Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Пискарева, Ольга Александровна

• Пискарева, Ольга Александровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пискарева, Ольга Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация генома человека и мобильные элементы.

1.2. Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека.

1.2.1. Транспозоны.

1.2.2. LTR - содержащие ретротранспозоны.

1.2.3. LTR - несодержащие ретротранспозоны.

1.2.4. SINE.

1.3. Жизненный цикл LTR - несодержащего регротранспозона L1.

1.3.1. Транскрипция.

1.3.2. Процессии г.

1.3.3. Трансляция

1.3.4. Белок ОРТ 1.

1.3.5. Белок ОРТ2.

1.3.6. Нос ггрансляционные модификации белков и образование рибонуклеопротеинового комплекса.

1.3.7. Доставка в ядро.

1.3.8. Интеграция в геномную днк.

1.4. Образование инверсий и делеций элемента L1.

1.5. Образование укороченных копий L1.

1.6. Перемещение элементов L1 по геномной ДНК.

1.6.1. Гомологичная рекомбинация.

1.6.2. Транспозиционная активность элементов LI.

1.6.3. Частота транспозиций элементов L I.

1.7. Клеточные функции элемента LI

1.7.1. Влияние на экспрессию генов.

1.7.2. Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК.

1.7.3. Реорганизация генома.

1.8. Практическое применение элементов L1.

1.8.1. Филогенетические маркеры.

1.8.2. Система случайного мутагенеза.

1.8.3. Вектор для переноса генов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и реактивы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Штаммы H.coh и культуры клеток.

2.1.3. Вектора.

2.1.4. Олигонуклеотиды.

2.1.5. Основные буферы и растворы.

2.1.6. Бактериальные среды.

2.2. Методы рекомбинантных днк.

2.3. Клонирование и экспрессия OPTI и фрагмента ОРТ элемента LIHs в клетках \i.coli.

2.4. Выделение и очитка рекомбинантных белков из клеток И.соЧ.

2.5. Получение поликлональных мышиных антител.

2.6. Клонирование и экспрессия ОРТ2 элемента Llf/,v, кодирующей обратную транскриптазу в клетках насекомых Sf 21.

2.6.1. Получение рекомбинантной бакмиды, несущей ОРТ2 Ll//,s.

2.6.2. Получение рекомбинантного бакуловируса, несущего ОРТ2 UHs.

2.6.3. Определение титра рекомбинантного бакуловируса.

2.6.4. Наращивание и хранение рекомбинантного бакуловируса.

2.6.5. Экспрессия ОРТ2 элемента L\Hs в клетках насекомых Sf 21.

2.7. Выделение рекомбинантной ОТ элемента L\Hs из клеток насекомых Sf 21.

2.8. Конструирование и экспрессия элемента L\H.s в клетках млекопитающих

2.9. Культивирование клеток эукариот.

2.10. Выделение ядер клеток млекопитающих.

2.11. Аналитические методы.

2.11.1. РНК-зависимая ДНК-полимеразная реакция.

2.1 1.2. Получение гетерогенных матриц.

2.11.3. Реакция элонгации праймера.

2.11.4. Определение активности РНКазы Н.

2.11.5. Гель-электрофорез НК в денатурирующих условиях.

2.1 1.6. SDS-электрофорез белков.

2.1 1.7. Окрашивание белковых гелей ни гратом серебра.

2.1 1.8. Иммуноблотинг.

2.11.9. Определение концентрации белка.

2.12. Микроскопия.

2.12.1. Световая микроскопия.

2.12.2. Флюоресцентная микроскопия.

2.12.3. Конфокальная микроскопия.

2.12.4. Трансмиссионная электронная микроскопия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Экспрессия гибридных белков элемента L\Hs с целью получения поликлональных антител.

3.2. Экспрессия белка ОРТ2 элемента LI Hs в клетках насекомых S

3.3. Получение препарата обратной транскриптазы элемента LI Hs.

3.4. Оптимумы ДНК-полимеразной активности обратной транскриптазы элемента L I Hs.

3.5. Влияние двухвалентных катионов на активность ОТ элемента L\Hs.

3.6. Специфичность к субстратам ОТ элемента LI Hs.

3.7. Синтез ДНК ОТ элемента U//.v.

3.8. Активность РНКазы Н ОТ элемента L\Hs.

3.9. Локализация белка р40 элемента LI Hs в клетках млекопитающих

3.9.1. В клетках человека линии HeLa белок р накапливается в цитоплазме.

3.9.2. В клетках хомяка CHO-KI in vivo белок р40 элемента L1//.S накапливается в цитоплазме.

3.10. Образование вирусоподобных частиц белками элемента L\Hs.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека»

Актуальность проблемы

Элементы L1 или LINE-1 относятся к классу ретротранспозонов, не содержащих длинные концевые повторы (LTR), и составляют приблизительно 17% генома человека. Элементы этого класса реингегрируют в геном через РНК-посредник при участии собственной обратной транскриптазы. В основном элементы L1 генома человека (Ll//.v) функционально не активны, так как укорочены с 5'-конца и/или имеют внутренние перестановки и/или мутации, и только около 60 копий способны перемещаться в геноме. К настоящему времени клонированы полноразмерные "активные" копии L\Hs и определены их структурные особенности (Kazazian Н., 2001). Именно активные LIHs способны вызывать мутации, наследственные заболевания, генетическое разнообразие и полиморфизм, в го время как неактивные копии являются причиной неправильного кроссинговера, приводящего либо к делеции, либо к дупликации.

Консенсусная последовательность L\Hs протяженностью 6-7 тыс. пар оснований содержит две не перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ). Первая рамка кодирует белок со свойствами gag белков ретровирусов, вторая - белок с активностями эндонуклеазы и обратной транскриптазы. При исследовании белка OPT I, р40, выделенного из клеток тератокарциномы человека, было обнаружено, что р40 имеет высокое сродство к РНК LI//.S (Hohjoh Н., 1996, 1997) и образует в цитоплазме клеток мультимеры (Holmes S., 1992, Hohjoh Н., 1997). При изучении транспозиционной активности LI/7.S в культуре клеток было показано, что С - концевая область белка р40 содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиции элемента LI (Moran J., 1996). Кроме того, было обнаружено цис-активное функционирование L1//.S в процессе реинтеграции в геном (Moran J., 1996, 1999, Goodier, 2000, Wei W„ 2001).

В двух независимых экспериментах было показано, что активность ОТ свойственна центральному домену белка ОРТ2, хотя другие выдвинутые предположения спорны, поскольку исследования проводились на частично очищенном препарате белка ОРТ2 (Clements А., 1998), либо в клеточной системе in vivo (Dhellin О., 1997). С помощью генетического метода определения частоты событий ретротранспозиции было показано, что делеции и мутации в последовательности ОРТ2 L1//.S приводят к инактивации транспозиционной активности элемента в культуре клеток человека (Moran J., 1996). Недавно было показано, что интеграция элемента человека L\Hs в геном обеспечивается активностью обратной транскриптазы белка ОРТ2, причем в качестве праймера для построения кДНК используется З'-выступаюгций конец сайта мишени геномной ДНК (Cost G., 2002). Такой механизм впервые был описан для LTR - несодержащего ретротранспозона R2 Вт и получил название - обратная транскрипция, праймированая сайтом-мишенью (Liian D., 1993). Таким образом, именно активность обратной гранскриптазы является одним из важнейших факторов, определяющим возможность построения кДНК копии элемента и его дальнейшее встраивания в геном.

Совокупность имеющихся данных, касающихся молекулярной биологии LI//.V, оставляет открытыми ряд важных вопросов, решение которых является актуальным. В частности плохо изучены функциональные и структурные свойства белка ОРТ2 Llf/.v, так же как и особенности процесса, катализируемого этим ферментом, из-за отсутствия гомогенного и стабильного препарата фермента. Так же остается неясной роль р40 в транспозиции L\Hs. Кроме того, не выяснен механизм взаимодействия белков и РНК элемента в процессе доставки матрицы в ядро.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было исследование функциональных свойств белков, кодируемых LTR- несодержащим ретротранспозоном L1 генома человека. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

Г) провести экспрессию открытой рамки трансляции 2 элемента L\Hs в эукариотической системе;

2) выделить и очистить полноразмерный белок ОРТ2 L1/7.V и охарактеризовать его ферментативную активность;

3) исследовать ДНК-полимеразную активность белка ОРТ2 LI Hs;

4) разработать модельную систему экспрессии элемента L1 в культуре клеток млекопитающих;

5) исследовать взаимодействие белков L I Hs в процессе его экспрессии.

Работа выполнена в ВНТК мобильных генетических элементов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ.

Научная новизна

Впервые проведена характеристика ферментативной активности белка ОРТ2 элемента LI Hs. Показано, что очищенный белок является Mg2+-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, так и ДНК-зависимую ДНК-полимеразные активности, но не обладает активностью РНКазыН. Впервые показаны процессивность и паузинг ОТ L\Hs в процессе синтеза ДНК.

В экспериментах по экспрессии ОРТI в клетках млекопитающих, впервые получены доказательства накопления белка ОРТ! в цитоплазме клеток в виде неупорядоченных агрегатов.

Предложена модельная система экспрессии элемента L\Hs in vivo. Впервые обнаружено, что белки элемента L\Hs образуют структуры, подобные вирусным частицам. Вирусоподобные частицы имеют диаметр 9295 нм и ассоциированы с ядерной мембраной.

Практическая ценность работы

Настоящая работа является частью фундаментальных исследований, посвященных изучению молекулярных механизмов транспозиционной активности элемента LIHs. Предложена методика очистки белка ОРТ2 LIHs из клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, несущим ОРТ2, позволяющая получать высокоочищенный препарат, сохраняя его ферментативную активность.

Полученные в настоящей работе результаты могут быть использованы при реконструкции in vitro этапов гранспозиции элемента LI / /л, а так же при создании векторов для переноса генов.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пискарева, Ольга Александровна

ВЫВОДЫ:

Проведена бакуловирусная экспрессия ОРТ2 мобильного элемента L1 генома человека. Разработана методика хроматографической очистки белка ОРТ2, проявляющего активность обратной гранскриптазы. Впервые показано, что белок ОРТ2 элемента LI//.S является магний-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, гак и ДНК - зависимую ДНК - полимеразную активность. Впервые показаны высокая процессивность обратной транскриптазы элемента Ll//,v, которая составила не менее 600 н., и паузы синтеза ДНК на L1-матрице.

Обратная транскриптаза ретротранспозона L1//.V не проявляет активности РНКазы Н, характерной для обратных транскриптаз ретровирусов и ретротранспозонов.

Эксперименты по экспрессии элемента LI Hs in vivo показали, что белок ОРТ! накапливается только в цитоплазме клеток и формирует неупорядоченные агрегаты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, суммируя данные обеих частей настоящей работы, целью которой было исследование функциональных свойств белков, кодируемых LTR- несодержащим ретротранспозоном LI генома человека, можно прийти к следующему заключению.

Высокая ОТ активность, проявляемая белком ОРТ2 элемента LI Hs на матрице поли(гА)-олиго(ёТ), по-видимому, облегчает синтеза кДНК в реакции обратий транскрипции, праймированной сайтом-мишенью и объясняет накопление копий элемента Ll/Y.s в АТ-богатых областях геномной ДНК человека в процессе эволюции. В то время как, высокая процессивность обратной транскриптазы элемента L\Hs и паузы синтеза ДНК в GC-богатых последовательностях РНК LI Ял, по-видимому, являются одной из причин высокого содержания неактивных и укороченных копий элемента LI Hs в геноме человека.

Свойства белка р40 элемента L\Hs, накапливаться в цитоплазме клеток и формировать неупорядоченные агрегаты, позволяют предположить, что, белки элемента L\Hs, взаимодействуя с собственной РНК, образуют РНГ1 частицы необходимые для сохранения целостности РНК элемента. А отсутствие в последовательности белков элемента LI Hs специальных сигналов для проникновения в клеточное ядро свидетельствует в пользу того, что доставка матрицы L\Hs в составе РНП частиц к геномной ДНК осуществляется во время митоза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пискарева, Ольга Александровна, 2004 год

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, под ред. Георгиева Г.П. // М.: Мир, 1995;

2. Методы культивирования клеток // Сборник научных трудов. Л.: Наука, 1988;

3. Сингер М., Берг П. Гены и геномы, под ред. Янковского Н.К. // М.: Мир, 1998.

4. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Наука, 1975.

5. Adey N.B., Tollefsbol Т.О., Sparks А.В., Edgell М.Н., Hutchison C.A. Molecular resurrection of an extinct ancestral promoter for mouse LI // PNAS. 1994. - V. 91. - N. l.-P. 1569-1573;

6. Andersson G., Svensson A., Setterblad N., Rask L. Retroelements in the human Ml 1С class II region // TIG 1998. - V. 14. - P. 109-114;

7. Arning S., Gruter P., Bilbe G., Kramer A. Mammalian splicing factor SF I is encoded by variant cDN As and binds to RNA // RN A. 1996. - V. 2. -P. 794-810;

8. Asch H.L., Eliacin E., Fanning T.G., Connolly J.L., Bratthauer G., Ascli B.B. Comparative expression of the LINE-1 p40 protein in human breastcarcinomas and normal breast tissues // Oncol. Res. 1996. - V. 8. -P.239-247;

9. Avidan O., Hizi A. The processivity of DNA synthesis exhibited by drug-resistant variants of human immunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase // Nucleic Acids Research. 1998. - V. 26. - N. 7. - P. 17131717;

10. Avidan О., Meer M., Oz I., Hizi A. The processivity and fidelity of DNA synthesis exhibited by the reverse transcriptase of bovine leukemia virus // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. - P. 859-867;

11. Badge R., Alisch R., Moran J. ATLAS: a system to selectively identify human-specific LI insertions // Am. J. Hum. Genet. 2003. - V. 72. - P. 823-838;

12. Barabano S., Huber W., Jenny A., Keller W. The 30-kD subunit of mammalian cleavage and polyadenilation specifity factor and its yeast homolog are RNA-binding zinc finger proteins // Genes Dev. 1997. - V. 11. P. 1703-1716;

13. Benjes S., Morris C. A full-length and potentially active LINE element is integrated polymorphically within the IGL locus in a genomically unstable region of chromosome 22 // Hum. Genet. 2001. - V. 109. - P. 628-637;

14. Berg J. Zinc fingers and other metal-binding domans. Elements for interactions between macromolecules // .I.Biol.Chem. 1990. - V. 265. P. 6513-6516;

15. Bibillo A., Eickbush T. High processivity of the reverse transcriptase from a non-long terminal repeat retrotransposon // J. Biol. Cliem. 2002. - V. 277. - P. 34836-34845;

16. Bibillo A., Eickbush T. The reverse transcriptase of the R2 non-LTR retrotransposon: continuous synthesis of cDNA on non-continuous RNA templates // J. Mol. Biol. 2002. - V. 316. - P. 459-473;

17. Blum, H., Beier, H., and Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins RNA and DNA in polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1987.1. V. 8. P. 93-99;

18. Boeke J.D., Pickeral O.K. Retroshuffling the genomic deck // Nature.1999. V. II. P. 108-109;

19. Boeke J.D. LINEs and Alus the polyA connection // Nat. Genet. - 1997. -V. 16. - P. 6-7;

20. Boissinot S., Chevret P., Furano A.V. LI (LINE-1) retrotransposon evolution and amplification in recent human history // Mol. Biol. Evol.2000. V. 17.-P. 915-928;

21. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254;

22. Bratthauer G., Fanning T.G. Active LINE-1 retrotransposons in human testicular cancer // Oncogene. 1992. - V. 7. - P. 507-510;

23. Brattliauer G., Cardiff R.D., Fanning T.G. Expression LINE-1 retrotransposons expression in human breast cancer // Cancer. 1994. V. 73. - P. 2333-2336;

24. Bratthauer G., Fanning T.G. LINE-1 retrotransposon expression in pediatric germ cell tumors // Cancer. 1993. - V. 71. - P. 2383-2386;

25. Brown P.O., Bowerman В., Varmus H.E., Bishop J.M. Correct integration of retroviral DNA in vitro // Cell. 1987. V. 49. P. 347-356;

26. Burke T.W., Kadonaga J.T. Drosophila TF1ID binds to a conseved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters // Genes Dev. 1996. - V. 10. - P. 71 1-724;

27. Burwinkel В., Kiliman M. Unequal homologous recombination between LINE-1 elements as a mutational mechanism in human genetic disease // J.Mol.Biol. 1998. - V. 277. - P.513-517;

28. Bushman F.D., FujiwaraT., Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro // Science. 1990. - V. 249. - P. 15551558;

29. Cantrell M., Grahn R., Scott L., Wichman H. isolation of markers from recently transposed LINE-1 retrotransposons // Biotechniques 2000. - V. 29. - P. 1310-1315;

30. Chamboissier M.C., Busseau F, Prosser J., Finnegan D.J., Bucheton A. Identification of a potential RNA intermediate for transposition of the LINE-like element I factor in Drosophila melanogaster // EMBO J. 1990. - V. 9. - P. 3557-3563;

31. Chen F., MacDonald C.C., Wilusz J. Cleavege site determinants in the mammalian polyadenilation signal // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. -P. 2614-2620;

32. Clements A.P., Singer M.F. The human LINE-1 reverse transcriptase: effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 3528-3535;

33. Cost, G., and Boeke, J.D. Targeting of human retrotransposon integration is directed by the specificity of the L I endonuclease for regions of unusual DNA structure // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 18081-18093;

34. Cost GJ, Feng Q, Jacquier A, Boeke JD. Human LI element target-primed reverse transcription in vitro // EMBO J. 2002. - V. 21. - P. 5899-5910;

35. DeBerardinis R.J., Gabriel A., Swergold G.D., Kazazian H.H. Jr. Many human LI elements are capable of retrotransposition // Nat Genet. 1997. -V.I6. - P. 37-43;

36. DeBerardinis R.J., Kazazian H.H. Jr. Analysis of the promoter from an expanding mouse retrotransposon subfamily // Genomics. 1999. - V. 56. -N.3.-P. 317-323;

37. Deragon J.M., Sinnett D., Labuda D. Reverse transcriptase activity from human embryonal carcinoma cells NTera2DI // EMBO J. 1990. - V. 9. -P. 3363-3368;

38. Dhellin 0., Maestre J., Heidmann T. Functional differences between the human LINE retrotransposon and retroviral reverse transcriptases for in vivo mRNK reverse transcription // EMBO J. 1997. - V. 16. - N. 21. - P.6590-6602;

39. Dombroski B.A., Mathias S.L., Nanthakumar E., Scott A.F., Kazazian H. Jr. Isolation of an active human transposable element // Science. 1991. -V. 254. - P. 1805-1808;

40. Dombroski B.A., Scott A.F., Kazazian H.H. 2 Additional potential retrotransposons isolated from a human Ll subfamily that contains an active retrotransposable element // PNAS. 1993. - V. 90. - N. 14. - P. 6513-6517;

41. Dongmei et al. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: A mechanism for non-LTR retrotransposition //Cell. 1993. V. 72. P. 595-605;

42. Duvernell D., Turner B. Swimmer 1, a new low-copy-number LINE family in teleost genomes with sequence similarity to mammalian Ll //

43. Mol.Biol.Evpl. 1998. - V.15. - P.1791 -1793;

44. Eichinger D.J., Boeke J.D. A specific terminal structure is required for Ту 1 transposition // Genes Dev. 1990. - V. 4. - P. 324-330;

45. Feng Q., Moran J., Naas Г., Boeke J., and Kazazian H. Human LI retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition // Cell. 1996. - V. 87. - P. 905-916;

46. Feng Q., Schumann G.,Boeke J.D. Retrotransposon R1 Bin endonuclease cleaves the target sequence // PNAS. 1998. - V. 95. - P. 2083-2088;

47. Fitch D., Bailey W., Slightom J. Duplication of the gamma-globin gene mediated by 11 long interspersed repetitive elements in an early ancestor of simian primates // PNAS. 1991. - V. 88. - P. 7396-7400;

48. Geisse S., Gram H., Kleuser B. Eukaryotic expression systems: a comparison // Prot. Exp. Pur. 1996. - V. 8. - P. 271-282;

49. Goodier J., Ostertag E., Du K., Kazazian H.Fl.Jr. Transduction of 3'-flanking sequences is common in LI retrotransposition // Hum.Mol.Genet.- 2000. V.9. - P. 653-657;

50. Goodwin Т., Ormandy J., Poulter R. LI-like nonOLTR retrotransposons in the yeast Candida albicans // Curr.Genet. 2001. - V. 39. - P. 83-91;

51. Guan, K. L., and Dixon, J. E. Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli: An improved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteins with glutathione S-transferase // Anal. Biochem. 1991. V. 192.- P. 262-267;

52. Harrison G., Mayo V., Hunter E., Lever A. Pausing of reverse transcriptase on retroviral RNA templates is influenced by secondary structures both 54 and 34 of the catalytic site // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - N. 14. -P. 3433-3442;

53. Hirose Y., Manley J. RNA polymerase II is an essential mRNA polyadenilation factor// Nature. 1998. - V. 395. - P. 93-96;

54. Hohjoli 11., Singer M.F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-I protein and RNA // EMBO J. 1996. - V. 15. -N. 3. - P. 630-639;

55. Hoh joh H., and Singer M. J. Ribonuclease and high salt sensitivity of the ribonucleoprotein complex formed by the human LINE-I retrotransposon // J. Mol. Biol. 1997.-V. 271.-P. 7-12;

56. Hohjoh H. and Singer M. Sequence-specific single-strand RNA binding protein encoded by the human LINE-I retrotransposon // EMBO J. 1997. - V. 16. P. 6034-6043;

57. Holmes S.E., Dombrowski B.A., Krebs C.M., Boehm CD., Kazazian H.H. Jr. A new retrotransposable human LI element from the LRE2 locus on chromosome Iq produces a chimaeric insertion // Nat. Genet. 1994. V. 7.-p. 143-148;

58. Huber H., McCoy J., Seehra J., Richardson C. // J. Biol. Chem. 1989. -V. 264. - P. 4669-4678;

59. Hughes J., Coffin J. Evidence for genomic rearrangements mediated by hyman endogenous retroviruses during primate evolution // Nat. Genet. -2001. V. 29. - P. 487 -489;

60. Isel C., Ehresmann C., Keith G., Ehresmann В., Marquet R. Two step synthesis of (-) strong-stop DNA by avian and murine reverse transcriptases in vitro // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - N. 3. - P. 545-552;

61. Janicic N., Pausova Z., Cole D., Hendy G. Insertion of an Alu sequence in the Ca(2+)-sensing receptor gene in familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism // Am. J. Hum. Genet. 1995. -V. 56. - P. 880-886;

62. Jurka J. Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons // PNAS. 1997. - V. 94. - P. 18721897;

63. Katz R.A., Merkel G., Kulkosky J., Leis J., Skalka A.M. The avian retroviral IN protein is both necessary and sufficient for integrative recombination in vitro // Cell. 1990. - V. 63. - P. 87-95;

64. Katz R.A., Skalka A.M. // Annu. Rev. Genet. 1990. - V. 24. - P. 409445;

65. Katz R.A., Skalka A.M. //Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 133173;

66. Kazazian H.H. Jr., Wong C., Youssoufian H., Scott A.F., Phillips D.G., Antonarakis S.E. Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represents a novel mechanism for mutation in man // Nature. -1988,-V. 332. P. 164-166;

67. Kazazian H.H. Jr. Mobile elements and disease // Curr. Opin. Genet. Dev. -1998. -V. 8.-P. 343-350;

68. Kazazian H.H. Jr., Moran J.V. The impact of LI retrotransposons on the human genome // Nat. Genet. -- 1998. V. 19. - P. 19-24;

69. Kimberland M.L., Divoky V., Prchal J., Schwahn U., Berger W., Kazazian H.H. Jr. Full-length human LI insertions retain the capacity for high frequency retrotransposition in cultured cells // Hum. Mol. Genet. 1999. -V. 8. - P. 1557-1560;

70. King, L.A., and Possee, R.D. "The Baculovirus Expression System. A laboratory guide." 1st ed., Chapman & Hall, London. 1992;

71. Kingsmore S., Giros В., Suh D., Bieniarz M., Caron M., Seldin M: Glycine receptor beta-subunit gene mutation in spastic mouse associated with LINE-1 element insertion//Nat. Genet 1994. - V. 7. - P. 136-141;

72. Kohlstaedt L., Wang J., Friedman J., Rice P., Streitz T. // Science. 1992.1. V. 256. P. 1783-1790;

73. Kohrman D., Harris J., Meisler M. Mutation detection in the med and medJ alleles of the sodium channel Scn8a. Unusual splicing due to a minor class AT-AC intron // J. Biol. Cliem. 1996. - V. 271. P. 17576-17581;

74. Kuroda, K„ Geyer, H„ Geyer, R„ Doerfler, W„ and Klenk, H. D. (1990) The oligosaccharides of influenza virus hemagglutinin expressed in insect cells by a baculovirus vector // Virology. 1990. - V. 174. P. 418-429;.

75. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature (London). 1970. -- V. 227. - P. 680685;

76. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., Nusbaum C. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. 2001. - V. 409. - P. 860921;

77. Leibold D.M., Swergold G.D., Singer M.F., Thayer R.E., Dombroski B.A., Fanning T.G. Translation of LINE-1 DNA elements in vitro and in human cells // PNAS. 1990. - V. 87. - P. 6990-6994;

78. Luan D., Komi an M., Jakubczak J., Eickbush T. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition // Cell. 1993. -V. 72. P. 595-605;

79. Luan D., Eickbush T. RNA template requirements for target DNA-primed reverse transcription by the R2 retrotransposable element // Mol. Cell. Biol. 1995. - V. 15. - P. 3882-3891.

80. Luckow, V. A. Baculovirus systems for the expression of human gene products // Curr. Opin. Biotechnol. 1993. - V, 4. - P. 564-572;

81. Malik I I., Burke W., Eickbush T. The age and evolution of non-LTR retrotransposable elements // Mol. Biol. Evol. 1999. - V. 16. - P. 793805;

82. Malik H., Eickbush T. Phylogenetic analysis of ribonuclease H domains suggests a late, chimeric origin of LTR retrotransposable elements and retroviruses // Genome Res. 2001. V. 11. P. 1187-1197;

83. Mathews L., Chi S., Greenberg N., Ovchinnikov I., Swergold G. Large differences between LINE-1 amplification rates in the human and chimpanzee lineages // Am. J. Hum. Genet. 2003. - V. 72. - P.739-748;

84. Mathias S.L., Scott A.F., Kazazian H.H., Boeke J.D., Gabriel A. Reverse Transcriptase Encoded by a Human Transposable Element // Science. -1991. V. 254.-P. 1808-1810;

85. Martin S.L., Li J., Epperson L.E., Lieberman B. Functional reverse transcriptases encoded by A-type mouse LINE-1: defining the minimal domain by deletion analysis // Gene. 1998. - V. 215. - P. 69-75;

86. McCracken S„ Fong N„ Yankulov K„ Ballantyne S., Pan G„ et al. The C-terminal domain of RNA polymerase li couples mRNA processing to transcription // Nature. 1997. - V. 385. - P.357-361;

87. McDevitt M., Impriale M., All H., Nevins J. Requirement of a downstream sequence for generation of poly(A) addition site // Cell 1984. - V. 37. -P. 993-999;

88. McLuachlan J., Gaffney D., Whitton j., Clements J., The consensus sequence YGTGTTYY located downstream from the AATAAA signal is required for efficient formation of rnRNA 3'termini // Nucleic Acid Research 1985. - V. 13. - P. 1347-1368;

89. McMillan J., Singer M. Translation of the human LINE-1 element, LI Hs // PNAS 1993. - V. 90. - P. 11533-11537;

90. Mears M., Hutchinson С. The evolution of modern lineages of mouse Ll elements // J.Mol.Evol. 2001. - V. 52. - P. 51-62;

91. Miki Y., Nishisho I., Horii A., Miyoshi Y., Utsunomiya J., Kinzler K.W., Voglestein В., Nakamura H. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of Ll sequence in a colon cancer // Cancer Res. -1992 V. 52.- P. 643-645;

92. Minchiotti G., Contursi C., Di Nocera P. Multiple down stream promoter modules regulate the transcription of the Drosophila Melanogaster I, Doc and F elements // J.Mol.Biol. 1997. - V.267. - P.37-46;

93. Mizrokhi L., Georgieva S., Ilyin Y. Jockey, a mobile Drosophila element similar to mammalian LINEs, is transcribed from internal promoter by RNA polymerase 11 // Cell 1988. - V.54. P.685-691;

94. Morales J., Snow E., Murnane J. Environmental factors affecting transcription of the human L l retrotransposon. 11. Stressors. // Mutagenesis 2003,-V. 18.-P. 151-158;

95. Moran J.V., Naas T.P., Boeke J.D., and Kazazian H.H. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells // Cell. 1996. - V. 87. - P. 917-927;

96. Moran J.V., DeBerardinis R.J., Kazazian H.H. Jr. Exon shuffling by L l retrotransposition // Science. 1999. - V. 283. - N. 5407. - P. 1530-1534;

97. Morrish Т., Gilbert N., Myers J., Vincent В., Stamato Т., Taccioli G., Batzer M., Moran J. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition // Nat. Gen. 2002. - V. 31. - P. 159-165;

98. Muratani K., Hada Т., Yamamoto Y., Kaneko Т., Shigeto Y., Ohue Т., Furuyama J., Higashino K. Inactivation of the cholinesterase gene by Alu insertion: possible mechanism for human gene transposition // PNAS. -1991. V. 88. - P. 11315-11319;

99. Naas T.P., DeBerardinis R.J., Moran J.V., Ostertag E.M., Kingsmore S.F., Seldin M.F., Hayashizaki Y., Martin S.L., Kazazian H.F1. An actively retrotransposing, novel subfamily of mouse LI elements // EMBO J. -1998. V. 17. - N.2. - P. 590-597;

100. Osheim Y., Proudfoot N., Beyer A., EM visualization of transcription by RNA polymerase II: downstream termination requires a poly(A) signal but not transcript cleavage // Mol.Cell 1999. - V.3. - P. 379-387;

101. Ostertag E M. and Kazazian H.H. Biology of mammalian L I retrotransposons // Annu. Rev. Genet. 2001. - V. 35. - P. 501-538;

102. Ovchinnikov I., Troxel A., Swergold G. Genomic characterization of recent human LINE-I insertions: evidence supporting random insertion // Genome Res.-2001.-V. II. P. 2050-2058;

103. Pavlicek A., Paces J., Zika R., Hejnar J. Length distribution of LINEs and processed pseudogenes of human endogenous retroviluses: implications for retrotransposition and pseudogen detection // Gene 2002. - V. 300. - P. 189-194;

104. Perou C.M., Pryor R.J., Naas T.P., Kaplan J. The allele mutation is due to a LINE I element retrotransposition // Genomics. 1997. - V. 42. - P. 366368;

105. Reynolds E.S., The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. - V. 17. - P. 208-212;

106. Pfeiffer J., Topping R., Shin N., Telesnitsky A. Altering the intracellular environment increases the frequency of tandem repeat deletion during moloney murine leukemia virus reverse transcription // J. Virology. 1999.

107. V.73. N. 10. P. 8441-8447;

108. Piskareva O A., Denmukhametova S.V., Schmatchenko V.V. Functional reverse transcriptase encoded by the human LINE-I from baculovirus -infected insect cells // Prot. Exp. Pur. 2003. - V. 28. - N. I. - P. 125-130;

109. Prak E., Dodson A., Farkash E., Kazazian H.H. Jr. Tracking an embryonic LI retrotransposition event // PNAS. 2003. - V. 100. - P. 1832-1837;

110. Salem A., Myers J., Otieno A., Watkins W., Jorde L„ Batzer M. LINE-1 preTa elements in the human genome // J. Mol. Biol. 2003. - V. 326. P. 1127-1146;

111. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

112. Sandmeyer S.B., Hansen L.J., Chalker D.L. Integratino specificity of retrotransposons and retroviruses // Annu. Rev. Genet. 1990. - V. 24. - P. 491-518.

113. Sassaman D.M., Dombroski B.A., Moran J.V., Kimberland M.L., Naas T.P., et al. Many human 11 elements are capable of retrotransposition // Nat. Genet. 1997. - V. 16. - P. 37-43;

114. Segal Y., Peissel В., Renieri A., de Marchi M„ Ballabio A., et al. LINE-1 elements at the sites of molecular rearrangements in Alport syndromediffuse leiomyomatosis // Am .I.Hum.Genet. 1999. - V. 64. -P.62-69;

115. Singer M.F., Skowronski J. Making sense out of LINEs: long interspersed repeat sequences in mammalian genomes // Trends Biochem. Sci. 1985. -V. 10. - P. 119-122;

116. Skalka, A.M., and Goff, S.P. Reverse Transcriptase // Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. - 1993;

117. Skowronski J., Fanning Т., Singer M. Unit-length line-1 transcripts in human teratocarcinoma cells // Mol. Cell Biol. 1988. - V. 8. - P. 13851397.

118. Smit A.F. The origin of interspersed repeats in the human genome // Curr. Opm. Genet. Dev. 1996. - V. 6. - P. 743-748;

119. Stoppa-Lyonnet D., Carter P., Meo Т., Tosi M. Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human C I inhibitor locus to deleterious rearrangements// PNAS 1990 - V. 87.-P. 1551-1555;

120. Swergold G. Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter// Mol. Cell Biol. 1990. - V. 10. - P. 67186729;

121. Szak S., Pickeral O., Landsman D., Boeke J. Identifying related LI retrotransposons by analyzing 3' transduced sequences // Genome Biol. -2003. V. 4. - P. 30;

122. Taube, R., Loya, S., Avidan, O., Peracli, M., and Hizi, A. (1998) Reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus: expression in bacteria, purification and biochemical characterization // Biochem. J. 1998. - V. 329. - P. 579-587;

123. Trelogan S.A., Martin S.L. Tightly regulated, developmentally specific expression of the first open reading frame from LINE-1 during mouse embryogenesis // PNAS. 1995. - V. 92. - P. 1520-1524;

124. Vishvvanatha J., Jindal IT, Davis R. // J. Cell Sci. 1992. V. 101. P. 25-34.

125. Wallace M.R., Andersen L.B., Saulino A.M., Gregory P.E., Glover T.W., Collins F.S. A de novo Alu insertion results in neurofibromatosis type I // Nature. 1991. - V. 353. - P. 864-866;

126. Wei W„ Gilbert N., Ooi S.L., Lawler J.F., Ostertag E.M., Kazazian 11.H., Boeke J.D., Moran J.V. Human LI retrotransposition: cis preference versus trans complementation // Mol. Cell Biol. 2001. - V. 21. - P. 1429-1439;

127. Whitcomb J., Hughes S. Retroviral reverse transcription and integration: progress and problems // Annu.Rev.Cell Biol. 1992. - V.8. P. 275-306;

128. Williams K., Loeb L., Fryll M. Synthesis of DNA by human immunodeficiency virus reverse transcriptase is preferentially blocked at template oligo(deoxyadenosine) tracts // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. -N 30.-P. 1868-18669;

129. Woods-Samuels P., Wong C., Mathias S.L., Scott A.F., Kazazian H. Jr.,1

130. Antonarakis S.E. Characterization of a nondeleterious LI insertion in anintron of the human factor VIII gene and further evidence of open reading frames in functional LI elements // Genomics. 1989. V. 4. - P. 290-296;

131. Xiong Y., Eickbush Т.Н. The site-specific ribosomal DNA insertion element R IBm belongs to a class of non-long-terminal-repeat retrotransposons // Mol. Cell. Biol. 1988. - V. 8. - P. 114-123;

132. Xiong Y., Eickbush Т.Н. Functional expression of a sequence-specific endonuclease encoded by the retrotransposon R2Bm // Cell. 1988. - V. 55.-P. 235-246;4 145. Young M., Inaba H., Hoyer L.W., Higuchi M., Kazazian H.H. Jr.,

133. Yoshio M., Tohoku J. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of LI sequence in a colon cancer// Cancer Res. 1992. V. 52. -P. 643-645;

134. Я благодарю к.б.н. Снежкова Е В. за предоставленную культуру клеток насекомых Sf2l, а Деньмухаметову С.В. за рутинное ведение культуры и не только.

135. Я хотела бы выразить глубокую благодарность к.б.н. Шматченко Н А. за исчерпывающие консультации по очистке белков и предоставление х ро м а гографи ч ее к и х с м ол.

136. И, наконец, но не в последнюю очередь благодарю своих родителей за поддержку на протяжении всего периода выполнения исследований и подготовки диссер гаци и.

137. Работа частично поддержана грантом European Molecular Biology Organisation (ASTF 62-2003)