Функциональные свойства мотива В РНК-полимеразы бактериофага Т 7 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат химических наук Русакова, Екатерина Евгеньевна

• Русакова, Екатерина Евгеньевна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Русакова, Екатерина Евгеньевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Т7 РНКГТ.

1.2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА Т7 РНКП.

1.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ЦИКЛ Т7 РНК ПО ЛИМЕ РАЗЫ

1.3.1. Взаимодействие Т7 РНК полимеразы с промотором.

1.3.2. Инициация и ранние стадии транскрипции.

1.3.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК.

1.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Т7 РНКП С ШТР И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1.

СРЕДЫ.

2.2. ШТАММЫ Е.СОИ, ПЛАЗМИДЫ И БАКТЕРИОФАГ.

2.3. МЕТОДИКИ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ САЙТА ИНИЦИАЦИИ В 17 РНКП С ПОМОЩЬЮ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ.

3.2. УДЛИНЕНИЕ ДНК-ПРАЙМЕРА С ПОМОЩЬЮ

МУТАНТА TYR639PHE,-SER641 ALA.

3.3 САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ JB МОТИВЕ В.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональные свойства мотива В РНК-полимеразы бактериофага Т 7»

Одним из фундаментальных процессов, лежащих в основе жизнедеятельности клетки является транскрипция -"переписывание" закодированной в, ДНК генетической информации, в РНК. Транскрипция осуществляется специальными ферментами, ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, использующими рибонуклеозидтрифосфаты (гМТР) в качестве субстратов и ДНК в качестве матрицы, на которой строится вновь синтезируемая цепь РНК.

Несмотря на то, что транскрипция изучается в течение нескольких десятилетий и накоплен огромный экспериментальный материал, многие аспекты этого процесса остаются невыясненными. В частности, механизмы действия. РНК-полимераз сформулированы лишь в самом общем виде. Это обстоятельство вызвано, в первую очередь, ограниченностью информации о третичной структуре этих ферментов, связанной с их большими молекулярными массами и сложным субъединичным составом. связи с этим весьма удобными, объектами для изучения различных стадий транскрипции являются РНК-полимеразы некоторых бактериофагов. Эти ферменты, как правило, состоят из одной субъединицы с м.в. около 100 кДа, обладают высокой специфичностью в отношении собственных промоторов и способны осуществлять полный цикл транскрипции от специфической инициации до специфической терминации в отсутствие дополнительных белковых факторов. Наиболее известным представителем фаговых РНК-полимераз является ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага Т7 (Т7 РНКП), получившая чрезвычайно широкое распространение в генноинженерных исследованиях в качестве инструмента для получения специфических транскриптов. В настоящее время существует ряд эффективных продуцентов Т7РНКП на основе клеток E.coli, что позволяет достаточно легко получать большие количества фермента.

В настоящей работе предпринята попытка методами аффиной модификации и сайт-специфического мутагенеза определить функциональную роль ряда аминокислотных остатков в мотиве В, одном из консервативных мотивов а бактериальных и фаговых ДНК- и РНК-полимеразах.

•т

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СТРУКТУРА И СВОЙСТВА РНК-ПОЛИМЕРАЗЬ! БАКТЕРИОФАГА Т7.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Русакова, Екатерина Евгеньевна

В Ы В О Д Ь!

1. Исследовано взаимодействие Т7 РНКП полимеразы и ее мутантной формы Туг639!уз с промотором, в положениях -11; +1 и +2 которого находились остатки цитидина, содержащие дополнительное рибозное кольцо в 2'-положении рибозного кольца. После окисления гидроксильных групп рибозы периодатом натрия они были способны ковалентно связываться с аминогруппой лизина. Установлено, что мутант Туг6391уз ковалентно связывается с промотором, с модификацией в положении +2, что указывает на расположение остатка 639 в сайте инициации транскрипции.

2. Показано, что мутантная форма 11 РНКП Туг639РИе, способна к удлинению ДНК-праймера, причем наличие в матрице 11 промотора не влияет на этот процесс.

3. Получен и исследован ряд мутантных форм 17 РНКП с заменами аминокислотных остатков в мотиве В. Показано, что остаток 635 влияет на стабильность фермента и на точность транскрипции. Остатки 633 и 641 по-видимому участвуют в образовании нековалентных взаимодействий в третичной структуре белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Русакова, Екатерина Евгеньевна, 1999 год

1. Chamberlin М., McGrath J., Waskei! L. New RNA polymerase from Escherichia coli infected with bacteriophage T7. Nature, 1970, v.228, p. 227-231.

2. Davanloo P.,Rosenberg A.H., Dunn J.J., Studier F.W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984, v.81, p. 2035-2039.

3. Речинский B.O., Драган С М., Косткж Д.А., Ляхов Д.Л., Кочетков С.Н. Генетическая система отбора точечных мутантов РНК-полимеразы бактериофага Т7, Молекулярная Биология, 1991, том 25, стр. 1588-1593.

4. Niles Е., Conlon S., Summers W. Purification and physical characterization of T7 RNA polymerase from T7-infected Escherichia coli. Biochemistry, 1974, v. 13, p. 3904 3S11.

5. Grachev M.A., Pletnev A.G. The nucleotide sequence of gene 1 of T7 phage DNA which codes for the phage specific DNA-dependent RNA-polymersse. FEBS Lett., 1981, v.127, p. 53-56.

6. Moffatt B.A., Dunn J.J., Studier F.W. Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1984, v.173, p. 265-269.

7. Burton Z., Burgess R.R., Lin J., Moore D., Holder S., Gross C.A. The nucleotide sequence of the cloned rpoD gene for the RNA polymerase sigma subunit from Escherichia coli К 12. Nucl. Acids Res., 1981, v.9, p. 2889-2904

8. Oakley J.L., Pascale J.A., Coleman J.E. T7 RNA polymerase: conformation, functional groups, and promoter binding. Biochemistry, 1975, v. 14, p. 4684-4691.

9. Coleman J. The ro!e of Zn (!!) In transcription by T7 RNA polymerase. Biochem. Biophys. Res. Com., 1974, v. 60, p. 641-648.

10. King G.C., Martin C.T., Pham T.T., Coleman J.E. Transcription by T7 RNA polymerase is not zinc-dependent and is abolished on amidomethylation of cystein-347. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 36-40.

11. Ikeda R.A., Richardson C.C. Enzymatic properties of proteotically nicked RNA polymerase of bacteriophage T7. J.Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 3790-3799.

12. Lyakhov D., He B., Zhang X.,Studier F.W., Dunn J.J.,McAllister W.T. Mutant bacteriophage T7 RNA polymerases with altered termination properties. J. Mol. Biol., 1997, v. 269, p. 28-40.

13. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interactions of a proteolytically nicked RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter. J.Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 3800-3808.

14. Sousa R., Rose J.P., Chung Y.J., Lafer E.M., Wang B.-C. Single crystals of bacteriophage T7 RNA polymerase. Proteins Struct. Funct. Genet., 1989, y. 5, p. 266-270.

15. Sousa R., Chung Y.T., Rose J.P., Wang B.-C. Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3,3 A resolution. Nature, 1993, v. 364, p. 593-599.

16. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependent DNA polymerases. Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, v. 3, p. 31-38.

17. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interaction of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, v. 83, p. 3614-3618.

18. Shi Y., Gampsr H., Hearst J.E. Interaction of T7 RNA polymerase with DNA in an elongation complex arrested at a specific psoralen adduct site. -J. Biol. Chem., 1.988, v. 263, p. 527-534.

19. Chamberlin M. Bacterial DNA-dependent RNA polymerases. The Enzymes, 1982, v. XV, p. 61-86.

20. Bautz E.K.F. Bacteriophage-induced DNA dependent RNA polymerase, in RNA Polymerase. Losick R., Chamberlin M., eds., New-York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1976, p.273-284.

21. Straney D.C., Crothers D.M. intermediates In transcription initiation from the E.coli !acUV5 promoter. Cell, 1985, v. 43, p. 449-459.

22. Buc H., McClure W. Kinetic of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lacUV5 promoter. Evidence for a sequential mechanism Involving three steps. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 2712 2722.

23. Chamberlin M.J., Ryan T. Bacteriophage DNA-dependent RNA polymerases. The Enzymes , 1982, v. XV, p. 87-108 .

24. Golomb M., Chamberlin M. Characterization of T7- specific ribonucleic acid polymerase. IV Resolution of the major in vitro transcripts by gel electrophoresis. J.Biol.Chem., 1974, v.249, p. 2858-2863.

25. McAllister W.T., Kupper H., Bauts K.F. Kinetics of transcription by the bacteriophage T3 RNA polymerase in vitro. Eur. J. Biochem., 1973, v.34, p. 489-501.

26. Chapman K. A., Wells R.D. Bacteriophage T7 late promoters: construction and in vitro transcription properties of deletion mutants. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, p. 6331-6340.

27. Studier F.W. Bacteriophage TT. Science, 1972, v. 176, p.367-372 .

28. McAllister W.T., Barrett C. Hybridization mapping of restriction fragments from the early region of bacteriophage 17 DNA . Virology, 1977, v.82, p.275-287. ,

29. Gunderson S.I., Chapman K.A., Burgess R.R. Interaction of 17 RNA polymerase with 17 late promoters measured by footprint!ng with methidiumpropyl ED1A - iron (II). Biochemistry, 1987, v.26, p. 1539-1546 .

30. Chapman K.A., Gunderson S.T., Anello M., Wells R.D., Burgess R.R. Bacteriophage 17 late promoters with point mutations : quantitative footprinring and in vivo expression. Nucl. Acids Res., 1988, v. 16, p.4511-4524.

31. Muller D.K., Martin C.T., Coleman J.E. T7 RNA polymerase interacts with its promoter from one side of DNA helix . Biochemistry, 1989, v.28, p.3306-3313.

32. Osterman H.L., Coleman J.E. 17 ribonucleic acid polymerase promoter interactions. Biochemistry, 1981, v. 20, p. 4884 -4892.

33. Martin C.T., Coleman J.E. Kinetic analysis of 17 RNA polymerase promoter interactions with small syntetic promoters. Biochemistry, 1987, v. 26, p. 2690-2696.

34. Li T, Ho H.H., Maslak M., Schick C., Martin C.T. Major groove recognition elements in the middle of the 17 RNA polymerase promoter. Biochemistry, 1996, v.35, p. 3722-3727.

35. Baklanov M.M., Golikova L.N., Malygin E.G Effect on DNA transcriprion of nucleotide sequences upstream to 17 promoter. Nucl. Acids Res., 1996, v. 24,p. 3659-3660

36. Jorgensen E.D., Durbin R.K., Risman S.S., McAllister W.T. Specific contacts between the bacteriophage T3,17 and SP 6 RNA polymerases and their promoters. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 645-651.

37. Stah! S. J., Chamberlin M.J. Transcription of T7 DNA containing modified nucleotides by bacteriophage T7 specific RNA polymerase. J. Biol. Chem., 1978, v.253, N14, p. 49-51-4959.

38. Ikeda R. A, Ligman C. M., Warshamana S. T7 promoter contacts essentia! for promoter activity in vivo. Nucl. Acids Res., 1992, v. 20, p. 2517-2524.

39. Schick C. and Martin C.T. Tests of a model of specific contacts in T7 RNA polymerase promoter interactions. Biochemistry, 1995, v. 34, p. 666-672.

40. Muller O.K., Martin C.T., Coleman J.E. Processivity of proteolytically modified forms of T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1988, v. 27, p. -5763-5771.

41. Schneider T.D. and Stormo G.D. Excess information at bacteriophage T7 genomic promoters detected by a random cloning technique. Nucl. Acids Res., 1989, v.17, p. 659-674.

42. Chapman K. A., Burgess R.R. Construction of bacteriophage T7 late promoters with point mutations and characterization by In vitro transcription properties. Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, p. 5413-5432 .

43. Dunn J.J., Studier F.W. Nucleotide sequence from the genetic left end of bacteriophage T7 DNA to the beginning of gene 4. J. Mol. Biol., 1981, v. 148,p. 303-330

44. Dunn J.-J.,Studier F.W. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the locations of T7 genetic elements. -J. Mol. Bio!., 1983, v. 166,p. 477-535 .

45. Beier H., Hausmann R. T3 T7 phage crosses leading to recombinant RNA polymerases. Nature, 1974, v. 251, p. 538 -539.

46. Ryan T., McConnel D.J. Physical mapping of hybrid bacteriophage T7/T3 RNA polymerase genes. Virology , 1982, v. 43, p. 844-858.

47. Raskin C.A., Diaz G.A., McAllister W.T. T7 RNA polymerase mutants with.alteres promoter specificities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 3147-3151.

48. McAllister W.T. Structure and function of the bacteriophage T7 RNA polymerase.

49. Cell Mol. Biol. Res., 1993, v. 39 ,p. 385-391.

50. Rong M., He B., McAllister W.T., Durbin R.K. Promoter specificity determinants of T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, p. 515-519.

51. Ujvari A. and Martin C.T. Thermodynamic and kinetic measurements of promoter binding by T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 14574-14582.

52. Sastry S.S., Ross B.M. A direct real-time spectroscopic investigation of the mechanism of open complex formation by T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 15715-15725.

53. Villeman J., Guajardo R., Sousa R. Role of open complex instability in kinetic promoter selection by bacteriophage T7 RNA polymerase. -J. Mol. Biol., 1997, v. 273, p. 958-977

54. Martin C.T., Muller D.K., Coleman J.E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 3966-3974 .

55. Martin C.T., Coleman J.E. T7 RNA polymerase does not interact with the 5'-phosphate of the initiating nucleotide . Biochemistry, 1989, v.28, p.2760-2762

56. Chamberlin M., Ring J. Characterization of T7-specific ribonucleic acidpolymerase. !. General properties of the enzymatic reaction and the templatespecifity of the enzyme. J. Biol. Chem.,1973, v. 248, p. 2235-2244.

57. Sousa R., Patra D., Lafer E M. Mode! for the mechanism of bacteriophage T7 RNAP transcription initiation and termination . JMB., 1992, v.224, p.319-334.

58. Moroney S.E., Picciri!!i J.A. Abortive products as initiating nucleotides during transcription by 17 RNA po!ymerase. Biochemistry, 1991, v.30, p. 10343-10349.

59. Sengupta D., Chakravati D., Maitra U. Relative efficiency of utilization of promoter and termination sites by bacteriophage T3 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 14246-14255.

60. McClure W.R. Rate-limiting steps in RNA chain initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 5634-5638.

61. Maitra U., Salvo R. A., Chakraborty P.R. Specifity of ribonucleic acid chain initiation by bacteriophage T3-induced ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem., 1974, v. 249, p. 5835-5639.

62. McAllister W. T., Carter A.D. Regulation of promoter selection by the bacteriophage 11 RNA polymerase in vitro . Nucl. Acids Res., 1980, v. 8,p. 4821-4837.

63. Ling M.-L., Risman S.S., Klement J.F., McGraw N., McAllister W.T. Abortive initiation by bacteriophage 13 and 11 polymerases under conditions of limiting substrate. Nucl. Acids Res., 1989, v. 17, p. 1605-1618.

64. Diaz G.A., Rong M., McAllister W.T., Durbin R.K. The stability of abortively cycling T7 RNA polymerase complexes depends upon template conformation. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 10837-10843.

65. Patra D., Lafer E.M., Sousa R. Isolation and characterization of mutant bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Bio!., 1992, v. 224, p. 307-318.

66. Arndt K. M., Chamberlin M.J. RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase: factors affecting the stability of elongating ternary complexes. J. Mol. Biol., 1990, v. 213, p. 79-108.

67. Jia Y., Patel S.S. Kinetic mechanism of transcription initiation by bacteriophage T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1997, v.36, p.4223-4232.

68. Weston B.F., Kuzmine I., Martin C.T. Positioning of the start site in the initiation of transcription by bacteriophage 17 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1997, v. 272, p. 21-30.

69. Ujvari A., Martin C.T. Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter. J. Mol. Biol., 1997, v. 273, p. 775-781.

70. Nath S. T., Lee M.-S., Romano L.J. Effect of carcinogenic adducts on transcription by T7 RNA polymerase. NAR, 1987, v. 15, N 10, p.4257-4272.

71. White R.J., Phillips D.R. Sequence-dependent termination of bacteriophage T7 RNA transcription in vitro by DNA-binding drugs. Biochemistry, 1988, v. 28,p. 4277-4283.

72. Sastry S.S., Hearst J.E. Studies on the interaction of T7 RNA polymerase with a DNA template containing a site-specifically placed psoralen cross-link. I.Characterization of elongation complexes. J. Mol. Biol., 1991, v. 221,p. 1091-1110.

73. Sastry S.S., Hearst J.E. Studies on the interaction of T7 RNA polymerase with a DNA template containing a site-specifically placed psoralen cross-link. II. Stabilityand some properties of elongation complexes. J. Mol. Biol., 1991, v. 221, p. 11111125.

74. Daube S.S., von Hippel P.H. RNA displacement pathways during transcription from synthetic RNA DNA bubble duplexes. Biochemistry, 1994, v. 33, p. 340-347

75. Sastry S.S., Hoffman P.L. The influence of RNA and DNA template structures during transcript elongation by RNA polymerases. Biochem. Biophys. Res. Com., 1995, v. 211, p. 106-114.

76. Biebricher C. K., Luce R. Template-free generation of RNA species that replicate with bacteriophage T7 RNA polymerase. The EMBO Journal, 1996, v. 15, p. 3458-3465.

77. Zhou W., Doetsch P. W. Transcription bypass or blockage at single-strand breaks on the DNA template strand: effecxt of different 3' and 5' flanking groups on the T7 RNA polymerase elongation complex. Biochemistry, 1994, v. 33,p. 14926-14934

78. Zhou W., Reines D., Doetsch P. W. T7 RNA polymerase bypass of large gaps on the template strand reveals a critical role of the nontemplate strand in elongation. Cell, 1995, v. 82, p. 577-585.

79. Delarue M., Poch 0., Tordo N. .Moras D., Argos P., An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng. ,1990, v. 3, p. 461-467.

80. Osumi-Davis PA, de Aguiliera M.C., Woody R.W., Woody A.-Y.M. Asp537, Asp812 are essential and Lys631, His811 are catalytically significant in bacteriophage T7 RNA polymerase activity. J. Mol. Biol.,1992, v. 226, p. 37-45.

81. Osumi-Davis P.A., Sreerama N.,Volkin D.B., Middaugh R.C., Woody R.W., Woody A.-Y. M. Bacteriophage T7 RNA polymerase and its active-site mutants : kinetic, spectroscopic and calorimetric characterization. J. Mol. Biol., 1994, v. 237,p. 5-19.

82. Kostyuk D.A., Dragan S.M., Lyakhov D.L., Rechinsky V.O., Tunitskaya V.L., Chernov B.K., Kochetkov S.N. Mutants of T7 RNA polymerase that are able to synthesize both RNA and DNA. FEBS Lett., 1995, v. 369, p. 165-168 .

83. Lopez P.J., Guillerez J., Sousa R., Dreyfus M. The low processivity of T7 RNA polymerase over the initially transcribed sequence can limit productive initiation in vivo. J. Mol. Biol., 1997, v.269, p.41-51.

84. Izawa M., Sasaki N„ Watahiki M., Ohara E., Yoneda Y., Muramatsu M., Okazaki Y., Hayashzaki Y. Recognition sites of З'-OH group by T7 RNA polymerase and its application to transcriptional sequensing. J.Biol. Chem., 1998, v. 273,p. 14242-14246.

85. Rechinsky V.O., Kostyuk D.A., Lyakhov D.L., Chernov B.K., Kochetkov S.N. Random mutagenesis of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Mol.Gen. Genet., 1993, v. 238, p. 455-458.

86. Rechinsky V.O., Kostyuk D.A., Tunitskaya V.L., Kochetkov S.N. On the functional role of the Tyr-639 residue of bacteriophage 11 RNA polymerase. FEBS Let., 1992, v. 306, p. 129-132.

87. Joho K.E., Gross L.B., McGraw N.J., Raskin C., McAllister W.T. Identification of a region of the bacteriophage T3 and 11 RNA polymerases that determines promoter specificity. J. Mol. Biol., 1990, v. 215, p. 31-39.

88. Mookhtiar K.A., Peluso P.S., Muller D.K., Dunn J.J., Coleman J.E. Processiyity of 11 RNA polymerase requires the C-terminal Phe882-Ala883- COO" or " foot". Biochemistry, 1991, v. 30, p. 6305-6313.

89. Gardner L.P., Mookhtiar K.A., Coleman J.E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of 11 RNA polymerase. Biochemistry, 1997, v. 36, p. 2908-2918.

90. Ляхов Д.Л., Ильгенфриц X., Речинский В.О., Туницкая В.Л., Чернов Б.К., Кочетков С.Н. Изменение специфичности РНК-полимеразы фага Т7 в результате олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. Доклады АН СССР, 1991, т.317, N 4, стр. 1005-1008.

91. Gross L.B., Chen W.J., McAllister W.T. Characterization of bacteriophage T7 RNA polymerase by linker insertion mutagenesis. J. Mol. Biol., v. 228, p. 488-505.

92. He B., Rong M., Durbin R.K., McAllister W.T. A mutant T7 RNA polymerase that is defective in RNA binding and blocked in the early stadies of transcription. J. Mol. Biol., 1997, v.265, p.275-288.

93. Macdonald L.E., Zhou Y., McAllister W.T. Termination and slippage by bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., v.232., p. 1030-1047.

94. Rechinsky V.O., Chernov B.K., Dragan S.M., Kostyuk D.A., Tunitskaya V.L., Kochetk.ov S.N. Targeted mutagenesis Identifies Asp-569 as a catalitically critical residue in T7 RNA polymerase. Mol. Gen. Genet., 1995, v. 247, p. 110-113.

95. Rechinsky V.O., Tunitskaya V.L., Dragan S.M., Kostyuk D.A., Kochetkov S.N. Tyr-571 Is involved in the T7 RNA polymerase binding to Its promoter. FEBS Let., 1993, v. 320, p. 9-12.

96. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellenberg T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A° resolution. Nature, 1998, v. 391, p. 251-258.

97. Poiesky A.H., Dahlberg M.E., Benkovic S.J., GrindSey N.D., Joyce C.M. Side chains Involved catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli. J.Bioi.Chem., 1992, v. 267, p. 8417 8428.

98. Kaushik N., Pandey V.N., Modak M.J. Significance of the O-helix residues of Escherichia coli DNA. polymerase I in DNA synthesis: dynamics of the dNTP binding pocket. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 7256-7266.

99. Joyce C M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, v. 94, p. 1619-1622.

100. Tabor S., Richardson. C.C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, v. 92,p. 6339-6343.

101. Sambrook K.J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

102. Hanahan D. Techniques for transformation of E.coli. In: DNA Cloning. Glover D. ed., Oxford: IRL Press, 1985, v.!, p.109-135.

103. Promega protocol and application guide. 2nd edition, Madison: Promega Corporation, 1991.

104. Gudima S.O., Kostyuk D.A., Grishchenko O.I., Tunltskaya V.L., Memelova L.V., Kochetkov S.N. Synthesis of mixed ribo/deoxyribopolynucleotides by mutant T7 RNA polymerase. FEBS Let., v. 439, p. 302-306.

105. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 4007-4021.

106. Promega protocol and application guide. 3rd edition, 1996.

107. Brevnov M.G., Gritsenko O.M., Mikhailov S.N., Efimtseva E.V., Ermolinsky

108. В.S., Van Aershot A., Herdewijn P., Repyk A.V., Gromova E.S. DNA duplexes with reactive dialdehyde groups as novel reagents for cross-linking to restriction-modification enzymes. Nucl. Acids Res., 1997, v. 25, p. 3302-3309.

109. Cheetham G.M.T., Jeruzaim! D., Steitz T.A. Structura! basis for initiation of transcription from an RNA polymerase-promoter complex. Nature, 1999, v. 399,p. 80-8.3.

110. Туницкая В.Л., Мемелова Л.В., Косткж Д.А., Судима С.О., Кочетков С.Н. Исследование закономерностей утилизации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов мутантными формами РНК-полимеразы бактериофага Т7. Молекулярная Биология. 1997. Т.31. С.353-358.

111. Huang Y., Eckstein F., Padilla R., Sousa R. Mechanism of rlbose 2'-group discrimination by an RNA polymerase. Biochemistry. 1997. V.36. P.8231-8242.

112. Sousa R., Padilla R. A mutant T7 RNA polymerase as a DNA polymerase. EMBO J. 1995, v. 14, p. 4609-4621.