1N1).

2. Антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, циркулировавшего на территории РФ в период с апреля 2009 года по февраль 2010 года, не изменялись.

3. В гене НА штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 преобладает положительный отбор (частота несинонимичных нуклеотидных замен выше частоты синонимичных), а большинство аминокислотных замещений в НА регистрируются в антигенных эпитопах.

4. Исследованные штаммы пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09 не имеют мутаций, формирующих устойчивость к препаратам из группы ингибиторов NA, но содержат аминокислотное замещение, приводящее к резистентности к препаратам адамантанового ряда.

5. Популяции выделенных штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 являются генетически гетерогенными.

Вклад автора

Первичная обработка образцов, выделение штаммов вируса гриппа из диагностического материала проводились совместно с научными сотрудниками отдела эпидемиологии ООВИ Сергеевым Ар.А. и Деминой O.K. Постановки реакции гемагглютинации и реакции торможения гемагглютинации осуществлялись совместно с научным сотрудником отдела эпидемиологии ООВИ Деминой O.K. Штаммы A/Habarovsk/01/2009(HlNl), A/Bishkek/02/2009(HlNl) и A/Omsk/04/2009(H1N1) были выделены сотрудниками отдела зоонозных инфекций и гриппа Дурымановым А.Г. и к.б.н. Шаршовым К.А. и предоставлены для молекулярно-генетических и вирусологических исследований.

Выделение РНК, реакция обратной транскрипции, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени» проводились автором, сотрудниками отдела эпидемиологии ООВИ Берилло С.А. и Сергеевой Е.И., а также сотрудницей отдела молекулярной вирусологии флавиви-русов и вирусных гепатитов Семенцовой А.О.

Все остальные эксперименты, включая постановку ПЦР, очистку полученных продуктов ПЦР, секвенирование и очистку продуктов секвенирова-ния, депонирование полученных нуклеотидных последовательностей геномов вируса гриппа, их теоретический анализ, выполнены автором лично и в соавторстве с к.б.н. Терновым В.А.

Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов молекулярно-генетических исследований оказывали к.б.н. Терновой В.А. и к.б.н. Бакулина А.Ю.

Общее руководство работой осуществлялось Агафоновым А.П.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены: на 2-й международной конференции «Астана-Биотех 2011» (Астана, Республика Казахстан, 2011); на конференции «Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Новосибирск, 2012).

Работа выполнена в 2009-2012 годах в ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках научных тем организации; выполнения приказов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 01.03.2010 г. №70 «О проведении верификации ПЦР-диагностики гриппа типа А, включая грипп птиц Н5ТЧ1 и пандемический грипп А/НШ1(зш2009)» и от 17 марта 2008 г. N 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней»; выполнения тем в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)»; выполнения тем в рамках Координационного научного совета по санитарно-

эпидемиологической охране территории Российской Федерации по проблем-

11

ной комиссии 48.02 «Диагностика, профилактика и лечение особо опасных инфекционных заболеваний».

Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании научного семинара ФГУН ГНЦВБ «Вектор» (12 сентября 2013 года).

По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации, 1 методические рекомендации. Получен патент Российской Федерации на изобретение (№ 2457242 от 27 июля 2012 года).

Благодарности

За оказанную методическую и практическую помощь в подготовке диссертационной работы автор благодарит своих коллег, сотрудников ГНЦ ВБ «Вектор»: Берилло С.А., Винокурову A.B., Кобыхно Г.А., Кузнецову Н.Д., Денисову Н.Т., Сергеева Ар.А., Швалова А.Н., Семенцову А.О., Бакунину А.Ю., Шаршова К.А., Суслопарова И.М., Дурыманова А.Г., Скарнови-ча М.О., Чаусова Е.В. и Сергееву Е.И.

Отдельно автор выражает благодарность научному сотруднику отдела «Коллекция микроорганизмов» Деминой Ольге Константиновне, непосредственно участвовавшей в получении результатов, описанных в данной работе.

Особую благодарность автор выражает заведующему лабораторией молекулярной эпидемиологии ООП, к.б.н. Терновому Владимиру Александровичу и своему научному руководителю, д.б.н. Агафонову Александру Петровичу за обучение профессиональным навыкам, терпение и помощь в подготовки диссертационной работы.

Сгруюура и объем работы

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, включает 17 таблиц и 13 рисунков и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список литературы,

содержащий 201 источник отечественных и зарубежных авторов.

12

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация вирусов гриппа

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, которое в настоящее время по данным Международного комитета по таксономии вирусов включает в себя 6 родов. Ниже приведена классификация ортомиксови-русов (данные с сайта Международного комитета по таксономии вирусов: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2012).

Семейство: Orthomyxoviridae: Род: Influenzavirus А

Вид: Вирус гриппа A (Influenza A virus) Род: Influenzavirus В

Вид: Вирус гриппа В (Influenza В virus) Род: Influenzavirus С

Вид: Вирус гриппа С (Influenza С virus) Род: Isavirus

Вид: Вирус инфекционной анемии лосося (Infectious salmon anemia virus)

Род: Thogotovirus

Виды: Dhori virus; Thogoto virus Род: Quaranjavirus

Виды: Johnston Atoll virus, Quaranfil virus

Помимо установленных 6 родов существуют пока еще не классифицированные представители этого семейства вирусов, выделенные от птиц (Kes-sell et al., 2012).

Деление вирусов гриппа на отдельные роды проводится в соответствии с отличиями в антигенных свойствах их нуклеопротеинов (NP) и матриксных белков (Ml).

Все представители семейства Orthomyxoviridae имеют сегментированный геном, состоящий из одноцепочечных минус-РНК сегментов, кодирующих вирусные белки. Геном вирусов гриппа А и В состоит из 8 сегментов, в

13

то время как вирус гриппа С имеет 7 сегментов в геноме. В настоящее время известно, что из всех родов вирусов гриппа, только вирус гриппа А имеет широкий спектр хозяев, который включает в себя различные виды птиц и млекопитающих. Вирус гриппа В способен инфицировать только людей и тюленей (Osterhaus et al., 2000), а вирус гриппа С - людей и свиней (Guo et al., 1983). Распространение вируса гриппа С среди людей происходит либо в форме локальных вспышек, либо имеет спорадический характер. Вирус гриппа В способен вызывать локальные эпидемии. В отличие от них вирус гриппа А способен к быстрому глобальному распространению, результатом которого явились известные в истории пандемии: пандемия 1918-1920 гг. вызвана субтипом H1N1; 1957-1958 гг. - субтипом H2N2; 1968-1969 гг. -субтипом H3N2 (Hilleman, 2002) и 2009-2010 гг. - субтипом H1N1.

Деление вируса гриппа А на субтипы основано на различиях антигенных свойств поверхностных гликопротеинов оболочки вириона - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). На сегодняшний день выделяют 10 антигенных вариантов NA (N1-N10) и 17 антигенных вариантов НА (Н1-Н17). Вирус гриппа А, идентифицированный как субтип H17N10 [изолят A/little yellow-shouldered bat/Guatemala/060/2010(Н17N10), GenBank: CY103892 - ген НА, CY103894 - ген NA)], был выделен от летучих мышей Sturnira lilium в Гватемале в 2010 году (Tong et al., 2012).

Таким образом, вирус гриппа А, имея широкий спектр природных хозяев и обладая способностью к пандемическому и панзоотическому распространению (Vijaykrishna et al., 2008), а также вызывая ежегодные сезонные эпидемии, представляет собой серьезную проблему для системы общественного здравоохранения и является объектом особого внимания со стороны ВОЗ.

1.2. Морфология вируса гриппа А

По своей форме вирионы гриппа А являются плеоморфными частицами. Форма вирионов (рисунок 1.1) варьирует от сферической и овальной до ни-

тевидной, достигая в длину 20 мкм (Burnet, 2012). Диаметр вирионов составляет примерно 80-120 нм. Следует отметить, что штаммы вируса гриппа, прошедшие несколько пассажей в РКЭ, как правило, представлены вириона-ми сферической формы, в то время как клинические изоляты плеоморфны и в большем количестве содержат нитевидные формы (Chu et al., 1949; Kilbourne, Murphy, 1960). Как показано в исследованиях вируса гриппа А с помощью метода обратной генетики (Bourmakina, García-Sastre, 2003), способность вируса к формированию нитевидных форм обусловлена генетически, основную роль в этом процессе играют белки Ml и М2. Кроме того, известно, что формирование вирионов неправильной формы происходит под влиянием различных внешних воздействий, связанных с исследовательской работой, таких как ультрацентрифугирование (Sugita et al., 2011), криоэлектронная микроскопия очищенных вирионов (Harris et al., 2006), подготовка образцов для электронной микроскопии с негативным контрастированием (Wrigley, 1979) и др.

Вирионы снаружи имеют липидную оболочку, которая имеет клеточное происхождение (участок клеточной мембраны) и которой вирус покрывается во время почкования. Липидная оболочка вириона пронизана вирусными гликопротеидами - НА и NA, которые на поверхности вириона выглядят как выступающие «шипы», а также небольшим количеством белка М2, который функционально является ионным каналом. Матриксный белок Ml, представленный в наибольшем количестве в вирионе, образует связанный с липидной оболочкой, спирально уложенный плотный слой (Calder et al., 2010). Он играет важную роль при сборке вириона и в поддержании морфологии вириона.

Сегментированный геном вируса гриппа А представлен 8 сегментами РНК, которые вместе с нуклеокапсидным белком NP и присоединенным к 3'-концу полимеразным комплексом, состоящим из белков РВ2, РВ1 и РА, образуют рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP).

А Б

Рисунок 1.1. (А) Схематическое изображение вирионов вируса гриппа по (Nöda, 2012): слева - овальный вирион, справа - нитевидный вирион, слева внизу - обозначения вирусных белков и рибонуклеопротеинов. (Б) Единичный вирион вируса гриппа А. Изображение электронной микроскопии из работы (Ruigrok et al., 1984)

Каждый из 8 сегментов имеет отдельную спиралевидную укладку, которая реализуется с помощью белка NP. Длина таких RNP-структур варьирует от 30 до 110 нм в соответствии с длиной нуклеотидной последовательности каждого сегмента. Диаметр RNP составляет 10-15 нм (Compans et al., 1972). В работах по изучению морфологии вириона вируса гриппа А было показано полярное расположение RNP (Nöda et al., 2006). Вне зависимости от морфологии (сферической или нитевидной) вирион содержит 8 RNP структур, которые собраны вместе и расположены ближе к одному из концов вириона (Nöda et al., 2006; Calder et al., 2010).

1.3. Сегменты генома и кодируемые ими белки

Как уже упоминалось ранее, геном вируса гриппа представлен 8 одноце-

почечными молекулами РНК отрицательной полярности, которые вместе с

белками полимеразного комплекса и белком NP образуют структуры RNP. В

16

таблице 1.1 перечислены сегменты генома и кодируемые ими белки вируса гриппа А, а также кратко описаны свойства и функции вирусных белков.

Таблица 1.1

Белки вируса гриппа А, их свойства и функции

Сегмент Длина (и.о.) Белок Длина (а.о.) Свойства и функции

1 2341 РВ2 759 Субъединица полимеразного комплекса, отвечает за сар-связь, имеет свойства основания.

2 2341 РВ1 757 Субъединица полимеразного комплекса, катализирует полимеризацию нуклеотидов, имеет свойства основания.

PB1-F2 87-90 Индуцирует апоптоз, ингибирует индукцию интер-феронов I типа.

РВ1 -N40 718 В настоящее время функция белка неясна.

3 2233 РА 716 Субъединица полимеразного комплекса, обладает эндонуклеазной активностью, имеет свойства кислоты.

РА-Х 252 или 232 Содержит эндонуклеазный домен. В настоящее время функциональное значение белка неясно.

4 1778 НА 566 Мембранный гликопротеин, основной вирусный антиген, протеазами расщепляется на фрагменты НА1 и НА2, связывается с остатками сиаловой кислоты рецепторов эпителиальных клеток, участвует в слиянии, индуцирует выработку нейтрализующих антител.

5 1565 NP 498 Участвует в инкапсидации РНК, формировании ЯЫР. Участвует в транскрипции, репликации и упаковке вирионов, являясь молекулярным адаптером между вирусными и клеточными макромолекулами.

6 1413 NA 470 Мембранный гликопротеин, поверхностный антиген. Катализирует отщепление остатков сиаловой кислоты, разрушая клеточный рецептор, участвует в сборке и высвобождении вирионов.

7 1027 М1 252 Матриксный белок, основной компонент вириона. Участвует в поддержании морфологии вириона.

М2 97 Мембранный белок, является рН-опосредованно активируемым протонным каналом. Участвует в распаковке вириона и высвобождении ЯНР, предотвращает преждевременную конформационную перестройку вновь синтезированного НА.

М42 99 Белок, родственный белку М2. Функционально может заменять М2.

8 890 NS1 230-237 Неструктурный белок. Ингибирует сплайсинг, по-лиаденилирование и ядерный транспорт клеточных РНК. Обладает функцией антагониста интерферона.

NS2/NEP 121 Неструктурный белок, является посредником ядерного экспорта вирусных ИКР.

Общая длина генома вируса гриппа А составляет примерно 13,5 kb. На 5'-конце каждого сегмента имеется богатый уридином участок (Desselberger et al., 1980). Первые 12 нуклеотидов З'-конца и последние 13 нуклеотидов 5'-конца каждого сегмента являются нетранслируемыми регионами. Эти участки высоко консервативны для всех 8 сегментов генома вируса гриппа A (Desselberger et al., 1980) и выполняют роль промоторов в процессе транскрипции и репликации. Кроме того, известно, что 3'- и 5'-концы вирионной (-) РНК и комплиментарной (+) РНК образуют «винтообразные» вторичные структуры (рисунок 1.2), которые распознаются РНК-зависимой РНК-полимеразой и благодаря которым инициируется транскрипция и репликация (Crow et al., 2004; Deng et al., 2006).

G A

U—A

л9

G—С

5' A

3'

1Г 12' 13'

G G I I

UG I I

и и

в

A A

A

2 G"~С9

10' 1Г 12'

5' A

AGO I I I

u С CI

G I

С

U G I I

А С

и Lu_c_cl С А с 3' и и,о

2с- q9 ю 11 12 2С— G9

3G~ с8 3А— и8

и и и и

с и

vRNA cRNA

Рисунок 1.2. Вторичная структура промоторов вирионной (-) РНК (А) и комплиментарной (+) РНК (В), рисунок из работы (Crow et al., 2004)

На сегодняшний день известно о 14 белках в протеоме вируса гриппа А, которые закодированы в 8 сегментах его генома. Сегменты 2, 3, 7 и 8 представлены полицистронной РНК, кодирующей больше одного белка. РНК остальных четырех сегментов является моноцистронной.

Белки вируса гриппа делятся на структурные и неструктурные, т.е. не входящие в структуру вириона. К структурным белкам относятся: НА, NA, Ml, М2, М42, NP, РВ2, РВ1, РА. Белки NSI, NS2 (NEP), PB1-F2, PB1-N40 и РА-Х обнаруживаются в зараженной клетке, но не входят в состав вириона.

Мембранный гликопротеин НА является основным антигеном вируса гриппа А вместе с NA, определяющим его субтип. Часть вируснейтрализую-щих антител, вырабатывающихся в организме хозяина, направлена против НА. Основные функции НА - это связывание с остатком сиаловой кислоты клеточного рецептора и слияние мембраны вириона с мембраной клеточной эндосомы (Skehel, Wiley, 2000). В структуре вириона НА представлен в форме тримера, состоящего из трех одинаковых молекул НА (Wilson et al., 1981). Молекула НА синтезируется в виде белка-предшественника НАО, содержащего на N-конце сигнальный пептид длиной 16 а.о., который в ходе процес-синга отщепляется. Оставшийся полипептид посттрансляционно расщепляется клеточными пептидазами на две субъединицы НА1 и НА2, длиной 328 а.о. и 221 а.о. соответственно, которые связаны между собой одной ди-сульфидной и несколькими нековалентными связями. Расщепление молекулы НА на две субъединицы сопровождается изменением конформации НА, слиянием вирусной и клеточной мембран и является важным звеном в процессе формирования инфекционной активности вируса (Steinhauer, 1999).

На поверхности молекулы НА расположен рецептор-связывающий сайт и антигенные сайты (рисунок 1.3), с которыми связываются антитела, участвующие в нейтрализации вируса. На сегодняшний день известно пять основных антигенных эпитопов НА вируса гриппа А субтипа H1N1: СЬ (а.о. 7883), Sa (а.о. 128-129, 156-160, и 162-167), Sb (а.о. 187-198), Cal (а.о. 169173, 206-208, и 238-240), и Са2 (а.о. 140-145 и 224-225) (нумерация по НЗ) (Brownlee, Fodor, 2001). При картировании НА штамма A/California/04/2009(H1N1), как представлено в работе (Deem, Pan, 2009), определены антигенные эпитопы: А, В, С, D и Е.

Как показали исследования изменчивости пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, во всех пяти антигенных сайтах, но с разной частотой, возникают замещения аминокислотных остатков (Zhou et al., 2011).

Рисунок 1.3. Антигенная структура НА штамма А/РЯ/8/34 (НШ1). Выделены цветом пять антигенных сайтов, определенных с помощью монокло-нальных антител: Ба (голубой), 8Ь (красный), Са1 (желтый), Са2 (зеленый), СЬ (синий). Использована нумерация а.о. по НА субтипа НЗ. ЯВ8 - рецеп-тор-связывающий участок. Рисунок из работы (811еп е1 а1., 2009)

Второй мембранный гликопротеин ЫА обладает ферментативной экзо-а-сиалидазной активностью (ЕС 3.2.1.18 - по номенклатуре 1ЦВМВ) и осуществляет гидролиз а-(2-3)- и а-(2-6)-гликозидных связей концевых остатков ТЧ-ацетилнейраминовой кислоты в олигосахаридных цепях гликопротеинов и гликолипидов. Функция ЫА заключается в высвобождении вновь собранных вирионов от поверхности клеточных рецепторов, предотвращении агрегации вирусных частиц, а также освобождении вирионов от мукопротеинов, содержащихся в слизи дыхательных путей (БЬ^угуа е1 а1., 2009).

На поверхности вирусной оболочки белок ЫА представлен в виде шипов, каждый из которых является тетрамером. Молекула NA имеет следую-

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шиков, Андрей Николаевич, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Л.: Гос. изд. мед. лит. - 1962., 179 с.

2. Белокриницкая Т.Е., Трубицына А.Ю., Кошмелева Е.А. Осложненные формы пандемического гриппа A(H1N1)09 у беременных // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. 2011. № 1-1. С. 25.

3. Вейн В.И., Руднов В.А., Багин В.А. Факторы риска неблагоприятного исхода у больных пневмонией тяжёлого течения вызванной вирусом гриппа a (H1N1). // Уральский медицинский журнал. 2012. №1. С. 10-14.

4. ВОЗ (а). Глобальное предупреждение и ответные действия (GAR). Клинические признаки тяжелых случаев заболевания пандемическим гриппом. Пандемический грипп (H1N1) - 2009. Краткое сообщение № 13. 16 октября 2009 г.

http://www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/hlnl_clinical_features_200910 16/ru/index.html

5. ВОЗ (б). Грипп Информационный бюллетень № 211 Апрель 2009 г. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/ги/

6. Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Бурлаченко В.П., Змиевский A.B., Ди-воча В.А., Дерибон Е.Л. Особенности изменения структуры легких у больных гриппом A (H1N1), погибших от пневмонии. // Актуальные проблемы транспортной медицины. 2011. № 4. С. 75-79.

7. Зазирняя Н.И., Федорович O.K. Течение высокопатогенного гриппа А (HlNl)-2009 у беременных женщин. // Кубанский научный медицинский вестник. 2011. №2. С. 65-67.

8. Игнатова Н.Б., Храмцов М.М., Графова H.A., Михайлова И.С. Морфологическая характеристика дыхательных путей при тяжелой форме гриппа A/H1N1 (sw2009). // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. 2011. № 2. С. 20-22.

9. Карпова JI.C., Бурцева Е.И., Поповцева Н.М., Столярова Т.П. Сравнение эпидемий гриппа в россии 2009 и 2011 годов, вызванных пандемическим вирусом гриппа A(H1N1). // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. №5. С. 6-15.

10. Кимура М. Молекулярная эволюция: теория нейтральности: Пер. с англ. М.: Мир, 1985.394 с.

11. Кузнецов O.K., Степанова Л.А., Чурикова A.A., Гашинская О.В., Белов А.Б., Комиссаров А.Б. Популяционный иммунитет к сезонному гриппу как основной фактор, ограничивающий глобальную эпидемию 2009-2010 годов A(H1N1). // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010. №4. С. 9-17.

12. Лещенко И.В., Кривоногов A.B. Пневмонические осложнения при пандемическом гриппе A/H1N1/09. // Вестник современной клинической медицины. 2011. Т. 4. № 4. С. 17а-24.

13. Лузина Е.В., Ларева Н.В. Особенности и возможные механизмы тяжелого течения гриппа A(H1N1). // Российский медицинский журнал. 2011. № 5. С. 17-20.

14. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г. и соавт. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа A/H1N1 swl в рецептор-связывающем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина. // Вопросы вирусологии. 2010. Т. 55. № 4. С. 3-7.

15. Мейхи Б. (ред.) Вирусология. Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. 344 с.

16. Роспотребнадзор. Пресс-релиз. В Российской Федерации выявлен больной гриппом A(H1N1). 22.05.09.

17. Тарбаева Д.А., Иозефсон С.А., Загородняя Э.Д. Анализ течения беременности и ее исходов на фоне гриппа A (H1N1) 2009. // Дальневосточный медицинский журнал. 2010. № 2. С. 43^5.

18. Трубникова Л.И., Киселева Л.М., Жданова В.Ю., Таджиева В.Д., Шевченко И.В., Ашанин Б.С. Особенности течения гриппа A (H1N1) у бере-

менных в период пандемии 2009-2010 гг. // Ульяновский медико-биологический журнал. 2011. № 2. С. 91-99.

19. Чарторижская Н.Н., Сепп А.В., Пруткина Е.В. Патологическая анатомия изменений внутренних органов при синдроме острого повреждения легких на фоне гриппа A/H1N1 в Забайкальском крае. // Кубанский научный медицинский вестник. 2010. № 8. С. 192-196.

20. Abed Y., Baz M., Boivin G. Impact of neuraminidase mutations conferring influenza resistance to neuraminidase inhibitors in the N1 and N2 genetic backgrounds. // Antivir.Ther. 2006. V. 11. P. 971-976.

21. Abed Y., Goyette N., Boivin G. Generation and characterization of recombinant influenza A (H1N1) viruses harboring amantadine resistance mutations. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. V. 49. P. 556-559.

22. Amorim M.J., Bruce E.A., Reed E.K., Foeglein A., Mahen R., Stuart A. D., Digard P. A Rabll- and microtubule-dependent mechanism for cytoplasmic transport of influenza A virus viral RNA. // J. Virol. 2011. V. 85. P. 41344156.

23. Anhlan D., Grundmann N., Makalowski W., Ludwig S., Scholtissek C. Origin of the 1918 pandemic H1N1 influenza A virus as studied by codon usage patterns and phylogenetic analysis. // RNA. 2011. V. 17. P. 64-73.

24. Auewarakul P., Suptawiwat O., Kongchanagul A., Sangma C., Suzuki Y., Ungchusak K., Louisirirotchanakul S., Lerdsamran H., Pooruk P., Thitithan-yanont A., Pittayawonganon C., Guo C.T., Hiramatsu H., Jampangern W., Chunsutthiwat S., Puthavathana P. Anavian influenza H5N1 virus that binds to a human-type receptor. // J.Virol. 2007. V. 81. P. 9950-9955.

25. Azzi A., Corcioli F., Arvia R.,Clausi V., Giannecchini S., Puzelli S., Donatellil. Presence of D222E mutation in the haemagglutin of pandemic (H1N1) 2009 isolates inTuscany. // J. Mol. Genet. Med. 2010. V. 4. P. 252.

26. Baigent S .J., McCauley J.W. Influenza type A in humans, mammals and birds: Determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission. // Bioessays. 2003. V. 25. P. 657-671.

27. Bialas K.M., Desmet E.A., TakimotoT. Specific residues in the 2009 H1N1 swine-origin influenza matrix protein influence virion morphology and efficiency of viral spread in vitro. // PLoS One. 2012. V. 7. P. e50595.

28. Bloom J.D., Gong L.I., Baltimore D. Permissive secondary mutations enable the evolution of influenza oseltamivir resistance. // Science. 2010. V. 328. P.1272-1275.

29. Boivin S., Cusack S., Ruigrok R.W., Hart D.J. Influenza A Virus Polymerase: Structural Insights into Replication and Host Adaptation Mechanisms. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 28411-28417.

30. Bourmakina S.V., García-Sastre A. Reverse genetics studies on the filamentous morphology of influenza A virus. // J. Gen. Virol. 2003. V. 84. P. 517— 527.

31. Brownlee G.G., Fodor E. The predicted antigenicity of the haemagglutinin of the 1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin. // Philos. Trans. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci. 2001. V. 356. P. 1871-1876.

32. Burnet F.M. Filamentous forms of influenza virus. // Nature. 1956. V. 177. P. 130.

33. Bourret V., Croville G., Mariette J., Klopp C., Bouchez O., Tiley L., Guérin J.L. Whole-genome, deep pyrosequencing analysis of a duck influenza A virus evolution in swine cells. // Infect. Genet. Evol. 2013. V. 18. P. 31-41.

34. Bush R.M., Fitch W.M., Bender C.A., Cox N.J. Positive selection on the H3 hemagglutinin gene of human influenza virus A. // Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. P. 1457-1465.

35. Bussey K.A., Bousse T.L., Desmet E.A., Kim B., Takimoto T. PB2 residue 271 plays a key role in enhanced polymerase activity of influenza A viruses in mammalian host cells. // J.Virol. 2010. V. 84. P. 4395^1406.

36. Cady S.D., Luo W., Hu F., Hong M. Structure and function of the influenza A M2 proton channel. // Biochemistry. 2009. V. 48. P. 7356-7364.

37. Calder L.J., Wasilewski S., Berriman J.A., Rosenthal P.B. Structural organization of a filamentous influenza A virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. V.107. P.10685-10690.

38. CDC (a). MMWR. Outbreak of Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Infection Mexico, March-April 2009. April 30, 2009 / 58(Dispatch); 1-3. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm58d0430a2.htm

39. CDC (b). Update: swine influenza A (H1N1) infections California and Texas, April 2009. // Morbidity and Mortality Weekly Report May 1, 2009. V. 58. N 16. P. 435-437.

40. Chang M., eSouthard C., SullivanM. Learningfromthe 2009 H1N1 Influenza Pandemic. RMS Special Report. April 2010. https://support.rms.com/Publications/HlNl_2009_SpecialReport.pdf

41. Chen H., Wen X., To K.K., Wang P., Tse H., Chan J.F., Tsoi H.W., Fung K.S., Tse C.W., Lee R.A., Chan K.H., Yuen K.Y. Quasispecies of the D225G substitution in the hemagglutinin of pandemic influenza A(H1N1) 2009 virus from patients with severe disease in Hong Kong, China. // J. Infect. Dis. 2010. V. 201. P. 1517-1521.

42. Chen L.H., Wilson M.E. The role of the traveler in emerging infections and magnitude of travel. // Med. Clin. North Am. 2008. V. 92. P. 1409-1432.

43. Chen W., Calvo P.A., Malide D., Gibbs J., Schubert U., Bacik I., Basta S., O'Neill R., Schickli J., Palese P., Henklein P., Bennink J.R., Yewdell J.W. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. // Nat. Med. 2001. V. 7. P. 1306-1312.

44. Chen Z., Wang W., Zhou H., Suguitan A.L. Jr., Shambaugh C., Kim L., Zhao J., Kemble G., Jin H. Generation of live attenuated novel influenza virus A/California/7/09 (H1N1) vaccines with high yield in embryonated chicken eggs. //J.Virol. 2010. V. 84. P. 44-51.

45. Cheung C.Y., Poon L.L., Lau A.S., Luk W., Lau Y.L., Shortridge K.F., Gordon S., Guan Y., Peiris J.S. Induction of proinflammatory cytokines in human

macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease? // Lancet. 2002. V. 360. P. 1831-1837.

46. Chu C.M., Dawson I.M., Elford W.J. Filamentous forms associated with newly isolated influenza virus. // Lancet. 1949. V. 253. P. 602-603.

47. Chutinimitkul S., Herfst S., Steel J., Lowen A.C., Ye J., van Riel D., Schrau-wen E.J., Bestebroer T.M., Koel B., Burke D.F., Sutherland-Cash K.H., Whit-tleston C.S., Russell C.A., Wales D.J., Smith D.J., Jonges M., Meijer A., Koopmans M., Rimmelzwaan G.F., Kuiken T., Osterhaus A.D., García-Sastre A., Perez D.R., Fouchier R.A. Virulence-associated substitution D222G in the hemagglutinin of 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus affects receptor binding. //J. Virol. 2010. V. 84. P. 11802-11813.

48. Coleman J.R. The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages. // Virol. J. 2007. V. 4. P. 9. http://www.virologyj.eom/content/4/l/9

49. Collins P.J., Haire L.F., Lin Y.P., Liu J., Russell R.J., Walker P.A., Martin S.R., Daniels R.S., Gregory V., Skehel J.J., Gamblin S.J., Hay A.J. Structural basis for oseltamivir resistance of influenza viruses. // Vaccine. 2009. V. 27. P. 6317-6323.

50. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the Ribonucleoprotein of Influenza Virus. // J.Virol. 1972. V. 10. P. 795-800.

51. Conenello G.M., Tisoncik J.R., Rosenzweig E., Varga Z.T., Palese P., Katze M.G. A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza A virus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo. // J. Virol. 2011. V. 85. P. 652-662.

52. Crow M., Deng T., Addley M., Brownlee G.G. Mutational analysis of the influenza virus cRNA promoter and identification of nucleotides critical for replication. // J. Virol. 2004. V. 78. P. 6263-6270.

53. Cuevasa J.M., Elenaa S.F., Moya A. Molecular basis of adaptive convergence in experimental populations of RNA viruses. // Genetics. 2002. V. 162. P. 533-542.

54. Dharia N.V., Bright A.T., Westenberger S.J., Barnes S.W., Batalov S., Kuhen K., Borboa R., Federe G.C., McClean C.M., Vinetz J.M., Neyra V., Llanos-Cuentas A., Barnwell J.W., Walker J.R., Winzeler E.A. Whole-genome sequencing and microarray analysis of ex vivo Plasmodium vivax reveal selective pressure on putative drug resistance genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. V. 107. P. 20045-20050.

55. de Jong M.D., Simmons C.P., Thanh T.T., Hien V.M., Smith G.J., Chau T.N., Hoang D.M., Chau N.V., Khanh T.H., Dong V.C., Qui P.T., Cam B.V., Ha do Q., Guan Y., Peiris J.S., Chinh N.T., Hien T.T., Farrar J. Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercyto-kinemia. //Nat. Med. 2006. V. 12. P. 1203-1207.

56. Deem M.W., Pan K. The epitope regions of HI-subtype influenza A, with application to vaccine efficacy // Protein. Eng. Des. Sel. 2009. V. 22. P. 543546.

57. Deng T., Vreede F.T., Brownlee G.G. Different de novo initiation strategies are used by influenza virus RNA polymerase on its cRNA and viral RNA promoters during viral RNA replication. // J.Virol. 2006. V. 80. P. 2337-2348.

58. Deng Y.M., Iannello P., Smith I., Watson J., Barr I.G., Daniels P., Komadi-naN., Harrower B., Wong F.Y. Transmission of influenza A(H1N1) 2009 pandemic viruses in Australian swine. // Influenza Other Respi. Viruses. 2012. V. 6. P. e42-e47.

59. Desselberger U., Racaniello V.R., Zazra J.J., Palese P. The 3' and 5'-terminal sequences of influenza A, B and C virus RNA segments are highly conserved and show partial inverted complementarity. // Gene. 1980. V. 8. P. 315-328.

60. Domingo E., Holland J.J. RNA virus mutations and fitness for survival. // An-nu. Rev. Microbiol. 1997. V. 51. P. 151-178.

61. Eisfeld A.J., Kawakami E., Watanabe T., Neumann G., Kawaoka Y. RAB11A is essential for transport of the influenza virus genome to the plasma membrane. // J. Virol. 2011. V. 85. P. 6117-6126.

62. Ekiert D.C., Bhabha G., Elsliger M.A., Friesen R.H., Jongeneelen M., Throsby M., Goudsmit J., Wilson I.A. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. // Science. 2009. V. 324. P. 246-251.

63. Elster C., Larsen K., Gagnon J., Ruigrok R.W., Baudin F. Influenza virus Ml protein binds to RNA through its nuclear localization signal. // J. Gen. Virol. 1997. V. 78. P. 1589-1596.

64. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. // Evolution. 1985. V. 39. P. 783-791.

65. Fitch WM., Bush R.M., Bender C.A., Cox N.J. Long term trends in the evolution of H (3) HA1 human influenza type A. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94. P. 7712-7718.

66. Fitch W.M., Leiter J.M., Li X.Q., Palese P. Positive Darwinian evolution in human in fluenza A viruses. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. V. 88. P. 4270^1274.

67. Gabriel G., Herwig A., Klenk H.D. Interaction of polymerase subunit PB2 and NP with importin alphal is a determinant of host range of influenza A virus. // PLoS Pathog. 2008. V. 4. P. ell.

68. Gambaryan A., Tuzikov A., Pazynina G., Bovin N., Balish A., Klimov A. Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. // Virology. 2006. V. 344. P. 432^138.

69. Gamblin S.J., Skehel J.J. Influenza hemagglutinin and neuraminidase membrane glycoproteins. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 28403-28409.

70. Garten R.J., Davis C.T., Russell C.A., Shu B., Lindstrom S., et al.. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. // Science. 2009. V. 325. P. 197-201.

71. Getting Started Guide for Applied Biosystems 3130/3130x1 Genetic Analyzers.

72. Glaser L., Stevens J., Zamarin D., Wilson I.A., García-Sastre A., Tumpey T.M., Basler C.F., Taubenberger J.K., Palese P. A single amino acid

substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. // J.Virol. 2005. V. 79. P. 11533-11536.

73. Guo Y.J., Jin F.G., Wang P., Wang M., Zhu J.M. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza C virus. // J. Gen. Virol. 1983. V. 64. P. 177-182.

74. Hai R., Schmolke M., Varga Z.T., Manicassamy B., Wang T.T., Belser J.A., Pearce M.B., García-Sastre A., Tumpey T.M., Palese P. PB1-F2 expression by the 2009 pandemic H1N1 influenza virus has minimal impact on virulence in animal models. // J. Virol. 2010. V. 84. P. 4442-4450.

75. Hale B.G., Randall R.E., Ortín J., Jackson D. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. // J. Gen. Virol. 2008. V. 89. P. 2359-2376.

76. Hale B.G., Steel J., Medina R.A., Manicassamy B., Ye J., Hickman D., Hai R., Schmolke M., Lowen A.C., Perez D.R., García-Sastre A. In efficien control of host gene expression by the 2009 pandemic H1N1 influenza A virus NS1 protein. // J. Virol. 2010. V. 84. P. 6909-6922.

77. Harris A., Cardone G., Winkler D.C., Heymann J.B., Brecher M., White J.M., Steven A.C. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. V. 103. P. 19123-19127.

78. Harris A., Forouhar F., Qiu S., Sha B., Luo M. The crystal structure of the influenza matrix protein Ml at neutral pH: Ml-Ml protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of Ml. // Virology. 2001. V. 289. P. 34-44.

79. Hatta M., Gao P., Halfmann P., Kawaoka Y. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses. // Science. 2001. V. 293. P. 1840-1842.

80. Hilleman M.R. Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control. // Vaccine. 2002. V. 20. P. 3068-3087.

81. Holmes E.C., Ghedin E., Miller N., Taylor J., Bao Y., St George K., Gren-fell B.T., Salzberg S.L., Fraser C.M., Lipman D.J., Taubenberger J.K. Whole-genome analysis of human influenza A virus reveals multiple persistent line-

ages and reassortment among recent H3N2 viruses. // PLoS Biol. 2005. V. 3. P. e300.

82. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat posed by avian influenza Aviruses. //Clin. Microbiol. Rev. 2001. V. 14. P. 129-149.

83. Hurt A.C., Hardie K., Wilson N.J., Deng Y.M., Osbourn M., Leang S.K., Lee R.T., Iannello P., Gehrig N., Shaw R., Wark P., Caldwell N., Givney R.C., Xue L., Maurer-Stroh S., Dwyer D.E., Wang B., Smith D.W., Levy A., Booy R., Dixit R., Merritt T., Kelso A., Dalton C., Durrheim D., Barr I.G. Characteristics of a widespread community cluster of H275Y oseltamivir-resistant A(HlNl)pdm09 influenza in Australia. // J. Infect. Dis. 2012. V. 206. P. 148-157.

84. Hurt A.C., Holien J.K., Parker M., Kelso A., Barr I.G. Zanamivir-resistant influenza viruses with a novel neuraminidase mutation.// J. Virol. 2009. V. 83. P.10366-10373.

85. Hutchinson E.C., von Kirchbach J.C., Gog J.R., Digard P. Genome packaging in influenza A virus. // J. Gen. Virol. 2010. V. 91. P. 313-328.

86. Ilyushina N.A., Khalenkov A.M., Seiler J.P., Forrest H.L., Bovin N.V., Mar-juki H., Barman S., Webster R.G., Webby R.J. Adaptation of pandemic H1N1 influenza viruses in mice. // J. Virol. 2010. V. 84. P. 8607-8616.

87. Imai M., Watanabe T., Hatta M., Das S.C., Ozawa M., Shinya K., Zhong G., Hanson A., Katsura H., Watanabe S., Li C., Kawakami E., Yamada S., Kiso M., Suzuki Y., Mäher E.A., Neumann G., Kawaoka Y. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets. // Nature. 2012. V. 486. P. 420^128.

88. Jackson D., Hossain M.J., Hickman D., Perez D.R., Lamb R.A. A new influenza virus virulence determinant: the NS1 protein four C-terminal residues modulate pathogenicity. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2008. V. 105. P. 4381—4386.

89. Jagger B.W., Wise H.M., Kash J.C., Walters K.A., Wills N.M., Xiao Y.L.,

Dunfee R.L., Schwartzman L.M., Ozinsky A., Bell G.L., Dalton R.M., Lo A.,

124

Efstathiou S., Atkins J.F., Firth A.E., Taubenberger J.K., Digard P. An overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response. // Science. 2012. V. 337. P. 199-204.

90. Jiao P., Tian G., Li Y., Deng G., Jiang Y., Liu C., Liu W., Bu Z., Kawaoka Y., Chen H. A single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice. // J.Virol. 2008. V. 82. P.1146-1154.

91. Jing X., Ma C., Ohigashi Y., Oliveira F.A., Jardetzky T.S., Pinto L.H., Lamb R.A. Functional studies indicate amantadine binds to the pore of the influenza A virus M2 proton-selective ion channel. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. V. 105. P. 10967-10972.

92. Kawaoka Y., Webster R.G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammaliancells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. V. 85. P. 324-328.

93. Kessell A., Hyatt A., Lehmann D., Shan S., Crameri S., Holmes C., Marsh G., Williams C., Tachedjian M., Yu M., Bingham J., Payne J., Lowther S., Wang J., Wang L.F., Smith I.Cygnet River virus, a novel orthomyxovirus from ducks, Australia. // Emerg. Infect. Dis. 2012. V. 18. P. 2044-2046.

94. Kilander A., Rykkvin R., Dudman S.G., Hungnes O. Association of D222G substitution in haemagglutinin of 2009 pandemic influenza A (H1N1) with severe disease. // Euro Surveill. 2010. V. 15. P. 19535.

95. Kilbourne E.D., Murphy J.S. Genetic studies of influenza viruses. I. Viral morphology and growth capacity as exchangeable genetic traits. Rapid in ovo adaptation of early passage Asian strain isolates by combination with PR8. // J. Exp. Med. 1960. V. 111. P. 387-406.

96. Kiso M., Mitamura K., Sakai-Tagawa Y., Shiraishi K., Kawakami C., Kimura K., Hayden F.G., Sugaya N., Kawaoka Y. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. // Lancet. 2004. V. 364. P. 759-765.

97. Kuroda M., Katano H., Nakajima N., Tobiume M., Ainai A., Sekizuka T., Ha-segawa H., Tashiro M., Sasaki Y., Arakawa Y., Hata S., Watanabe M., Sata T. Characterization of quasispecies of pandemic 2009 influenza A virus (A/H1N1/2009) by de novo sequencing using a next-generation DNA sequencer. // PLoS One. 2010. V. 5. P. el0256.

98. Lavenu A., Leruez-Ville M., Chaix M.L., Boelle P.Y., Rogez S., Freymuth F., Hay A., Rouzioux C., Carrat F. Detailed analysis of the genetic evolution of influenza virus during the course of an epidemic. // Epidemiol. Infect. 2006. V. 134. P. 514-520.

99. Li Y., Chen Z.Y., Wang W., Baker C.C., Krug R.M. The 3'-end-processing factor CPSF is required for the splicing of single-intron pre-mRNAs in vivo. // RNA. 2001. V. 7. P. 920-931.

100. Li Z., Chen H., Jiao P., Deng G., Tian G., Li Y., Hoffmann E., Webster R.G., Matsuoka Y., Yu K. Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model. // J. Virol. 2005. V. 79. P. 1205812064.

101. Li Z.N., Lee B.J., Langley W.A., Bradley K.C., Russell R.J., Steinhauer D.A.Length requirements for membrane fusion of influenza virus hemagglutinin peptide linkers to transmembrane or fusion peptide domains. // J. Virol. 2008. V. 82. P. 6337-6348.

102. Lin D., Lan J., Zhang Z. Structure and function of the NS1 protein of influenza A virus. // ActaBiochim. Biophys. Sin. (Shanghai). 2007. V. 39. P. 155162.

103. Lin Y.P., Gregory V., Bennett M., Hay A. Recent changes among human influenza viruses. // Virus Res. 2004. V. 103. P. 47-52.

104. Lindstrom S.E., Cox N.J., Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence and multiple reassortment events. // Virology. 2004. V. 328. P. 101-119.

105. Lindstrom S.E., Hiromoto Y., Nerome R., Omoe K., Sugita S., Yamazaki Y.,

Takahashi T., Nerome K. Phylogenetic analysis of the entire genome of influ-

126

enza A (H3N2) viruses from Japan: evidence for genetic reassortment of the six internal genes. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 8021-8031.

106. Liu Y., Childs R.A., Matrosovich T., Wharton S., Palma A.S., Chai W., Daniels R., Gregory V., Uhlendorff J., Kiso M., Klenk H.D., Hay A., Feizi T., Matrosovich M.Altered receptor specificity and cell tropism of D222G hemagglutinin mutants isolated from fatal cases of pandemic A(H1N1) 2009 influenza virus.// J. Virol. 2010. V. 84. P. 12069-12074.

107. Mak G.C., Au K.W., Tai L.S., Chuang K.C., Cheng K.C., Shiu T.C., Lim W.Association of D222G substitution in haemagglutinin of 2009 pandemic influenza A (H1N1) with severe disease. // Euro Surveill. 2010. V. 15. P. 19534.

108. Mase M., Tanimura N., Imada T., Okamatsu M., Tsukamoto K., Yamaguchi S. Recent H5N1 avian influenza A virus increases rapidly in virulence to mice after a single passage in mice. // J. Gen.Virol. 2006. V. 87. P. 3655-3659.

109. Massin P., van der Werf S., Naffakh N. Residue 627 of PB2 is a determinant of cold sensitivity in RNA replication of avian influenza viruses. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 5398-5404.

110. Matrosovich M., Tuzikov A., Bovin N., Gambaryan A., Klimov A., Castruc-ci M.R., Donatelli I., Kawaoka Y. Early alterations of the receptor-binding properties of HI, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals. // J.Virol. 2000. V. 74. P. 8502-8512.

111. Maurer-Stroh S., Lee R.T., Eisenhaber F., Cui L., Phuah S.P., Lin R.T. A new common mutation in the hemagglutinin of the 2009 (H1N1) influenza A virus. // PLoS Curr. 2010. V. 2. P. RRN1162.

112. McAuley J.L., Chipuk J.E., Boyd K.L., Van De Velde N., Green D.R., Mc Cullers J.A. PB1-F2 proteins from H5N1 and 20 century pandemic influenza viruses cause immunopathology. // PLoS Pathog. 2010. V. 6. P. el001014.

113. Medina R.A., García-Sastre A. Influenza A viruses: new research developments. // Nat. Rev. Microbiol. 2011. V. 9. P. 590-603.

114. Mehle A., Doudna J.A. Adaptive strategies of the influenza virus polymerase for replication in humans.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. V. 106. P. 21312-21316.

115. Moscona A. Global transmission of oseltamivir-resistant influenza. // N. Engl J. Med. 2009. V. 360. P. 953-956.

116. Moscona A. Oseltamivir resistance-disabling our influenza defenses. // N. Engl. J. Med. 2005. V. 353. P. 2633-2636.

117. Murphy B.R., Webster R.G. Orthomyxoviruses // Fields virology / Fields B.N., et al. editors. 3rd Edn. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996. P. 13971446.

118. Necula G., Mihai M.E., Sbarcea C.E., Dinu S., Lupulescu E., Ceausu E., Streinu-Cercel A., Mihailescu D.F., Alexandrescu V.I. Overview of influenza virus antiviral resistance in Romania in the last four epidemic seasons - phe-notyping, genotyping and molecular analysis study. // Rom. Rev. Lab. Med. 2011. V.19. P. 227-240. http://www.rrml.ro/articole/2011/201 l_3_2.pdf

119. Neumann G., Brownlee G.G., Fodor E., Kawaoka Y. Orthomyxovirus replication, transcription, and polyadenylation. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2004. V. 283. P. 121-143.

120. Neumann G., Hughes M.T., Kawaoka Y. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRMl. // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6751-6758.

121. Neumann G., Noda T., Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. // Nature. 2009. V. 459. P. 931-939.

122. Noda T. Native morphology of influenza virions. // Front. Microbiol. 2012. V. 2. P. 269.

123. Noda T., Sugita Y., Aoyama K., Hirase A., Kawakami E., Miyazawa A., Saga-ra H., Kawaoka Y.Three-dimensional analysis of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus. // Nat.Commun. 2012. V. 3. P. 639.

124. Noda T.,Sagara H., Yen A., Takada A., Kida H., Cheng R.H., Kawaoka Y. Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles. // Nature. 2006. V. 439. P. 490^92.

125. Osterhaus A.D., Rimmelzwaan G.F., Martina B.E., Bestebroer T.M., Fouchier R.A.Influenza B virus in seals. // Science. 2000. V. 288. P. 1051-1053.

126. Ping J., Keleta L., Forbes N.E., Dankar S., Stecho W., Tyler S., Zhou Y., Babiuk L., Weingartl H., Halpin R.A., Boyne A., Bera J., Hostetler J., Fedo-rova N.B., Proudfoot K., Katzel D.A., Stockwell T.B., Ghedin E., Spiro D.J., Brown E.G. Genomic and protein structural maps of adaptive evolution of human influenza A virus to increased virulence in the mouse. // PLoS One. 2011. V. 6. P. e21740.

127. Portela A., Digard P. The influenza virus nucleoprotein: amultifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication. // J. Gen.Virol. 2002. V. 83. P. 723-734.

128. Potdar V.A., Chadha M.S., Jadhav S.M., Mullick J., Cherian S.S., Mishra A.C. Genetic characterization of the influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus isolates from India. // PLoS One. 2010. V. 5. P. e9693.

129. Puthavathana P., Auewarakul P., Charoenying P.C., Sangsiriwut K., Pooruk P., Boonnak K., Khanyok R., Thawachsupa P., Kijphati R., Sawanpanyalert P. Molecular characterization of the complete genome of human influenza H5N1 virus isolates from Thailand. // J. Gen.Virol. 2005. V. 86. P. 423^33.

130. Reed M.L., Yen H.L., DuBois R.M., Bridges O.A., Salomon R., Webster R.G., Russell C.J.Amino acid residues in the fusion peptide pocket regulate the pH of activation of the H5N1 influenza virus hemagglutinin protein.// J. Virol. 2009. V. 83. P. 3568-3580.

131. Reid A.H., Fanning T.G., Hultin J.V., Taubenberger J.K. Origin and evolution of the 1918 "Spanish" influenza virus hemagglutinin gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. V. 96. P. 1651-1656.

132. Reid A.H., Fanning T.G., Janczewski T.A., Taubenberger J.K. Characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus neuraminidase gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. V. 97. P. 6785-6790.

133. Remold S.K., Rambaut A., Turner P.E. Evolutionary genomics of host adaptation in vesicular stomatitis virus. // Mol. Biol. Evol. 2008. V. 25. P. 1138— 1147.

134. Richardson J.C., Akkina R.K. NS2 protein of influenza virus is found in purified virus and phosphorylated in infected cells. // Arch. Virol. 1991. V. 116. P. 69-80.

135. Robb N.C., Smith M., Vreede F.T., Fodor E. NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome. // J. Gen. Virol. 2009. V. 90. P. 1398-1407.

136. Roberts J.D., Bebenek K., Kunkel T.A. The accuracy of reverse transcriptase from fflV-1.//Science. 1988. V. 242. P. 1171-1173.

137. Rodríguez-Baño J., Paño-Pardo J.R., Múñez Rubio E., Segura Porta F. Pregnancy, obesity and other risk factors for complications in influenza A(H1N1) pdm09 infection. // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2012. V. 30. P. 32-37.

138. Rogers G.N., Paulson J.C. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. // Virology. 1983. V. 127. P. 361-373.

139. Ruigrok R.W., Cremers A.F., Beyer W.E., de Ronde-Verloop F.M.Changes in the morphology of influenza particles induced at low pH. // Arch. Virol. 1984. V. 82. P. 181-194.

140. Ryan-Poirier K., Suzuki Y., Bean W.J., Kobasa D., Takada A., Ito T., Kawa-oka Y. Changes in H3 influenza A virus receptor specificity during replication in humans. // Virus Res. 1998. V. 56. P. 169-176.

141. Rzhetsky A., Nei M. A simple method for estimating and testing minimum evolution trees. // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. P. 945-967.

142. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406^25.

130

143. Schnell J.R., Chou J J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. // Nature. 2008. V. 451. P. 591-595.

144. Seo S.H., Hoffmann E., Webster R.G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. // Nat. Med. 2002. V. 8. P. 950-954.

145. Shen J., Ma J., Wang Q. Evolutionary trends of A(H1N1) influenza virus hemagglutinin since 1918. // PLoS One. 2009. V. 4. P. e7789.

146. Shimizu T., Takizawa N., Watanabe K., Nagata K., Kobayashi N.Crucial role of the influenza virus NS2 (NEP) C-terminal domain in Ml binding and nuclear export of vRNP. // FEBS Lett. 2011. V. 585. P. 41-46.

147. Shinya K., Ebina M., Yamada S., Ono M., Kasai N., Kawaoka Y. Avian flu: influenza virus receptors in the human airway. // Nature. 2006. V. 440. P. 435-436.

148. Shtyrya Y.A., Mochalova L.V., Bovin N.V. Influenza virus neuraminidase: structure and function. // Acta Naturae. 2009. V. 1. P. 26-32.

149. Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 531-569.

150. Smith D.J., Lapedes A.S., de Jong J.C., Bestebroer T.M., Rimmelzwaan G.F., Osterhaus A.D., Fouchier R.A. Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus. // Science. 2004. V. 305. P. 371-376.

151. Steel J., Lowen A.C., Mubareka S., Palese P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. // PLoS Pathog. 2009. V. 5. P. el000252.

152. Steinhauer D.A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. // Virology. 1999. V. 258. P. 1-20.

153. Stevens J., Corper A.L., Basler C.F., Taubenberger J.K., Palese P., Wilson I.A. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. // Science. 2004. V. 303. P. 1866-1870.

154. Sugita Y., Noda T., Sagara H., Kawaoka Y.Ultracentrifugation deforms unfixed influenza Avirions. // J. Gen. Virol. 2011. V. 92. P. 2485-2493.

155. Suzuki Y. Sialobiology of influenza molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. // Biol. Pharm. Bull. 2005. V. 28. P. 399^08.

156. Tamura K., Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. V. 101. P. 11030-11035.

157. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. P. 2731-2739.

158. Tang J.W., Ngai K.L., Wong J.C., Lam W.Y, Chan P.K. Emergence of ada-mantane-resistant influenza A (H3N2) viruses in Hong Kong between 1997 and 2006. // J. Med. Virol. 2008. V. 80. P. 895-901.

159. Taubenberger J.K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. // Proc. Am. Philos. Soc. 2006.V. 150. P. 86-112.

160. Taubenberger J.K., Morens D.M. 1918 Influenza: the mother of all pandemics. //Emerg. Infect. Dis. 2006.V. 12. P. 15-22.

161. Thomas Y., Kaiser L. Influenza virus surveillance in Switzerland Season 2011-2012. // National Reference Centre of Influenza. Geneva, 12 July 2012. P. 18. Ref. Type: Report. http://virologie.hug-ge.ch/_library/pdf/Flu2012.pdf

162. Tindall K.R., Kunkel T.A. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquat-icus DNA polymerase. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6008-6013.

163. Tong S., Li Y., Rivailler P., Conrardy C., Castillo D.A., Chen L.M., Recuenco S., Ellison J.A., Davis C.T., York I.A., Turmelle A.S., Moran D., Rogers S., Shi M., Tao Y., Weil M.R., Tang K., Rowe L.A., Sammons S., Xu X., Frace M., Lindblade K.A., Cox N.J., Anderson L.J., Rupprecht C.E., Donis R.O. A distinct lineage of influenza A virus from bats. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. V. 109. P. 4269-4274.

164. Trifonov V., Racaniello V., Rabadan R. The contribution of the PB1-F2 protein to the fitness of influenza A viruses and its recent evolution in the 2009

influenza A (H1N1) pandemic virus. // PLoS Curr. 2009. V. 1. P. RRN1006.

132

165. Tscherne D.M., García-Sastre A. Virulence determinants of pandemic influenza viruses. // J. Clin. Invest. 2011. V. 121. P. 6-13.

166. UNWTO. World Tourism Organization. International tourism to continue robust growth in 2013. Press Release. 28 Jan. 2013. No.: PR13006. http://media.unwto.org/en/press-release/2013-01 -28/international-tourism-continue-robust-growth-2013

167. Varga Z.T., Grant A., Manicassamy B., Palese P. Influenza virus protein PB1-F2 inhibits the induction of type I interferon by binding to MAVS and decreasing mitochondrial membrane potential. // J. Virol. 2012. V. 86. P. 83598366.

168. Vignuzzi M., Stone J.K., Arnold J.J., Cameron C.E., Andino R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. // Nature. 2006. V. 439. P. 344-348.

169. Vijaykrishna D., Bahl J., Riley S., Duan L., Zhang J.X., Chen H., Peiris J.S., Smith G.J., Guan Y. Evolutionary dynamics and emergence of panzootic H5N1 influenza viruses. // PLoS Pathog. 2008. V. 4. P. el000161.

170. Wang C., Takeuchi K., Pinto L.H., Lamb R.A. Ion channel activity of influenza A virus M2 protein: characterization of the amantadine block. // J. Virol. 1993. V. 67. P. 5585-5594.

171. Wang M.Z., Tai C.Y., Mendel D.B. Mechanism by which mutations at his274 alter sensitivity of influenza a virus nl neuraminidase to oseltamivir carbox-ylate and zanamivir. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. V. 46. P. 38093816.

172. Wang W., Riedel K., Lynch P., Chien C.Y., Montelione G.T., Krug R.M. RNA binding by the novel helical domain of the influenza virus NS1 protein requires its dimer structure and a small number of specific basic amino acids. // RNA. 1999. V. 5. P. 195-205.

173. Watanabe Y., Ibrahim M.S., Ellakany H.F., Abd El-Hamid H.S., Ikuta K. Genetic diversification of H5N1 highly pathogenic avian influenza A virus during replication in wild ducks. // J. Gen. Virol. 2011. V. 92. P. 2105-2110.

133

174. Webster R.G., Laver W.G., Air G.M., Schild G.C. Molecular mechanisms of variation in influenza viruses. // Nature. 1982. V. 296. P. 115-121.

175. WHO (a). Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, WHO, Geneva, 2002.

176. WHO (b). Director-General's opening statement at virtual press conference 10 August 2010.

http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2010/hlnl_vpc_20100810

177. WHO (c). Global Alert and Response (GAR). Influenza A (H1N1) - update 41. 29 May 2009. http://www.who.int/csr/don/2009_05_29/en/index.html#

178. WHO (d). Information about pandemic influenza. 2009. http://www.euro.who.int/influenza/20080618 20

179. WHO (e). Laboratory methodologies for testing the antiviral susceptibility of influenza viruses: M2 ion channel inhibitor. Current approaches to M2 inhibitor resistance testing. November 2012. http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/m2inhi bitor/en/index.html

180. WHO(f). Pandemic (H1N1) 2009 - update 109. 2009. http://www.who.int/csr/don/2010_07_16/en/index.html

181. WHO (g). Sequencing primers and protocol. 2009. http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/sequencing_primers/e n /

182. WHO (h). What is post-pandemic? 10 August 2010. http://www.who.int/csr/disease/swineflu/frequently_asked_questions/post_pan demic/en/index.html

183. WHO (i). World now at the start of 2009 influenza pandemic. 11 June 2009. http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/hlnl_pandemic_phase 6_20090611/en/

184. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. // Nature. 1981. № 289. C. 366-373.

185. Wise H.M., Foeglein A., Sun J., Dalton R.M., Patel S., Howard W., Anderson E.C., Barclay W.S., Digard P. A complicated message: Identification of a novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA. // J. Virol. 2009. V. 83. P. 8021-8031.

186. Wise H.M., Hutchinson E.C., Jagger B.W., Stuart A.D., Kang Z.H., Robb N., Schwartzman L.M., Kash J.C., Fodor E., Firth A.E., Gog J.R., Taubenberger J.K., Digard P. Identification of a novel splice variant form of the influenza A virus M2 ion channel with an antigenically distinct ectodo-main. // PLoS Pathog. 2012. V. 8. P. el002998.

187. Wrigley N.G. Electron microscopy of influenza virus. // Br. Med. Bull. 1979. V. 35. P. 35-38.

188. Xing Z., Cardona CJ. Preexisting immunity to pandemic (H1N1) 2009. // Emerg. Infect. Dis. 2009. V. 15. P. 1847-1849.

189. Xu L., Bao L., Zhou J., Wang D., Deng W., Lv Q., Ma Y., Li F., Sun H., Zhan L., Zhu H., Ma C., Shu Y., Qin C. Genomic polymorphism of the pandemic A (H1N1) influenza viruses correlates with viral replication, virulence, and pathogenicity in vitro and in vivo. // PLoS One. 2011. V. 6. P. e20698.

190. Xu R., Ekiert D.C., Krause J.C., Hai R., Crowe J.E. Jr., Wilson I.A. Structural basis of preexisting immunity to the 2009 H1N1 pandemic influenza virus. // Science. 2010. V. 328. P. 357-360.

191. Xu R., Wilson I.A. Structural characterization of an early fusion intermediate of influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 2011. V. 85. P. 5172-5182.

192. Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M.Q., Nidom C.A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y., Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y., Hay A., Haire L.F., Stevens D.J., Russell R.J., Gamblin S.J., Skehel J.J., Kawaoka Y. Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors. // Nature. 2006. V. 444. P. 378-382.

193. Yang L., Chan K.P., Lee R.S., Chan W.M., Lai H.K., Thach T.Q., Chan K.H.,

Lam T.H., Peiris J.S., Wong C.M. Obesity and influenza associated mortality:

135

evidence from an elderly cohort in Hong Kong. // Prev. Med. 2013. V. 56. P. 118-123.

194. Yang T.T., Wang Z.G., Li S.P., Liu X.L., Yi Y., Yang Y., Yu P., Chen J.M. Increased prevalence of a rare mutant of pandemic H1N1 influenza virus in a Eurasian region. // Infect. Genet. Evol. 2011. V. 11. P. 227-231.

195. Yasugi M., Nakamura S., Daidoji T., Kawashita N., Ramadhany R., Yang C.S., Yasunaga T., Iida T., Horii T., Ikuta K., Takahashi K., Nakaya T. Frequency of D222G and Q223R hemagglutinin mutants of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus in Japan between 2009 and 2010. // PLoS One. 2012. V. 7. P. e30946.

196. Zamarin D., Ortigoza M.B., Palese P. Influenza A virus PB1-F2 protein contributes to viral pathogenesis in mice. // J. Virol. 2006. V. 80. P. 7976-7983.

197. Zell R., Krumbholz A., Eitner A., Krieg R., Halbhuber K.J., Wutzler P. Prevalence of PB1-F2 of influenza A viruses. // J. Gen. Virol. 2007. V. 88. P. 536546.

198. Zhirnov O.P., Ksenofontov A.L., Kuzmina S.G., Klenk H.D. Interaction of influenza A virus Ml matrix protein with caspases. // Biochemistry (Mose). 2002. V. 67. P. 534-539.

199. Zhou J.J., Tian J., Fang D.Y., Liang Y., Yan H.J., Zhou J.M., Gao H.L., Fu C.Y., Liu Y., Ni H.Z., Ke C.W., Jiang L.F. Analysis of antigen epitopes and molecular pathogenic characteristics of the 2009 H1N1 pandemic influenza A virus in China. // Acta Virol. 2011. V. 55. P. 195-202.

200. Zuckerkandl E., Pauling L. Evolutionary divergence and convergence in proteins. // Evolving Genes and Proteins. / Edited by Bryson V. and Vogel H.J. New York: Academic Press. 1965. P. 97-166.

201. Zürcher T., Yates P.J., Daly J., Sahasrabudhe A., Walters M., Dash L., Tisdale M., Mc Kimm-Breschkin J.L. Mutations conferring zanamivir resistance in human influenza virus N2 neuraminidases compromise virus fitness and are not stably maintained in vitro. // J. Antimicrob. Chemother. 2006. V. 58. P. 723-732.