Функциональный анализ пептидаз у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Пожидаева, Елена Станиславовна

• Пожидаева, Елена Станиславовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пожидаева, Елена Станиславовна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Протеазы и их роль в гомеостазе клетки

1. Классификация пептидаз

2. Типы протеолиза белков

3. Семейства пептидаз

3.1. АТФ-зависимые пептидазы

3.1.1. Семейство пептидаз С1р

3.1.2. Семейство пептидаз FtsH

3.2. АТФ-независимые пептидазы

3.2.1. Семейство пептидаз Deg

3.2.2. Семейство пептидаз Ctp

3.2.3. Семейство пептидаз SppA

4. Роль пептидаз в клетке

5. Адаптация цианобактерий к изменяющимся условиям окружающей среды

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительный анализ пептидаз у Synechocystis и A.thaliana

2. Физиологический анализ мутантов по генам пептидаз у Synechocystis в

72

условиях стресса

3. Функциональный анализ белков семейства SppA-пептидаз у Synechocystis

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ

а.о. аминокислотные остатки

кДНК комплементарная ДНК

ДМСО диметил сульфоксид

ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I

ДТ штамм дикого типа

ИПТГ (1РТС) Изопропил-бета-В-тиогалактозид

ОП (А) оптическая плотность

п.н. пар нуклеотидов

ПАА полиакриламидный

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНКаза рибонуклеаза

ЭДТА (БЭТА) этилендиаминтетрауксусная кислота

т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

Трис (Тиб) трис (гидроксиметил) аминометан

ОРС открытая рамка считывания

сск светособирающий комплекс

ФС1 фотосистема I

ФСИ фотосистема II

ТВЕ Трис борат, ЭДТА

ТХУ трихлоруксусная кислота

ТЕМЕД N514, К., Ы-тетрам етилэтилен диамин

АРС аллофикоцианин

Ар* устойчивость к ампициллину

Сшк устойчивость к хлорамфениколу

с!СТР дезоксицитозинтрифосфат

БЬ 2 1 низкий свет (20 мкмоль фотонов м" с" )

ББР диизопропилфторфосфат

EtBr бромистый этидий

HL 2 1 высокий свет (350 мкмоль фотонов м" с")

HS тепловой шок (42°С)

IgG иммуноглобулин G

IAA иодоацетамид

GmR устойчивость к гентамицину

KmR устойчивость к канамицину

LL 2 1 обычный свет (50 мкмоль фотонов м" с")

ML 9 1 повышенный свет (150 мкмоль фотонов м" с")

PC фикоцианин

PMSF фенилметилсульфонил фторид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональный анализ пептидаз у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803»

ВВЕДЕНИЕ

Пептидазам, наравне с киназами, фосфатазами и белками-шаперонами, принадлежит ключевая роль в регуляции структурных и физиологических процессов, обеспечивающих быстрое и оптимальное приспособление клеток к изменяющимся условиям окружающей среды. Роль пептидаз в поддержании клеточного гомеостаза становится особенно очевидной после искусственного выключения определённых протеолитических процессов, что влечёт за собой кардинальные изменения в физиологии клетки (Huffaker, 1990; Gottesman et al., 1997; Kirschner, 1999). Благодаря интенсивному развитию геномики, в последние годы были полностью расшифрованы геномы различных организмов, что позволило выявить большое число генов, кодирующих протеолитические ферменты. Причём, и автотрофные, и гетеротрофные организмы, несмотря на различия в структуре клетки и форме жизни, содержат набор пептидаз, имеющих общие филогенетические корни (Clarke, 1999; Kieselbach, Funk, 2003). Согласно гипотезе об эндосимбиотической природе хлоропластов (Margulis, 1970), их предками были цианобактерии, о чем свидетельствует значительное структурное и функциональное сходство аппаратов фотосинтеза хлоропластов и цианобактерий (Bryan, 1994). В течение эволюции в растительной клетке происходило существенное по своему масштабу перестроение и перераспределение генетического потенциала, что, в конечном итоге, привело к разделению генетического материала по отдельным компартментам (Herrmann, 1997; Race et al., 1999; Herrmann, Westhoff, 2001). Описанная реструктуризация геномов включала внутриклеточный перенос генов, главным образом, от геномов органелл к ядру. Поэтому, не удивительно, что протеолитические системы пластид и митохондрий, несмотря на преобладающее ядерное/цитоплазматическое происхождение, имеют так же родство с протеолитическими системами цианобактерий в случае пластид, и а-протеобактерий в случае митохондрий (Gray

et al., 2001), и информация о протеолитических компонентах этих органелл, хотя бы частично, может быть получена из базы данных бактериальных геномов.

Известно, что в клетках фотосинтезирующих организмов функционирование фотосинтетического аппарата приводит к повреждению составляющих его белков. Поврежденные белки специфически разрушаются пептидазами и замещаются молекулами, синтезированными de novo. В настоящее время идентифицированы лишь отдельные компоненты протеолитической системы, вовлеченные в этот процесс (Lindahl et al., 2000; Haufiul et al., 2001; Ivleva et al., 2002). Вместе с тем, многочисленные экспериментальные данные указывают на существенную роль протеолитических белков в обеспечении эффективной работы оксигенного фотосинтеза, фундаментального биологического процесса, который происходит у цианобактерий и в хлоропластах растений. Различные исследования демонстрируют наличие большого числа пептидаз, имеющих прокариотическое происхождение, в клетках растений (Adam et al., 2001), однако функция большинства из них до сих пор остаётся неизвестной.

Используемая в данной работе цианобактерия Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis), открывает широкие возможности для молекулярного анализа генов пептидаз, так же присутствующих у растений. Этот штамм способен к росту при фотоавтотрофных и фотогетеротрофных условиях (Shestakov, Grigorjeva, 1982), что может быть успешно использовано для исследования генов, напрямую или опосредованно, участвующих в фотосинтезе. Для Synechocystis разработаны подходы, направленные на изучение функций генов, заключающиеся в ведении в них инсерционных или делеционных мутаций, полностью инактивирующих гены, в создании комплементационных и супрессорных мутантов.

Раннее, в лаборатории молекулярной генетики фотосинтеза (проф. Зинченко В.В., биологический факультет, МГУ им. Ломоносова), с целью функционального анализа генов пептидаз у Synechocystis, кодирующих гомологи растительных пептидаз, была создана коллекция мутантов с инсерционной и делеционной

инактивацией 22 генов пептидаз (Паничкин, 2001). В данной работе было показано, что полная сегрегация прошла только у 14 мутантов, тогда как 7 мутантов оставались гетерозиготными, что указывает на необходимость соответствующих генов (с1рВ1, с1рР1, с1рРЗ, с1рР4, с1рХ, згр, ЫгА) для жизнедеятельности клеток.

С целью получения большей информации о функциональной роли пептидаз у цианобактерий и растений в рамках решения вопросов сравнительной функциональной и эволюционной геномики, в данной работе были поставлены следующие основные задачи исследования:

1. поиск и идентификация протеолитических компонентов у цианобактерии 8упескосу8й$, имеющих гомологов у растения АгаЫ(1орз1з ¡каИапа (далее АлНаНапа).

2. Изучение физиолого-биохимических характеристик мутантов Бупескосузйз с инактивированными генами пептидаз в различных условиях стресса, для обнаружения генов участвующих в фотосинтезе.

3. Функциональный анализ генов яррА 1 и яррА2, кодирующих белки семейства БррА-пептидаз, для установления их роли в адаптации цианобактерии к световым режимам различной интенсивности.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Протеазы и их роль в поддержании гомеостаза клетки 1. Классификация пептидаз

У всех живых организмов осуществляется постоянный синтез и деградация белковых молекул. Концентрация индивидуальных клеточных белков определяется балансом между уровнями их синтеза и деградации, которые, в свою очередь, зависят от факторов внешней среды и контролируются набором регулируемых биохимических механизмов (Vierstra, 1993; Hengge, Bukau, 2003). Протеолиз является ключевым процессом, участвующим в поддержании гомеостаза клетки (Hershko, Ciechanovich, 1998; Vierstra, 1993; Bohley, 1996). Этот процесс катализируется пептидазами (или протеазами), белками с протеолитической активностью, обеспечивающими гидролиз пептидных связей внутри молекулы-мишени. В настоящее время пептидазы классифицируют по а) типу катализируемой реакции, б) химическому механизму катализа; в) по молекулярной структуре и гомологии пептидаз (Kenny, 1999; Rawling, Barrett, 1999).

Пептидазы могут проявлять селективность, гидролизуя, только определенные пептидные связи. Одна из форм этой селективности проявляется в гидролизе пептидной связи в специфическом положении полипептидной цепи белковой молекулы и лежит в основе классификации пептидаз по типу реакции: эндопептидазы и экзопептидазы. Экзопептидазы гидролизуют молекулу субстрата либо с N-конца (аминопептидазы), либо с С-конца (карбоксипептидазы). В зависимости от числа отщепляемых аминокислотных остатков экзопептидазы подразделяют на моно-, ди- и трипептидазы. Эндопептидазы катализируют расщепление связей, расположенных внутри молекулы. Согласно классификации пептидаз на основе химического механизма катализа (Hartley, 1960), эндопептидазы делятся на сериновые, цистеиновые, треониновые, глютаминовые, аспарагиновые, металлопептидазы и пептидазы с неизвестным типом катализа (Barrett, 1994 и 1995; Kenny, 1999). В базе данных по пептидазам MEROPS эти

семейства обозначаются латинскими буквами S, С, Т, G, А, М и U, соответственно. Данная система обладает рядом ограничений, поскольку определенное семейство, например сериновых пептидаз, включает пептидазы с различной молекулярной структурой и каталитическими механизмами. Более того, эта классификация не позволяет определить степень гомологии между белками. Поэтому, внутри одного семейства могут находиться белки, различающиеся как по своей молекулярной структуре, так и по типу катализа. Классификация пептидаз по молекулярной структуре и гомологии (Rawlings, Barrett, 1993) стала структурной основой базы данных по пептидазам MEROPS. Подобный подход в классификации стал возможным только после развития методов определения аминокислотных последовательностей белков и их трёхмерной структуры. Позднее, эта схема была дополнена белками, ингибирующими пептидазы (Rawlings et al., 2004).

2. Типы протеолиза белков

В клетках различают два типа протеолиза: неселективный протеолиз, приводящий к расщеплению белковых молекул неспецифичными пептидазами и избирательный (или ограниченный) протеолиз, катализируемый специфическими пептидазами в различных компартментах клетки.

Протеолиз первого типа происходит в результате согласованного действия различных пептидаз и во многих случаях протекает внутри лизосом или вакуолей, требуя затраты энергии АТФ (Seglen, Bohley, 1992; Knop et al., 1993). Число лизосом в клетке особенно быстро возрастает в условиях дефицита питательных веществ или гормонов, когда увеличивается число аномальных белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза. При этом большая часть аномальных белков, предназначенных для деградации, попадает в лизосомы случайным образом по неселективному пути. Однако, следует отметить, что в условиях дефицита питательных веществ также может происходить избирательный транспорт белков в лизосомы (Olson et al., 1991). Это было показано на культуре клеток млекопитающих (Terlecky et al., 1991). В процессе участвует белок

теплового шока Hsc73, который способен связываться со специфической аминокислотной последовательностью KFERQ цитоплазматических полипептидов, предназначенных для деградации в лизосомах (Chiang, Dice, 1988). При взаимодействии с шаперонами и лизосомальными мембранными рецепторами (Terlecky, Dice, 1993) цитоплазматические белки претерпевают конформационные изменения, затрачивая при этом энергию АТФ, что, в свою очередь, облегчает их транспорт в лизосомы. Примерно 25-30% всех цитозольных белков клеток человека содержат домены, взаимодействующие с антителами к аминокислотной последовательности KFERQ (Dice, 1992). Это дает основание полагать, что большинство белковых молекул животных клеток, предназначенных для протеолиза, попадает в лизосомы, используя этот путь (Dice, Chiang, 1989; Olson et al., 1991; Terlecky, Dice, 1993; Vierstra, 1993).

Второй тип протеолиза, избирательный протеолиз, отвечает за выборочный кругооборот клеточных белков, как в нормальных, так и в стрессовых условиях (Burgess et al., 1978; Ciechanover et al., 1980; Klausner, Sitia, 1990; Heinemeyer et al., 1991; Wagner et al., 1994; Ciechanover, 1998; Brown et al., 2000; Hicke, 2001). Одним из основных компонентов избирательного протеолиза является протеасома (Hershko et al., 1983; Hershko, 1988). У различных организмов протеасома представляет собой консервативный белковый комплекс размером более 2,5 МДа, осуществляющий АТФ-зависимое расщепление белков с образованием пептидов и свободной молекулы убиквитина. Убиквитин является небольшим консервативным полипептидом, состоящим из 76 аминокислот. Он способен связываться своим С-концом с боковыми лизинами белка-мишени. Наличие такой метки в белке является первичным сигналом для их сортировки, направляющей образовавшиеся конъюгаты к протеасомам для последующего протеолиза (Hershko, 1988; Ciechanover, Schwarz, 1989; Vierstra, 1993; Ciechanover, 1998; De Mot et al, 1999; Glickman, 2000). Убиквитин-зависимый протеолиз участвует в деградации белков, поврежденных во время различных стрессов, включая тепловой стресс. Увеличение

количества убиквитина, в данном случае, может выполнять сигнальную роль для протеолиза (Bond et al., 1988; Klausner, Sitia, 1990; Sommer, Jentsch, 1993; Kopito, 1997; Mayer et al., 1998; Kopito, Sitia, 2000; Lee et al., 2004). В клетках высших растений функция убиквитина сопряжена с расщеплением фитохром-содержащих фоторецепторов в условиях светового стресса (Shanklin et al., 1987; Hershko, 1988; Jabben et al., 1998).

Кроме убиквитин-зависимой протеасомы ограниченный протеолиз катализируется специфическими пептидазами, которые избирательно расщепляют одну или несколько пептидных связей в молекуле белка. Они входят в состав различных семейств {см. далее в главе 3) и выполняют различные функции в клетке. Специфические пептидазы участвуют в регуляции клеточного цикла (Pagano, 1997), генной экспрессии (Adam, 2000), дифференцировки клеток (Kinoshita et al., 1995), сортировки и доставки белков к месту их окончательной локализации (Perlman, Halvorson, 1983), а также процессов старения и запрограммированной смерти клеток (Huffaker, 1990; Matile et al., 1996; Hortensteiner, Fello, 2002).

3. Семейства пептидаз

Неселективный и ограниченный протеолиз обычно катализируются различными регуляторными механизмами, в различных органеллах и компартментах клетки (Burgess et al., 1978; Brown et al., 2000; Hicke, 2001).

В настоящий момент в клетках прокариот и эукариот наиболее подробно охарактеризованы пептидазы следующих семейств:

3.1. АТФ-зависимые пептидазы

В эту группу входят семейства пептидаз, которые относятся к подгруппе ААА+-белков (т.е. АТФаз, ассоциированных с другими клеточными активностями) и содержат в своей белковой последовательности консервативный АТФ-азный участок размером 200-250 а.о. (Neuwald et al., 1999; Ogura, Wilkinson, 2001; Lupas, Martin, 2002). Протеолитическая активность и регуляторная функция этих

ферментов сопряжены с гидролизом АТФ (Katayama-Fujimura et al., 1987; Horwich et al., 1999). АТФ-зависимые пептидазы проявляют высокую селективность, поскольку производят отбор субстратов-мишеней из общего пула внутриклеточных белков (Gottesman, Maurisi, 1992). Все известные АТФ-зависимые пептидазы являются олигомерами (Bochtler et al., 2000; Guo et al, 2002). В настоящий момент описаны четыре цитоплазматических (ClpAP, ClpXP, HslUV и Lon) и одна мембрано-связанная (FtsH) АТФ-зависимые пептидазы (Suzuki et al., 1997; Dougan et al., 2002; Gottesman, 2003). У эукариот также присутствует большой АТФ-зависимый мультикаталитический комплекс, называемый 268-протеасома (т. е. протеиназа, являющаяся крупной частицей - "сома"), чья функция была описана выше в главе 2 (Lupas et al., 1987).

3.1.1. Семейство пептидаз Clp

Clp (çaseinolytic peptidase, т.е. казеинолитические) пептидазы образуют высокомолекулярные мультимерные комплексы. Они состоят из протеолитических и регуляторных субъединиц (или шаперонов) (Maurizi, 1991; Pelter et al., 2001), чья АТФ-зависимая активность может изменяться за счёт действия белков-адапторов (Dougan et al., 2002а). В клетках разных организмов тип и число протеолитических и регуляторных субъединиц Clp может варьировать (Clarke, 1999). У E.coli найдены три регуляторных субъединицы (ClpA, ClpB и ClpX) и одна протеолитическая субъединица (ClpP). У фотосинтетических организмов их число увеличивается: в клетках Synechococcus найдено 5 регуляторных (ClpB 1-2, ClpC, ClpX) и 4 протеолитических (ClpP 1-3, ClpR) субъединицы, у A.thaliana - 9 (ClpBl-3, ClpC 1-2, ClpD, CIpXl-3) и 10 (ClpPl-6, ClpRl-4) субъединиц, соответственно (Adam etal., 2001; Clarke, 1999).

У большинства нефотосинтетических бактерий протеолитическая субъединица ClpP, кодируется однокопийным геном clpP (Kroh, Simon, 1990/ тогда как у цианобактерий и растений ген clpP образует мультигенные семейства, состоящие из трёх clpP (clpPl-clpP3) и шести clpP (clpP-clpP6) членов,

соответственно (Kaneko et al., 1996; Clarke et al., 1998; Halperin et al, 2001 a,b). Кроме того, в геноме фотосинтетических организмов идентифицирован ген clpR (clpR\-clpR4), кодирующий ClpP-подобную субъединицу ClpR (ClpRl-ClpR4) (Porankiewcz et al., 1999; Nakabayashi et al., 1999, Adam et al., 2001). Аминокислотная последовательность ClpR имеет высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью ClpP, однако у ClpR отсутствует протеолитический домен с каталитической триадой Ser-His-Asp, характерной для сериновых пептидаз (Porankiewcz et al, 1999).

Регуляторные субъединицы (или белки-шапероны) регулируют протеолитическую активность пептидазного комплекса. Существует несколько типов АТФ-зависимых регуляторных субъединиц: ClpA, ClpB, ClpC, ClpD и ClpX (Squires , Squires, 1992; Schirmer et al., 1996; Turgay etal., 1998; "Newer et al., 1999). Так же как и в случае протеолитической субъединицы ClpP, число регуляторных белков в клетках фотосинтетических организмов увеличивается (Adam et al, 2001). В клетках E.coli однокопийные гены clpA, clpB и clpX кодируют шапероны ClpA, ClpB и ClpX, соответственно, тогда как у цианобактерии их число увеличивается до 4 (clpBl, clpB2, clpC, clpX), а у растений - до 9 (clpBl-B3, clpCl-2, clpD, clpXl-3) (Kaneko etal., 1996; Gottestnan étal, 1998; Clarke etal, 1994, Clarke, 1999).

Пептидаза Clp E.coli является основной моделью при изучении этого комплекса в других организмах (Wang et al, 1997). У E.coli протеолитическая субъединица ClpP, связываясь с регуляторными субъединицами ClpA и ClpX, образует два типа пептидаз - ClpAP и ClpAX (Kessel et al, 1995; Grimaud et al, 1998). Мономеры ClpP собираются в гептамерные кольца. Два гептамерных кольца, наложенные друг на друга, формируют ядро протеолитического центра (Flanagan et al, 1995; Shin et al, 1996; Wang et al, 1997). Регуляторные субъединицы, ClpA и ClpX, представляют собой смесь нестабильных мономеров и димеров, которые в присутствии АТФ образуют стабильные структуры из гексамерных колец (Maurizi, 1991; Ishikawa et al, 2002; Ortega et al, 2002).

Функциональная пептидаза ClpAP или ClpAX состоит из колец протеолитических субъединиц ClpP, фланкированных кольцами АТФ-зависимых регуляторных субъединиц ClpA или ClpX, соответственно (Maurizi et al., 1994; Kessel et al., 1995; Ortega et al., 2002).

Протеолитическая субъединица ClpP содержит в своей последовательности каталитическую триаду, серии, гистидин и лизин, характерную для серинового типа пептидаз (Maurizi et al., 1990). В отсутствие регуляторных субъединиц, ClpP обладает ограниченной протеолитической активностью, гидролизуя, только короткие пептиды (Gottesman, Maurizi, 1992). Расщепление пептидов больше 6 а.о. в длину, и белковых субстратов, требующих разворачивания перед их переносом внутрь камеры деградации, происходит только в присутствии шаперонов ClpA и ClpX (Kessel et al., 1995; Grimaud et al., 1998; Reid et al., 2001).

Регуляторные субъединицы ClpA и ClpX имеют в своей последовательности АТФ-связывающие участки (AAA участки). Участок ААА-1 расположен в N-концевой части белка, а участок ААА-2 - в С-концевой части. У ClpA присутствуют оба участка - ААА-1 и ААА-2 (Gottesman et al., 1997а), однако ClpX содержит только один участок ААА-2 (Grimaud et al., 1998). Участок ААА-1 отвечает за образование гексамерной структуры регуляторной субъединицы, и за связывание пептидазы с белковым субстратом; участок ААА-2 вовлечен в гидролиз АТФ и деградацию белка-субстрата (Singh, Maurizi, 1994). Из-за отсутствия у ClpX последовательности ААА-1 функции N-концевого участка выполняет ААА-2 (Ortega et al., 2002). Регуляторные субъединицы выполняют несколько функций: они участвуют в узнавании определённых белковых субстратов (например, белок ХО, RepA, GFP-SsrA), их связывании, разворачивании и переносе несвёрнутой полипептидной цепочки в область протеолитических центров, образованных ClpP (Ishikawa et al., 2001; Flynn et al., 2003). То, что именно регуляторные субъединицы определяют выбор субстрата, подтверждается фактом, что ClpAP и ClpXP, имеющие общий протеолитический компонент ClpP, гидролизуют разные

внутриклеточные субстраты (Maurizi et al., 1994; Gottesman, 1999). Надо отметить, что регуляторные субъединицы при определённых условиях могут проявлять шапероноподобную активность и участвовать в рефолдинге белков (Wickner et al., 1994).

Позднее, у E.coli был описан ещё один тип АТФ-зависимой пептидазы семейства С1р, пептидаза ClpYQ, более известная как HslUV (heat shock locus UV) пептидаза (Chuang et al, 1993; Wang et al., 2001). Подобно 20S протеасоме пептидаза ClpYQ относится к треониновым пептидазам (Yoo et al., 1997). Её протеолитическое ядро образовано двумя гексамерными кольцами протеолитической субъединицы ClpQ (HslV). Регуляторная субъединица CpY образует только одно гексамерное кольцо, которое в присутствии АТФ присоединяется к протеолитическому центру с любой стороны (Kessel et al., 1996; Bochter et al., 1997; Rohrwild et al., 1997; Bochtler et al., 2000). Стабильность пептидазы ClpQY зависит от субстрата и в его отсутствии комплекс распадается на протеолитические и регуляторные компоненты.

АТФазная активность пептидазы С1р в некоторых случаях может изменяться за счёт действия белков-адапторов (Dougan et al, 2002а). Это, как правило, низкомолекулярные белки, которые способны специфически изменять связывающие свойства регуляторных субъединиц (Muffen et al, 1996; Zhou et al, 2001; Dougan et al, 2002b). Белок-адаптор ClpS (12 кДа) способен связываться с N-концевым участком шаперона ClpA, в результате этого усиливается узнавание пептидазой ClpAP белков, агрегированных во время теплового стресса (Dougan et al, 2002b).

Пептидазы семейства Clp выполняют различные функции в клетке, действуя, как пептидазы или как молекулы-шапероны (Squires, Squires, 1992; Schirmer et al, 1996; Gottesman et al, 1997b). Пептидазы Clp играют критическую роль в устойчивости к стрессовым факторам (Damerau, St John, 1993; Gerth et al, 1998; Msadek et al, 1998; Panichkin et al., 2001), они вовлечены в протеолиз неправильно

свёрнутых, повреждённых или агрегированных белков (Frees, Ingmer, 1999; Krüger et ah, 2000; Eriksson, Clarke, 1996), а также участвуют в таких процессах, как клеточное деление, споруляция, развитие генетической компетентности и качественный контроль белков (Jenal, Fuchs, 1998; Msadek et ah, 1998; Nanamiya et ah, 1998; Turgay et ah, 1998, Flynn et ah, 2001).

3.1.2. Семейство пептидаз FtsH

Пептидазы семейства FtsH относятся к семейству Zn-зависимых металлопротеиназ. В С-концевом участке пептидазы FtsH обнаружена характерная для металлопептидаз Zn-связывающая последовательность с двумя остатками гистидина (HEXffi) (Herman et ah, 1995; Tomoyasu et al., 1995). У E.coli пептидаза FtsH является единственной мембрано-связанной АТФ-зависимой пептидазой (Tomoyasu et ah, 1993), наличие которой необходимо для жизнеспособности клеток E.coli (Herman et al., 1993). Её протеолитический и АТФазный центры локализованы в одной полипептидной цепи (Tomoyasu et ah, 1995). Пептидаза FtsH кодируется однокопийным геном ftsH, транскрипция которого находится под контролем промотора теплового шока (обобщено у Akyamo, Ito, 2000).

Подобно другим АТФ-зависимым пептидазам, пептидаза FtsH образует мультимерную (гомодимерную и (или) гексамерную) структуру, необходимую для ее каталитической активности (Karata et al., 1999; Krzywda et al., 2002; Niwa et al., 2002). Все пептидазы FtsH имеют два трансмембранных участка, расположенных в N-концевой части белка, после которых следует большой цитоплазматический участок. Исключением является митохондриальная пептидаза Ymel, содержащая только один трансмембранный участок (Tomoyasu et al., 1993; Langer, 2000). За олигомеризацию пептидазы отвечает N-концевая область, а трансмембранная организация белка существенна для протеолитической активности по отношению к мембранным белкам (Langer, 2000; Akiyama, Ito, 2000). Несколько субстратов пептидазы FtsH были обнаружены у E.coli, включая транскрипционный фактор а32 теплового шока (Nakahigashi et al., 1999).

У цианобактерий ген ftsH образует мультигенную группу, состоящую из четырёх ftsH (ftsHl-ftsH4). В клетках Synechocystis все четыре гена ftsH были индивидуально инактивированы (Bailey et al., 2001). Инактивация гена ftsH2 привела к нарушению биогенеза ФСП (Mann et al., 2000). Не удалось получить полностью сегрегированные мутанты с инактивированными генами ftsHl или ftsH3, что свидетельствует о жизненноважной функции этих генов.

У растений выявлено 9 генов ftsH (Adam et al., 2001). У A.thaliana инактивация гена ftsH2 (var2) привела к возникновению "пятнистого" фенотипа. Это дало основание предположить, что пептидаза FtsH2 необходима для дифференциации пластид и участвует в предотвращении частичного фотоокисления развивающихся хлоропластов (Chen et al., 2000; Takechi et al., 2000). Установлено, что экспрессия гена ftsH2, кодирующего эту пептидазу, является свето-индуцибельной. (Lindahl et al., 1996; Ostersetzer, Adam, 1997). Дальнейшие исследования показали, что она принимает участие в деградации белка D1 реакционного центра ФСП (Lindahl et al., 2000; Bailey et al., 2002).

3.2. АТФ-независимые пептидазы

Эта группа включает в себя семейства пептидаз, чья протеолитическая и шаперонная активность не требует затраты энергии АТФ.

3.2.1. Семейство пептидаз Deg

Семейство пептидаз Deg включает в себя сериновые эндопептидазы: HtrA (DegP), HhoA (DegQ) и HhoB (DegS) (Lipinska et al., 1990; Pallen, Wren, 1997; Wallen, Sauer, 1996). Члены этого семейства широко распространённы у про- и эукариот, участвуя, в протеолизе повреждённых белков. Гены hhoA (degQ), hhoB (degS) были идентифицированы как мультикопийные супрессоры условно-летального фенотипа (чувствительность к комбинированному действию теплового и осмотического стрессов) у мутанта E.coli с инактивацией гена pre, кодирующего С-концевую процессирующую пептидазу (Bass et al., 1996).

У E.coli пептидаза HtrA (high temperature requirement A, т.е. белок, необходимый при повышенной температуре) является белком теплового шока, который абсолютно необходим для выживаемости бактерий при температуре выше 42°С (Skorko-Glonek et al., 1995). Эта пептидаза является периферическим белком, расположенным на периплазматической стороне внутренней мембраны (Alba et al., 2001). Белки HhoA и HhoB являются периплазматическими белками и проявляют высокую степень гомологии с HtrA (58 и 35% идентичности, соответственно) и между собой (36% идентичности) (Bass et al., 1996). Установлено, что плазмида, экспрессирующая ген hhoA, восстанавливает фенотип дикого типа у мутанта HtrA" являющегося температурочувствительным. Таким образом, пептидаза HhoA может функционально замещать пептидазу HtrA при определенных условиях. Ген hhoA не является важным для роста клеток E.coli при нормальных условиях. Более того, ген hhoA, в отличие от гена htrA, не является необходимым для выживания клеток при повышенной температуре (44°С). Пептидаза HhoB не способна замещать пептидазу HtrA, однако она является необходимой для нормального роста клеток (Waller, Sauer, 1996). Последнее, очевидно, объясняется тем, что пептидаза HhoB вовлечена в регуляцию стЕ-специфичного анти-сигма фактора RseA (Ades et al., 1999).

Все члены семейства пептидаз Deg образуют гомо-тримерную структуру, необходимую для активности пептидазы, однако в ряде случаев, например, в случае HtrA, возможна димеризация этих триммеров, приводящая к образованию гексамерной структуры (Kim et al., 1999; Sassoon et al., 1999; Krojer et al., 2002; Li et al., 2002).

У фотосинтетических организмов число гомологов Deg-белков увеличивается (Adam et al., 2001). Так в геноме A.thaliana выявлено 13 генов, кодирующих изомерные формы пептидазы DegP (Kaneko et al., 1996; Adam et al., 2001). Четыре гена, кодируют пептидазы, локализованные в хлоропласте: DegPl, Р2, Р5, Р8 (Adam et al., 2001; Schubert et al., 2001). Пептидазы DegPl, P2 ассоциированы с мембраной тилакоидов (Itzhaki et al., 1998; Haussuhl et al., 2001).

В клетках E.coli Deg участвует в рефолдинге неправильно свёрнутых белков, а так же в деградации периплазматических и мембранных белков в условиях различных стрессов (Strauch et al., 1989; Skorko-Glonek et al., 1997). У фотосинтетических организмов несколько гомологов Deg вовлечены в обновление белка D1 реакционного центра ФСП (HauBtthl et al., 2001; Silva et al., 2002).

3.2.2. Семейство карбоксипептидаз Ctp

Это и следующие несколько семейств относятся к процессирующим пептидазам, которые классифицируют на две группы: С-концевые и N-концевые процессирующие пептидазы.

Ctp-пептидазы являются С-концевыми процессирующими пептидазами, физиологическая роль которых до конца не изучена. Пептидаза Tsp E.coli (tail-specific peptidase, т.е. пептидазы, специфичные к определённой концевой последовательности) (Нага et al., 1991; Silber et al., 1992) участвует в деградации неправильно транслированных белков, которые несут на С-конце специфичную последовательность ssrA (Jentsch, 1996; Keiler et al., 1996). Белок Tsp имеет на C-конце характерный домен PDZ, необходимый для узнавания субстрата (Ponting, 1997; Beebe et al., 2000).

В геноме Synechocystis выявлены три гена (Kaneko et al., 1996), ctp A, ctpB и ctpC, которые кодируют гомологи пептидазы Tsp (Fulda et al., 2000; Zak et al., 2001). Пептидаза CtpA интегрирована в цитоплазматическую мембрану (Zak et al., 2001), тогда как CtpB и CtpC находятся в периплазме клетки (Fulda et al., 2000). В активном центре CtpA обнаружена диада Ser/Lys, а не триада Ser/His/Lys(Asp), свойственная сериновым пептидазам. Пептидаза CtpA имеет строгую специфичность узнавания сайта расщепления на С-конце белка-мишени. Такими сайтами являются сочетания А1а-Х-А1а или Ala-X-Ser (Yamamoto et al., 2001; Zak et al., 2001). Установлено, что инактивация гена ctpA у Synechocystis приводит к утрате способности клеток расти фотоавтотрофно (Shestakov et al., 1994). В дальнейшем было установлено, что пептидаза CtpA принимает участие в биогенезе

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_19

фотосинтетического аппарата: она осуществляет С-концевой процессинг белка D1 (Anbudurai et al, 1994), важнейшего компонента ФСП, что является необходимым этапом для правильной интеграции белка D1 в тилакоидную мембрану (Diner et al, 1988). Идентифицировать функции генов ctpB и ctpC с помощью инсерционного мутагенеза не удалось. Инактивация гена ctpC была летальной, что свидетельствует о его жизненноважной функции, а инактивация гена ctpB не приводила к видимым фенотипическим изменениям (Ivleva et al., 2002).

Геном A.thaliana кодирует три гена ctp. Протеомный анализ люменальной фракции тилакоидов показал, что все три пептидазы Ctp находятся в тилакоидном люмене (Schubert et al., 2002). Пептидаза ClpA у шпината также является люминальным белком (Inagaki et al, 1996; Oelmüller et al., 1996).

3.2.3. Семейство пептидаз SppA

SppA-белки также относятся к группе процессирующих пептидаз. Пептидазы SppA (signal peptide peptidase, т.е. сигнальные пептид пептидазы) являются сериновыми эндопептидазами, чья протеолитическая активность не требует затраты АТФ. Это семейство широко распространено среди вирусов, бактерий и растений, однако отсутствует у гетеротрофных эукариот. Число членов семейства SppA варьирует от 1 до 5 гомологов у разных организмов, которые отличаются как по молекулярной массе, так и по доменной организации. Пептидазы SppA были четвёртым и пятым ферментами, выделенными из цитоплазматической мембраны E.coli (Rehnier, 1981; Pacaud, 1982) и поэтому, изначально, имели названия -пептидаза IV (в дальнейшем, SppA; Ichihara et al., 1986) и пептидаза V (SohB; Baird et al., 1991), соответственно. У разных организмов гомологи SppA E.coli имеют разные названия: у B.subtilis - SppA и ТерА (Bolhuis et al., 1999), у Synechocystis -SppAl и SppA2 (Lensch et al, 2001).

Ген sppA был идентифицирован в результате анализа продуктов рестрикции ДНК, выделенных из клонов E.coli, у которых наблюдали суперпродукцию пептидазы IV (Ichihara et al, 1986). Ген sohB E.coli был идентифицирован как

мультикопийный супрессор условно-летального фенотипа (неспособность расти при повышенной температуре, 42°С) у мутанта с инактивацией гена htrA, кодирующего одноименную пептидазу (Baird, Georgopoulos, 1990). Было предположено, что температурочувствительность HtrA" мутанта (Lipinska et al., 1990) может быть связана с накоплением токсичных полипептидов. Введение в клетки мутанта мультикопийной плазмиды с геном sohB приводило к восстановлению температуроустойчивости мутанта, очевидно, в результате суперпродукции пептидазы SohB, которая деградирует эти полипептиды (Baird et al., 1991).

За исключением цитоплазматической пептидазы ТерА B.subtilis (Bolhuis et al., 1999), описанные пептидазы семейства SppA являются мембранными или ассоциированными с мембраной белками, о чём свидетельствует присутствие в их белковой последовательности одного и более гидрофобных участков. У нефотосинтетических бактерий они вовлечены в процессинг небольших (10-30 а.о.) полипептидов при переносе белков через мембрану (Ichihara et al., 1986; Novak, Dev, 1988; Bolhuis et al., 1999). У фотосинтетических организмов функция sppA-генов остаётся неизвестной. В геноме Synechocystis обнаружены гены sppAl и sppA2, кодирующие пептидазы этого семейства (Kaneko et al., 1998). У A.thaliana обнаружен только один ген sppA, гомологичный гену sppAl Synechocystis (Lensch et al., 2001). Показано, что этот ген у A.thaliana является светоиндуцируемым как на транскрипционном, так и трансляционном уровнях. Пептидаза SppA A.thaliana связана с тилакоидной мембраной (Lensch et al., 2001).

1.4. Роль пептидаз в клетке

На примере модельных организмов показана ключевая роль пептидаз на всех этапах пути реализации генетической информации:

а) Пептидазы участвуют в регуляции генной экспрессии через прямое или опосредованное взаимодействие с транскрипционными а - факторами. Например, в клетках E.coli пептидаза FtsH отвечает за специфичную деградацию

транскрипционного фактора ст32 (RpoH; Herman et al, 1995; Tomoyasu et al., 1993) и транскрипционную активацию белка CII (Herman et al., 1993). Пептидазы Clp (ClpAP и ClpXP) вовлечены в деградацию транскрипционных факторов RpoS и АО (Gottesman et al., 1993; Becker et al., 1999; Hengge-Aronis, 2002). У дрожжей несколько пептидаз, включая гомологи пептидазы Lon E.coli, связываясь с митохондриальными промоторами, участвуют в регуляции транскрипции или репликации ДНК (Fu et al., 1997; van Dyck et al., 1998).

б) Пептидазы участвуют в удалении неправильно транслированных или повреждённых полипептидов, синтезированных с дефектных РНК (Goldberg, Dice, 1974; Keiler et al., 1996), а так же белков, которые в результате ошибочных посттрансляционных изменений, потеряли свою нативную функциональную конформацию (Callis, 1995; Grune et al., 1995; Bohley, 1996; Missiakas, Raina, 1997).

Физиологические стрессы, например, увеличение температуры или интенсивности света, приводят к денатурации белков. В этих условиях индуцируется экспрессия генов, кодирующих белки теплового шока, чтобы предотвратить повреждение органелл или клеток (Chuang, Blattner, 1993; Itzhaki et al., 1998; Clausen et al., 2002). Некоторые белки теплового шока являются молекулярными шаперонами и могут стабилизировать неправильно свёрнутые белки, препятствуя их агрегации, что обеспечивает эффективный рефолдинг их нативной структуры при нормальных условиях (Hartl, 1996; Schwartz et al, 1996). Если ренатурация белка не может быть достигнута с помощью шаперонов, то осуществляется деградация аберрантных белков с помощью протеолиза. В ряде случаев пептидазы обладают шаперонной и протеолитической активностями (Spiess et al, 1999).

в) Пептидазы участвуют в качественном контроле белков (Bradshaw et al, 1998). Например, они осуществляют посттрансляционную модификацию белков, в результате чего белки-предшественники процессируются в активную зрелую форму (Zou et al, 1997; Tang, Guest, 1999). Существуют два различных типа

процессинга белков: С- и N-концевой процессинг. С-концевая специфическая деградация белков впервые была обнаружена у некоторых цитоплазматических белков E.coli (Parsell et al., 1990; Keiler, Sauer, 1996; Gottesman et ah, 1998). У E.coli эндопептидаза Tsp (Silber et ah, 1992) отвечает за специфичное С-концевое расщепление ошибочно транслированных белков, содержащих на С-конце определённую последовательность ssrA (Нага et al., 1991; Silber et ah, 1992; Keiler et al., 1996; Keiler, Sauer, 1996). Её гомолог у фотосинтетических организмов пептидаза CtpA (кодируемая одноименным геном), вовлечен в С-концевой процессинг белка D1. Процессинг белка D1 является ключевым событием, необходимым для сборки марганцевого кластера, светозависимого окисления воды и стабилизации реакционного центра ФСП (von Heijne at al., 1989; Anbudurai et al., 1994; Inagaki et ah, 2001).

В N-концевую деградацию белков вовлечены две большие группы пептидаз, различающиеся по своим функциональным свойствам. Первая группа аминопептидаз участвует в отщеплении N-концевого метионина или формилметионина (Bradshaw et al., 1998; Giglione, Meinnel, 2001), необходимого для трансляции белка (Chang et al., 1989; Li, Chang, 1995) или его стабильности (Giglione et al., 2000). К этой группе так же относится белок ЕЗ, входящий в убиквитин-зависимую протеолитическую систему. Убиквитин присоединяется к N-концу неправильно свёрнутых полипептидов, или белков, содержащих окисленные или другие аномальные аминокислоты, для их последующей деградации (Callis, 1995; Bohley, 1996; Varshavsky, 1997 a,b). Ко второй группе относятся пептидазы, входящие в состав семейства процессирующих пептидаз, которые необходимы для транспорта белков через мембрану. В клетке значительная часть белков синтезируется в компартментах, отличных от места их функционального назначения. Такие белки содержат на N-конце особый сигнальный пептид, который узнаётся процессирующими пептидазами и удаляется в один или два этапа, в зависимости от места локализации белка (Hagemann et al., 1986; Oblong, Lamppa,

1992; Richter, Lamppa, 1998; 1999). Например, белки, предназначенные для хлоропластов и митохондрий, содержат транзитный пептид, узнаваемый пептидазами, чья функция связана с работой транспортных систем (Perlman, Halvorson, 1983; vonHeijne etal., 1989; Dalbey, 1991; Houben étal., 2002).

Протеолитическое расщепление повреждённых, ошибочно синтезированных белков и других аномальных белков ведёт к формированию пула свободных аминокислот, которые могут быть использованы для последующего синтеза полипептидов или в противном случае подвержены химическим изменениям в процессе обмена веществ.

5. Адаптация цианобактерий к изменяющимся условиям окружающей

среды

Оксигенный фотосинтез, свойственный растениям, водорослям и цианобактериям, является важным биологическим процессом, обеспечивающим преобразование и запасание солнечной энергии, а также синтез углеводов и выделение кислорода. Известно, что функционирование аппарата фотосинтеза приводит к повреждению составляющих его белков. Особенно этот процесс интенсифицируют различные стрессы. Любые повреждения вызванные стрессом активируют транскрипцию пептидазных генов, продукт которых важен для поддержания физиологических процессов в живых клетках. Клетки цианобактерий обладают набором пептидаз, относящихся к семействам пептидаз Clp (Eriksson, Clarke, 1996; Porankiewicz et al, 1998; Panichkin et al, 2001), Deg (Adam et al., 2001), FtsH (Mann et al, 2000; Bailey et al, 2001), Ctp (Shestakov., 1994; Ivleva et al, 2000), Gsp (Zuther et al, 1998) и SppA (Lensch et al, 2001).

У фотосинтетический организмов улавливание и преобразование световой энергии происходит с участием последовательно функционирующих светособирающих (ССК) и хлорофиллсодержащих комплексов - фотосистемы I и фотосистемы II - находящихся в мембране тилакоидов клетки, а так же цитохромового (b6/f) и АТФ-синтетазного комплексов (рис. 1; Bryant, 1994;

ОоМЬеск, 1994). Все структуры фотосинтетического аппарата, кроме светособирающего комплекса, высоко консервативны среди высших растений, водорослей и цианобактерий; за исключением некоторых различий (МеББег а/., 1994; КавЫпо е/ а1, 2001) их белковый состав примерно одинаков.

Фикобплпсомы

С'трома

_У' >¥> »

\

hv

Люмен

ФС:: ФС: НАДФ Цптохром 2>/ ФС1 Цптохром АТР

л»гилрог«наза комплекс оксиэаза сиктаза

Рис. 1. Структура фотосинтстических мембран тилакоидов у цианобактерий (Bryan, 1994).

Главным отличием цианобактерий от растений является отсутствие у цианобактерий хлорофилл-содержащих светособирающих комплексов. Роль ССК у цианобактерий выполняют фикобилисомы, в состав которых входят билин-содержащие пигменты (рис. 2; MacColl, 1998; Glazer, 1985). Энергия возбуждения от светособирающих пигментов передаётся на хлорофилл реакционного центра ФСН, которая участвует в фотоокислении воды с образованием кислорода и восстановлении пластохинонов (Bald et al., 1996). Комплекс ФС1 вместе со специальной энзиматической системой участвует в восстановлении НАДФ1 до НАДФН (Golbeck, 1994; Ben-Shem et al., 2003). Окисление воды, а также перенос электронов от ФСН к ФС1 приводит к появлению разности концентраций ионов Н+

по обе стороны тилакоидной мембраны, которая необходима для образования энергии АТФ (Rieh, Bendall, 1980; Allen, 2004), используемой в качестве источника энергии в биологических процессах (Pedersen, Amzel, 1993; Dimroth et al, 2000).

Необходимо отметить, что у высших растений и водорослей тилакоиды расположены в хлоропластах, особенностью которых является наличие собственных ДНК и рибосом (Alscher et al., 1978; Bedbrook, Kolodner, 1979). В процессе эволюции цианобактерия потеряла свою автономность, что сопровождалось латеральным переносом её генов в ядерный геном эукариота (Margulis, 1970; Herrmann, 1997; Martin, Herrmann, 1998; Martin et al, 1998). Вследствие этого сборка фотосистем и функционирование аппарата фотосинтеза в хлоропластах находятся под двойным генетическим контролем: часть белков кодируется ядерными генами, а часть - хлоропластными (Rochaix, 2001; Rodermel, 2001). Приблизительно половина белков, необходимых для построения четырёх основных комплексов электрон-транспортной цепи, кодируется в геноме хлоропластов и синтезируется в хлоропластах (Hess, Borner, 1999; Liere, Maliga, 1999), a половина кодируется в ядре, синтезируется в цитоплазме, и транспортируется в хлоропласт (Jarvis, Soll, 2002). Белки ССК кодируются только ядерными генами (Chitnis, Thornber, 1988), а ФС I представлена белками, которые кодируются как ядерными (8), так и хлоропластными psa (5) генами, большая часть белков АТФ-синтетазного комплекса кодируется хлоропластными atp генами (6) и только три белка кодируются ядерным геномом (Шестаков, 1998; Meurer et al., 1998; Krause et al., 2000). Мутации в генах, кодирующих белки аппарата фотосинтеза и обслуживающие его белки, могут снижать или полностью блокировать фотосинтез (Aroétal., 1993).

Для фотосинтетических организмов свет является не только источником энергии, необходимой для жизнедеятельности организма, но также регулятором внутренних процессов, влияющих, в первую очередь, на транскрипцию генов, кодирующих белки фотосистем, и белков, обслуживающих этот процесс, а также

на их трансляцию и пост-трансляционные изменения. Адаптация цианобактерий к свету высокой интенсивности может быть разделена на два процесса: кратковременная и долговременная адаптации (Anderson, 1986; Anderson et al, 1995).

Кратковременная адаптация происходит в течение нескольких минут и включает в себя механизм перераспределения избыточной энергии возбуждения между фотосистемами (state transition; Bonaventura, Myers, 1969; Murakami, Fujita, 1991; Niyogi, 1999; McConnel et al., 2002) и её нефотохимическое тепловое разложение (Campbell et al, 1998), а также изменения в экспрессии генов фотосинтетических белков (Muramatsu, Hihara, 2003). Важным отличием высших растений и водорослей от цианобактерий является высокое содержание в мембране цианобактерий комплексов ФС1 по отношению к ФСП. У высших растений число фотосистем I и II приблизительно одинаково и их соотношение равно единице (Blankenship, 1992). Однако у цианобактерий оно достигает 3 (Golbeck, 1994), причём это число может меняться в зависимости от параметров света при их культивировании (Fujita et al., 1994). У цианобактерий около 110-140 молекул хлорофилла связано с реакционным центром ФС1 (например, у Synechoccus elongatus 96 молекул хлорофилла локализовано в ФС1; Jordan et al., 2001) и только 35-70 молекул хлорофилла принадлежат ФСП. С увеличением световой интенсивности в первую очередь происходит изменение стехиометрии ФС1 и ФСП (Fujita et al., 1994, Murakami et al., 1997; McConnell et al, 2002), которое обеспечивает перераспределение возбуждающей энергии между фотосистемами и коррекции любого энергетического дисбаланса (Hihara et al, 1998).

Долговременная адаптация происходит более медленно и может продолжаться от нескольких часов до нескольких дней. Этот процесс ведёт к существенным изменениям в композиции, структуре и функционировании фотосинтетического аппарата (Fujita et al, 1994; Murakami et al, 1997; McConnell et al, 2002), что ведёт к снижению в эффективности передачи энергии от ССК к ФСП

(Hassidim et al., 1997), наблюдаются изменения в фиксации С02 (Murakami et al., 1997; Schmeterer, 1994). Так же индуцируется экспрессия белков, способных ослабить разрушительный эффект длительного стресса (Lindahl et al., Bailey et al., 2001; He et al., 2002; van Waasbergen et al., 2002; Kanervo et al., 2003).

В отличие от кратковременной адаптации изменения, происходящие в клетках цианобактерий из-за длительно действующего стресса, обусловлены работой генетического аппарата клетки. В условиях повышенной освещённости происходит быстрое снижение транскрипции генов psa, кодирующих субъединицы ФС1, вплоть до 10% от начального уровня в течение первого часа адаптации (Hihara et al., 2001; Muramatsu, Hihara, 2003). Согласованное снижение экспрессии генов ФС1 на транскрипционном, а также на трансляционном уровне ведёт к заметному уменьшению количества ФС1 при повышении освещённости. В этих условиях также происходит снижение экспрессии ртб-генов, кодирующих субъединицы ФСП, однако в этом случае не наблюдается скоординированного уменьшения количества самой ФСП. Это объясняется тем, что клетка справляется с репарацией повреждённого комплекса ФСП за счёт быстрого синтеза de novo белков реакционного центра, причём быстрее всех синтезируется белок D1 (Mattoo et al., 1984). В дальнейшем вновь синтезированные полипептиды участвуют в сборке неактивного гетеродимерного реакционного центра ФСП с другими полипептидами (Melis, 1991; Mohamed, Jansson, 1989; Komenda et al., 2000). Нужно отметить, что большая скорость ресинтеза D1 позволяет быстро восстанавливать индуцированные светом повреждения, которые при длительном стрессе могут привести к светозависимой инактивации ФСП и падению эффективности фотосинтеза (Andersson, 1997, Aro et al., 1993). В этот процесс вовлечены различные пептидазы и шапероны, включая пептидазы семейства FtsH и HtrA (или DegP) (Ostersetzer, Adam, 1997; Lindahl et al., 2000; Bailey et al., 2001; Silva et al., 2002). Анализ экспрессии генов пептидаз у Synechocystis, адаптированных к свету нормальной и высокой интенсивности, показал, что индукция генов ftsHl и ftsH2

происходит первые 15 мин после переноса клеток на высокий свет и затем снижается в течение следующих 15 часов (Hihara et al, 2001). Продукты генов ftsHl и ftsH2 выполняют жизненно важные функции у Synechocystis, так как не удалось получить мутантов с инактивацией этих генов. Позднее, оказалось, что белок FtsH2 контролирует обновление белка D1 реакционного центра ФСП в условиях светового стресса (Bailey et al., 2002; Silva et al., 2003).

Работы по изучению механизмов адаптации у Synechocystis к световому стрессу демонстрируют резкое снижение транскрипции генов chl, aps и срс, кодирующих хлорофилл и билин-содержащие белки, причём происходит это уже первые три часа стресса (Lorimier et al, 1991; Hihara et al, 2001). В то же время инициируется транскрипция генов hit hliA, -В, -С, -D и hemH (high light inducible, т.е. индуцируемые светом высокой интенсивности), которые кодируют гомологов растительных белков светового стресса (ELIP; Adamska et al., 1999; Funk, Vermaas, 1999; He et al, 2001). Интересно, что максимальную концентрацию Hli-белков наблюдали только в первые часы стресса (Не et al, 2001), во время которых клетки не делятся, пытаясь приспособиться к новым условиям жизнедеятельности. Вероятно, это связано с ключевой ролью этих белков именно на начальном этапе адаптации, участвуя, в рассеивании избыточной световой энергии, или в работе комплекса, обеспечивающего доставку хлорофилла к местам его деградации и (или) к пигмент-белковым комплексам биосинтеза (Не et al., 2001; Havaux et al, 2002). Нужно отметить, что транскрипция hli-генов возрастает также в условиях дефицита в среде азота и серы, и при низких температурах (van Waasbergen et al., 2002), что свидетельствует о комплексной роли Hli-белков у цианобактерий.

Синхронное уменьшение размера фикобилисом (Lorimier et al., 1991), а так же изменения в реакционном центре ФСП (Melis, 1991), в первую очередь, направлены на уменьшение потока энергии на фотосинтетические мембраны, возросшего из-за высокой интенсивности света. Ранние работы демонстрируют участие пептидаз в посттрансляционных изменениях фикобилисом (Yamanaka et

al., 1980). Фикобилисомы, находясь на поверхности тилакоидов, и, отвечая, за поглощение световой энергии и перенос её к реакционным центрам фотосистем, являются первой мишенью при изменениях окружающих условий. В условиях возрастания освещённости света у фикобилисом происходит удаление дисков фикоцианина боковых цилиндров и редукция числа боковых цилиндров, а в дальнейшем, при длительном воздействии сильным светом, происходит отделение всей структуры фикобилисом от тилакоидных мембран и их последующая деградация (рис. 2). Фикобилисомы являются пигмент-белковым водорастворимым комплексом (Glazer, 1985), состоящим из ядра, образованного тремя цилиндрами а- и (3-субъединиц аллофикоцианина, и боковых цилиндров, состоящих из дисков ос- и (3-субъединиц фикоцианина (рис. 2). Некоторые цианобактерии содержат также фикоэритрин на концевой части боковых цилиндров, однако он отсутствует у Synechocystis (Grossman et al., 2001). Все фикобилипротеины содержат хромофоры, сходные с хромофором растений, которые ассоциируются с фоторецептором фитохрома, играющего решающую роль в развитии и дифференцировки хлоропластов. Важной структурной частью фикобилисом являются непигментированные связующие полипептиды (линкерные полипептиды), отвечающие за формирование дисков боковых цилиндров и дисков, составляющих ядро, а так же за стабилизацию всей структуры фикобилисом и их связь с мембраной тилакоидов. Молекулярный вес линкерных полипептидов варьирует от 8 до 120 кДа. Полипептиды, находящиеся в боковых цилиндрах, обозначают - LR (rod - цилиндр), а расположенные в ядре - Lc (core - ядро). Полипептиды, участвующие в связи боковых цилиндров и ядра, обозначают - LRC. Полипептиды, связывающие ядро фикобилисом с мембраной тилакоидов, обозначают - LCM (core - ядро, membrane - мембрана). Белок LCM участвует в поддержании однонаправленного потока энергии внутри фикобилисом и от фикобилисом к молекулам хлорофилла реакционного центра ФСП (Kuhl et al., 1999), он так же физически связывает фикобилисомы с мембраной тилакоидов. LCM

имеет химерную структуру с неоднородной организацией доменов. Его С-концевая часть имеет три повторяющихся домена (REP1-3), которые обладают высокой гомологией к консервативной области линкерных полипептидов боковых цилиндров, и полипептидов, соединяющих боковые цилиндры с центральной частью фикобилисом. Эта гомология обеспечивает связывание доменов с трёхмерным ядром аллофикоцианина. Определение аминокислотной последовательности пептида размером 23 к Да, ассоциированного с комплексом APC (AP"APr), показало, что за этот процесс отвечает его С-концсвая часть (Gottschalk et al., 1994), содержащая домен REP-3.

Боковые Ядро L"CM цилиндры (core)

(rods)

Рис. 2. Структура фикобилисом при различной световой интенсивности. ЬСм - мембранный линкер фикобилисом. LKC - полипептиды, участвующие в связи боковых цилиндров и ядра. Lr - полипептиды, участвующие в связи боковых цилиндров и ядра. Боковые цилиндры состоят из блоков фикоцианина (PC), ядро состоит из блоков аллофикоцианина (АРС).

Кроме света, температура, концентрация питательных веществ, влажность и другие факторы окружающей среды, включая радиацию, патогены и токсичные химические агенты, также влияют на жизнедеятельность фототрофных организмов. Перенос цианобактерий на высокую температуру (60-65°С) даже на 10 мин приводит к потере фикобилисом клетками (Zhao, Brand, 1989; Nishiyama et al.,

1993), хлорофилла и каротиноидов. Наряду с фикобилисомами, наиболее чувствительной к изменениям температурного режима является ФСП (Berry, Björkman, 1980). Диссоциация двух из четырёх атомов Мп комплекса ФСП приводит к полному подавлению выделения кислорода без существенной потери белков реакционного центра. Этот механизм позволяет защитить ФСП от полной инактивации её функций вследствие теплового шока (Nash et al., 1985). Кроме того, увеличение уровня насыщенных жирных кислот в липидном слое мембран способствует усилению тепловой стабильности фотосинтеза (Shneyour et al., 1973). В дальнейшем, увеличение экспрессии дополнительных белков, например белков теплового шока Hsp, усиливает тепловую стабильность ФСП и защищает фикоцианин фикобилисом от индуцируемой тепловым стрессом деградации (Nakamoto et al., 2000). Белки теплового шока, белки-шапероны и пептидазы участвуют в рефолдинге или деградации полипептидов, повреждённых при нагревании. Наиболее хорошо изученными являются бактериальная пептидаза Htr и шаперон ClpB (Strauch et al., 1989; Lipinska et al., 1990; Spiess et al., 1999).

Одним из существенных требований для выживания клеток в естественной среде является их способность противостоять ограниченному содержанию или полному отсутствию питательных веществ. Недостаток микро- или макроэлементов, так же как и другие чрезвычайные состояния, сопровождается экспрессией специальных наборов стрессовых белков (Fulda et al., 2000; Suzuki et al., 1997; Hihara et al., 2001; Görl et al., 1998). Эти белки разделяются на две группы: специальные белки стресса, которые индуцируются только при определённых стрессах и общие белки стресса, которые экспрессируются при различных условиях. Они могут контролировать содержание внутриклеточных белков на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.

Нехватка минеральных ресурсов (азота, железа, фосфора, серы) приводит к уменьшению количества фикобилипротеинов в клетке, а также к деградации и даже полному исчезновению фикобилисом, и к утрате хлорофилла. Деградация

фикобилисом приводит к появлению свободных аминокислот, которые могут быть использованы для синтеза незаменимых белков в условиях голодания клетки. При минеральном голодании, несмотря на иногда полное исчезновение фикобилисом и уменьшение тилакоидных мембран, жизнеспособность клеток сохраняется, и при усилении минерального питания число фикобилисом и тилакоидов может быть восстановлено уже после нескольких клеточных делений.

При недостатке азота, серы или железа в среде в клетках дианобактерии наблюдается уменьшение числа тилакоидных мембран, по сравнению с клетками, выращенными на полной среде (Wanner et al., 1986). Дефицит азота и серы запускает в клетке каскад реакций, приводящих к быстрому и эффективному разрушению фикобилисом (Lau et al., 1977; Wanner et al., 1986). Белок NblA (none bleaching) способен специфически связываться с а-субъединицей фикоцианина фикобилисом, активируя тем самым специфичную пептидазу, участвующую в протеолизе фикобилисом (Collier, Grossman, 1994; Grossman et al., 2001).

В клетках, выращенных при недостатке фосфора, наблюдается лишь незначительное снижение количества фикобилинов (Grossman et al., 1993; Sauer et al., 2001), тогда как мнения о степени деградации хлорофилла при дефиците фосфора различаются. Некоторые исследования указывают на резкое снижение содержания хлорофилла, тогда как в других исследованиях этот эффект не наблюдался (Allen, Smith, 1969; Wanner et al., 1986; Collier, Grossman, 1992).

Так как железо входит в состав протогема - непосредственного предшественника фикобилинов в цепи их биосинтеза, то дефицит железа в среде в первую очередь приводит к потере фикобилисом (Brown et al., 1990). Одновременно с этим, происходит заполнение межклеточного пространства гранулами гликогена, деградация уже синтезированных фикобилисом и уменьшение размера тилакоидов, сопровождающееся потерей хлорофилла (Sherman, Sherman, 1983; Trick et al., 1995; Sandström et al., 2002). Кроме того, этот

процесс сопровождается активацией экспрессии генов isiA и isiB, продукт которых участвует в защите ФС1 (Pakrasi et al., 1985; Bibby et al., 2001).

Различные исследования демонстрируют роль пептидаз при изменении световой интенсивности (Adamska et al., 1996; Porankiewicz et al., 1998; Grossman et al., 2001; HauBuhl et al., 2001; Lensch et al., 2001), в течение теплового (Lippinska et al., 1990; Spiess et al., 1999; Diamant et al., 2001) и солевого (Gerth et al., 1998; Msadezk et al., 1998) стресса, при дефиците питательных веществ (Damerau, St John, 1993; Collier, Grossman, 1994; Katoh et al., 2001) или в результате отравления химическими реагентами (Andersson, Аго, 1997). Исследования в области геномики и протеомики стресса показали, что концентрация продуктов генов, участвующих в адаптивном ответе, включая неспецифические и специфические пептидазы, белки-шапероны, регуляторы избирательного протеолиза (протеасомы), способные снизить ущерб, вызванный стрессом, как правило, возрастает в первые минуты или даже секунды стресса (Hihara et al., 2001; Adamska, 1997; Mary et al., 2004). Несмотря на интенсивное изучение функциональной роли генов, активно транскрибирующихся при неблагоприятных условиях, знания о механизмах, позволяющих фотосинтетической клетке выживать во время стресса, до сих пор остаются фрагментированными.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактериальные штаммы и плазмиды

Штаммы и плазмиды, использованные в работе, представлены в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пожидаева, Елена Станиславовна, 2004 год

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Миллер Дж. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Москва «Мир» 440 с

Паничкин В.Б. (2000) Инсерционный мутагенез и функциональный анализ генов, предположительно кодирующих пептидазы у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов». М.: Изд-во МГУ, Выпуск 4:с. 55

Паничкин В.Б. (2001) Функциональный анализ генов, предположительно кодирующих пептидазы у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Автореф. канд. биол. наук: Изд-во МГУ, с. 24

Шестаков С.В. (1998) Молекулярная генетика фотосинтеза СОЖ, 9:22-27

Abdullah KM, Udoh ЕА, Shewen РЕ, Mellors А. (1992) A neutral glycoprotease of Pasteurella haemolytica A1 specifically cleaves O-sialoglycoproteins. Infect Immun. 60(l):56-62

Adam Z (2000) Chloroplast proteases: possible regulators of gene expression? Biochimie 82:647-654

Adam Z, Adamska I, Nakabayashi K, Ostersetzer O, HauBuhl K, Manuell A, Zheng B, Vallon O, Rodermel SR, Shinozaki K, Clarke AK (2001) Chloroplast and mitochondrial peptidases in Arabidopsis. A proposed nomenclature. Plant Physiol 125:1912-1918

Adamska I, Lindahl M, Roobol-Boza M, Andersson В (1996) Degradation of the light-stress protein is mediated by an ATP-independent, serine-type protease under low-light conditions. Eur J Biochem 236:591 599

Adamska I, Roobol-Boza M, Lindahl M, Andersson В (1999) Isolation of pigment-binding early light-inducible proteins from pea. Eur J Biochem 260:453-460

Ades SE, Connolly LE, Alba BM, Gross С A (1999) The Escherichia coli sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response is controlled by the regulated proteolysis of an anti-sigma factor. Genes Dev 13:2449-2461

Akiyama Y, Ito К (2000) Roles of multimerization and membrane association in the proteolytic functions of FtsH (HflB). EMBO J 19:3888-3895

Alba BM, Zhong HJ, Pelayo JC, Gross CA (2001) DegS (hhoB) is an essential Escherichia coli gene whose indispensable function is to provide sigma activity. Mol Microbiol 40:1323-1233

Allen J (2004) Cytochrome b6f. structure for signalling and vectorial metabolism. TRENDS in Plant Scie 3:131-137

Allen MM, Smith A J (1969) Nitrogen chlorosis in blue-green algae. Arch Mikrobiol 69:114-120

Alscher R, Patterson R, Jagendorf AT. (1978) Activity of Thylakoid-bound Ribosomes in Pea Chloroplasts. Plant Physiol. 62(l):88-93

Anbudurai PR, Mor TS, Ohad I, Shestakov SV, Pakrasi HB (1994) The ctpA gene encodes the C-terminal processing protease for the D1 protein of the photosystem II reaction center complex. Proc Natl Acad Sci USA 91:8082-8086

Anderson B, Aro EM (1997) Proteolytic activities and protease of plant chloroplasts. Phys Plantarium 100:783-793

Arnon, DI, McSwain BD, Tsujimoto HY, Wad K (1974) Photochemical activity and components of membrane preparations from bluegreen algae. I. Coexistence of two photosystems in relation to chlorophyll a and removal of phycocyanin. Biochim Biophys Acta 357:231.245

Bailey S, Silva P, Nixon P, Mullineaux C, Robinson C, Mann N (2001) Auxiliary functions in photosynthesis: the role of the FtsH peptidase. Biochem Soc Trans 29:455-459

Bailey S, Thompson E, Nixon PJ, Horton P, Mullineaux CW, Robinson C, Mann NH

(2002) A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J Biol Chem 277:2006-2011

Baird L, Georgopoulos C. (1990) Identification, cloning, and characterization of the Escherichia coli sohA gene, a suppressor of the htrA (degP) null phenotype. J Bacteriol. 172(3):1587-94

Baird L, Lipinska B, Raina S, Georgopoulos C (1991) Identification of the Escherichia coli sohB gene, a multicopy suppressor of the HtrA (DegP) null phenotype. J Bacteriol 173:5763-5770

Barret AJ (1994) Proteolytic enzymes: serines and cysteine peptidase. Methods Enzymol Academic Press Inc. San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo and Toronto 244:765

Barret A J (1995) Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidase. Methods Enzymol Academic Press Inc. San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo and Toronto 248: 765

Bartling D, Weiler EW (1992) Leucine aminopeptidase from Arabidopsis thaliana. Molecular evidence for a phylogenetically conserved enzyme of protein turnover in higher plants. Eur J Biochem 205:425-431

Bass S, Gu Q, Christen A (1996) Multicopy suppressors of pre mutant Escherichia coli include two HtrA (DegP) peptidase homologues (HhoAB), DksA, and a truncated RlpA. J Bacteriol 178:1154-1161

Becker G, Klauck E, Hengge-Aronis R (1999) Regulation of RpoS proteolysis in Escherichia coli: the response regulator RssB is a recognition factor that interacts with the turnover element in RpoS. Proc Natl Acad Sei USA 96:6439-6444

Bedbrook, J. K., Kolodner, R. (1979) The structure of chloroplast DNA. A. Rev. PI. Physiol. 30: 598-620

Beebe KD, Shin J, Peng J, Chaudhury C, Khera J, Pei D (2000) Substrate recognition through a PDZ domain in tail-specific peptidase. Biochem 39:3149-3155

Ben-Shem A, Frolow F, Nelson N (2003) Crystal structure of plant photosystem I. Nature 426:630-635

Berry J, Bjorkman O (1980) Photo synthetic response and adaptation to temperature in higher plants. Annu Rev Plant Physiol 31: 491-543

Bibby TS, Nield J, Barber J (2001) Iron deficiency induces the formation of an antenna ring around trimeric photosystem I in cyanobacteria. Nature 412:743-745

Bohley P (1996) Surface Hydrophobicity and intercellular degradation of proteins. J Biol Chem 377:425-435

Bolhuis A, Matzen A, Hyyrylainen HL, Kontinen VP, Meima R, Chapuis J, Venema G, Bron S, Freudl R, Dijl JM van (1999) Signal peptide peptidase- and ClpP-like proteins of Bacillus subtilis required for efficient translocation and processing of secretory proteins. J Biol Chem 274:24585-24592

Bonaventura C, Myers J. (1969) Fluorescence and oxygen evolution from Chlorella pyrenoidosa. Biochim Biophys Acta. 189(3):366-83.

Bond U, Agell N, Haas AL, Redman K, Schlesinger MJ (1988) Ubiquitin in stressed chicken embryo fibroblasts. J Biol Chem 263:2384-2388

Bradshaw RA, Brickey WW, Walker KW (1998) N-terminal processing: the methionine aminopeptidase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem Sci 23:263-267

Brown SB, Houghton JD, Vernon DI. (1990) Biosynthesis of phycobilins. Formation of the chromophore of phytochrome, phycocyanin and phycoerythrin J Photochem Photobiol B. 5(l):3-23

Brown MS, Ye J, Rawson RB, Goldstein JL (2000) Regulated intermembrane proteolysis: a control mechanism conserved from bacteria to humans. Cell 100:391-398

Brown EC, Somanchi A, Mayfleld SP (2001) Interorganellar crosstalk: new perspectives on signaling from the chloroplast to the nucleus. Genome Biol 2:10211-10214

Burgess RJ, Walker JH, Mayer RJ (1978) Choice of precursors for the measurement of protein turnover by the double-isotope method. Application to the study of mitochondrial proteins. Biochem J176:919-926

Chaal BK, Mould RM, Barbrook AC, Gray JC, Howe CJ (1998) Characterization of a eDNA encoding the thylakoidal processing peptidase from Arabidopsis thaliana. Implications for the origin and catalytic mechanism of the enzyme. J Biol Chem 273:689692

Chang SY, McGary EC, Chang S (1989) Methionine aminopeptidase gene of Escherichia coli is essential for cell growth. J Bacteriol 171:4071-4072

Chen M, Choi Y, Voytas DF, Rodermel S (2000) Mutations in the Arabidopsis VAR2 locus cause leaf variegation due to the loss of a chloroplast FtsH peptidase. Plant J 22:303313

Ciechanover A, Elias S, Heller H, Ferber S, Hershko A (1980) Characterization of the heat-stable polypeptide of the ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. J Biol Chem 255:7525-7528

Ciechanover A (1998) The ubiquitin.proteasome pathway: on protein death and cell life. EMBO J 17:7151.7160

Ciechanover A, Schwarz A (1998) The ubiquitin-proteasome pathway: The complexity and myriad functions of proteins death Proc Natl Acad Sci USA 95:2727-2730

Chiang HL, Dice JF (1988) Peptide sequences that target proteins for enhanced degradation during serum withdrawal. J Biol Chem 263:6797-805

Chitnis VP, Chitnis PR (1993) PsaL subunit is required for the formation of photosystem I trimers in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEBS Lett 336:330-334

Chuang SE, Blattner FR (1993) Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. JBacteriol 175:5242-52

Chuang SE, Burland V, Plunkett G 3rd, Daniels DL, Blattner FR. (1993) Sequence analysis of four new heat-shock genes constituting the hslTS/ibpAB and hslVU opérons in Escherichia coli. Gene. 134(1): 1-6.

Clarke AK, Gustafsson P, Lidholm JA. (1994) Identification and expression of the chloroplast clpP gene in the conifer Pinus contorta. Plant Mol Biol. 26(3):851-62

Clarke AK (1996) Variations on a theme: combined molecular chaperone and proteolysis functions in Clp/HSP100 proteins. J. Biosci. 21:161-177

Clarke AK (1999) ATP-depending Clp proteases in photosynthetic organism - a cut above the rest. Ann Bot 83:593-599

Clarke AK, Schelin J, Porankiewicz J (1998) Inactivation of the clpPl gene for the proteolytic subunit of the ATP-dependent Clp peptidase in the cyanobacterium Synechococcus limits growth and light acclimation. Plant Mol Biol 37:791-801

Clarke AK, Eriksson MJ (2000) The truncated form of the bacterial heat shock protein ClpB/HSPlOO contributes to development of thermotolerance in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. J Bacteriol 182:7092-7096

Clausen T, Southan C, Ehrmann M (2002) The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell 10:443-455

Collier JL, Grossman AR (1992) Chlorosis induced by nutrient deprivation in Synechococcus sp. strain PCC 7942: not all bleaching is the same. J Bacteriol 174:47184726

Collier JL, Grossman AR. (1994) A small polypeptide triggers complete degradation of light-harvesting phycobiliproteins in nutrient-deprived cyanobacteria. EMBO J 13(5): 1039-47

Cvetanovic S (2003) Funktion von Proteasen bezüglich Adaptation und posttranslationaler modifikation. Diploma thesis, LMU, Munich, Germany

Dalbey RE (1991) Leader peptidase. Mol Microbiol 5:2855-2860

Damerau K, St John AC (1993) Role of Clp peptidase subunits in degradation of carbon starvation proteins in Escherichia coli. J Bacteriol 175:53-63

De Mot R, Nagy I, Walz J, Baumeister W (1999) Proteasomes and other self-compartmentalizing proteases in prokaryotes. Trends Microbiol 7:88-92

Desimone M, Kruger M, Wessel T, Wehofsky M, Hoffmann R, Wagner E (2000) Purification and characterization of an aminopeptidase from the chloroplast stroma of barley leaves by chromatographic and electrophoretic methods. J Chromatogr Biomed Sei Appl 737:285-293

Diamant S, Eliahu N, Rosenthal D, Goloubinoff P (2001) Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. J Biol Chem 276:39586-39591 Dice JF (1992) Selective degradation of cytosolic proteins by lysosomes. Ann NY Acad Sei 674:58-64

Dimroth P, Kaim G, Matthey U (2000) Crucial role of the membrane potential for ATP synthesis by FIFO ATP synthases. J Exp Biol 1:51-59

Diner BA, Ries DF, Cohen BN, Metz JG (1988) COOH-terminal processing of polypeptide D1 of the photosystem II reaction center of Scenedesmus obliquus is necessary for the assembly of the oxygen-evolving complex. J Biol Chem 263:8972-8980

Dougan D.A., Mogk A, Zeth K, Turgay K., Bukau B. (2002a) AAA+ proteins and substrate recognition, it all depends on their partner in crime FEBS Lett. 529: 6-10 Dougan D.A., Reid BG, Horwich AL, Bukau B. (2002b) ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. Mol Cell 9: 673-683

Eriksson MJ, Clarke AK (1996) The heat shock protein ClpB mediates the development of thermotolerance in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. J Bacteriol 178:4839-4846

Flynn JM, Levchenko I, Seidel M, Wickner SH, Sauer RT, Baker TA (2001) Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. Proc Natl Acad Sei USA 98:10584-10589

Frasch WD (1994) The F-type ATPase in cyanobacteria: pivotal point in the evolution of a universal enzyme. In Book: The Molecular Biology of Cyanobacteria. Bryant DA. pp361-380

Frees D, Ingmer H (1999) ClpP participates in the degradation of misfolded protein in Lactococcus lactis. Mol Microbiol 31:79-87

Fu GK, Smith MJ, Markovitz DM (1997) Bacterial protease Lon is a site-specific DNA-binding protein. J Biol Chem 272:534-538

Fujita Y, Murakami A, Ohki K (1994) Short-term and long-term adaptation of the photosynthetis apparatus: homeostatic properties of thylakoids. In The Molecular Biology of Cyanobacteria. edited by Bryant DA: pp 677-692. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht

Fulda S, Huang F, Nilsson F, Hagemann M, Norling B (2000) Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803. Identification of periplasmic proteins in cells grown at low and high salt concentrations. Eur J Biochem 267:5900-5907

Funk C, Vermaas W (1999) A cyanobacterial gene family coding for single-helix proteins resembling part of the light-harvesting proteins from higher plants. Biochemistry 38:93979404

Gerth U, Kruger E, Derre I, Msadek T, Hecker M (1998) Stress induction of the Bacillus subtilis clpP gene encoding a homologue of the proteolytic component of the Clp peptidase and the involvement of ClpP and ClpX in stress tolerance. Mol Microbiol 28:787-802

Giglione C, Meinnel T (2001) Organellar peptide deformylases: universality of the N-terminal methionine cleavage mechanism. Trends Plant Sci 6:566-572

Giglione C, Serero A, Pierre M, Boisson B, Meinnel T (2000) Identification of eukaryotic peptide deformylases reveals universality of N-terminal protein processing mechanisms. EMBO J 19:5916-5929

Gill RE, Karlok M, Benton D (1993) Myxococcus xanthus encodes an ATP-dependent peptidase which is required for developmental gene transcription and intercellular signaling. J Bacteriol 175:4538-4544

Glazer AN (1985) Light harvesting by phycobilisomes. Annu Rev Biophys Biophys Chem 14:47-77

Glickman MH (2000) Getting in and out of the proteasome. Semin Cell Dev Biol 11:149158

Golbeck JH (1994) Photosystem I in cyanobacteria. In Book The Molecular Biology of Cyanobacteria. Edited by Bryant DA. pp 319-360

Goldberg AL, Dice JF (1974) Intracellular protein degradation in mammalian and bacterial cells. Annu Rev Biochem 43:835-869

Gottesman S, Maurizi MR. (1992) Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol Rev. 56(4):592-621

Gottesman S, Clark WP, de Crecy-Lagard V, Maurizi MR. (1993) ClpX, an alternative subunit for the ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Sequence and in vivo activities. J Biol Chem. 268(30):22618-26

Gottesman S, Maurizi MR, Wickner S (1997a) Regulatoiy subunits of energy-dependent peptidases. Cell 91:435-438

Gottesman S, Wickner S, Maurizi MR (1997b) Protein quality control: triage by chaperones and peptidases. Genes Dev 11:815-823

Gottesman S, Roche E, Zhou Y, Sauer RT. (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev. 12(9): 1338-47

Gottesman S. (1999) Regulation by proteolysis: developmental switches. Curr Opin Microbiol. 2(2): 142-7

Gottesman S. (2003) Proteolysis in bacterial regulatory circuits. Annu Rev Cell Dev Biol. 19:565-87.

Gottschalk L, Lottspeich F, Scheer H. (1994) Reconstitution of an allophycocyanin trimer complex containing the C-terminal 21-23 kDa domain of the core-membrane linker polypeptide Lcm. Z Naturforsch [C]. 49(5-6):331-6

Gray MW, Burger G, Lang BF (2001) The origin and early evolution of mitochondria. Genome Biol 2:10181-10185

Grigorieva GA, Shestakov SV (1982) Transformation in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiol Lett 13:367-370

Groth G, Pohl E. (2001) The structure of the chloroplast Fl-ATPase at 3.2 A resolution. J Biol Chem. 276(2): 1345-52

Grossman AR, Schaefer MR, Chiang GG, Collier JL (1993) The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiol Rev 57:725-749

Grossman AR, Bhaya D, He Q (2001) Tracking the light environment by cyanobacteria and the dynamic nature of light harvesting. J Biol Chem 276:11449-11452

Gruís DF, Selinger DA, Curran JM, Jung R (2002) Redundant proteolytic mechanisms process seed storage proteins in the absence of seed-type members of the vacuolar processing enzyme family of cysteine proteases. Plant Cell 14:2863-2868

Gruñe T, Reinheckel T, Joshi M, Davies KJA (1995) Proteolysis in cultured liver epithelial cells during oxidative stress. J Biol Chem 270:2344-2351

Gu YQ, Walling LL (2000) Specificity of the wound-induced leucine aminopeptidase (LAP-A) of tomato activity on dipeptide and tripeptide substrates. Eur J Biochem 267:11781187

Guikema JA, Sherman LA (1983) Chlorophyll-protein organization of membranes from the cyanobacterium Anacystis nidulans. Arch Biochem Biophys 220:155-166

Guo, F., Maurizi, M.R., Esser, L., ia, D. (2002) Crystal structure of ClpA, an HsplOO chaperone and regulator of ClpAP protease. J. Biol. Chem. 277, 46743-46752

Hageman M, Robinson C, Smeekens S, Weisbeek P (1986) Thylakoid processing peptidase is required for complete maturation of the lumen protein plastocyanin. Nature 324:567-569

Halperin T, Ostersetzer O, Adam Z (2001a) ATP-dependent association between subunits of Clp protease in pea chloroplasts. Planta 213:614-619

Halperin T, Zheng B, Itzhaki H, Clarke AK, Adam Z (2001b) Plant mitochondria contain proteolytic and regulatory subunits of the ATP-dependent Clp protease. Plant Mol Biol 45:461-468

Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y (1991) Cloning, mapping, and characterization of the Escherichia coli pre gene, which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3. J Bacteriol 173:4799-4813

Hartl FU (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381:571-579

HauBühl K, Andersson B, Adamska I (2001) A chloroplast DegP2 peptidase performs the primary cleavage of the photodamaged D1 protein in plant photosystem II. EMBO J 20:713722

Havaux M, Guedeney G, He Q, Grossman AR (2003) Elimination of high-light-inducible polypeptides related to eukaryotic chlorophyll a/b-binding proteins results in aberrant photoacclimation in Synechocystis PCC6803. Biochim Biophys Acta 1557:21-33

He Q, Dolganov N, Bjorkman O, Grossman AR (2001) The high light-inducible polypeptides in Synechocystis PCC6803. Expression and function in high light. J Biol Chem 276:306-314

Hengge-Aronis R (2002) Stationary phase gene regulation: what makes an Escherichia coli promoter sigmaS-selective?

Heinemeyer W, Simeon A, Hirsch HH, Schiffer HH, Teichert U, Wolf DH (1991) Lysosomal and non-lysosomal proteolysis in the eukaryotic cell: studies on yeast. Biochem Soc Trans 19:724-725

Herbers K, Prat S, Willmitzer L (1994) Functional analysis of a leucine aminopeptidase from Solanum tuberosum. Planta 194:230-240

Herman C, Thevenet D, D'Ari R, Bouloc P (1995) Degradation of sigma 32, the heat stress regulator in Escherichia coli, is governed by HflB. Proc Natl Acad Sei USA 92:35163520

Herman C, Ogura T, Tomoyasu T, Hiraga S, Akiyama Y, Ito K, Thomas R, D'Ari R, Bouloc P (1993) Cell growth and lambda phage development controlled by the same essential Escherichia coli gene, ftsH/hflB. Proc Natl Acad Sei USA 90:10861-10865

Herrmann RG (1997) Eukaryotism, towards a new interpretation. In: Schenk HEA, Herrmann RG, Jeon KW, Müller NE, Schwemmler W (eds) Eukaryotism and symbiosis. Springer, Berlin Heidelberg New York:73-l 18

Herrmann RG, Westhoff P (2001) Thylakoid biogenesis and dynamics: the result of a complex phylogenetic puzzle. In: Aro E-M, Andersson B (eds) Regulation of photosynthesis. Kluwer, Rotterdam: 1-28

Hershko A, Heller H, Elias S, Ciechanover A (1983) Components of ubiquitin-protein ligase system. J Biol Chem 258:8206-8214

Hershko A (1988) Ubiquitin-mediated protein degradation J Biol Chem 263(30):15237-15240

Hershko A, Ciechanover A. (1998) The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67:425-479 Hicke L (2001) Protein regulation by monoubiquitin. Nat Rev Mol Cell Biol 2:195-201

Hihara Y, Sonoike K, Ikeuchi M (1998) A novel gene, pmgA, specifically regulates photosystem stoichiometry in the cyanobacterium Synechocystis species PCC 6803 in response to high light. Plant Physiol 117:1205-1216

Hihara Y, Kamei A, Kanehisa M, Kaplan A, Ikeuchi M (2001) DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell 13:793-806

Hildmann T, Ebneth M, Pena-Cortes H, Sanchez-Serrano JJ, Willmitzer L, Prat S

(1992) General roles of abscisic and jasmonic acids in gene activation as a result of mechanical wounding. Plant Cell 4:1157-1170

Hortensteiner S, Fello U (2002) Nitrogen metabolism and remobilization during senescence. J Exp Bot 53:927-937

Horwich AL, Weber-Ban EU, Finley D. (1999) Chaperone rings in protein folding and degradation. Proc Natl Acad Sci USA. 96(20): 11033-40

Houben EN, Urbanus ML, Van Der Laan M, Ten Hagen-Jongman CM, Driessen AJ, Brunner J, Oudega B, Luirink J (2002) YidC and SecY mediate membrane insertion of a Type I transmembrane domain. J Biol Chem 277:35880-35886

Huang F, Parmryd I, Nilsson F, Persson AL, Pakrasi HB, Andersson B, Norling B

(2002) Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803: identification of plasma membrane proteins. Mol Cell Proteomics. 1:956-966

Huang F, Hedman E, Funk C, Kieselbach T, Schroder WP, Norling B (2004) Isolation of outer membrane of Synechocystis sp. PCC 6803 and its proteomic characterization. Mol Cell Proteomics 3:586-595

Huffaker RC (1990) Proteolytic activity during senescence of plants. New Phytol 116:199231

Houmard J, Capuano V, Colombano MV, Coursin T, Tandeau de Marsac N (1990) Molecular characterization of the terminal energy acceptor of cyanobacterial phycobilisomes. Proc Natl Acad Sci USA 87:2152-2156

Ichihara S, Suzuki T, Suzuki M, Mizushima S (1986) Molecular cloning and sequencing of the sppA gene and characterization of the encoded peptidase IV, a signal peptide peptidase, of Escherichia coli. J Biol Chem 261:9405-9411

Inagaki N, Yamamoto Y, Mori H, Sato K (1996) Carboxyl-terminal processing peptidase for the D1 precursor protein: cloning and sequencing of the spinach cDNA. Plant Mol Biol 30:39-50

Itzhaki H, Naveh L, Lindahl M, Cook M, Adam Z (1998) Identification and characterization of DegP, a serine protease associated with the luminal side of the thylakoid membrane. J Biol Chem 273:7094-7098

Ivleva NB, Shestakov SV, Pakrasi HB (2000) The carboxyl-terminal extension of the precursor D1 protein of photosystem II is required for optimal photosynthetic performance of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiol 124:1403-1412

Ivleva N, Sidoruk K, Pakrasi HB, Shestakov SV (2002) Study of functional roles of Ctp-family proteins in the cyanobacterium Synechocystis 6803. Microbiology 71: 509-513

Jabben M, Shanklin J, Vierstra RD (1998) Ubiquitin-phytochrome conjugates. Pool dynamics during in vivo phytochrome degradation. J Biol Chem 264:4998-5005

Jbanko M, Zinchenko V, Shestakov SV, Klosgen RB (2000) The effect of a leader peptidase knock-out mutation in Synechocystis PCC 6803. In: Abstr 10th Int Symp Phototrophic Prokaryotes. Barcelona: 174

Jenal U, Fuchs T (1998) An essential peptidase involved in bacterial cell-cycle control. EMBO J 17:5658-5669

Jentsch S (1996) When proteins receive deadly messages at birth. Science 271:955-956

Kaneko T, Sato S, Kotani H., Tanaka A, Asamizu E, Nakamura Y, Miyajima N, Hirosawa M, Sugiura M, Sasamoto S, Kimura T, Hosouchi T, Matsuno A, Muraki A, Nakazaki N, Naruo K, Okumura S, Shimpo S, Takeuchi C, Wada T, Watanabe A, Yamada M, Yasuda M, Tabata S (1996) Sequence analysis of the genome of the unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Res 3:109136

Kanervo E, Spetea C, Nishiyama Y, Murata N, Andersson B, Aro EM (2003) A cyanobacterial proteolytic system: efficiency in inducing degradation of the D1 protein of photosystem II in cyanobacteria and plants. Biochim Biophys Acta 1607:131-140

Karata K, Inagawa T, Wilkinson A J, Tatsuta T, Ogura T (1999) Dissecting the role of a conserved motif (the second region of homologue) in the AAA family of ATPases. Site-directed mutagenesis of the ATP-dependent peptidase FtsH. J Biol Chem 274:26225-26232

Kashino Y, Lauber WM, Carroll JA, Wang Q, Whitmarsh J, Satoh K, Pakrasi HB

(2001) Proteomic analysis of a highly active photosystem II preparation from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 reveals the presence of novel polypeptides. Biochemistry 41:8004-8012

Katoh H, Hagino N, Grossman AR, Ogawa T (2001) Genes essential to iron transport in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacterid 183:2779-2784 Kehoe DM, Grossman AR (1996) Similarity of a chromatic adaptation sensor to phytochrome and ethylene receptors. Science 273:1409-1412

Katayama-Fujimura Y, Gottesman S, Maurizi MR. (1987) A multiple-component, ATP-dependent protease from Escherichia coli. J Biol Chem. 262(10):4477-85

Keiler KC, Sauer RT (1996) Sequence determinants of C-terminal substrate recognition by the Tsp peptidase. J Biol Chem 271:2589-2593

Keiler KC, Waller PR, Sauer RT (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science 271:990-993

Kenny AJ (1999) Nomenclature and Classes of Peptidases. In Boot. Proteolytic. Enzymes. Tools and Targest. Edited by Sterchi EE,Stocker W. pp 1-8

Kieselbach T, Funk CD (2003) The family of Deg/HtrA proteases: from Escherichia coli to Arabidopsis Physiologia Plantarum 119(3):337-346

Kinoshita T, Nishimura M, Hara-Nishimura I (1995) The sequence and expression of the gamma-VPE gene, one member of a family of three genes for vacuolar processing enzymes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 36:1555-1562

Kim KI, Park SC, Kang SH, Cheong GW, Chung CH (1999) Selective degradation of unfolded proteins by the self- compartmentalizing HtrA peptidase, a periplasmic heat stress protein in Escherichia coli. J Mol Biol 294:1363-1374

Kirschner M. (1999) Intracellular proteolysis. Trends Cell Biol. 9(12):M42-5.

Klausner RD, Sitia R (1990) Protein degradation in the endoplasmic reticulum. Cell 1990 62:611-614

Knop M, Schiffer HH, Rupp S, Wolf DH. (1993) Vacuolar/lysosomal proteolysis: proteases, substrates, mechanisms Curr Opin Cell Biol. 5(6):990-6

Komenda J, Hassan HA, Diner BA, Debus RJ, Barber J, Nixon PJ (2000) Degradation of the Photosystem II D1 and D2 proteins in different strains of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 varying with respect to the type and level of psbA transcript. Plant Mol Biol 42:635-645

Kopito RR (1997) ER quality control: the cytoplasmic connection. Cell 88:427-430

Kopito RR, Sitia R (2000) Aggresomes and Russell bodies. EMBO Rep 1:225-231

Koussevitzky S, Neeman E, Sommer A, Steffens AS, Stefens JC, Harel E (1998) Purification and properties of a novel chloroplast stromal peptidase. J Biol Chem 273:2706427069

Krause K, Maier RM, Kofer W, Krupinska K, Herrmann RG. (2000) Disruption of plastid-encoded RNA polymerase genes in tobacco: expression of only a distinct set of genes Is not based on selective transcription of the plastid chromosome. Mol Gen Genet. 263(6): 1022-30.

Kroh HE, Simon LD (1990) The ClpP component of Clp protease is the sigma 32-dependent heat shock protein F21.5. J Bacteriol. 172(10):6026-34

Krojer T, Garrido-Franco M, Huber R, Ehrmann M, Clausen T. (2002). Crystal structure of DegP (HtrA) reveals a new protease-chaperone machine .Nature, 416: 455-459.

Kriiger E, Witt E, Ohlmeier S, Hanschke S, Hecker M (2000) The Clp peptidases of Bacillus subtilis are directly involved in degradation of misfolded proteins. J Bacteriol 182:3259-3265

Krzywda, S., Brzozowski, A.M., Verma, C., Karata, K., Ogura, T. & Wilkinson, A.J.

(2002) The crystal structure of the AAA domain of the ATP-dependent protease FtsH of Escherichia coli at 1.5 A resolution. Structure (Camb) 10:1073-1083

Kuhl H, Rogner M, Van Breemen JF, Boekema EJ (1999) Localization of cyanobacterial photosystem II donor-side subunits by electron microscopy and the supramolecular organization ofphotosystem II in the thylakoid membrane. Eur J Biochem 266:453-459.

Kumar S, Vaux DL (2002) Apoptosis. A Cinderella caspase takes center stage. Science 297:1290-1291

Kyte J, Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 157:105-132

Laing WA, Christeller JT. (1997) A Plant Chloroplast Glutamyl Proteinase.Plant Physiol. 114(2):715-722

Langer T (2000) AAA proteases: cellular machines for degrading membrane proteins. Trends Biochem Sci 25:247-251

LaPointe CF, Taylor RK (2000) The type 4 prepilin peptidases comprise a novel family of aspartic acid peptidases. J Biol Chem 275:1502-1510

Lau RH, MacKenzie MM, Doolittle WF (1977) Phycocyanin synthesis and degradation in the blue-green bacterium Anacystis nidulans. J Bacteriol 132:771-778

Lee RJ, Liu CW, Harty C, McCracken AA, Latterich M, Romisch K, DeMartino GN, Thomas PJ, Brodsky JL (2004) Uncoupling retro-translocation and degradation in the ER-associated degradation of a soluble protein. EMBO J 23: 2206-2215

Lensch M (2002) Identifizierung und Charakterisierung von Proteasen der Photosynthesemembrane. PhD thesis, LMU, Munich, Germany

Lensch M, Herrmann RG, Sokolenko A (2001) Identification and characterization of SppA, a novel light-inducible chloroplast peptidase complex associated with thylakoid membranes. J Biol Chem 276:33645-33651

Lewis AP, Thomas PJ (1999) A novel clan of zinc metallo-peptidases with possible intramembrane cleavage properties. Protein Sei 8:439-442

Li HH, Merchant S (1995) Degradation of plastocyanin in copper-deficient Chlamydomonas reinhardtii. Evidence for a peptidase-susceptible conformation of the apoprotein and regulated proteolysis. J Biol Chem 270:23504-23510

Li X, Chang YH (1995) Amino-terminal protein processing in Saccharomyces cerevisiae is an essential function that requires two distinct methionine aminopeptidases. Proc Natl Acad Sei USA 92:12357-12361

Lichtenthaler HR (1987) Chlorophyll and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymology. 148:350-382

Liere K, Maliga P. (1999) In vitro characterization of the tobacco rpoB promoter reveals a core sequence motif conserved between phage-type plastid and plant mitochondrial promoters. EMBO J. 18(l):249-57.

Lindahl M, Tabak S, Cseke L, Pichersky E, Andersson B, Adam Z (1996) Identification, characterization, and molecular cloning of a homologue of the bacterial FtsH peptidase in chloroplasts of higher plants. J Biol Chem 271:29329-29334

Lindahl M, Spetea C, Hundal T, Oppenheim AB, Adam Z, Andersson B (2000) The thylakoid FtsH peptidase plays a role in the light-induced turnover of the photosystem II D1 protein. Plant Cell 12:419-432

Lipinska B, Zylicz M, Georgopoulos C (1990) The HtrA (DegP) protein, essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an endopeptidase. J Bacteriol 172:17911797

Lorimier RM, Smith RL Jr, Stevens SE (1991) Regulation of phyeobilisomes structure and gene expression by light intensity. Plant Physiol 98:1003-1010

Lory S, Strom MS (1997) Structure-function relationship of type-IV prepilin peptidase of Pseudomonas aeruginosa - a review. Gene 192:117-121

Lupas, A.N., Martin, J. (2002) AAA proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 12:746-753.

MacColl R (1998) Cyanobacterial phyeobilisomes. J Struct Biol 24:311-334

Mann NH, Novae N, Mullineaux CW, Newman J, Bailey S, Robinson C (2000) Involvement of an FtsH homologue in the assembly of functional photosystem I in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEBS 479:72-77

Margulis, L. (1970) Origin of Eukaryotic Cells. Yale University Press, New Haven.

Markwell MA, Haas SM, Bieber LL, Tolbert NE (1978) A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal Biochem 87:206-210

Martin W, Stoebe B, Goremykin, Hansmann S, Hasegawa M, Kowallik KV (1998) Gene transfer to the nucleus and the evolution of chloroplasts. Nature 393:162-165

Martin W, Herrmann R (1998) Gene transfer from organelles to the nucleus: how much, what happens, and why? Plant Physiol 118:9-17

Matile P, Hortensteiner S, Thomas H, Krautler B (1996) Chlorophyll Breakdown in Senescent Leaves. Plant Physiol 112:1403-1409

Mary I, Tu CJ, Grossman A, Vaulot D. (2004) Effects of high light on transcripts of stress-associated genes for the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 and Prochlorococcus MED4 and MIT9313. Microbiology. 150(Pt 5):1271-81.

Mattoo AK, Hoffman-Falk H, Marder JB, Edelman M. (1984) Regulation of protein metabolism: Coupling of photosynthetic electron transport to in vivo degradation of the rapidly metabolized 32-kilodalton protein of the chloroplast membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 81(5): 1380-1384.

Mayer TU, Braun T, Jentsch S (1998) Role proteasome in membrane extraction of a shortlived ER-transmembrane protein. EMBO J 17: 3251-3257

McConnell MD, Koop R, Vasil'ev S, Bruce D (2002) Regulation of the distribution of chlorophyll and phycobilin-absorbed excitation energy in cyanobacteria. A structure-based model for the light state transition. Plant Physiol 130:1201-1212

Melis A (1991) Photosystem-II damage and repair cycle in chloroplasts: what modulates the rate of photodamage? Trends Plant Sci 4:130-135

Meurer J, Pliicken H, Kowallik KV, Westhoff P (1998) A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17(18): 5286-5297

Missiakas D, Raina S (1997) Signal transduction pathways in response to protein misfolding in the extracytoplasmic compartments of E. coli\ role of two new phosphoprotein phosphatases PrpA and PrpB. EMBO J 16:1670-1685

Mohamed A, Jansson C (1989) Influence of light on accumulation of photosynthesis-specific transcripts in the cyanobacterium Synechocystis 6803. Plant Mol Biol 13:693-700

Msadek T, Dartois V, Kunst F, Herbaud ML, Denizot F, Rapoport G (1998) ClpP of Bacillus subtilis is required for competence development, motility, degradative enzyme synthesis, growth at high temperature and sporulation. Mol Microbiol 27:899-914

Murakami A, Fujita Y (1991) Regulation of photosystem stoichiometry in the photosynthetic system of the cyanophyte Synechocystis PCC6714 in response to light intensity. Plant Cell Physiol 32:223-230

Murakami A, Kim SJ, Fujita Y (1997) Changes in photosystem stoichiometry in response to environmental conditions for cell growth observed with the cyanophyte Synechocystis PCC 6714. Plant Cell Physiol 38:392-397

Muramatsu M, Hihara Y (2003) Transcriptional regulation of genes encoding subunits of photosystem I during acclimation to high-light conditions in Synechocystis sp. PCC 6803. Planta 216:446-53

Nakamoto H, Suzuki N, Roy SK. (2000) Constitutive expression of a small heat-shock protein confers cellular thermotolerance and thermal protection to the photosynthetic apparatus in cyanobacteria. FEBS Lett 483(2-3): 169-74.

Nanamiya H, Ohashi Y, Asai K, Moriya S, Ogasawara N, Fujita M, Sadaie Y, Kawamura F (1998) ClpC regulates the fate of a sporulation initiation sigma factor, sigma H protein, in Bacillus subtilis at elevated temperatures. Mol Microbiol 29:505-513

Nash D, Miyao M, Murata N (1985) Heat inaetivation of oxygen evolution in photosystem II particles and its acceleration by chloride depletion and exogenous manganese. Biochem Biophys Acta 807: 127-133

Neuwald AF, Aravind L, Spouge JL, Koonin EV. (1999) AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res 9(l):27-43

Nishiyama Y, Kovacs E, Lee CB, Hayashi H, Watanabe T, Murata N (1993) Photosynthetic adaptation to high temperature associated with thylakoid membranes of Synechococcus PCC7002. Plant Cell Physiol 34:337-343

Novak P, Dev IK (1988) Degradation of a signal peptide by peptidase IV and oligopeptidase A. J Bacteriol 170:5067-5075

Oblong JE, Lamppa GK (1992) Identification of two structurally related proteins involved in proteolytic processing of precursors targeted to the chloroplast. EMBO J 11:4401-4409.

Oelmuller R, Herrmann RG, Pakrasi HB (1996) Molecular studies of CtpA, the carboxyl-terminal processing protease for the D1 protein of the photosystem II reaction center in higher plants. J Biol Chem 271:21848-21852

Ogura, T. & Wilkinson, A.J. (2001) AAA+ superfamily ATPases: common structure-diverse function. Genes Cells 6, 575-597

Olson TS, Terlecky SR, Dice JF (1991) Targeting specific proteins for lysosomal proteolysis. Biomed Biochim Acta 50:393-397

Ostersetzer O, Adam Z (1997) Light-stimulated degradation of an unassembled Rieske FeS protein by a thylakoid-bound protease: the possible role of the FtsH protease. Plant Cell 9:957-965

Pagano M (1997) Cell cycle regulation by the ubiquitin pathway. FASEB J 11:1067-1075

Pacaud M (1982a) Purification and characterization of two novel proteolytic enzymes in membranes of E. coli. Peptidase IV and peptidase V. J Biol Chem 257:4333-4339

Pacaud M (1982b) Identification and localization of two membrane-bound esterases from E. coli. J Bacteriol 149:6-14

Paetzel M, Dalbey RE. (1997) Catalytic hydroxy 1/amine dyads within serine proteases. Trends Biochem Sci. 22(1):28-31

Packer JC, André D, Howe CJ. (1995) Cloning and sequence analysis of a signal peptidase I from the thermophilic cyanobacterium Phormidium laminosum. Plant Mol Biol. 27(1): 199204

Pakrasi HB, Riethman HC, Sherman LA (1985) Organization of pigment proteins in the photosystem II complex of the cyanobacterium Anacystis nidulans R2. Proc Natl Acad Sci USA 82:6903-6907

Palmer SM, St John AC (1985) Proteolytic activities in membranes of Escherichia coli. Prog Clin Biol Res 180:295-297

Panichkin YB, Glazer VM, Zinchenko VV, Sokolenko A, Herrmann RG, Shestakov SV

(2001) clpP2 gene encoding peptidase in cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 controls the sensitivity of cells to photoinhibition. Izv Akad Nauk SSSR Ser Biol 3:312-317

Parsell DA, Silber KR, Sauer RT (1990) Carboxy-terminal determinants of intracellular protein degradation. Genes Dev 4:277-286

Pedersen PL, Amzel LM (1993) ATP synthases. Structure, reaction center, mechanism, and regulation of one of nature's most unique machines. J Biol Chem 268:9937-9940

Peltier JB, Ytterberg J, Liberies DA, Roepstorff P, Wijk KJ van (2001) Identification of a 350-kDa ClpP peptidase complex with 10 different Clp isoforms in chloroplasts of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 276:16318-16327

Perlman D, Halvorson HO (1983) A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukaryotic and prokaiyotic signal peptides. J Mol Biol 167:391-409

Pojidaeva E, Zinchenko VV, Shestakov SV, Sokolenko A (2004) Involvement of the SppAl Peptidase in Acclimation to Saturating Light Intensities in Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J Bacteriol 186:3991-3999

Ponting CP (1997) Evidence for PDZ domains in bacteria, yeast, and plants. Protein Sci 6:464-468

Porankiewicz J, Schelin J, Clarke AK (1998) The ATP-dependent Clp peptidase is essential for acclimation to UV-B and low temperature in the cyanobacterium Synechococcus. Mol Microbiol 29:275-283

Raps S, Kycia J H, Ledbetter MC, Siegelman HW (1985) Light intensity adaptation and phycobilisome composition of Mycrocystis aeruginosa. Plant Physiol 79:983-987.

Race HL, Herrmann RG, Martin W (1999) Why have organelles retained genomes? Trends Genet 15:364-370

Rawlings ND, Barrett A J (1999) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res 27:325-331

Regnier P (1981a) The purification of protease IV of E. coli and the demonstration that it is an endoproteolytic enzyme. Biochem Biophys Res Commun 99:1369-7136

Regnier P (1981b) Identification of protease IV of E. coli. Biochem Biophys Res Commun 99:844-854

Reuter W, Nickel-Reuter C (1993) Molecular assembly of the phycobilisomes from the cyanobacterium Mastigocladus laminosus. J. Photochem Photobiol 18:51.66

Rich PR, Bendall DS (1980) The redox potentials of the b-type cytochromes of higher plant chloroplasts. Biochim Biophys Acta 591:153-161

Richaud C, Zabulon G, Joder A, Thomas JC (2001) Nitrogen or sulphur starvation differentially affects phycobilisome degradation and expression of the nblA gene in Synechocystis strain PCC 6803. J Bacteriol 183:2989-2994

Richter S, Lamppa GK (1998) A chloroplast processing enzyme functions as the general stromal processing peptidase. Proc Natl Acad Sci USA 95:7463-7468

Richter S, Lamppa GK (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. J Biol Chem 147:33-43

Richter R, Hejazi M, Kraft R, Ziegler K, Lockau W (1999) Cyanophycinase, a peptidase degrading the cyanobacterial reserve material multi-L-arginyl-poly-L-aspartic acid (cyanophycin): molecular cloning of the gene of Synechocystis sp. PCC 6803, expression in Escherichia coli, and biochemical characterization of the purified enzyme. Eur J Biochem 263:163-169

Rippka R (1988) Isolation and purification of cyanobacteria. In Methods Enzymol 167:3-27

Rochaix JD (2001) Posttranscriptional control of chloroplast gene expression from RNA to photosynthetic complex. Plant Physiol 125:142-144

Rodermel S (2001) Pathways of plastid-to-nucleus signaling. Trends Plant Sci 6:471-478

Rudner DZ, Fawcett P, Losick R (1999) A family of membrane-embedded metallo-peptidases involved in regulated proteolysis of membrane-associated transcription factors. Proc Natl Acad Sci USA 96:14765-14769

Sandstrom S, Ivanov AG, Park YI, Oquist G, Gustafsson P (2002) Iron stress responses in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942. Physiol Plant 116:255-263

Sassoon N, Arie JP, Betton JM (1999) PDZ domains determine the native oligomeric structure of the DegP (HtrA) peptidase. Mol Microbiol 33:583-589

Sauer J, Schreiber U, Schmid R, Volker U, Forchhammer K (2001) Nitrogen starvation-induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942. Low-level photosynthesis as a mechanism of long-term survival. Plant Physiol 126:233-243

Schagger H, von Jagow G (1991) Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 199:223-231

Schirmer EC, Glover JR, Singer MA, Lindquist S (1996) HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci 21:289-296

Schmetterer G (1994) Cyanobacterial respiration In Book: The Molecular Biology of Cyanobacteria. Edited by Bryant DA. Kluwer Academic Publishers. pp406-435

Schmetterer G, Alge D, Gregor W (1994) Deletion of cytochrome c oxydase genes from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: evidence for alternative respiratory pathways. Photosyn Res 42:43-50

Schubert M, Petersson UA, Haas BJ, Funk C, Schroder WP, Kieselbach T (2002) Proteome map of the chloroplast lumen of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 277:83548365

Schwarz E, Lilie H, Rudolph R (1996) The effect of molecular chaperones on in vivo and in vitro folding processes. Biol Chem 377:411-416

Seglen PO, Bohley P (1992) Autophagy and other vacuolar protein degradation mechanisms. Experientia 48:158-172

Shanklin J, Jabben M, Vierstra RD (1987) Red light-induced formation of ubiquitin-phytochrome conjugates: identification of possible intermediates of phytochrome degradation. Proc Natl Acad Sci USA 84:359-363

Sherman DM, Sherman LA (1983) Effect of iron deficiency and iron restoration on ultrastructure of Anacystis nidulans. J Bacteriol 156:393-401

Shestakov SV, Anbudurai PR, Stanbekova GE, Gadzhiev A, Lind LK, Pakrasi HB

(1994) Molecular cloning and characterization of the ctpA gene encoding a carboxyl-terminal processing peptidase. Analysis of a spontaneous photosystem Il-deficient mutant strain of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 269:19354-19359

Shikanai T, Shimizu K, Ueda K, Nishimura Y, Kuroiwa T, Hashimoto T (2001) The Chloroplast clpP gene, encoding a proteolytic subunit of ATP-dependent protease, is indispensable for chloroplast development in tobacco. Plant Cell Physiol 42:264-273

Shin DH, Lee CS, Chung CH, Suh SW (1996) Molecular symmetry of the ClpP component of the ATP-dependent Clp protease, an Escherichia coli homolog of 20 S proteasome. J Mol Biol. 262(2):71-6

Shneyour A, Raison JK, Smillie RM (1973) The effect of temperature of the rate of photosynthetic electron transfer in chloroplasts of chilling-sensitive and chilling-resistant plants. Biochim Biophys Acta 292:152-161

Shukla VK, Stanbekova GE, Shestakov SV, Pakrasi HB (1992) The D1 protein of the photosystem II reaction-centre complex accumulates in the absence of D2: analysis of a mutant of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 lacking cytochrome b559. Mol Microbiol 6:947-956

Silber KR, Keiler KC, Sauer RT (1992) Tsp: a tail-specific peptidase that selectively degrades proteins with nonpolar C termini. Proc Natl Acad Sei USA 89:295-299

Silva P, Thompson E, Bailey S, Kruse O, Mullineaux CW, Robinson C, Mann NH, Nixon PJ (2003) FtsH is involved in the early stages of repair of photosystem II in Synechocystis sp PCC 6803 Plant Cell 15:2152-2164

Skorko-Glonek J, Lipinska B, Krzewski K, Zolese G, Bertoli E, Tanfani F (1997) HtrA heat stress peptidase interacts with phospholipid membranes and undergoes conformational changes. J Biol Chem 272:8974-8982

Skorko-Glonek J, Zurawa D, Kuczwara E, Wozniak M, Wypych Z, Lipinska B (1999) The Escherichia coli heat stress peptidase HtrA participates in defense against oxidative stress. Mol Gen Genet 262:342-350

Slilaty SN, Vu HK. (1991) The role of electrostatic interactions in the mechanism of peptide bond hydrolysis by a Ser-Lys catalytic dyad. Protein Eng. 4(8):919-22

Sokolenko A, Pojidaeva E, Zinchenko V, Panichkin V, Glaser VM, Herrmann RG, Shestakov SV (2002) The gene complement for proteolysis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and Arabidopsis thaliana chloroplasts. Curr Genet 41:291-310

Sommer T, Jentsch S (1993) A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature 365:176-179

Spiess C, Beil A, Ehrmann M (1999) A temperature-dependent switch from chaperone to peptidase in a widely conserved heat stress protein. Cell 97:339-347

Squires C, Squires CL (1992) The Clp proteins: proteolysis regulators or molecular chaperones? J Bacteriol 174:1081-1085

Strauch KL, Johnson K, Beckwith J (1989) Characterization of degP, a gene required for proteolysis in the cell envelope and essential for growth of Escherichia coli at high temperature. J Bacteriol 171:2689-2696

Sun J, Ke A, Jin P, Chitnis VP, Chitnis PR (1998) isolation and functional study of photosystem I subunits in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. In Methods in Enzym. 297:124-126

Sutcliffe IC, Russell RR. (1995) Lipoproteins of gram-positive bacteria. J Bacteriol. 177(5): 1123-8.

Suzuki CK, Rep M, van Dijl JM, Suda K, Grivell LA, Schatz G. (1997) ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogenesis. Trends Biochem Sei. 22(4): 118-23.

Takechi K, Sodmergen, Murata M, Motoyoshi F, Sakamoto W (2000) The yellow variegated (VAR2) locus encodes a homologue of FtsH, an ATP-dependent peptidase in Arabidopsis. Plant Cell Physiol 41:1334-1346

Tang Y, Guest JR (1999) Direct evidence for mRNA binding and post-transcriptional regulation by Escherichia coli aconitases. Microbiology 145:3069-3079

Terlecky SR, Dice JF (1993) Polypeptide import and degradation by isolated lysosomes. J Biol Chem 268:23490-23495

Terlecky SR, Olson TS, Dice JF (1991) A pathway of lysosomal proteolysis mediated by the 73-kilodalton heat shock cognate protein. Acta Biol Hung. 42(l-3):39-47

Tomoyasu T, Yamanaka K, Murata K, Suzaki T, Bouloc P, Kato A, Niki H, Hiraga S, Ogura T (1993) Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol 175:1352-1357

Trick CG, Wilhelm SW, Brown CM (1995) Alterations in cell pigmentation, protein expression, and photosynthetic capacity of the cyanobacterium Oscillatoria tenuis grown under low iron conditions. Can J Microbiol 41:1117-1123

Turgay K, Hahn J, Burghoorn J, Dubnau D (1998) Competence in Bacillus subtilis is controlled by regulated proteolysis of a transcription factor. EMBO J 17:6730-6738

van Dyck L, Neupert W, Langer T. (1998) The ATP-dependent PIM1 protease is required for the expression of intron-containing genes in mitochondria. Genes Dev. 12:1515-1524

van Waasbergen LG, Dolganov N, Grossman AR (2002) nblS, a gene involved in controlling photosynthesis-related gene expression during high light and nutrient stress in Synechococcus elongatus PCC 7942. J Bacteriol 184:2481-2490

VanderVere PS, Bennett TM, Oblong JE, Lamppa GK (1995) A chloroplast processing enzyme involved in precursor maturation shares a zinc-binding motif with a recently recognized family of metalloendopeptidases. Proc Natl Acad Sci USA 92:7177-7181

Varshavsky A (1997a) The N-end rule pathway of protein degradation. Genes Cells. 2:1328

Varshavsky A (1997b) The ubiquitin system. Trends Biochem Sci 22:383-387

Vierstra RD (1993) Protein degradation in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 44:385-410

Vision TJ, Brown DG, Tanksley SD (2000) The origins of genomic duplications in Arabidopsis. Science 290:2114-2117

von Heijne G, Steppuhn J, Herrmann RG (1989) Domain structure of mitochondrial and chloroplast targeting peptides. Eur J Biochem 180:535-545

Wagner I, Arlt H, van Dyck L, Langer T, Neupert W (1994) Molecular chaperones cooperate with PIM1 protease in the degradation of misfolded proteins in mitochondria. EMBO J 13:5135-5145

Waller PR, Sauer RT (1996) Characterization of degQ and degS, Escherichia coli genes encoding homologues of the DegP peptidase. J Bacteriol 178:1146-1153

Wan J, Bringloe D, Lamppa GK (1998) Disruption of chloroplast biogenesis and plant development upon down-regulation of a chloroplast processing enzyme involved in the import pathway. Plant J 15:459-468

Wang J, Hartling JA, Flanagan JM (1997) The Structure of ClpP at 2.3 A Resolution Suggests a Model for ATP-Dependent Proteolysis Cell. 91(4):47-456

Wanner C, Henkelmann G, Schmidt A, Kost HP (1986) Naturforsch 41C:741-750

Weaver LM, Froehlich JE, Amasino RM (1999) Chloroplast-targeted ERD1 protein declines but its mRNA increases during senescence in Arabidopsis. Plant Physiol 119:12091216

Wickner W, Moore K, Dibb N, Geissert D, Rice M (1987) Inhibition of purified Escherichia coli leader peptidase by the leader (signal) peptide of bacteriophage M13 procoat. J Bacteriol 169:3821-3822

Wickner S, Gottesman S, Skowyra D, Hoskins J, McKenney K, Maurizi MR. (1994) A molecular chaperone, ClpA, functions like DnaK and DnaJ. Proc Natl Acad Sci USA. 91(25):12218-22.

Yamanaka G, Glazer AN, Williams RC (1980) Molecular architecture of a light-harvesting antenna. Comparison of wild type and mutant Synechococcus 6301 phycobilisomes. J Biol Chem 1980 255:1104-1110

Yang, D.-H., J. Webster, Z. Adam, M. Lindahl, and B. Andersson. 1998. Induction of acclimative proteolysis of the light-harvesting chlorophyll a/b protein of photosystem II in response to elevated light intensities. Plant Physiol. 118:827-834.

Zak E, Norling B, Maitra R, Huang F, Andersson B, Pakrasi HB (2001) The initial steps of biogenesis of cyanobacterial photosystems occur in plasma membranes. Proc Natl Acad Sci USA 98:13443-13448

Zhao J, Brand JJ (1989) Specific bleaching of phycobiliproteins from cyanobacteria and red algae at high temperature in vivo. Arch Microbiol 152:447-452

Zheng B, Halperin T, Hruskova-Heidingsfeldova, Adam Z, Clarke AK (2002) Characterization of chloroplast Clp proteins in Arabidopsis: localization, tissue specificity and stress responses. Physiol Plant 114:92-101

Zuther E, Schubert H, Hagemann M (1998) Mutation of a gene encoding a putative glycopeptidase leads to reduced salt tolerance, altered pigmentation, and cyanophycin accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol 180:1715-1722

Диссертация написана лично автором с использованием собственных результатов, а также данных, полученных в совместных экспериментах. Работа выполнялась в рамках программы сотрудничества между Людвиг-Максимилиан Университетом, г. Мюнхен (Германия) и МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва.

Автор глубоко признателен группе проф. В.В. Зинченко (кафедра генетики, МГУ им. М.В. Ломоносова), к.б.н. В.М. Глазеру и к.б.н. В.Б. Паничкину, за предоставленную коллекцию мутантов Synechocystis sp. PCC 6803, несущих инсерцию в генах пептид аз.

Автор благодарен своему научному руководителю проф. Владиславу Владимировичу Зинченко за критическое прочтение диссертационной работы и за помощь в написании манускриптов.

Автор признателен своему научному руководителю д-ру Анне Соколенко и проф. д-ру Р.Г. Херрманну за теоретическую и финансовую помощь в проведении экспериментов, а также помощь при написании диссертации.

Автор благодарен д-ру Ирине Пивен за помощь в получении поликлональных антител.