Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы при температурной адаптации рыб тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Персиков, Антон Валерьевич

• Персиков, Антон Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Персиков, Антон Валерьевич

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Температурные адаптации белков

2.1.1. Физиологический уровень адаптаций: как перестраивается метаболизм в ответ на изменение температуры

2.1.2. Воздействие температуры на функциональные и структурные свойства ферментов

2.2. Строение лактатдегидрогеназы

2.2.1. Структурам свойства лактатдегидрогеназы

2.2.2. Строение активного центра ЛДГ

2.2.3. Воздействие температуры на функциональные и структурные свойства ЛДГ

2.3. Термодинамические свойства белков при температурной денатурации и механизмы их термостабильности

2.3.1. Денатурация небольших глобулярных белков

2.3.2. Денатурация сложных белков

2.3.3. Взаимодействие белков с лигандами

2.3.4. Анализ необратимых переходов в белках

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Краткая характеристика объектов

3.2. Выделение лактатдегидрогеназы из мышц рыб

3.3. Определение активности ЛДГ

3.4. Определение максимальной скорости реакции

3.5. Термоинактивация ЛДГ

3.6.Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия

3.9. Деконволюция кривых ДСК

3.8. Измерение абсолютной величины теплоемкости нативной и денатурированной формы ЛДГ

3.9. Кинетическое исследование температурной денатурации

3.10. Определение содержания ионов цинка в ЛДГ методом рентгеноспектрального флуоресцентного анализа

3.11. Компьютерный анализ трехмерной структуры молекулы м4-ЛДГ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Влияние температуры на активность ЛДГ

4.1.1. Температурный оптимум ферментативной реакции

4.1.2. Кинетика температурной инактивации ЛДГ

4.1.3. Определение термодинамических параметров ферментативной реакции для «холодной» и «теплой» ЛДГ

4.2. Микрокалориметрическое исследование температурной денатурации ЛДГ

4.2.1. Температурная зависимость избыточной теплоемкости ЛДГ

4.2.2. Изменение термодинамических параметров денатурации ЛДГ при разных рН раствора

4.2.3. Анализ деконволюции калориметрических кривых

4.2.4. Вычисление температурной зависимости изменения свободной энергии Гиббса при денатурации

4.3. Определение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме

4.3.1. Измерение теплоемкости ЛДГ в нативной форме при 25°С

4.3.2. Измерение теплоемкости денатурированной формы ЛДГ при 25°С

4.3.3. Вычисление теплоемкости денатурированной формы ЛДГ по аминокислотному составу

4.4. Кинетические особенности температурной денатурации ЛДГ

4.5. Исследование возможности связывания ионов цинка молекулой ЛДГ

4.6. Измерение содержания цинка в молекуле «холодной» и «теплой» форм ЛДГ

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Функциональные свойства ЛДГ из мышц вьюна при адаптации к разным температурам

5.1.1. Температурный оптимум ферментативной реакции ЛДГ

5.1.2. Кинетика термоинактивации фермента

5.1.3. Термодинамические параметры ферментативной реакции для «холодной» и «теплой» ЛДГ

5.2. Микрокалориметрическое исследование температурной денатурации ЛДГ

5.2.1. Анализ температурной зависимости избыточной теплоемкости ЛДГ. Калориметрическая энтальпия денатурации ЛДГ

5.2.2. Влияние рН на термодинамические параметры тепловой денатурации ЛДГ

5.2.3. Анализ деконволюции кривых плавления «холодной» и «теплой» ЛДГ

5.2.4. Температурная зависимость изменения свободной энергии Гиббса при денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ

5.3. Определение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме

5.4. Особенности необратимого характера температурной денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ

5.4.1. Доказательство применимости термодинамики обратимых процессов к анализу денатурации ЛДГ

5.4.2. Кинетический анализ температурной денатурации ЛДГ

5.5. Изучение возможности связывания ионов цинка молекулой ЛДГ

6. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы при температурной адаптации рыб»

1. ВВЕДЕНИЕ

Изучение физиологических и биохимических особенностей адаптации пойкилотермных животных к разным температурам имеет важное значение для понимания регуляторных механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность этих организмов в различных условиях среды. Важное место в приспособлении пойкилотермных к разным температурным условиям занимают ферменты, обеспечивающие метаболические перестройки при изменении температуры.

В то время, как механизмы эволюционных приспособлений к различным температурным условиям детально исследованы (Александров, 1975; Хочачка, Сомеро, 1988; Holland et al., 1997 и др.), онтогенетические температурные адаптации, формирующиеся на протяжении нескольких недель или месяцев, изучены фрагментарно (Клячко и др., 1993; Ozernyuk et al., 1994; Vetter, Buchholz, 1997). Изменение функциональных и структурных свойств белков при адаптациях к различным температурам обитания определяется, с одной стороны, аминокислотными заменами, а с другой - взаимодействием белков со стабилизирующими факторами (катионами, коферментами, мембранами, пептидами) (Argos et al., 1979; Jaenicke, 1991; Fields, Somero, 1997).

Изменения претерпеваемые белками при кратковременных температурных адаптациях (акклимациях) и сезонных адаптациях, изучены недостаточно. Особенно важным представляется изучение структурных изменений в белках при температурных акклимациях пойкилотермных животных, поскольку эти изменения лежат в основе функциональных особенностей белков.

Для изучения структурных и функциональных изменений в белках при температурной акклимации был выбран фермент углеводного обмена - лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Известно, что этот детально изученный

фермент проявляет высокую степень полиморфизма и чувствительность к различным воздействиям. В связи с этим можно ожидать, что изучение структурных и функциональных особенностей данного фермента в различных температурных условиях может служить адекватной моделью для исследования молекулярных механизмов адаптации ферментативных процессов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Температурные адаптации белков.

2.1Л. Физиологический уровень адаптаций: как перестраивается метаболизм в ответ на изменение температуры.

Влияния экологических факторов на функциональные и структурные особенности белков и ферментов, в частности, в последние годы является предметом интенсивных исследований. При этом, наибольший интерес вызывает температура, поскольку у пойкилотермных животных этот фактор среды меняет температуру тела и, следовательно, скорость реакций метаболизма. Однако, влияние температуры на скорость метаболических процессов - не единственный вид температурных воздействий.

В литературе обсуждается несколько возможностей регуляции метаболизма при температурной акклимации пойкилотермных животных. Так, в частности, Шакли с сотрудниками (81шк1ее е! а1., 1977) рассмотрели несколько основных механизмов, в соответствии с которыми может регулироваться суммарный поток метаболитов:

1) изменения концентрации субстратов и/или продуктов метаболического пути (либо прямой, либо обратной реакции);

2) изменения концентрации модуляторов, которые влияют на каталитическую активность ферментов;

3) конформационные изменения ферментов, приводящие к изменениям в Км, Утах и др.;

4) изменения количества ферментов, которые катализируют отдельные реакции в рамках данного метаболического пути;

5) изменения изоферментных спектров.

Все эти типы регуляции были рассмотрены (8Ьак1ее ег а1., 1977) при анализе более десяти ферментов углеводного и окислительного

метаболизма в процессе температурной акклимации к низким и высоким температурам зеленой солнечной рыбы Leponis cyanellus. V

Все пять вышеупомянутых механизмов в различной степени влияют на динамику регуляции метаболизма в период температурной акклимации. Анализу первых трех механизмов посвящен ряд работ (Moon, Hochachka, 1971* 1972; Somero, 1975; Dittrich, 1992; Vetter, Buchholz, 1997 ; Holland et al., 1997; Pierce, Crawford, 1997 и др.).

В цитированной выше работе (Shaklee et al, 1977) рассматриваются механизмы изменения количества ферментов, а также изменения изоферментных спектров. Следует отметить, что все перечисленные механизмы в разной степени играют регулирующую роль для различных органов и тканей тех или иных видов рыб при температурных адаптациях.

2.1.2. Воздействие температуры на функциональные и структурные

свойства ферментов.

Анализ механизмов температурной адаптации ферментов предполагает изучение их кинетических свойств при разных температурах среды. Так, отличительной особенностью адаптации ферментов к низкой температуре является их более высокая каталитическая эффективность, которая компенсирует неизбежное падение скорости химической реакции при понижении температуры (Хочачка, Сомеро, 1988). Эта оптимизация каталитических параметров определяется высокой гибкостью структуры этих белков, обеспечивающей повышенную способность подвергнуться конформационным изменениям в процессе катализа при низких температурах.

Молекулярное моделирование трехмерной структуры адаптированных к холоду ферментов показывает, что только тонкие конформационные изменения в ферменте, связаны с их адаптацией (Feller et al., 1997). Наблюдаемые структурные особенности включают: 1) сокращение числа слабых взаимодействий, вовлеченных в стабильность нативной структуры, таких как солевые мостики, слабо

полярные взаимодействия между ароматическими группами, водородные связи, содержание аргинина и дипольные взаимодействия в а-спиралях;

2) понижение уровня гидрофобности гидрофобных кластеров, формирующих ядро белковой глобулы;

3) стирание или замена пролиновых остатков в петлях или поворотах, соединяющих вторичные структуры;

4) усиление солевых связей с гидрофильной поверхностью посредством экспонирования дополнительных заряженных участков;

5) смещение глициновых кластеров ближе к функциональным областям молекулы;

6) изменение констант связывания ионов металлов, в частности Са+2.

Не существует общего правила наблюдаемых изменений в разных случаях. Каждый фермент принимает собственную стратегию адаптации, используя одно или комбинацию этих изменений. Следует отметить, что у термофильных ферментов наблюдаются такие же типы структурных особенностей, поэтому можно говорить об общности в стратегии адаптации белков к температуре (Feller et al., 1997).

Известно, что основной кинетической характеристикой ферментов принято считать константу Михаэлиса (Км), численно равную концентрации субстрата, при которой скорость данной реакции составляет половину от максимальной. Чем больше фермент-субстратная аффинность, тем меньшая концентрация субстрата требуется для достижения максимальной скорости реакции, и следовательно, тем меньше будет численное значение Км. Таким образом , величина Км обратна степени сродства фермента к субстрату. При избытке субстрата изменение Км мало отразится на скорости реакции. Поскольку концентрация субстратов в клетке низкая, изменение Км служит регулятором скорости ферментативной реакции. Величина Км зависит от температуры в самом широком смысле, т.е. от температуры обитания вида, температуры акклимации и от температуры опыта (Holland et al.,

1997; Jagdale, Gordon, 1997; Vetter, Buchholz, 1997; Zietara et al., 1997 и

др.)-

Обычно выделяют эволюционный и онтогенетический уровни адаптаций ферментов пойкилотермных животных к температуре среды (Александров, 1975; Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Argos et al., 1979; Клячко и др., 1992, 1993; Ozernyuk et al., 1994). Остановимся подробнее на примерах эволюционных температурных адаптаций ферментов.

Исследование взаимосвязи температуры обитания и функциональных свойств ферментов у пойкилотермных животных наиболее основательно проведено Хочачкой, Сомеро и их сотрудниками (Хочачка, Сомеро, 1977, 1988). Из этих работ следует, что у большинства изученных ферментов пойкилотермных животных наблюдается зависимость Км от температуры обитания вида, от температуры акклимации и температуры опыта.

В исследованиях по зависимости кинетических свойств ферментов от температуры среды минимальная величина Км обнаруживается при температуре, близкой к температуре обитания вида. Например, минимальное значение Км для глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы камчатского краба, средняя температура обитания которого около 7°С, находится при 5°С (Somero, 1969). Было показано, что пируваткиназа в мышцах камчатского краба существует в двух различных формах: фермент, адаптированный к низким температурам, имеет минимум Км при 5°С, а при адаптации к относительно высоким - минимум при 12°С. «Холодный» фермент активен лишь при температуре ниже 10°С, а «теплый» - при температуре выше 9°С (Somero, 1969).

Из изложенных выше данных, следует, что у животных, обитающих в различных температурных условиях, положение температурного минимума Км различается и соответствует в общем температуре обитания вида (Хочачка, Сомеро, 1988). Причиной этих различий могут являться аминокислотные замены в участках полипептидной цепи вдали от активного центра. Эти замены могут независимо влиять как на кинетические свойства, так и на

термостабильность ЛДГ (Hewitt et al, 1997; Holland et al., 1997; Pretsch et al, 1998).

Подробное изучение этой проблемы было проведено в лаборатории Дж. Сомеро (Holland et al, 1997) на МрЛДГ из мышц шести видов барракуд (семейство Sphyraena). Анализ первичной структуры м4-ЛДГ (на основе секвенирования кДНК) показал, что для гомологов из трех видов: самого северного - S. argentea, субтропического - S. lucas ana и самого южного - S. idiastes, выявляются четыре аминокислотные замены: в позициях 8, 61, 68 и 223. Показано, что замены 61 и 68 аминокислотных остатков приводят к различию в величинах Км между S. argentea и S. lucasana. Различия в позиции 8, в свою очередь, являются причиной разной термостабильности гомологов м4-ЛДГ из S. argentea, S. idiastes и S. lucasana.

Следует отметить, что у животных, обитающих в различных температурных условиях и отличающихся степенью эвритермальности, может меняться темп изменения Км при разных температурах опыта (Хочачка, Сомеро, 1988; Coppes, Somero, 1990).

Если механизмы эволюционных адаптаций ферментов к температурным условиям детально исследованы, то онтогенетические температурные адаптации (акклимации), формирующиеся на протяжении нескольких недель, изучены недостаточно. В ряде работ установлено, что функциональная активность ферментов может модифицироваться относительно кратковременными (несколько недель) температурными воздействиями (Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Dittrich, 1992; Клячко и др., 1993; Ozernyuk et al., 1994). Температурная акклимация, приводящая к изменению функциональных и структурных свойств ферментов, в некоторых случаях связана с синтезом новых изоформ ферментов. В других случаях синтеза новых изоферментов при изменении температуры не происходит.

При перенесении особей одного вида в разные температурные условия кривая зависимости Км от температуры, а также положение температурного минимума Км меняются. Болдуин (Baldwin, 1971)

определял Км для ацетилхолина у ацетилхолинэстеразы из головного мозга форели, акклимированной к 2°С и 18°С. Температурный минимум Км при акклимации к низким температурам был отмечен при 2°С, а при адаптации к высоким температурам - при 20°С.

Хебб и сотрудники (Hebb et al., 1972) исследовали кинетические свойства ацетилхолинтрансферазы мозга у золотых рыбок, акклимированных к 6°С и 30°С. Было установлено , что минимальная величина Км (для холина и ацетил-КоА) приблизительно соответствует температуре акклимации каждой группы рыб. Эти изменения температурной зависимости сродства фермента к субстратам при акклимации, по мнению авторов не связаны с наличием разных изозимов. Они считают, что повышенное сродство фермента к субстрату при температуре акклимации обеспечивает стабилизацию фермента в этих условиях. Данные, полученные Муном и Хочачкой показывают, что у форели, акклимированной в течение четырех недель к 17°С, минимум Км для изоцитратдегидрогеназы из мышц приходился на 15-17°С, а у живущих при 2°С - соответствовало 3°С (Moon, Hochachka, 1971).

Верник и Кюнеман (Wernick, Künnemann, 1973) исследовали температурную зависимость Км для лактатдегидрогеназы у двух видов рыб (язя и горчака), адаптированных к температурам 10°С и 20°С. У язя, адаптированного к низким температурам, Км для данного фермента была минимальна при 10°С, а при акклимации к высоким температурам - при 20°С. В отличие от этого у горчака разные температуры акклимации не влияли на температурную зависимость Км для лактатдегидрогеназы.

Следует отметить, что температурная адаптация у пойкилотермных животных на уровне ферментов является тканеспецифическим процессом, т.е. в различных органах и тканях этот процесс протекает по разному (Shaklee et al., 1977; Vetter, Buchholz, 1997). Предполагается, что адаптация к температурным условиям важнее для мышечных изоформ ферментов пойкилотермных животных, из-за необходимости поддерживать перманентно высокую энергию метаболизма для обеспечения максимальной скорости плавания на достаточном уровне при

разных температурах среды (Buchholz, Vetter, 1993; Vetter, 1995; Franklin, Johnston, 1997; Hubley et al., 1997).

Важную роль в понимании механизмов онтогенетических температурных адаптации: ферментов сыграли работы по изучению изоферментных спектров при разных температурах среды. Болдуин и Хочачка (Baldwin, Hochachka, 1970), исследуя изоферменты ацетилхолинэстеразы из головного мозга форели , обнаружили, что при акклимации рыб к низким температурам (2°С) выявляется одна изоформа этого фермента, тогда как при адаптации рыб к относительно высоким температурам (18°С) обнаруживается другая изоформа, обладающая большей электрофоретической подвижностью, чем первая. Естественно, что температурная зависимость Км для этих двух изоформ ацетилхолинэстеразы отличается. Предполагается, что наличие этих изозимов имеет значение для приспособления организмов к температуре среды (Vetter, 1995).

Тщательное изучение электрофоретических спектров различных ферментов в разных органах и тканях было проведено при температурной

' '■'MS

акклимации к 5°С и 25°С зеленой солнечной рыбы Lepomis cyanneus (Shaklee et al., 1977). В этой работе было показано, что только изоферменты эстераз из печени и глаза отличаются при акклимации к низким и высоким температурам, тогда как спектр изоферментов ЛДГ, альдолазы, глицерофосфатизомеразы, фосфоглюкомутазы,

глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и креатинкиназы не меняются во всех изученных органах (скелетные мышцы, сердце, печень, глаз, мозг).

Как видно из изложенного выше, температура акклимации вызывает изменения спектра изоформ у небольшого числа ферментов, прежде всего эстераз.

В связи с обсуждением синтеза новых изоферментов вызванных температурой, следует отметить, что при кратковременной (5 недель) адаптации карпов к 10, 20 и 30°С, наблюдали изменения свойств миозина из скелетных мышц. Анализ сиквенса кДНК показал различия в

последовательности нуклеотидов. Следовательно, наблюдаемые изменения связаны с различиями в первичной структуре трех изоформ миозина (Hirayama, Watabe, 1997; Hirayama et al., 1997; Imai et al., 1997).

У большинства исследованных ферментов изозимные спектры при различных температурах акклимации не меняются. Вильсон и др. (Wilson et al.,1975) показали, что у золотых рыбок, акклимированных в течение четырех недель и более к температурам 5°С и 25°С не было обнаружено изменения изозимного состава лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в мозге, мышцах, сердце и печени. Также не различался изозимный спектр ЛДГ различных органов и у язя, адаптированного к 10°С и 20°С (Künnemann, 1973 ).

Изучение двух изоформ пируваткиназы из мышц (ПК I) и головогруди (ПК II) северного криля Meganyctiphanes norvegica, показало, что при адаптациях к сезонным колебаниям температуры, происходит изменение каталитических свойств только мышечной изоформы ПК I (Vetter, Buchholz, 1997). При изменении температуры с зимней на летнюю (с 5°С до 8°С), понижался уровень фермент-субстратной аффинности, о которой судили по росту Км от 0,024 ммоль/л до 0,033 ммоль/л. Для «зимних» и «летних» образцов энергия активации ПК I составляла 50,2±1,2 кДж/моль и 53,2±1,5 кДж/моль соответственно. Температурный оптимум активности был выше для «летнего» фермента (47°С), чем для «зимнего» (42°С).

В работах Озернюка с сотрудниками (Клячко и др., 1992, 1993; Ozernyuk et al., 1994) подробным образом изучены свойства ЛДГ из мышц вьюнов адаптированных к 5°С («холодный» фермент) и к 18°С («теплый» фермент). Минимум Км для «холодного» фермента находился при 9°С, а для теплого фермента - при 17°С. Также, как и в предыдущих работах, изменений изозимного спектра ЛДГ при адаптации вьюнов к низким и высоким температурам не происходило.

2.2. Строение лактатдегидрогеназы 2.2.1. Структура и свойства лактатдегидрогеназы.

Лактатдегидрогеназа (L-лактат НАД-оксиредуктаза, К.Ф. 1.1.1.27.) присутствует почти у всех живых организмов и катализирует взаимопревращения лактата и пирувата в углеводном обмене.

У большинства позвоночных ЛДГ кодируется двумя генными локусами А и В. Эти гены кодируют синтез двух субъединиц М и Н. Изоформа М-ЛДГ экспрессируется преимущественно в скелетных мышцах (преимущественно белых); изоформа Н-ЛДГ обнаружена в сердечных мышцах, красной мускулатуре, мозге. Поскольку нативная молекула ЛДГ является тетрамером, комбинации М и Н субъединиц образуют пять различных тетрамеров с отличающимися кинетическими и физико-химическими свойствами (Markert, 1963; Shaklee et al., 1977; Basaglia , 1989, 1991). Изоферментный состав ЛДГ зависит от того, какие гены экспрессируются в тех или иных тканях. У многих позвоночных в тканях присутствуют все пять изоферментов (М4, М3Н, М2Н2, МН3 и НД образующихся из полипептидов, продуктов генов А и В. В сетчатке глаза млекопитающих и птиц, а также у некоторых низших позвоночных, в частности, у рыб (Holbrook et al., 1975), экспрессируется С-ЛДГ. Позднее была найдена бактериальная изоформа этого фермента (D-ЛДГ) (Hondred, Hanson, 1990).

Субъединица С входит в состав гетерополимеров ЛДГ гораздо реже. Однако, ряд авторов находят ассоциацию как между Н и С субъединицами, так и между С и М субъединицами (Shaklee, 1975).

В зависимости от характера метаболизма в определенных тканях могут преобладать те или иные изоформы фермента. Так, в частности, субъединицы М преобладают в тканях, в которых образуется лактат, т.е. в условиях анаэробиоза. Напротив, ткани, постоянно снабжающиеся кислородом, обычно богаты изоформами Н.

Физиологическая роль разных изоформ до конца не ясна. Вообще, разные изоформы обладают неодинаковым сродством к субстрату, что создает определенные кинетические преимущества для ферментативного катализа в физиологических условиях, когда концентрация субстратов может меняться. Так для Н и С изоформ ЛДГ из колюшки Gasterosteus aculeatus, удельная активность составила соответственно 186 Е/мг и 229 Е/мг (Zietara et al., 1997). Более того, С-ЛДГ более термостабильна и обладает более высоким сродством к субстрату.

Для лактатдегидрогеназы определена молекулярная структура на всех уровнях: от первичной до четвертичной структуры. Было установлено, что молекула ЛДГ состоит из четырех субъединиц (Markert, Moller, 1959). Молекулярная масса каждой из субъединиц составляет около 35000 Да, весь тетрамер имеет молекулярную массу 140000 Да. Количество аминокислотных остатков в молекуле ЛДГ варьирует от 310 для фермента выделенного из культуры бактерий Thermus aquaticus (Ono et al., 1990) до 356 для ЛДГ из ячменя Hordeum vulgare (Hondred, Hanson, 1990). В мышечной изоформе (м4-ЛДГ) их число варьирует не сильно - от 329 для собачьей акулы (Eventoff et al., 1977) до 333 для шпорцевой лягушки (Tsuji et al., 1994).

Впервые обстоятельный анализ первичной структуры ЛДГ из тканей человека и животных был проведен в 1964 году (Wachsmuth et al., 1964). Первые же кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного дифракционного анализа, были получены для м4-ЛДГ из мышц собачьей акулы Squalus acanthius в 1967 году (Rossmann et al., 1967), однако, первая полная кристаллографическая структура ЛДГ была определена только через 20 лет (Abad-Zapatero et al., 1987). На сегодняшний день, в базе данных «Brookhaven protein data bank», содержится информация о первичной структуре ЛДГ из более чем восьмидесяти видов организмов.

Больше половины аминокислотных последовательностей в молекуле ЛДГ формируют регулярные структуры: a-спиральные участки и (3-цепи. В a-спиралях ЛДГ из мышц акулы локализовано около 40% аминокислотных остатков, тогда как в (3-структурах - около 23%. В

молекуле ЛДГ содержится несколько а-спиральных участков различной протяженности (от аА до аН) и несколько ^-структур (от (5А до рН) (Adams et al, 1973).

Для ЛДГ, как и для других белков, помимо основных четырех уровней организации молекулы выделяют еще два: сверхвторичные структуры для обозначения энергетически предпочтительных агрегатов вторичной структуры и домены как кооперативные единицы сборки белка и главные интермедиаты этого процесса (Jaenicke, 1987, 1991). Домены как элементы третичной структуры играют важную роль не только в процессе сборки белка, но и в его функционировании (Jaenicke, 1993). Мономер ЛДГ состоит из нуклеотидсвязывающего (HAD-связывающего) и каталитического доменов: В и С доменов соответственно. Активный центр молекулы локализуется на их границе. Каждый из доменов подразделяется еще на два субдомена: Bi и В2, и Q и С2 (Rossmann et al., 1974).

Основным структурным элементом НАД-связывающего домена являются две складки Россмана: шесть цепей параллельных р-структур и несколько ос-спиралей. Начиная от N-конца полипептидной цепи первым структурным элементом является (ЗА. Аденозиновую и никотинамидную части NAD принято рассматривать отдельно. Одной из причин этого является предположение о возникновении самого НАД-связывающего домена в результате дупликации складки Россмана: двух последовательно соединенных правых участка (Зсф. Данная структурная единица является энергетически предпочтительным элементом сверхвторичной структуры. Каждый мононуклеотидный фрагмент НАД присоединяется к одной складке Россмана. Аденозин, входящий в НАД, связывается в кармане, который не строго специфичен к этому лиганду, а специфичен к ароматическим остаткам вообще. Никотинамидный фрагмент НАД инвариантно связывается в плоскости, гидрофобной с одной стороны и гидрофильной с другой стороны, которая взаимодействует с субстратом.

Пирофосфатный фрагмент НАД связан с основной цепью соответствующей петли водородными связями. Связывание

фосфорильной группы осуществляется петлями, выступающими из жесткой вторичной или сверхвторичной структуры, например, шпильки Россмана. Поскольку эти петли имеют конформационно жесткие основания, сами они могут проявлять подвижность, не нарушая структуру белка в целом. В ЛДГ петля является центром значительных конформационных изменений в процессе ферментативного катализа (Rossmann et al., 1973).

В каталитическом домене ЛДГ [3-структура представлена в виде трех близко расположенных антипараллельных пептидных цепей, соединенных между собой короткими участками. Такой структурный элемент называют Р-зигзагом. Его классифицируют как сверхвторичную структуру (Richardson, 1976, 1977). (3-зигзаг обеспечивает образование примерно 2/3 водородных связей между атомами аминокислотного остова в данном участке цепи.

Анализируя особенности четвертичной структуры, следует отметить, что мышечная ЛДГ (изофермент М4) представляет из себя тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц с точечной группой 222, т. е. его можно условно представить в виде тетраэдра. В тетрамере ЛДГ имеются три типа контактов, по одному на пересечении с каждой осью второго порядка. Для стабилизации тетрамера необходимы только два из трех контактов. Для идентификации субъединиц используется цветовой код, а поворотные оси второго порядка обозначены Р, Q, R. Каждую субъединицу ЛДГ можно представить треугольникам, а контакт между субъединицами - гранью этого треугольника (Rossmann et al.,1973).

2.2.2. Строение активного центра ЛДГ.

После установления первичной, вторичной и третичной структур ЛДГ стала понятна пространственная организация активного центра и функциональная роль отдельных аминокислот и их последовательностей в активном центре. Основную роль в связывании субстрата с активным

центром ЛДГ играют гистидин 193 и аргинин 171 (Somero, 1981; Abad-Zapatero et al., 1987). При этом ключевую роль в активном центре играет гистидин 193, который в зависимости от величины внутриклеточного рН может находиться в протонированном или депротонированном состоянии. При относительно низких рН и протонированной имидазольной группе гистидина 193 с активным центром связывается пируват, тогда как при относительно высоких значениях рН и депротонированным гистидином связывается только лактат. Десять молекул воды, связанных через водород с атомами белка и взаимодействующими между собой, расположены внутри полости активного центра. Гибкая петля (аминокислотные остатки 97-123), охватывающая активный центр в присутствии связанных коэнзима и субстрата усиливает внутримолекулярные контакты (Holbrook, 1975; Abad-Zapatero et al., 1987). Эта петля подвергается наиболее значительным конформационным изменениям во время ферментативного катализа.

Очевидно, что структура активного центра ЛДГ формируется вследствии взаимодействия различных участков аминокислотных последовательностей. Особенно важны такие взаимодействия в области активного центра и в частности в районе гистидина 193. Этот район активного центра служит местом приложения различных регуляторных воздействий на ферментативную активность ЛДГ.

2.2.3. Воздействие температуры на функциональные и структурные

свойства ЛДГ.

Поскольку фермент-субстратная аффинность отражает эффективность ферментативного катализа, то температурная зависимость этого параметра может указывать на особенности температурной адаптации метаболизма.

Температурная зависимость Км для ряда ферментов (ацетилхолинэстераза, изоцитратдегидрогеназа, пируваткиназа, лактатдегидрогеназа) из различных органов беспозвоночных и рыб,

акклимированных к низким температурам среды, имеет минимум Км в районе низких температур измерения, а при адаптации к высоким температурам - в области высоких (Baldwin, 1971; Moon, Hochachka, 1971; Ozernyuk et al., 1994; Fields, Somero, 1997; Vetter, Buchholz, 1997). В некоторых случаях эти особенности ферментативной кинетики связаны с появлением новых изоферментов при изменении температуры среды (Baldwin, Hochachka, 1970, Shaklee et al., 1977; Ono et al., 1990). Однако, для других ферментов, в частности, для ЛДГ различный характер температурной зависимости Км при разных температурах среды не связан с синтезом новых изоформ (Wilson et al., 1975; Shaklee et al., 1977; Клячко и др., 1992; Fields, Somero, 1997).

Кинетические свойства ферментов при температурной акклимации были изучены на примере м4-ЛДГ, которую выделяли из мышц вьюнов Missgurnus fossilis, адаптированных в течение 25 суток к 5°С («холодный» фермент) и к 18°С («теплый» фермент). Минимум Км для «холодного» фермента находился при 9°С, а для «теплого» фермента - при 17°С (Клячко и др., 1993, Ozernyuk et al., 1994). Была исследована динамика полученных изменений. Вьюнов, которые в течение нескольких месяцев содержались при 5°С, помещали в среду с температурой 18°С и через каждые трое суток определяли температурную зависимость Км-Перестройка кинетических свойств фермента на новую температуру среды заканчивалась к 15 суткам и температурный минимум Км к этому времени соответствовал 17°С.

Изучение активности ЛДГ из мышц вьюна в зависимости от pH раствора показало, что для двух сравниваемых образцов ЛДГ оптимум pH одинаков и равен 7,2 (Ozernyuk et al., 1994). Однако, фермент, выделенный из мышц рыб, акклимированных к низким температурам, обладал большей устойчивостью в области кислых значений pH (от 5,0 до 6,2).

Была исследована зависимость активности ЛДГ от концентрации мочевины (Клячко и др., 1993; Fields, Somero, 1997; Fuery et al., 1997). При изменении концентрации мочевины от 1 до 6 М происходило постепенное

снижение активности фермента и в 6 M мочевине фермент инактивировался на 80-90% (Клячко и др., 1993). Однако, «холодный» фермент обладал большей устойчивостью к действию мочевины по сравнению с «теплым». Концентрация денатурирующего агента, при которой активность фермента снижается на 50% (С5о), для «холодного» фермента составляла 3,75 M, а для «теплого» - 3,25 M (Клячко и др., 1993).

Образцы «холодного» и «теплого» ферментов, отличающиеся, как отмечалось выше, положением температурного минимума Км, подвергали обратимой инактивации 3 M мочевиной и затем проводили реактивацию сравниваемых типов ЛДГ(0гегпуик et al., 1994). После реактивации различия в положении температурного минимума Км между «холодным» и «теплым» ферментами исчезали. Оба образца приобретали новый температурный минимум Км в районе 15°С, одинаковый для обеих форм фермента.

Другими словами, ЗМ мочевина «разрушает» вызванные температурой различия между «холодной» и «теплой» формами ЛДГ, а реактивация приводит к восстановлению активности фермента, уже лишенного индуцированных изменений структуры (Ozernyuk, 1994). Поскольку мочевина воздействует на водородные связи (Hermans, 1966), гидрофобные взаимодействия (Wetlaufer et al., 1964; Niwa et al., 1989) и гидратную оболочку молекул белка (Finer et al., 1972; Sun et al., 1996), предполагалось, что вызванные температурой отличия между «холодной» и «теплой» ЛДГ обусловлены этими связями и взаимодействиями (Ozernyuk et al., 1994).

Следует отметить, что при температурных акклимациях ЛДГ, изменение активности фермента не сопровождается повышением концентрации фермента в клетке (Seddon, 1997; Seddon, Prosser, 1997).

При адаптации бычков Gillichthys seta к различным температурным условиям были получены аналогичные изменения кинетических свойств мышечной ЛДГ (Fields, Somero, 1997). Анализ первичной структуры ферментов не показал различий в аминокислотной последовательности.

Показано, что обратимое воздействие ЗМ мочевины или 6М гуанидина гидрохлорида, снимает различия между этими формами ЛДГ.

Филдсом и Сомеро сделано предположение, что в процессе сворачивания м4-ЛДГ, могут образовываться различные конформационные варианты - «конформеры» с различной стабильностью и функциональными свойствами. Возможность существования разных «конформеров» с одинаковой первичной структурой является важным механизмом адаптации белков к различным температурным условиям (Fields, Somero, 1997). Следует отметить, что впервые предположение о том, что при разных температурах среды, фолдинг одного и того же белка (в данном случае ЛДГ), может протекать по-разному и приводить к сборке различных конформаций фермента, было сделано ранее (Ozernyuk et al., 1994).

2.3. Термодинамические свойства белков при температурной денатурации и механизмы их термостабильности.

Механизмы стабилизации упорядоченной нативной структуры белка интенсивно дискутируется уже более полувека. За это время внимание интересующихся этой проблемой концентрировалось -на различного рода взаимодействиях, которые могут иметь место между различными группами белковой молекулы в водной среде и, которые, могут определять ее пространственную структуру. К таковым можно отнести ван-дер-ваальсовы взаимодействия, взаимодействия между заряженными группами (солевые связи), между полярными группами (водородные связи) и, наконец, гидрофобные взаимодействия между неполярными группами и водой (Vanbeek et al., 1997). Под последними подразумевается все то, что обуславливает низкое сродство неполярных групп к воде, их гидрофобность (Привалов, 1987).

Какие же взаимодействия вносят наиболее значимые вклады в стабилизацию нативной структуры белка? Действительно, о стабильности

любой структуры можно судить по ее разрушению под тем или иным воздействием. В частности, о стабильности белка можно судить по разрушению его нативной структуры, т.е. его денатурации под воздействием различных факторов. Очевидно, что не ответив на поставленный вопрос, невозможно решить проблему стабильности различных белков и механизм их сборки в нативную молекулу.

Для исследования конформационных переходов в белках пользуются различными биохимическими и биофизическими методами. Среди них особенно важны те методы, которые позволяют непосредственно установить изменения координат отдельных атомов в белке (рентгеноструктурный анализ и ядерный магнитный резонанс -ЯМР), а, также, методы, основанные на измерении изменения экстенсивных термодинамических параметров системы, сопровождающих конформационные переходы в белках.

Изменения конформации белков бывают весьма различны по своим масштабам: они могут быть ограничены локальными участками молекул белка, а могут нарушать всю их пространственную структуру. Пфайлем и Приваловым предложена следующая классификация конформационных изменений в белках (Пфайль, Привалов, 1982):

1) локальные изменения положения белковой цепи только одной или нескольких аминокислот;

2) изменения положений петель или других связанных областей молекулы;

3) частичная денатурация белков, образованных более или менее независимыми молекулярными фрагментами;

4) полная денатурация, т.е. разрыв всех нековалентных внутримолекулярных контактов под действием денатурирующих агентов (мочевины, гидрохлорида гуанидина) или при нагревании.

Наиболее интересны для рассмотрения крупные изменения конформации, такие, как частичная или полная денатурация, поскольку в этих процессах наиболее четко выявляются взаимосвязи между термодинамическими и структурными параметрами и могут быть

получены наиболее определенные сведения о характере сил, стабилизирующих нативную структуру белка (Пфайль, Привалов, 1982).

Однако, оперируя структурными понятиями, невозможно провести границу между значимыми изменениями и незначительными, особенно учитывая тот факт, что белок не является фиксированной структурой, как его модель, и флуктуации на молекулярном уровне весьма значительны (Cooper, 1976; Vanbeek et al., 1997). С другой стороны, используя термодинамический подход к данной проблеме, можно четко очертить границу между нативным и денатурированным состояниями белковой молекулы, поскольку переходы между этими состояниями сопровождаются гораздо большими изменениями свободной энергии, энтальпии и энтропии, чем при более тонких изменениях конформации (класса 1 и 2) (Privalov, 1979).

2.3.1. Денатурация небольших глобулярных белков

Предполагается, что только нативное и денатурированное состояния белка являются заселенными, другими словами, денатурация макромолекулы происходит по принципу «все или ничего». Предложенная модель двух состояний прекрасно описывает процессы денатурации небольших глобулярных белков, например, лизоцима или рибонуклеазы А (Рпуа1оу, КЪесЫпазЬ/Ш, 1974). Такое предположение дает возможность представить наблюдаемый эффект через абстрактный эффективный параметр - константу равновесия (Рпуа1оу, 1979):

кэфф = ^

где 9м и 0О - величины характеризующие чистое нативное и чистое денатурированное состояния, соответственно, а 0Х представляет эту величину при данных условиях. Изучая зависимость этой эффективной константы равновесия от таких внешних параметров, как температура, давление, ионная сила, можно определить эффективные параметры, характеризующие процесс денатурации (Рпуа1оу, 1979):

свободную энергию Гиббса AG* = -RT In Кэфф (2)

гИп Кэфф

энтальпию ДНэфф = RT2 эт (3)

Я In Кэфф

объем ЛУэфф = -RT „ (4)

др

д In Кэфф

кол-во связанных лигандов Av3** = ——-----(5)

ölnaj

В настоящее время механизм денатурации белков по принципу «все или ничего» широко принят, поскольку благодаря его применению стало возможным численно измерять макроскопические величины, характеризующие стабильность белка. В рамках модели двух состояний проблему изучения стабильности белка возможно решить с привлечением равновесной термодинамики (Privalov, 1979).

Известно, что при нагревании белковых растворов, растворимость белка резко снижается в определенном узком температурном диапазоне, что является результатом интенсивной аггрегации. Из-за этой тенденции, препятствующей применению равновесных физических методов исследования, процессы денатурации белков можно изучать только в условиях препятствующих аггрегации, т.е. вдали от изоэлектрической точки и в сильно разбавленных растворах. Это требование является причиной широкого использования оптических методов для изучения процессов денатурации. Наиболее распространенные методы изучения этих процессов: измерение ультрафиолетового поглощения (Ginsburg, Carroll, 1965), круговой дихроизм (Welfle et al., 1996; Vogl et al., 1997), измерение оптического вращения (Vogl, Hinz, 1994), белковая флуоресценция (Chen et al., 1975; Huang et al., 1996; Ibarra-Molero, Sanchez-Ruiz, 1996) и др. Широко используются, также, такие методы, как ЯМР- и ИК-спектроскопия (Vallee et al., 1991), вискозиметрия (Holcomb, van Holde, 1962), метод водородного обмена (Zhang et al., 1996; Смит, 1998), измерение энзиматической активности (Galisteo et al., 1991; Ozernyuk et al., 1994) и другие.

Важность применения калориметрического метода к исследованию изменений состояний белка при воздействии различных факторов, на

сегодняшний день не вызывает сомнения (Hinz, 1986; Schöppe et al., 1997). Только этот метод позволяет провести прямое измерение величины энтальпии, связанной с определенным процессом. Особое значение этот метод приобретает в случае температурного воздействия, поскольку температура и энтальпия представляют собой пару, состоящую из экстенсивного и интенсивного параметров. При этом все макроскопические изменения в системе сопровождаются изменением энтальпии, т.е. они происходят с поглощением тепла при повышении температуры или с выделением тепла - при ее понижении. Функциональная связь энтальпии с температурой включает в себя полную термодинамическую информацию о макроскопическом состоянии системы, которую можно получить при помощи термодинамического анализа (Privalov, Potekhin, 1986).

Температурную зависимость энтальпии денатурационных переходов можно определить экспериментально измеряя теплоемкость белка, при помощи дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК). Известно, что теплоемкость при постоянном давлении (Ср) является частной производной функции энтальпии по температуре, поэтому энтальпию легко определить интегрированием функции теплоемкости, определяемой экспериментально (Privalov, Khechinashvili, 1974):

т

Н(Т)= |cp(T)dT + H(T0) (6)

То

Важной особенностью метода ДСК является то, что он позволяет изучать макромолекулы не в изолированном состоянии (в вакууме), а в дисперсной среде - в растворе (в основном в естественной среде для большинства белков - водном растворе), где белок можно рассматривать как индивидуальную макроскопическую систему, окруженную растворителем. Концентрация белковых растворов может быть достаточно невысокой - 10"4М или около 1мг/мл для белка средней молекулярной массы (Privalov, Potekhin, 1986).

Другим преимуществом этого метода является то, что он позволяет одновременно определять не только калориметрическую энтальпию по уравнению (6), но также эффективную (Вант Гоффа) энтальпию исследуемого процесса денатурации - по характеру кривой плавления белка (Privalov, 1979). Наиболее часто эффективную энтальпию определяют по следующей формуле:

АЛ 4RT:AC"iax

ДНэфф =-5—(7)

АН1™ ^ ;

где Тт2- температура, при которой теплоемкость достигает максимального

значения, АСртах- максимальное изменение теплоемкости.

Если процесс денатурации белка протекает по принципу «все или ничего», т.е. в соответствии с моделью двух состояний, эффективная энтальпия денатурации должна быть равна калориметрической. Другими словами величина г=ЛНка7ЛНэфф (индекс кооперативности) должна быть приблизительно равна единице. Практическое использование этого отношения для анализа калориметрических кривых плавления белков позволяет с высокой точностью показать, денатурирует молекула белка как единое целое (г«1) или это более сложный процесс (г^1).

Такой анализ был проведен в работе Привалова и Хечинашвили (Privalov, Khechinashvili, 1974) для ряда небольших компактных глобулярных белков: рибонуклеазы А, лизоцима, а-химотрипсина, цитохрома с и метмиоглобина. Среднее значение индекса кооперативности, полученное для этих белков было равно 1,05±0,03. Тот же результат был получен позднее для парвальбумина (Filimonov et al., 1978), ингибитора барназы (Wintrode et al., 1995; Schoppe et al., 1997), 1,3-1,4-Р-глюканазы (Welfle et al., 1996), аннексина V (Vogl et al., 1997) и многих других макромолекул.

Для этих белков могут быть достаточно просто рассчитаны все основные термодинамические параметры денатурации: изменение теплоемкости при денатурации (АСр), энтропия денатурации (AS), рассчитан температурный профиль изменения свободной энергии Гиббса (AG) и т.д.

2.3.2. Денатурация сложных белков.

Однако, большинство изученных к настоящему времени белков не являются единой кооперативной системой. Поэтому их функциональные и структурные свойства меняются не одновременно в экстремальных условиях, их нативная структура не разрушается одномоментно, т.е. их денатурацию нельзя рассматривать в рамках модели двух состояний. Тем не менее, применение термодинамического метода исследования во многих случаях более предпочтительно, чем использование структурных методов.

Впервые методика термодинамического анализа стабильности сложных белковых структур была предложена Приваловым, Фрайре и их сотрудниками (Privalov, 1982; Privalov; Freire, Biltonen, 1978; Филимонов и др., 1982). Как отмечалось в начале этой главы, уникальная особенность метода ДСК состоит в возможности прямого определения функции энтальпии, которая, как термодинамический потенциал, включает всю информацию о термодинамических состояниях системы в исследуемом температурном интервале. Фрайре и Билтоненом было показано, что термодинамический анализ сложных белковых систем может быть проведен с использование компьютера, при помощи рекуррентной процедуры последовательной деконволюции температурной функции избыточной теплоемкости (Freire, Biltonen, 1978). Особенность деконволюции состоит в отсутствии необходимости предположений а priori, сколько промежуточных состояний мы наблюдаем в процессе денатурации белковой макромолекулы. Ответ на этот вопрос дает компьютерный анализ.

Анализ калориметрических данных температурной денатурации пепсиногена, типичного глобулярного белка с молекулярной массой 40000 Да, показал что этот процесс не соответствует модели двух состояний. Отношение АН

кал/днэфф было

значительно больше единицы и

приближалось к двум (Privalov, 1982). Таким образом, без использования структурных методов, было показано, что молекула пепсиногена состоит из двух независимых субъединиц.

Термодинамический анализ функции теплоемкости, дал более ясную информацию об этих субъединицах. Проведенная деконволюция показала, что денатурация пепсиногена происходит в две стадии, каждая из которых отвечает модели двух состояний. Однако температуры и энтальпии этих переходов не идентичны (800 и 1400 кДж/моль соответственно для первой и второй стадии). Исходя из известной молекулярной массы пепсиногена, была рассчитана молекулярная масса двух независимо плавящихся субъединиц - 14500 и 25500 Да (Privalov, 1982).

На сегодняшний день методы деконволюции кривых ДСК разработаны детально (Freire, Biltonen, 1987; Straume, Freire, 1992). Подобный анализ проведен для многих белков (Medved et al., 1989, 1996; Weifleetal., 1995, 1996).

В частности методом ДСК была изучена лактатдегидрогеназа из мышц кролика (при pH 7,0 в ЮОмМ фосфатном буфере). Денатурационный переход наблюдали при температуре 66,7°С, калориметрическая энтальпия перехода была равна 2120 кДж/моль, отношение АНкал/АНэфф равнялось приблизительно единице (Jacobson, Braun, 1976). Однако в этой работе использовались высокие концентрации белка (19-94 мг/мл), что, по-видимому, привело к нежелательному вкладу агрегационных процессов и, как следствие, к неверному определению величины энтальпии.

В работе Н.К.Наградовой и сотр. (Кубе и др., 1987) исследована термостабильность ЛДГ из мышц свиньи в ano- и холоформе (при pH 7,0 в ЮОмМ фосфатном буфере с 5мМ ЭДТА). Денатурацию наблюдали при температуре около 64°С, калориметрическая энтальпия перехода равнялась 2300 кДж/моль, индекс кооперативности был равен 2,3. В

комплексе с коферментом НАД (при степени насыщения фермента -0,5) энтальпия повышалась до величины 2600 кДж/моль, а отношение АНкал/АНэфф составляло уже 2,5. При дальнейшем насыщении активных центров молекулы ЛДГ коферментом (до величины 0,92), температура середины перехода поднималась на 4°С и составляла 68°С, калориметрическая энтальпия менялась незначительно, а индекс кооперативности понижался до 2,2 (Кубе и др., 1987).

В присутствии глицерола, наблюдали два пика при температурной денатурации м4-ЛДГ из мышц свиньи (БаЬигоуа а1., 1996): при 50 и 65°С. Первый, преденатурационный пик определялся воздействием глицерола, это - обратимый переход, не связанный с аггрегацией, не коррелирующий с кинетическими данными. Второй, высокотемпературный пик связанный с разрушением третичной структуры и разворачиванием а-спиральных участков, являлся необратимым одностадийным переходом первого порядка и не зависел от концентрации глицерола.

Температурная денатурация ЛДГ из мышц свиньи изучена также в других работах (Биркая и др., 1990; Киладзе и др., 1996). При рН 7,5 в ЮОмМ фосфатном буфере и концентрации белка 0,5 мг/мл, калориметрическая энтальпия денатурации равнялась 1930 кДж/моль, при температуре перехода 56,6°С. Однако при повышении концентрации ЛДГ до 4 мг/мл, энтальпия понижалась до 1350 кДж/моль, при незначительном повышении температуры перехода - 56,8°С. Из полученных данных авторы заключили, что при повышении концентрации раствора фермента до 4 мг/мл, в белке происходят некие конформационные изменения (Киладзе и др., 1996).

По данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии установлено, что температурная адаптация карпов приводит и существенному изменению термодинамических параметров денатурации миозина (Ыакауа еХ а1., 1998). При адаптации к 10°С, наблюдали два

перехода при температурах 32,5°С и 39,5°С с энтальпией 1125 и 218 кДж/моль соответственно. При адаптации к 20°С, выделялись уже три пика: 34,5°С; 40,2°С и 46,9°С с энтальпиями 636, 84 и 42 кДж/моль. Однако, при температуре адаптации 30°С, снова наблюдались два максимума: 39,2°С и 47,3°С с ДНкал равными 967 и 163 кДж/моль. Предполагается, что различия термодинамических параметров денатурации белка связаны со структурными изменениями, определяемыми вышеописанными механизмами (Nakaya et al., 1998).

2.3.3. Взаимодействие белков с лигандами.

Влияние связывания с лигандами на конформационную стабильность было изучено для различных белковых систем (Takahashi, Sturtevant, 1981; Goins, Freire, 1988; Conejero-Lara et al., 1991; Sasso et al., 1995). Теория этого связывания разработана детально (Hinz, 1986; Straume, Freire, 1992; Fisher, Singh, 1995). Чаще всего наблюдается эффект повышения термостабильности белка при присоединении лиганда. Например при связывании L-арабинозы с D-галактозой денатурация происходила при температуре 59,0°С, а энтальпия перехода была равна 840 кДж/моль, в то время как для свободного белка эти параметры были равны соответственно 53,5°С и 635 кДж/моль (Fukada et al., 1983). Это повышение стабильности определяется вкладом энтальпии диссоциации лиганда, которая, по результатам изучения изотермального калориметрического связывания, равнялась 130 кДж/моль при температуре денатурации. Подробный анализ показал, что смещение равновесия процесса денатурации-диссоциации при добавлении лиганда является причиной повышения температуры денатурационного перехода (Fukada et al., 1983).

Когда лиганд связывается с нативным белком, происходят различные энергетические и структурные перестройки. Эти изменения

равномернее распределяются между реагентами, чем в сложном образовании белка и лиганда (Hinz, 1986). Примером этого может служить температурная денатурация субтилизина в комплексе с ингибитором и без него (Takahashi, Sturtevant, 1981). Денатурация белка имела обратимый характер, в то время как денатурация комплекса была необратимой. Сделано предположение, что в ходе денатурации не происходит диссоциации белка и ингибитора.

Термостабильность рибонуклеазы А была изучена в зависимости от концентрации цитидин-2-монофосфата (ЦМФ). Температура денатурационного перехода (Тш) росла от 62,0°С при отсутствии ЦМФ до 70,8°С при полном насыщении белка лигандом (Straume, Freire, 1992). Калориметрическая энтальпия денатурации увеличилась, в то же время, от 455 кДж/моль до 565 кДж/моль. Интересные изменения происходили с индексом кооперативности (отношением ДНка7ДНэфф). Как при отсутствии лиганда, так и при полном насыщении, это отношение приблизительно равнялось единице, однако, при небольшой концентрации ЦМФ (0,161 мМ ЦМФ в 0,219 мМ растворе рибонуклеазы А) индекс кооперативности повышался до 1,34. Данная особенность объяснялась тем, что при промежуточных концентрациях лиганда часть молекул белка находилась в свободном состоянии, а другая часть - в связанном (Straume, Freire, 1992).

При помощи ДСК было исследовано также влияние аммония и тетраалкиламмония галидов на конформационную стабильность лизоцима (Jain, Ahluwalia, 1996). Практически все изученные галиды вызывали дестабилизацию белка, однако, nh4ci и Me4NCl стабилизировали структуру при повышении их концентрации. Этот эффект связывали с дополнительным зарядом атомов водорода, а наблюдаемую дестабилизацию - связыванием гидрофобных молекул растворителя с гидрофобной частью молекулы лизоцима.

Повышение термостабильности лактатдегидрогеназы при связывании с НАД+, показано во многих исследованиях (Кубе и др., 1987; Eszes et al., 1996; Bai et al., 1997). Этот эффект объясняют образованием дополнительных водородных связей в молекуле белка с участием кофермента и молекул Н20 (Eszes et al., 1996). Следует отметить наличие нескольких (двух и более) возможностей связывания НАД+ с ЛДГ. При этом, некоторые из вариантов могут быть каталитически непродуктивными (Vincent et al., 1997).

В работе Н.К.Наградовой и сотр. (Кубе и др., 1987) изучалась температурная денатурация ЛДГ из мышц свиньи в апоформе и в виде комплексов с пируватом, НАД+ и с адцуктом НАД-пируват. Связывание пирувата не влияло на термостабильность фермента. НАД+ оказывал стабилизирующее влияние, величина которого была пропорциональна степени заполнения коферментом активных центров тетрамера ЛДГ (в апоформе Тт=63,5°С; ДНкал=2300 кДж/моль, а при 92% насыщении комплекса Тт=68,0°С; ДНкал=2560 кДж/моль). В этом случае, как и в случае с рибонуклеазой А наблюдали повышение индекса кооперативности при 50% насыщении коферментом.

В работе Визингера и Хинца (Wiesinger, Hinz, 1996) собраны данные о термодинамических параметрах взаимодействия ряда белков с лигандами. Данные для мышечной лактатдегидрогеназы, представлены в таблице. Все результаты приведены к 25°С. Значения для изменения энтальпии (АН0) получены при помощи калориметров серии LKB, а изменения свободной энергии Гиббса (AG0) - из экспериментов по равновесному диализу, флуоресценции или изменению оптического поглощения. Изменение энтропии при присоединении лиганда рассчитывали по уравнению AS°=(AH°-AG0)/T.

Таблица 1. Термодинамические параметры ЛДГ из разных источников при взаимодействии с лигандами.

тип ЛДГ лиганд ДО0, кДж/моль АН0, кДж/моль AS0, Дж/моль К ссылка

мышцы свиньи НАДН -28,9±0,3 -31,6±2,1 -9,0±8,4 Hinzetal, 1975

НАД+ -18,8±0,3 -27,6±2,5 -29,3±13,4 Hinzetal, 1978

АМФ -14,6±0,4 -16,9±3,0 -7,5±11,0

АДФ -14,5±0,4 -21,9±2,4 -24,4±9,0

АДФ-рибоза -17,0±0,2 -32,6±2,3 -52,2±8,0

мышцы кролика НАДН -31,0 -28,9±0,4 -7,1±2,9 Subramanian, Ross, 1977,1978

НАД+ -15,9±0,4 -26,4±0,8 -34,7±4,2

Широко изучается изменение конформационной стабильности белков при связывании с ионами металлов Fe3+, Са2+ и др. (Lin et al., 1991, 1993; Welfle et al., 1995; Mely et al., 1996; Tsuruta et al., 1998). В частности исследован ряд структур образуемых комплексом белка с ионами цинка: цинковые пальцы, цинковые кластеры, цинковые скрутки и др. (Vallee, Auld, 1990; Vallee et al., 1991). Очевидно, что образование таких комплексов может приводить к существенным изменениям структурных и функциональных свойств белков (Vallee et al., 1991).

Например, наличие в первичной структуре белка в определенной последовательности двух инвариантных пар цистеинов и гистидинов (цинк-пальцевой последовательности), означает возможность связывания ионов цинка с молекулой этого белка. Белок (NS3) вируса гепатита С, имеющий металлсвязывающий участок (три цистеина, один гистидин) связан с ионом Zn2+. Более того, этот ион является неотъемлемой частью активного центра (De Francesco et al., 1996). Таким образом, ион металла играет важнейшую роль в функционировании таких металлопротеинов.

С другой стороны, непрямое лигандирование, т.е. встраивание иона металла в место, где существовала водородная связь, вызывает более

тонкие изменения в структуре и функции белков (Vallee et al., 1991).

Результат влияния ионов металлов на каталитические свойства ферментов

может быть и негативным. Например, активность фосфатазы из

Escherichia coli повышалось при присоединении ионов Mg2+ и Са2+,

2+

однако, при связывании этого фермента с ионом Zn , наблюдали существенный спад его активности (Tsuruta et al., 1998). Аналогично, при непрямом лигандировании цинком карбоангидразы II, чрезвычайно сильно понижается каталитическая активность этого фермента и его сродство к сульфонамиду (Huang et al., 1996).

Наличие цинк-пальцевых последовательностей обнаружено во многих белках: карбоангидразе I и II, щелочной фосфотазе, фосфолипазе С, термолизине, алкогольдегидрогеназе и др. (Vallee, Auld, 1990; Mely et al., 1996; Huang et al., 1996). Существование таких цистеин-гистидиновых пар в мономере лактатдегидрогеназы также, как и возможность координирования отдельных цистеинов и гистидинов в тетрамере фермента, дает возможность предположить, что ионы цинка связываются с молекулой ЛДГ (Биркая и др., 1990; Киладзе и др., 1996).

2.3.4. Анализ необратимых переходов в белках.

В большинстве работ по анализу термограмм ДСК белков полагают, что параметры денатурации не зависят от скорости нагревания, т.е. являются равновесными (Кубе и др., 1987; Sasso et al., 1995; Welfle et al., 1996 и др.). Соблюдение этого условия установлено экспериментально лишь в отдельных случаях (Privalov, Khechinashvili, 1974; Moses, Hinz, 1983; Schoppe et al., 1997). Многие сложные белки при повышении температуры денатурируют необратимо, что регистрируется строгой зависимостью термодинамических параметров денатурации белка и отсутствием конформационных переходов при повторном сканировании на дифференциальном сканирующем калориметре (Sanchez-Ruiz et al.,

1988; Arroyoreyna, Hernandezarana, 1995; Vogl et al., 1997). В этом случае встает вопрос о применимости методов равновесной термодинамики. Этот момент является ключевым при выборе подхода к интерпретации результатов калориметрического эксперимента (Жоли, 1968). Изучение кинетических параметров процесса помогает разрешить этот вопрос (Conejero-Lara et al., 1991; Galisteo et al., 1991; Shnyrov et al., 1996).

Необратимая денатурация белка должна происходить, по крайней мере, в два этапа: обратимое разворачивание нативного белка (N) и необратимая перестройка развернутой формы (U) в финальное состояние (F), из которого белок уже не может перейти в нативное (Klibanov, Ahern, 1987).

Двухступенчатый характер необратимой денатурации представляют следующей схемой:

N U —» F, (8)

которая была предложена Ламри и Эйрингом (Lumry, Eyring, 1954).

Во многих исследованиях считают, что необратимый этап происходит при температурах выше области перехода, поэтому допустимо применение равновесных методов для анализа полученных результатов (Privalov, Medved, 1982; Edge et al., 1985; Hu, Sturtevant, 1987, 1989; Brandts et al., 1989). Несмотря на то, что в некоторых случаях это соответствует истине (см. напр. Goins, Freire 1988), специальные исследования проведенные, в основном, Санчес-Руисом и его сотрудниками показали, что часто необратимый этап происходит именно в той узкой температурной области, где и наблюдается денатурационный тепловой эффект (Sanchez-Ruiz et al., 1988а, 1988b; Lepock et al., 1990; Morin et al., 1990; Freire et al., 1990; Galisteo et al., 1991; Conejero-Lara et al., 1991). В этом случае термодинамические параметры конформационных переходов сильно зависят от скорости нагрева.

Санчес-Руисом (Sanchez-Ruiz, 1992) была предложена классификация необратимых денатурационных переходов в белках по модели Ламри-Эйринга (8):

Ситуация А. Необратимый этап протекает с существенной скоростью при температурах превышающих Тт. Ход калориметрических кривых практически не отличается от кривых, характерных для обратимых переходов. В этом случае применение методов равновесной термодинамики к необратимым переходам не приводит к большим ошибкам.

Ситуация В. Скорость необратимой фазы сравнима со скоростью первого этапа (равновесного разворачивания). Ход кривых теплопоглощения значительно отличается от обратимого и применение равновесных методов может приводить к существенным ошибкам. Однако, из полученных калориметрических кривых при помощи специального анализа (Sanchez-Ruiz, 1992) можно получить информацию о термодинамических параметрах этапа обратимого разворачивания.

Ситуация С. При достаточно низких температурах, необратимый этап протекает со значительно большей скоростью, чем равновесный. Наблюдаемое значение Тт существенно занижается. Во всем диапазоне температур, существенно населены только состояния N и F. Таким образом, переход практически происходит по схеме так называемого «необратимого процесса двух состояний»:

N—»F (9)

с константой скорости реакции кК. Населенность промежуточного состояния очень мала, хотя химическое равновесие между нативным и промежуточным состояниями установлено (этот тип кинетического механизма иногда называют «вступительным механизмом равновесия», см. Lowry, Richardson, 1976). Применение равновесной термодинамики приведет, в этом случае, к огромным ошибкам. Необходим кинетический анализ полученных результатов.

После проведенного подробного теоретического анализа было предложено модифицировать модель Ламри-Эйринга (Sanchez-Ruiz, 1992; Любарев, Курганов, 1998). Доказано два основных утверждения:

1) Применение необратимых моделей денатурации белков могут приводить к различным ситуациям (А, В или С), в зависимости от скорости необратимого этапа. Если этот этап протекает достаточно быстро, наблюдаемый калориметрический переход в большей степени определяется кинетикой формирования финальной фазы. В этом случае применимость равновесного термодинамического анализа полностью исключена.

2) Даже в случае сильной зависимости от скорости сканирования (нагрева), возможно калориметрическое изучение лиганд-белкового и белок-белкового взаимодействия, но при условии, что наблюдаемое отщепление лиганда или диссоциация белка на мономеры происходит перед необратимым этапом денатурации.

Модель Ламри-Эйринга для денатурации субъединичного белка и лиганд-белкового комплекса иллюстрируют уравнения (10) и (11) соответственно (Sanchez-Ruiz, 1992; Jaenicke, 1991, 1993):

N^ <—■> |iU —» F (10)

N^LV <—»|Л1 + vL—>F +vL (И)

Следует отметить, однако, что в некоторых случаях применение методов равновесной термодинамики к анализу данных по необратимым переходам сложных белковых комплексов не приводит к значимым ошибкам (Manly et al., 1985; Edge et al., 1985; Hu, Sturtevant, 1987). В этом случае зависимости lnCt или In L0 от 1/Tm были линейными (Ct - полная концентрация белка, L0 - концентрация лиганда, Тт - температура перехода). Величина АНэфф, вычисленная из крутизны этих зависимостей, согласуется с энтальпией, вычисленной из формы кривых теплопоглощения. В этих случаях необратимый этап наступает при температурах значительно выше Тт и не вносит больших поправок в

получаемую калориметрическую кривую. Здесь неравновесные схемы (10) и (11) упрощаются до равновесных:

(12)

N^Lv^-»MU + vL (13)

С другой стороны нельзя утверждать, что линейность зависимости lnCt или In L0 от 1/Tm является критерием равновесности. Это было показано на примере температурной денатурации тетрамерного (ц=4) ядерного белка lac репрессора (Manly et al., 1985). Было показано, что в отсутствие лиганда ход калориметрических кривых и зависимость полной концентрации белка от температуры перехода (lnCt от 1/Тт) могут быть интерпретированы в рамках равновесной модели (12) с В то же время, те же экспериментальные результаты были достаточно успешно интерпретированы в соответствии с неравновесной моделью (9) в ситуации С.

Несовершенство предложенной модели подтверждается, также, результатами исследования необратимой денатурации многомерных белков. В некоторых экспериментах, величина Тт не зависела от концентрации белка (Edge et al., 1985; Guzman-Casado et al., 1990). Это может говорить о том, что степень олигомеризации развернутого белка та же, что и нативного, т.е. связь между мономерами сохраняется и в развернутой форме (Edge et al., 1985). В некоторых работах показано, что повышение концентрации лиганда приводит к понижению Тт, из чего заключают, что лиганд связан с развернутым белком крепче, чем с нативным (Edge et al., 1985; Ни, Sturtevant, 1989).

Таким образом, применение методов дифференциальной сканирующей микрокалориметрии дает важную информацию о структуре и внутримолекулярной динамике белков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЗЛ. Краткая характеристика объектов.

В работе были использованы взрослые самцы и самки вьюна Misgurnus fossilis (семейство Cobitidae, отряд Cypriniformes). Для изучения температурных адаптаций, рыб содержали в пластиковых аквариумах с постоянно поддерживаемой температурой воды. Для сравнения использовали относительно низкую (5°С) и относительно высокую (18°С) температуры среды. Период акклимации вьюнов составлял 25 суток (Клячко и др., 1993, 1994).

3.2. Выделение лактатдегидрогеназы из мышц рыб.

Основой метода выделения ЛДГ послужил метод дробного высаливания сульфатом аммония (Place, Powers, 1984; Лущак, 1990) с некоторыми модификациями и последующей очисткой с помощью хроматографической системы FPLC на колонке monoS.

Вьюнов обездвиживали, отпрепарировали белые мышцы. Навеску мышц массой примерно 40 грамм измельчали, промывали физиологическим раствором. Затем гомогенизировали трижды по 30 секунд с 15-секундными интервалами в растворе 150 мл 10 шМ фосфатного буфера, рН 7,4. Всю процедуру выделения проводили при температуре 1-4°С. Центрифугировали в течение 1 часа при ускорении 15000 g. К надосадочной жидкости при постоянном перемешивании медленно приливали насыщенный раствор дважды перекристаллизованного сульфата аммония до степени насыщения 0,52. Через 1,5 часа раствор центрифугировали при 5000 g в течение 1 часа. Осадок отбрасывали, к супернатанту добавляли сухой сульфат аммония до степени насыщения 0,72. На следующие сутки центрифугировали в том же режиме, удаляли надосадочную жидкость, а осадок постепенно

г '

растворяли в 25 мл бидистиллированной воды. Затем при постоянном перемешивании очень медленно при помощи бюретки добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до степени насыщения 0,55. Через сутки повторяли процедуру, с тем отличием, что насыщенный раствор сульфата аммония добавляли до степени насыщения 0,52, оставляли на 12 часов, центрифугировали в том же режиме, осадок отбрасывали. А к супернатанту в течение нескольких часов при постоянном несильном перемешивании добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до степени насыщения 0,55. Кристаллизовали в течение нескольких суток.

Полученный раствор центрифугировали при 10000 g. Осадок растворяли в 10 шМ какодилате Na, рН 6, и диализовали против смеси какодилатного буфера с 10 мМ раствора NaCl в течение суток. Наносили на колонку monoS хроматографической системы FPLC (Pharmacia). Предварительно колонку уравновешивали исходным буфером (10 гпМ какодилат Na). Белок элюировали в градиенте NaCl (от 10 мМ до 250 мМ NaCl) со скоростью протока 1 мл/мин. Белок выходил в первой трети градиента. Типичная хроматограмма приведена на рис.1. Чистоту белка определяли электрофоретически.

Фермент хранили в сульфате аммония при 5°С. Непосредственно перед экспериментом проводили диализ раствора белка против соответствующего буфера. Концентрацию ЛДГ определяли по ультрафиолетовому поглощению при 280 нм на спектрофотометре Specord М40, используя коэффициент экстинкции е= 1,38 мг"1 мл см"1.

3.3. Определение активности ЛДГ.

Активность ЛДГ определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению в течение 5 минут оптической плотности НАДН (Cahn,

О 10 20 мл

Рис. 1. Гель-хроматографическое выделение чистого препарата ЛДГ. Хроматографическая система FPLC (Pharmacia), колонка mono S, исходный буфер 0,01 М какодилат Na, градиент NaCl от 10 мМ до 250 мМ скорость протока 1 мл/мин.

1964). В измерительную кювету добавляли: 1мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,1 мл 5 мМ НАДН, 0,1 мл 2,7 мМ пирувата натрия, 0,1 мл исследуемого раствора белка. Активность ЛДГ выражали в МЕ или в рабочих единицах (1 МЕ соответствует 2143 p.e.).

3.4. Определение максимальной скорости реакции.

Для определения максимальной скорости реакции (Vmax) использовали метод измерения скоростей реакции при различных концентрациях фермента. Температурные зависимости максимальной скорости реакции представляли в координатах Аррениуса - lgVmax (1/Т). Из полученных линейных зависимостей рассчитывали энергию активации реакции как тангенс угла наклона к оси абсцисс:

Ea = tgcc (14)

3.5. Термоинактивация ЛДГ.

Для выяснения особенностей термоинактивации препараты очищенной ЛДГ прогревали при нескольких температурах таким образом, чтобы остаточная активность составляла от 100 до 10%. Измерение проводили при температурах от 50 до 72°С. Пробирки с препаратом ЛДГ в 0,03 М фосфатном буфере, нагревали в течение 30 минут в термостате, где поддерживалась определенная температура с точностью до 0,02°С, быстро охлаждали, а затем в них добавляли реактивы для определения ферментативной активности ЛДГ.

Температурный оптимум ферментативной реакции определяли сравнением величин ферментативной активности белка в пробах с реакционной смесью, инкубируемых при разных температурах. Измерение ферментативной активности проводили по методике,

описанной выше, но кювету с реакционной смесью помещали в термостатированную ячейку.

Для изучения кинетики термоинактивации были выбраны следующие температуры: 66 , 68 , 70 , 72°С. Время инкубирования меняли от 2 до 90 минут.

З.б.Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

Микрокалориметрическое исследование растворов ЛДГ проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4А с объемом ячейки 0.468 мл (Институт биологического приборостроения РАН) в интервале температур 10-110°С, при скорости сканирования 2.0°С/мин и избыточном давлении 4 атм. При изучении кинетических параметров денатурации ЛДГ, скорость сканирования варьировали в пределах 0.5-4.0°С/мин.

Анализ полученных зависимостей проводили по методу П.Л.Привалова (Рпуа1оу, 1979, 1986). Калориметрическую энтальпию денатурации АНкал получали численным интегрированием области под кривой избыточной теплоемкости, ограниченной снизу сигмоидальной базовой линией, определяемой разностью теплоемкостей между нативным и денатурированным состоянием. Эффективную энтальпию денатурации определяли по формуле:

с*-ЛСр

д1.гфф=4КТ2 ^ (15)

где: Тт - температура соответствующая максимуму теплоемкости, Я -газовая постоянная, Ср - максимальная ордината термограммы, АСР -разность теплоемкостей белка в денатурированном и нативном состояниях. Число кооперативных единиц г (энергетических доменов) определяли по формуле:

г = АНкал/АНэфф

(16)

3.9. Деконволюция кривых ДСК.

Анализ деконволюции зависимостей избыточной теплоемкости от температуры был проведен с использованием программы CpCalc Version 2.1 (Copyright 1995-1996, Applied Thermodynamics). Предполагалось, что полная избыточная теплоемкость является суммой п независимых температурных переходов, каждый из которых отвечает модели двух состояний. Теплоемкость каждого перехода определяется производной изменения энтальпии по температуре:

с;^ (17)

Изменение энтальпии i-ro перехода определяется произведением полной энтальпии i-ro перехода на долю молекул перешедших в новое состояние:

Н;(Т) = сц(Т) АН; (18)

Доля молекул в новом состоянии (заселенность состояния) определяется константой равновесия:

"'"-bin, <19>

kf(T) = exp

АН'

Заключение диссертации по теме «Физиология», Персиков, Антон Валерьевич

6. выводы

1. Лактатдегидрогеназа из белых скелетных мышц вьюнов, адаптированных к низким температурам («холодная» форма фермента), обладает большей термостабильностью по сравнению с ЛДГ из мышц рыб, адаптированных к относительно высоким температурам («теплый» фермент).

2. Температуры денатурационных переходов (Тт) для «холодной» и «теплой» ЛДГ не отличаются, однако «теплая» форма фермента обладает большей энтальпией перехода (ДНкал), по сравнению с «холодной» формой.

3. При физиологических температурах изменение свободной энергии Гиббса, характеризующее стабильность белка, меньше у «холодной» формы фермента по сравнению с «теплой».

4. Удельная теплоемкость при 25°С выше для «холодной» ЛДГ по сравнению с «теплой», что свидетельствует о большей конформационной подвижности «холодной» формы фермента. Различия в величине теплоемкости двух форм ЛДГ исчезают после их денатурации.

5. Денатурация ЛДГ во всем изученном интервале рН представляет собой трехстадийный переход, учитывающий начальный-диссоциацию фермента на субъединицы и двухстадийную денатурацию субъединиц.

6. Обнаружена хорошая корреляция кинетических данных, полученных методом дифференциальной сканирующей калориметрии, с данными по кинетике термоинактивации фермента.

7. Выявлены места возможного связывания ионов цинка молекулой ЛДГ. «Холодная» форма ЛДГ содержит в 3-4 раза больше ионов цинка, чем «теплая» форма. Предполагается, что эти различия служат одной из причин изменения функциональных и структурных свойств фермента при температурной адаптации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Персиков, Антон Валерьевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Александров, В. (1975) Клетки, макромолекулы и температура, Л.: Наука, 253 с.

Биркая, В. Г., Ломидзе, Э. М., Киладзе, А. А., Монаселидзе, Д. Р. Действие ионов цинка на структуру и функцию лактатдегидрогеназы М4, Биофизика, 1990, т. 35, с. 579-580.

Диксон, М., Уэбб, Э. (1982) Ферменты, в 3-х томах, М.: Мир.

Жоли, М. (1968) Физическая химия денатурации белков, М.: Мир, 361 с.

Киладзе, А. А., Биркая, В. Г., Ломидзе, Э. С., Монаселидзе, Д. Р. Различный характер связывания ионов цинка с лактатдегидрогеназой М4 в разбавленных и концентрированных растворах, Биофизика, 1996, т. 41, с. 326-328.

Клячко, О. С., Полосухина, Е. С., Озернюк, Н. Д. Функциональные отличия лактатдегидрогеназы из мышц рыб, адаптированных к разным температурам среды, Докл. РАН, 1992, т. 325, с. 1246-1251.

Клячко, О. С., Полосухина, Е. С., Озернюк, Н. Д. Температура вызывает структурные и функциональные изменения лактатдегидрогеназы из скелетных мышц рыб, Биофизика, 1993, т. 38, с. 596-601.

Кубе, Д., Шныров, В. Л., Пермяков, Е. А., Иванов, М. В., & Наградова, Н.К. Взаимосвязь между термостабильностью тетрамерной молекулы лактатдегидрогеназы из мышц свиньи и степенью занятости ее активных центров лигандами, Биохимия, 1987, т. 52, сЛ 116-1125.

Лущак, В. И. Выделение и характеристика лактатдегидрогеназы из ската Raja clavata, Укр. биохим. журн., 1990, т. 62, с. 38-42.

Любарев, А. Е., Курганов, Б. И. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. 1. Модель включающая две последовательно протекающие необратимые стадии, Биохимия, 1998, т. 63, с. 516-523.

Полторак, О. М., Чухрай, Е. С., Диссоциативная термоинактивация биокатализаторов. Биотехнология (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР), М., 1986, т. 5, с. 50-86,

Привалов, П. JI. Стабильность белка и гидрофобные взаимодействия, Биофизика, 1987, т. 32, с. 742-759.

Пфайль, В., Привалов, П. JL, Конформационные изменения в белках, 1982, Биохимическая термодинамика (Джоунс, М., ред.), М.: Мир, с. 95-139.

Филимонов, В. В., Потехин, С. А., Матвеев, С. В., Привалов, П. Л. Термодинамический анализ данных сканирующей микрокалориметрии, Молек. биол., 1982, т. 166, с. 551-562.

Хочачка, П., Сомеро, Д. (1977) Стратегия биохимической адаптации, М.: Мир, 398 с.

Хочачка, П., Сомеро, Д. (1988) Биохимическая адаптация, М.: Мир, 568 с.

Шахнович, Е. И., Финкелыптейн, А. В. К теории кооперативных переходов в белковых глобулах, Доклады АН СССР, 1982, т. 267, с.1247-1250.

Abad-Zapatero, С., Griffith, J. P., Sussman, J. L., & Rossman, M. G. Refined crystal structure of dogfish M4 apo-lactate dehydrogenase, J. Mol. Biol., 1987, v. 198, pp. 445-467.

Adams, M. J., M.Buehner, K.Chandrasekhar, G.C.Ford, M. L. Hackert, A.Liljas, M.G.Rossmann, I.E.Smiley, W. S. Allison, J.Everse, N.O.Kaplan, & S.S.Taylor Structure-Function Relationships In Lactate Dehydrogenase, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, pp. 1968-1972.

Argos, P., Rossman, M. G., Grau, U. M., Zuber, H., Frank, G., & Tratschin, J. D. Thermal stability and protein structure, Biochemistry, 1979, v. 18, pp. 5698-5703.

Arroyoreyna, A., & Hernandezarana, A. The thermal denaturation of stem bromelain is consistent with an irreversible two-state model, Biochim. et Biophys. Acta, 1995, v. 1248, pp. 123-128.

Bai, J. H., Wang, H. J., Liu, D. S., & Zhou, H. M. Kinetics of thermal inactivation of lactate dehydrogenase from rabbit muscle, J. Prot. Chem., 1997, v. 16, pp. 801-807.

Baldwin, J., & Hochachka, P. W. Functional significance of isoenzymes in thermal acclimatization: Acetylcholinesterase from trout brain, Biochem. J., 1970, v. 116, pp. 883-887.

Baldwin, J. Adaptation of enzymes to temperature: acetylcholinesterases in the central nervous system of fishes, Comp. Biochem. Physiol., 1971, v. 40, pp. 181-187.

Basaglia, F. Some aspects of isozymes of lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase and glucosephosphate isomerase in fish, Comp. Biochem. Physiol., 1989, v. 92B, pp. 213-226.

Basaglia, F. Lactate dehydrogenase isozymes and their genetic variation in fifteen sparidae species (Perciformes, Teleostei), Comp. Biochem. Physiol., 1991, v. 98B, pp. 1-8.

Bowden, L. A., Restall, C. J., & Rowley, A. F. The influence of environmental temperature on membrane fluidity, fatty acid composition and lipoxygenase product generation in head kidney leucocytes of the rainbow trout, oncorhynchus mykiss, Comp. Biochem. Physiol. B -Biochemistry & Molecular Biology, 1996, v. 115, pp. 375-382.

Brandts, J. F., Hu, C. Q., Lin, L.-N., & Mas, M. T. A simple model for proteins with interacting domains. Applications to scanning calorimetry data, Biochemistry, 1989, v. 28, pp. 8588-8596.

Brandts, J. F., & Lin, L. Study of strong to ultratight protein interaction using differential scanning calorimeter, Biochemistry, 1990, v. 29, pp. 69276940.

Buchholz, F., & Vetter, R.-A. H. Enzyme kinetics in cold water: characteristics of N-acetil-b-D-glucosaminidase activity in the Antarctic krill, Euphausia superba, compared with other crustacean species, J. Comp. Physiol. B, 1993, v. 163, pp. 28-37.

Cahn, R. D. Developmental changes in embrionic enzyme patterns: the effect of oxidative substrates on lactic dehydrogenase in beating chick embrionic heart cell cultures, Develop. Biol., 1964, v. 9, pp. 327-346.

Chen, R. F., Eldemann, H., & Steiner, R. F., Fluorescence of proteins, 1975, in Physical principles and techniques of protein chemistry (Leach, S. J., Ed.), pp 171, Academic Press, New York.

Conejero-Lara, F., Mateo, P. L., Aviles, F. X., & Sanchez-Ruiz, J. M. Effect of Zn on the thermal denaturation of carboxypeptidase B, Biochemistry, 1991, v. 30, pp. 2067-2072.

Cooper, A. Thermodynamic fluctuations in protein molecules, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, pp. 2740-2741.

Coppes, Z. L., & Somero, C. N. Temperature-adaptive differences between the M4 lactate dehydrogenases of stenothermal and eurythermal sciaenid fishes, J. Exper. Zool., 1990, v. 254, pp. 127-131.

De Francesco, R., Urbani, A., Nardi, M. C., Tomei, L., Steinkuehler, C., & Tramontano, A. A zinc binding site in viral serine proteinases, Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 13282-13287.

Dittrich, B. Thermal acclimation and kinetics of a trypsin-like protease in eucarid crustaceans, J. Comp. Physiol. B, 1992, v. 162, pp. 38-46.

Edge, V., Allewell, N. M., & Sturtevant, J. M. High-resolution differential scanning calorimetric analysis of the subunits of Escherichia coli asparate transcarbamoylase, Biochemistry, 1985, v. 24, pp. 5899-5906.

Eszes, C. M., Sessions, R. B., Clarke, A. R., Moreton, K. M., & Holbrook, J. J. Removal of substrate inhibition in a lactate dehydrogenase from human muscle by a single residue change, FEBS Letters, 1996, v. 399, pp. 193197.

Eventoff, Tw., Rossmann, M. G., Taylor, S. S., Torff, H.-J., Meyer, H., Keil, W., & Kiltz, H.-H. Structural adaptations of lactate dehydrogenase isosymes, Pros. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, pp. 2677-2681.

Feller, G., Arpigny, J. L., Narinx, E., & Gerday, C. Molecular adaptations of

enzymes from psychrophilic organisms, Comp. Biochem. Physiol. A -Physiology, 1997, v. 118, pp. 495-499.

Fields, P. A., & Somero, G. N. Amino aeid sequence differences cannot fully explain interspecific variation in thermal sensitivities of gobiid fish a(4)-lactate dehydrogenases (a(4)-LDHs), J. Exp. Biol., 1997, v. 200, pp. 1839-1850.

Finer, E. G., Francs, F., & Tait, M. J. Nuclear magnetic studies of aqueous urea solution, J. Amer. Chem. Soc., 1972, v. 94, pp. 4424-4429.

Fisher, H. F., & Singh, N., Calorimetric methods for interpreting protein-ligand interactions, 1995, in Energetics of Biological Macromolecules (Johnson, M. L., & Ackers, G. K., Eds.), pp 194-221, Academic Press, New York.

Franklin, C. E., & Johnston, I. A. Muscle power output during escape responses in an antarctic fish, J. Exp. Biol., 1997, v. 200, pp. 703-712.

Freire, E., & Biltonen, R. L. Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules, Biopolymers, 1978, v. 17, pp. 463-510.

Freire, E. Analysis of Irreversible Transitions Using Differential Scanning Calorimetry, Biophys. J., 1987, v. 51, pp. A381.

Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., & Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1990, v. 19, pp. 159188.

Fuery, C. J., Attwood, P. V., Withers, P. C., Yancey, P. H., Baldwin, J., & Guppy, M. Effects of urea on m-4-lactate dehydrogenase from elasmobranchs and urea-accumulating australian desert frogs, Comp. Biochem. Physiol. B - Biochemistry & Molecular Biology, 1997, v. 117, pp. 143-150.

Fukada, H., Sturtevant, J. M., & Quiocho, F. A. Thermodynamics of the binding of L-arabinose and D-galactose to the L-arabinose-binding protein of Escherichia coli, J. Biol. Chem., 1983, v. 258, pp. 13193-

13198.

Fushinobu, S., Ohta, T., & Matsuzawa, H. Homotropic activation via the subunit interaction and allosteric symmetry revealed on analysis of hybrid enzymes of 1-lactate dehydrogenase, J. Biol. Chem., 1998, v. 273, pp.2971-2976.

Galisteo, M. L., Mateo, P. L., & Sanchez-Ruiz, J. M. Kinetic study on the irreversible thermal denaturation of yeast phosphoglycerate kinase, Biochemistry, 1991, v. 30, pp. 2061-2066. Goins, B., & Freire, E. Thermal stability and intersubunit interactions of cholera toxin in solution and in association with its cell-surface receptor ganglioside GMi, Biochemistry, 1988, v. 27, pp. 2046-2052. Guzman-Casado, M., Parody-Morreale, A., Mateo, P. L., & Sanchez-Ruiz, J. M. Differential scanning calorimetry of lobster haemocyanin, Eur. J. Biochem., 1990, v. 188, pp. 181-185. Hebb, C., Stephens, T. S., & Smith, M. W. Effect of environmental temperature on the kinetic properties of goldfish brain choline acetyltransferase, Biochem. J., 1972, v. 129, pp. 1013-1021. Hermans, J. Y. The effect of protein dénaturants on the stability of the helix, J.

Amer. Chem. Soc., 1966, v. 88, pp. 2418-2422. Hewitt, C. O., Sessions, R. B., Dafforn, T. R., & Holbrook, J. J. Protein engineering tests of a homology model of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase, Prot. Eng., 1997, v. 10, pp. 39-44. Hinz, H.-J., & Jaenicke, R. Thermodynamics of complex formation between nicotinamide adenine dinucleotide and pig skeletal muscle lactate dehydrogenase, Biochemistry, 1975, v. 14, pp. 24-27. Hinz, H.-J. Microcalorimetry and Thermodynamics, Europhys. News, 1986, v.

1 n ^^ 1/1 1 /"

i /, pp. i4-io.

Hinz, H.-J. Thermodynamic parameters for protein-protein and protein-ligand interaction by differential scanning microcalorimetry, Meth. Enzymol., 1986, v. 130, pp. 59-79.

Hirayama, Y., & Watabe, S. Structural differences in the crossbridge head of temperature-associated myosin subfragment-1 isoforms from carp fast skeletal muscle, Eur. J. Biochem., 1997, v. 246, pp. 380-387.

Hirayama, Y., Kanoh, S., Nakaya, M., & Watabe, S. The two essential light chains of carp fast skeletal myosin, LCI and LC3, are encoded by distinct genes and change their molar ratio following temperature acclimation, J. Exp. Biol., 1997, v. 200, pp. 693-701.

Hochachka, P. W., & Clayton-Hochachka, B. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and thermal acclimation in the mullet fish, Marine Biol., 1973, v. 18, pp. 251-259.

Holbrook, J. J., Liljas, A., Steindal, S., & Rossmann, M. G., Lactate dehydrogenase, 1975, in The Enzymes (Boyer, P. D., Ed.), pp 191-292, Academic Press, New York.

Holcomb, D. N., & van Holde, K. E. J. Phys. Chem., 1962, v. 66, pp. 19992006.

Holland, L. Z., Mcfallngai, M., & Somero, G. N. Evolution of lactate dehydrogenase-a homologs of barracuda fishes (genus sphyraena) from different thermal environments: differences in kinetic properties and thermal stability are due to amino acid substitutions outside the active site, Biochemistry, 1997, v. 36, pp. 3207-3215.

Hondred, D., & Hanson, A. D. Hypoxically inducible barley lactate dehydrogenase: cDNA cloning and molecular analysis, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, pp. 7300-7304.

Hu, C. Q., & Sturtevant, J. M. Thermodynamic study of yeast phosphoglycerate kinase, Biochemistry, 1987, v. 26, pp. 178-182.

Hu, C. Q., & Sturtevant, J. M. A differential scanning calorimetric study on the binding of sulfate ion and of Cibacron "blue F3GA to yeast phosphoglycerate kinase, Biochemistry, 1989, v. 28, pp. 813-818.

Huang, C.-C., Lesburg, C. A., Kiefer, L. L., Fierke, C. A., & Christianson, D. W. Reversal of the hydrogen bond to zinc ligand histidine-119

dramatically diminishes catalysis and enhances metal equilibration kinetics in carbonic anhydrase II, Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 34393446.

Hubley, M. J., Locke, B. R., & Moerland, T. S. Reaction-diffusion analysis of the effects of temperature on high-energy phosphate dynamics in goldfish skeletal muscle, J. Exp. Biol., 1997, v. 200, pp. 975-988.

Ibarra-Molero, B., & Sanchez-Ruiz, J. M. A model-independent, nonlinear extrapolation procedure for the characterization of protein folding energetics from solvent-denaturation data, Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 14689-14702.

Imai, J. I., Hirayama, Y., Kikuchi, K., Kainuma, M., & Watabe, S. cDNA cloning of myosin heavy chain isoforms from carp fast skeletal muscle and their gene expression associated with temperature acclimation, J. Exp. Biol., 1997, v. 200, pp. 27-34.

Jacobson, A. L., & Braun, H. Differential scanning calorimetry of the thermal denaturation of lactate dehydrogenase, Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 493, pp. 142-153.

Jaenicke, R. Folding and association of proteins, Proc. Biophys. Molec. Biol., 1987, v. 49, pp. 117-237.

Jaenicke, R. (1991) Protein stability and protein folding, in Protein conformation (Ciba foundation symposium 161) pp 206-221, Wiley, Chichester.

Jaenicke, R., Protein stability, folding and association, 1993, in Immobilised macromolecules: application potentials (Sleytr, U. B., Ed.), pp 1-22.

Jagdale, G. B., & Gordon, R. Effect of temperature on the activities of glucose-6-phosphate dehydrogenase and hexokinase in entomopathogenic nematodes (nematoaa: steinernematidae), Comp. Biochem. Physiol. A -Physiology, 1997, v. 118, pp. 1151-1156.

Jain, S., & Ahluwalia, J. C. Differential scanning calorimetric studies on the effect of ammonium and tetraalkylammonium halides on the stability of

lysozyme, Biophys. Chem., 1996, v. 59, pp. 171-177.

Klibanov, A. M., & Ahern, T. J., Thermal stability of proteins, 1987, in Protein Engineering (Oxender, D. L., & Fox, C. F., Eds.), pp 213-218, Alan R. Liss, New York.

Klyachko, O. S., Polosukhina, E. S., & Ozernyuk, N. D. The effects of temperature and chorionic gonadotropin on the functional properties of lactate dehydrogenase from oocytes of loach Misgurnus fossilis, Comp. Biochem. Physiol., 1995, v. 11 IB, pp. 517-521.

Kiinnemann, H. Der Einflub der Temperatur auf Thermostabilitat, IsoenzymMuster und Reaktionskinetik der Laktate-Dehydrogenase aus Fischen, Marine Biol., 1973, v. 18, pp. 37-45.

Lepock, J. R., Rodahl, A. M., Zhang, C., Heynen, M. L., Waters, B., & Cheng, K.-H. Thermal denaturation of the Ca -ATPase of sarcoplasmic reticulum reveals two thermodynamically independent domains, Biochemistry, 1990, v. 29, pp. 681-689.

Lin, L.-N., Mason, A. B., Woodworth, R. C., & Brandts, J. F. Calorimetric Studies of the binding of Ferric Ions to Ovotranferrin and interactions between Binding Sites, Biochemistry, 1991, v. 30, pp. 11660-11669.

Lin, L.-N., Mason, A. B., Woodworth, R. C., & Brandts, J. F. Calorimetric studies of the binding of Ferric Ions to Human Serum Transferin, Biochemistry, 1993, v. 32, pp. 9398-9406.

Low, P. S., Bada, J. L., & Somero, G. N. Temperature adaptation of enzymes: roles of the free energy, the enthalpy, and the entropy of activation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, pp. 430-432.

Lumry, T. H., & Eyring, H. Conformational changes of proteins, J. Phys. Chem., 1954, v. 58, pp. 110-120.

Madurawe, R. D., Lin, Z., Dryden, P. K., & Lumpkin, J. A. Stability of lactate dehydrogenase in metal-catalyzed oxidation solutions containing chelated metals, Biotechnol. Prog., 1997, v. 13, pp. 179-184.

Makhatadze, G. I., & Privalov, P. L. Heat capacity of proteins. I. Partial molar

heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: hydration effect, J. Mol. Biol., 1990, v. 213, pp. 375-384.

Makhatadze, G. I., Clore, M., Gronenborn, A. M., & Privalov, P. L. Thermodynamics of unfolding of the all b-sheet protein interleukin-lb, Biochemistry, 1994, v. 33, pp. 9327-9332.

Makhatadze, G. I., & Privalov, P. L. Energetics of protein structure, Adv. Prot. Chem., 1995, v. 47, pp. 307-425.

Manly, S. P., Matthews, K. S., & Sturtevant, J. M. Thermal denaturation of the core protein of lac repressor, Biochemistry, 1985, v. 24, pp. 3842-3846.

Markert, C. L., & Moller, F. Multiple forms of enzymes: tissue, ontogenetic and species specific patterns, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1959, v. 45, pp. 753-763.

Markert, C. L. Lactate dehydrogenase isozymes: Dissociation and recombination of subunits, Science, 1963, v. 140, pp. 1329-1330.

Mayorga, O. L., & Freire, E. Dynamic Analysis of Differential Scanning Calorimetry Data, Biophys. J., 1987, v. 51, pp. A443.

Medved, L. V., Busby, T. F., & Ingham, K. C. Calorimetric investigation of the domain structure of human complement Cls: Reversible unfolding of the short consensus repeat units, Biochemistry, 1989, v. 28, pp. 5408-5414.

Medved, L. V., Solovjov, D. A., & Ingham, K. C. Domain structure, stability and interactions in streptokinase, Eur. J. Biochem., 1996, v. 239, pp. 333-339.

Mely, Y., De Rocquigni, H., Morellet, N., Roques, B. P., & Gerard, D. Zinc binding to the HTV-1 nucleocapsid protein: a thermodynamic investigation by fluorescence spectroscopy, Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 5175-5182.

Moon, T. W., & Hochachka, P. W. Temperature and enzyme activity in poikilotherms: isocitrate dehydrogenase in rainbow trout liver, Biochem. J., 1971, v. 123, pp. 695-705.

Moon, T. W., & Hochachka, P. W. Temperature and the kinetic analysis of

trout isocitrate dehydrogenases, Comp. Biochem. Physiol., 1972, v. 42, pp. 725-730.

Morin, P. E., Diggs, D., & Freire, E. Thermal stbility of membrane-reconstituted yeast cytochrome c oxidase, Biochemistry, 1990, v. 29, pp. 781-788.

Moses, E„ & Hinz, H.-J. J. Mol. Biol., 1983, v. 170, pp. 765-776. Nakaya, M., Kakinuma, M., Watabe, S., & Ooi, T. Differential scanning calorimetry and CD spectrometry of acclimation temperature-associated types of carp light meromyosin, Biochemistry, 1997, v. 36, pp. 91799184.

Niwa, E., Kanoh, S., Osaka, Y., Nakayama, T., Watabe, S., & Hashimoto, K. Changes in surface hydrophobicity of fish actomyosins induced by urea, Nippon Suisan Gakkaishi Bull. Jap. Soc. Fish, 1989, v. 55, pp. 143-146. Ono, M., Matsuzawa, H., & Ohta, T. Nucleotide sequence and characteristics of the gene for 1-lactate dehydrogenase of Thermus aquaticus YT-1 and the deduced amino acid sequence of the enzyme, J. Biochem., 1990, v. 107, pp. 21-26.

Ozernyuk, N. D., Klyachko, O. S., & Polosukhina, E. S. Acclimation temperature affects the functional and structural properties of lactate dehydrogenase from fish (Misgurnus fossilis) skeletal muscles, Comp. Biochem. Physiol., 1994, v. 107B,pp. 141-145. Pesce, A., Fondy, T. P., Stolzenbach, F., Castillo, F., & Kaplan, N. O. The comparative enzymology of lactic dehydrogenases., J. Biol. Chem., 1967, v. 242, pp. 2151-2167. Petukhov, M., Kil, Y., Kuramitsu, S., & Lanzov, V. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their a-helices,

n , • 1 AAH A O AA ^^ A

rroieins, iyy/, v. zy, pp. 3uy-3zu. Pierce, V. A., & Crawford, D. L. Phylogenetic analysis of thermal acclimation of the glycolytic enzymes in the genus fundulus, Physiological Zoology, 1997, v. 70, pp. 597-609.

Place, A. R., & Powers, D. A. Purification and characterization of the lactate dehydrogenase (LDH-B) allozymes of Fundulus heteroclitus, J. Biol Chem., 1984, v. 259, pp. 1299-1308.

Pretsch, W., Chatterjee, B., Favor, J., Merkle, S., & Sandulache, R. Molecular, genetic and biochemical characterization of lactate dehydrogenase-a enzyme activity mutations in mus musculus, Mamm. Genome, 1998, v. 9, pp. 144-149.

Privalov, P. L., & Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilisation of globular protein structure: a calorimetric study, J. Mol. Biol., 1974, v. 86, pp. 665-684.

Privalov, P. L. Stability of proteins. Small globular proteins, Adv. Prot. Chem., 1979, v. 33, pp. 167-241.

Privalov, P. L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system, Adv. Prot. Chem., 1982, v. 35, pp. 1-104.

Privalov, P. L., & Medved, L. V. Domains in the fibrinogen molecule, J. Mol. Biol., 1982, v. 159, pp. 665-683.

Privalov, P. L., & Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins, Meth. Enzymol., 1986, v. 131, pp. 4-51.

Privalov, P. L., Tiktopulo, E. I., Venyaminov, S. Y., Griko, Y. V., Makhatadze, G. I., & Khechinashvili, N. N. Heat capacity and conformation of proteins in the denaturated state, J. Mol. Biol, 1989, v. 205, pp. 737750.

Privalov, P. L., & Makhatadze, G. I. Heat capacity of proteins. II. Partial molar heat capacity of the unfolded polypeptide chain of proteins: protein unfolding effect., J. Mol Biol, 1990, v. 213, pp. 385-391.

Privalov, P. L., & Makhatadze, G. I. Contribution of hydration and non-covalent interactions to the heat capacity effect on protein unfolding, J. Mol Biol, 1992, v. 224, pp. 715-723.

Privalov, P. L., & Makhatadze, G. I. Contribution of hydration to protein

folding thermodynamics. II. The entropy and Gibbs energy of hydration, J. Mol. Biol., 1993, v. 232, pp. 660-679.

Richardson, J. S. Handedness of crossover connections in b-sheets, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, pp. 2619-2633.

Richardson, J. S. b-sheet topology and relatedness of proteins, Nature, 1977, v. 268, pp. 495-499.

Rossmann, M. G., Jeffery, B. A., Main, P., & Warren, S. The Crystal Structure Of Lactic Dehydrogenase, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1967, v. 57, pp. 515-524.

Rossmann, M. G., Adams, M. J., Buehner, M., Ford, G. C., Hackert, M. L., Liljas, A., Rao, S. T., Banaszak, L. J., Hill, E., Tsernoglou, D., & Webb, L. Molecular Symmetry Axes and Subunit Interfaces In Certain Dehydrogenases, J. Mol. Biol, 1973, v. 76, pp. 533-537.

Rossmann, M. G., & Liljas, A. Recognition Of Structural Domains In Globular Proteins, J. Mol. Biol., 1974, v. 85, pp. 177-184.

Saburova, E. A., Khechinashvili, N. N., & Elfimova, L. I. Polyhydric alcohol-protein interactions, microcalorimetry of lactate dehydrogenase denaturation in water-glycerol solutions, Mol. Biol., 1996, v. 30, pp. 733-738.

Sanchez-Ruiz, J. M., Lopez-Lacomba, J. L., Cortijo, M., & Mateo, P. L. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin, Biochemistry, 1988, v. 27, pp. 1648-1652.

Sanchez-Ruiz, J. M., Lopez-Lacomba, J. L., Mateo, P. L., Vilanova, M., Serra, M. A., & Alives, F. X. Analysis of the thermal unfolding of porcine procarboxypeptidase A and its functional pieces by differential scanning calorimetry, Eur. J. Biochem., 1988, v. 176, pp. 225-230.

Sanchez-Ruiz, J. M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry, Biophys. J., 1992, v. 61, pp. 921-935.

Sasso, S., Protasevich, I., Gilli, R., Makarov, A., & Briand, C. Thermal denaturation of bacterial and bovine dihydrofolate reductases and their

complexes with NADPH, trimethoprim and methotrexate, J. Biomolec. Struct. Dynamics, 1995, v. 12, pp. 1023-1032.

Schoppe, A., Hinz, H.-J., Agashe, V. R., Ramachandran, S., & Udgaonkar, J. B. DSC studies of the conformational stability of barstar wild-type, Protein Sci., 1997, v. 6, pp. 2196-2202.

Seddon, W. L. Mechanisms of temperature acclimation in the channel catfish ictalurus punctatus: isozymes and quantitative changes, Comp. Biochem. Physiol. A - Physiology, 1997, v. 118, pp. 813-820.

Seddon, W. L., & Prosser, C. L. Seasonal variations in the temperature acclimation response of the channel catfish, ictalurus punctatus, Physiol. Zool., 1997, v. 70, pp. 33-44.

Shakhnovich, E. I., & Finkelstein, A. V. Theory of cooperative transitions in protein molecules. I. Why denaturation of globular protein is a firstorder phase transition, Biopolymers, 1989, v. 28, pp. 1667-1680.

Shaklee, J. B., The role of subunit interaction in the genesis of non-binomial lactate dehydrogenase isozyme distribution, 1975, in Isozymes, I (Markert, C. L., Ed.), pp 101-118, Academic Press, New York.

Shaklee, J. B., Christiansen, J. A., Sidell, B. D., Prosser, C. L., & Whitt, G. S. Molecular aspects of temperature acclimation in fish: contributions of changes in enzyme activities and isozyme patterns to metabolic reorganisation in the green sunfish, J. Exp. Zool., 1977, v. 201, pp. 1-20.

Shnyrov, V. L., Marcos, M. J., & Villar, E. Kinetic study on the irreversible thermal denaturation of lentil lectin, Biochem. Molec. Biol. Internat., 1996, v. 39, pp. 647-656.

Somero, G. N. Pyruvate kinase variants of the Alaskan king-crab, Biochem. J., 1969, v. 114, pp. 237-241.

Somero, G. N., The role of isozymes in adaptation to varying temperatures, 1975, in Isozymes, XI, Physiological function (Markert, Ed.), pp 221234, Academic Press, New York.

Somero, G. N. pH-temperature interactions in proteins: principles of optimal

pH and buffer system design, Marine Biol. Lett., 1981, v. 2, pp. 163-178.

Stock, D. W., & Whitt, G. S. Evolutionary implications of the cDNA sequence of the single lactate dehydrogenase of a lamprey, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, pp. 1799-1803.

Straume, M., & Freire, E. Two-dimensional differential scanning calorimrtry: simultaneous resolution of intrinsic protein structural energetics and ligand binding interactions by global linkage analysis, Analitical Biochem., 1992, v. 203, pp. 259-268.

Subramanian, S., & Ross, P. D. Thermodynamics of binding of oxidized and reduced nicotinamide adenine dinucleotides, adenosine-5'-diphosphoribose, and 5'-iodosalicylate to dehydrogenases, Biochemistry, 1978, v. 17, pp. 784-790.

Sun, Z. Y., Pratt, E. A., Simplaceanu, V., & Ho, C. A F-NMR study of the equilibrium unfolding of membrane-associated D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli, Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 16502-16509.

Takahashi, K., & Sturtevant, J. M. Thermal denaturation of Streptomyces subtilisin inhibitor, subtilisin BPN', and the inhibitor-subtilisin complex., Biochemistry, 1981, v. 20, pp. 6185-6190.

Tsoi, S. C.-M., & Li, S. S.-L. The nucleotide and deduced amino-acid sequences of a cDNA encoding lactate dehydrogenase from Caenorhabditis elegans: the evolutionary relationships of lactate dehydrogenases from mammals, birds, amphibian, fish, nematode, plants, bacteria, mycoplasma, and plasmodium, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, v. 205, pp. 558-564.

Tsuji, S., Qureshi, M. A., Hou, E. W., Fitch, W. M., & Li, S. S.-L. Evolutionary relationships of lactate dehydrogenases (LDHs) from mammals, birds, amphibian, fish, barley, and bacteria: LDH cDNA sequences from Xenopus, pig, and rat, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, pp. 9392-9396.

Tsuruta, H., Tsuneta, S. T., Ishida, Y., Watanabe, K., Uno, T., & Aizono, Y.

Purification and some characteristics of phosphatase of a psychrophile, J. Biochem., 1998, v. 123, pp. 219-225.

Vallee, B. L., & Auld, D. S. Zinc coordination, function, and structure of zinc enzymes and other proteins, Biochemistry, 1990, v. 29, pp. 5647-5659.

Vallee, B. L., Coleman, J. E., & Auld, D. S. Zinc fingers, zinc clusters, and zinc twists in DNA-binding protein domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, pp. 999-1003.

Vanbeek, J., Callender, R., & Gunner, M. R. The contribution of electrostatic and van der waals interactions to the stereospecificity of the reaction catalyzed by lactate dehydrogenase, Biophys. J., 1997, v. 72, pp. 619626.

Vetter, R.-A. H. Ecophysiological studies on citrate-synthase: (I) enzyme regulation of selected crustaceans with regard to temperature adaptation, J. Comp. Physiol. B, 1995, v. 165, pp. 46-55.

Vetter, R.-A. H. Ecophysiological studies on citrate-synthase: (II) enzyme regulation of selected crustaceans with regard to life-style and the climatic zone, J. Comp. Physiol. B, 1995, v. 165, pp. 56-61.

Vetter, R.-A. H., & Buchholz, F. Catalytic properties of two pyruvate kinase isoforms in nordic krill, Meganyctiphanes norvegica, with respect to seasonal temperature adaptation, Comp. Biochem. Physiol. A -Physiology, 1997, v. 116A,pp. 1-10.

Vincent, S. J. F., Zwahlen, C., Post, C. B., Burgner, J. W., & Bodenhausen, G. The conformation of NAD(+) bound to lactate dehydrogenase determined by nuclear magnetic resonance with suppression of spin diffusion, Proc. Nat Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, pp. 4383-4388.

Vogl, T., & Hinz, H.-J. Characterization of recombinant proteins: biochemical and biophysical criteria for the identity of native and renatured human tissue plasminogen activator and its mutants, Biotechnol. Appl. Biochem., 1994, v. 20, pp. 1-22.

Vogl, T., Jatzke, C., Hinz, H.-J., Benz, J., & Huber, R. Thermodynamic

stability of annexin V E17G: equilibrium parameters from an irreversible unfolding reaction, Biochemistry, 1997, v. 36, pp. 1657-1668.

Wachsmuth, E. D., Pfleider, G., & Wieland, T. Aminosäurezusammensetzung von Isozymen der Lactatdehydrogenase aus menschlichen und tierischen Organen, Biochem. Zeitschrift, 1964, v. 340, pp. 80-94.

Welfle, K., Misselwitz, R., Welfle, H., Pölitz, O., & Borriss, R. Influence of 2+

Ca on conformation and stability of three bacterial hybrid glucanases, Eur. J. Biochem., 1995, v. 229, pp. 726-735.

Welfle, K., Misselwitz, R., Pölitz, O., Borriss, R., & Welfle, H. Individual amino acids in the N-terminal loop region determine the thermostability and unfolding characteristics of bacterial glucanases, Protein Sei., 1996, v. 5, pp. 2255-2265.

Wernick, A., & Künnemann, H. Der Einflub der Temperatur auf die SubstratAffinitat der Laktat-Dehydrogenase aus Fischen, Marine Biol., 1973, v. 18, pp. 32-36.

Wetlaufer, D. B., Stoller, L., & Coffin, R. L. Nonpolar group participation in the denaturation of proteins by urea and guanidinum salts. Model compound studies, J. Amer. Chem. Soc., 1964, v. 86, pp. 508-514.

Wiesinger, H., & Hinz, H.-J., Thermodynamic data for protein-ligand interaction, 1986, in Thermodynamic data in biochemistry and biotechnology (Hinz, H.-J., Ed.), pp 211-226, Springer-Verlag, Berlin & New York.

Wilson, F. R., Champion, M. J., Whitt, G. S., & Prosser, C. L., Isozyme patterns in tissues of temperature-acclimated fish, 1975, in Isozymes, II, Physiological function (Markert, C. L., Ed.), pp 193-206, Academic Press, New York.

Wintrode, P. L., Griko, Y. V., & Privalov, P. L. Structural energetics of barstar studied by differential scanning microcalorimetry, Prot. Sei., 1995, v. 4, pp. 1528-1534.

Zamyatnin, A. A. Amino acid, peptide and protein volume in solution, Ann.

Rev. Biophys. Bioeng., 1984, v. 13, pp. 145-165. Zhang, Z., Post, C. B., & Smith, D. L. Amide hydrogen exchange determined by mass spectrometry: Application to rabbit muscle aldolase. Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 779-791. Zietara, M. S., Gronczewska, J., & Skorkowski, E. F. Purification and properties of the threespine stickleback (gasterosteus aculeatus) lactate dehydrogenase LDH-b-4 and LDH-c-4 isoenzymes, Comp. Biochem. Physiol. B - Biochemistry & Molecular Biology, 1997, v. 117, pp. 571577.