Функциональная характеристика микроРНК-мРНК интерактома человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Кудряшова Ольга Михайловна

• Кудряшова Ольга Михайловна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Кудряшова Ольга Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 микроРНК

1.1.1 Открытие микроРНК регуляции

1.1.2 Биогенез микроРНК

1.2 Экспериментальные методы определения микроРНК-мРНК взаимодействий

1.2.1 Конструкции с репортерным белком

1.2.2 Косвенное определение микроРНК взаимодействий по изменению уровня экспрессии генов

1.2.3 Методы связывания РНК с белком и последующей иммунопреципитацией

1.2.4 Методы высокопроизводительного секвенирования нового поколения для определения микроРНК - РНК взаимодействий

1.3 Биоинформатические методы определения микроРНК-мРНК взаимодействий

1.3.1 Основные программы для предсказания микроРНК-мРНК взаимодействий

1.3.2 Программы по предсказанию микроРНК-мРНК взаимодействий нового поколения

1.4 Роль микроРНК в патогенезе заболеваний

1.4.1 Роль микроРНК в патогенезе наследственных заболеваний

1.4.2 Патогенез заболеваний, вызванных мутациями в генах микроРНК

1.5 Функциональность взаимодействий микроРНК с мРНК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Дизайн исследования

2.2 Обработка данных CLASH и CLEAR-CLIP и приведение к единому формату

2.3 Сбор дополнительных экспериментальных данных о микроРНК взаимодействиях (данные CLIP)

2.4 Определение достоверных регионов взаимодействия с микроРНК (exp-miBR)

2.5 Предсказание сайтов связывания микроРНК

2.6 Обработка экспрессионных данных мРНК и микроРНК

2.7 Разработка программы по определению нахождения варианта нуклеотидной последовательности в сайте связывания с микроРНК

2.8 Поиск функционально значимых вариантов нуклеотидной последовательности, нарушающих микроРНК-мРНК регуляцию

2.9 Экспериментальное изучение влияния мутаций в exp-miBR на регуляцию экспрессии гена-мишени

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Создание базы данных экспериментально установленных микроРНК-мРНК взаимодействий

3.1.1 Сравнение результатов высокопроизводительных методов определения микроРНК-мРНК взаимодействий

3.1.2 Выявление набора достоверных, экспериментально идентифицированных сайтов связывания микроРНК (exp-miBRs) с использованием данных CLIP экспериментов

3.1.3 Анализ характеристик выявленных exp-miBRs

3.2 Оценка эффективности программ по предсказанию микроРНК-мРНК взаимодействий

3.2.1 Предсказания микроРНК в регионах мРНК, идентифицированных методом CLASH

3.2.2 Анализ характеристик регионов взаимодействия мРНК

3.2.3 Расчёт основных предсказательных характеристик программ

3.3 Экспрессионный анализ микроРНК-мРНК интерактома

3.3.1 Анализ экспрессии мРНК

3.3.2 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК и их участия в мРНК-взаимодействиях

3.3.3 Сравнение характеристик микроРНК между типами клеточных линий

3.4 Создание программы для поиска вариантов нуклеотидной последовательности в сайтах связывания с микроРНК

3.4.1 Программа для анализа вариантов нуклеотидной последовательности ДНК (exp-miBR Annotator)

3.5 Поиск функционально значимых вариантов нуклеотидной последовательности, нарушающих микроРНК-мРНК взаимодействие

3.5.1 Роль микроРНК в патогенезе наследственных заболеваний

3.5.2 Анализ описанных патогенных вариантов способных нарушать микроРНК-мРНК взаимодействие

3.5.3 Экспериментальное изучение влияния патогенных вариантов в exp-miBR на регуляцию экспрессии гена-мишени

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

75

76

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная характеристика микроРНК-мРНК интерактома человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и степень ее разработанности

Изучение механизмов регуляции экспрессии генов является одним из ключевых вопросов в молекулярной биологии. Различие в экспрессии генов является одним из основных двигателей эволюции молекулярных процессов, а изменения в регуляции широко исследуются в патогенезе широкого ряда заболеваний. Одним из таких эффективных механизмов регуляции экспрессии генов является «РНК-интерференция», благодаря которой происходит специфичное подавление экспрессии генов с помощью малых некодирующих РНК. За объяснение данного механизма подавления экспрессии генов по средствам образования двуцепочечного дуплекса РНК в 2006 году Эндрю Фаер и Крэйг Мелло получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

микроРНК - класс малых некодирующих РНК, имеющих длину от 18 до 25нт и встречающихся в большинстве эукариотических организмов (Carthew R.W. 2009). Совместно с белком Ago2 микроРНК образует RISC комплекс, который связывается с мРНК и приводит либо к ингибированию трансляции, либо к деградации мРНК. Таким образом, микроРНК играет важную роль в регуляции экспрессии генов. Для человека в настоящий момент известно более 2'500 микроРНК [miRBase v.22, http://www.mirbase.orgl. Широко известно, что микроРНК являются мощными регуляторами, которые принимают активное участие во многих молекулярных и клеточных процессах, как в норме, так и при различных патологиях. При этом показано, что один ген может регулироваться несколькими микроРНК и одна микроРНК может регулировать несколько сотен мишеней (Selbach 2008). Однако до сих пор отсутствует полноценное понимание всех образующихся взаимодействий - микроРНК - мРНК интерактома человека.

Распространённым способом поиска микроРНК-мРНК взаимодействий является использование предсказательных программ. Их алгоритмы основаны на различных наборах параметров, характеризующих потенциальные взаимодействия, таких как: комплементарность, каноничность, свободная энергия взаимодействия, консервативность и другие (Witkos T.M. 2011). К сожалению, полученные с помощью этих программ результаты часто сильно разнятся (Li H. 2014). В связи с этим распространена практика использования одновременно нескольких алгоритмов и дальнейшее изучение только тех результатов, которые являлись общими для нескольких программ.

Для экспериментального подтверждения микроРНК-мРНК взаимодействий часто используется репортерная люциферазная система. Однако такой подход способен провести лишь

анализ единичных потенциальных взаимодействий (Baccarini A. 2010). Ряд экспериментальных методов (CLIP методы) основанных на иммунопреципитации белка Ago2 с последующим секвенированием всех регионов мРНК, входящих в комплекс RISC (Hafner M. 2010), позволяет определить лишь участки взаимодействия мРНК, но не конкретные микроРНК-мРНК взаимодействия. Недавно разработанный и апробированный на клеточной линии НЕК293 метод CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) (Helwak A. 2013) и аналогичный ему метод CLEAR-CLIP (covalent ligation of endogenous Argonaute-bound RNAs) (Moore M.J. 2015), проведенный на клеточной линии Huh7.5, позволяют определять микроРНК-мРНК взаимодействия. Оба метода имеют дополнительный этап, заключающийся в лигировании концов мРНК и микроРНК, которые находятся в комплексе RISC. На данный момент эти две работы являются единственными по получению экспериментальных высокопроизводительных данных о микроРНК-мРНК взаимодействиях на клеточных линиях человека.

В настоящей работе был впервые проведен всесторонний анализ микроРНК-мРНК интерактома человека на основе экспериментальных данных. Результаты анализа позволяют расширить имеющиеся фундаментальные представления о микроРНК-мРНК взаимодействиях человека. На основе полученных данных была разработана программа "exp-miBR Annotator", которая позволяет находить варианты нуклеотидной последовательности, способные нарушать связывание микроРНК с мРНК, что может приводить к нарушению регуляции экспрессии генов посредством микроРНК. С помощью разработанной программы "exp-miBR Annotator" были определены известные патогенные варианты нуклеотидной последовательности, находящиеся в сайтах связывания с микроРНК и проведена экспериментальная проверка in-vitro для нескольких найденных вариантов.

Цель и задачи настоящей работы

Целью данной работы является всесторонний анализ микроРНК-мРНК взаимодействий человека на основе экспериментальных данных. Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание базы данных экспериментально установленных микроРНК-мРНК взаимодействий человека.

2. Проведение оценки эффективности биоинформатических алгоритмов по предсказанию сайтов связывания микроРНК с мРНК.

3. Проведение сравнительного анализа уровня экспрессии и количества взаимодействий для мРНК и микроРНК.

4. Разработка программы, позволяющей проводить поиск вариантов нуклеотидной последовательности ДНК в регионах мРНК человека, достоверно взаимодействующих с микроРНК.

5. Поиск функционально значимых вариантов нуклеотидной последовательности, нарушающих микроРНК-мРНК регуляцию.

Положения Диссертации, выносимые на защиту:

1. Впервые создана база данных достоверных, экспериментально идентифицированных сайтов связывания микроРНК (exp-miBRs) человека. Собранная база данных exp-miBRs позволяет проводить исследования регуляции экспрессии генов человека с помощью микроРНК.

2. Для микроРНК let-7 и онкогена CDK6 из базы данных exp-miBRs было экспериментально подтверждено микроРНК-мРНК взаимодействие. Таким образом дополнительно была показана высокая достоверность собранных взаимодействий в базе данных exp-miBRs.

3. Показан низкий уровень эффективности программ, предсказывающих микроРНК-мРНК взаимодействия (TargetScan, PicTar, PITA, RNA22 и miRanda) в сравнении с экспериментальными данными. Таким образом, показана необходимость использования экспериментально выявленных микроРНК-мРНК взаимодействий для разработки программ нового поколения.

4. Сравнительный анализ микроРНК-мРНК интерактома и профилей экспрессий мРНК и микроРНК позволил полноценно охарактеризовать данные взаимодействия в клеточных линиях человека HEK293 и Huh7.5. Были выявлены ткане-специфичные мРНК, проявляющие эффект «губки микроРНК» и группы микроРНК, имеющие разные свойства по уровню экспрессии и количеству взаимодействий.

5. Используя базу данных exp-miBRs, была разработана веб-программа "exp-miBR Annotator", которая позволяет выявлять варианты нуклеотидной последовательности человека в регионах связывания с микроРНК (exp-miBRs). Таким образом, программа "exp-miBR Annotator" помогает находить новые механизмы патогенеза наследственных заболеваний, вызванных нарушением регуляции экспрессии генов посредством микроРНК. На примере генов TF и SNORD118 были найдены патогенные варианты, для которых было экспериментально подтверждено их влияние на микроРНК-мРНК взаимодействие.

Научная новизна

В настоящей работе был впервые проведен всесторонний анализ микроРНК-мРНК интерактома человека с использованием экспериментальных данных, полученных на клеточных линиях человека НЕК293 и Huh7.5. По результатам была создана база данных достоверных, экспериментально идентифицированных сайтов связывания микроРНК человека. В неё вошли 46 тысяч регионов мРНК (exp-miBR). На основе базы данных exp-miBRs была впервые разработана программа "exp-miBR Annotator", позволяющая определять варианты нуклеотидной последовательности генома человека в сайтах связывания микроРНК. С помощью разработанной программы "exp-miBR Annotator" были определены известные патогенные варианты нуклеотидной последовательности, находящиеся в сайтах связывания с микроРНК и проведена экспериментальная проверка in-vitro для нескольких найденных вариантов.

Теоретическое и практическое значение исследования

Научная и практическая значимость работы определяется поставленной фундаментальной научной задачей - исследование микроРНК-мРНК интерактома человека. микроРНК являются эффективными регуляторами экспрессии генов. Понимание природы мРНК-микроРНК взаимодействия позволяет не только определить фундаментальную роль в молекулярных процессах, но и определять механизмы патогенеза наследственных заболеваний, вызванных нарушением регуляции экспрессии генов по средствам микроРНК. Результаты работы были номинированы на 50-ой юбилейной конференции ESHG'2017 в Дании, организованной Европейской ассоциацией генетики человека (The European Society of Human Genetics - ESHG), став единственной номинированной работой за выдающиеся результаты молодых учёных Young Investigator Awards из России (https://2017.eshg.org/index.php/abstracts-2/speaker/).

По итогам работы была собрана база данных экспериментально установленных высокодостоверных микроРНК-мРНК взаимодействий (exp-miBRs), на основе которой разработана программа для анализа вариантов нуклеотидной последовательности. Как было показано, данный инструмент может играть важную роль при поиске новых механизмов и анализе вариантов у больных наследственными заболеваниями с неизвестным на данный момент механизмом патогенеза. База данных exp-miBRs была использована компанией geneXplain (http://genexplain.com) в коммерческом продукте TRANSFAC® 2020.1 - добавлено в релизе января 2020 года - http://genexplain.com/wp-content/uploads/2020/01/TRANSFAC release.pdf

Работы, опубликованные по результатам данной диссертации в международных журналах активно цитируются, несмотря на то что были опубликованы совсем недавно. Так, например, публикация (Plotnikova 2019) была процитирована 11 раз за год: девять раз в международных

журналах: (Telford 2021), (Rohani 2021), (Vannan 2021), (Hussen 2021), (Gao 2021), (Fitriawan 2020), (Ueno 2020), (Najafipour 2021), (Annese 2020), в книжном издании (Schober 2020) и в диссертационной работе (Frazier 2021).

Степень достоверности и апробация диссертационной работы

Степень достоверности результатов данной работы подтверждается согласованностью результатов с опубликованными ведущими отечественными и зарубежными работами в области исследования микроРНК регуляции и роли микроРНК в патогенезе наследственных заболеваний. Основные результаты получены с использованием современных методов биоинформатического анализа и статистических методов.

По материалам диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых научных журналах: две из них входят в основные библиометрические базы данных (РИНЦ, PubMed, WoS и Scopus) и одна индексируется базой данной РИНЦ:

1. Plotnikova O., Baranova A., and Skoblov M. "Comprehensive analysis of human microRNA-mRNA interactome." Frontiers in Genetics, 2019, (10):933, doi.org/10.3389/fgene.2019.00933

2. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. «Эффективность программ, предсказывающих микроРНКк- мРНК взаимодеиствия» («efficiency of the miRNA- mRNA interaction prediction programs») МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2018, 52(3): 1-12

3. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю «Роль микроРНК в патогенезе наследственных заболеваний» Медицинская генетика 2020, 19(9):5-17

Положения и выводы данной работы были апробированы на международных конференциях, как в рамках представления полученных результатов в виде устного доклада, так и в рамках доклада на постерных сессиях. Основные результаты настоящей диссертации были представлены на 11 конференциях: Устный доклад:

1. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. «Анализ характеристик микроРНК-мРНК интерактома человека и оценка алгоритмов предсказания», 59 научная конференция МФТИ, г. Долгопрудный МФТИ, 21-26 ноября 2016г.

2. Plotnikova O.M., Skoblov M.Y., "Expression insights into the human miRNA-mRNA interactome", C22.2, European Human Genetic Conference 2017, Denmark, Copenhagen, 24-31 May 2017.

3. Plotnikova O.M., Skoblov M.Y., «Expression analysis of human miRNA - mRNA interactome», MCCMB 2017, Moscow, MSU 27-30.07.2017

4. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. «Проблемы анализа микроРНК-мРНК интерактома человека», 60 научная конференция МФТИ, г. Долгопрудный МФТИ, 24 ноября 2017г.

5. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. "Идентификация качественного микроРНК-мРНК интерактома человека для анализа вариантов нуклеотидной последовательности полученных с помощью NGS", международная конференция Ломоносов 2018, МГУ, Москва, 11 апреля 2018г.

6. Plotnikova O., Skoblov M., "Arranging The High-Confidence MicroRNA Binding Regions Into Web Tool For Analyzing Variants In Diagnostic Next Generation Sequencing" BIOINFORMATICS OF GENOME REGULATION AND STRUCTURE\SYSTEMS BIOLOGY (BGRS\SB-2018); Symposium COGNITIVE SCIENCES, GENOMICS AND BIOINFORMATICS (CSGB-2018), Россия, Новосибирск, 24 августа 2018.

7. Plotnikova O.M., Skoblov M.Y., "Analysis of experimentally derived landscape of microRNA-mRNA human interactome", MCCMB 2019, Moscow, MSU 27-30.07.2019

Постерный доклад:

1. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. «миРНК-мРНК ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ - АНАЛИЗ ОСНОВНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК И ПРЕДСКАЗАТЕЛЬНЫХ АЛГОРИТМОВ», Всероссийская конференция 50 лет ВОГиС: успехи и перспективы, Москва, 8-10 ноября 2016г.

2. Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. «Анализ экспрессии и потенциала взаимодействия микроРНК-мРНК интерактома человека», Ломоносов 2017, Россия, Москва, 10-14 апреля 2017г.

3. Plotnikova O., Skoblov M., "Tool for pathogenesis analysis of nucleotide variants based on high-confidence human microRNA-mRNA interactions", Bertinoro, Italy, 3-4 May, 2018

4. Plotnikova O.M., Skoblov M.Y., «Tool for pathogenesis analysis of nucleotide variants based on high-confidence human miRNA-mRNA interactions», European Human Genetic Conference 2018 (ESHG 2018), Италия, Милан, 16-19 июня, 2018

Работы вышли до смены фамилии (до августа 2020 - Плотникова О. М., после - Кудряшова О. М.).

Методология и методы исследования

Анализ, проведенный в рамках данной диссертационной работы, основывается на результатах двух единственных работ, опубликованных на данный момент и использующих высокопроизводительные методы для экспериментального определения микроРНК-мРНК взаимодействий (химерных прочтений) на клеточных линиях человека: метод CLASH (Helwak A. 2013) выполнен на клеточной линии НЕК293 и метод CLEAR-CLIP (Moore M.J. 2015) - на клеточной линии Huh7.5. Также в анализе используются публичные экспериментальные данные о регионах взаимодействий микроРНК (CLIP-технологии) и об экспрессии микроРНК и мРНК в клеточных линиях НЕК293 и Huh7.5. Основные результаты получены с использованием современных методов биоинформатического анализа, подробно описанные в главе 2 «Материалы и методы». Экспериментальная проверка, выявленных в данной работе микроРНК-мРНК взаимодействий, была проведена в лаборатории функциональной геномики в Медико-генетическом научном центре имени академика Н.П. Бочкова.

Личный вклад автора

Автор принимал участие в планировании работы, сборе, изучении и обработке публичных экспериментальных данных, проведении анализа данных, а также в написании и подготовке публикаций. Основные результаты диссертационной работы получены лично автором. Веб интерфейс разработанной автором программы «Бхрш1БК Аппо1а1»г» был реализован совместно с Корвиго Ильей. Экспериментальная проверка выявленных автором микроРНК-мРНК взаимодействий проводилась в лаборатории функциональной геномики в Медико-генетическом научном центре имени академика Н.П. Бочкова Филатовой Александрой.

Объем и структура диссертации.

Данная диссертационная работа содержит следующие разделы: обзор литературы (Глава 1), материалы и методы (Глава 2), результаты (Глава 3), заключение, список сокращений и список цитируемой литературы. Объем диссертации 84 страницы, включая 20 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 127 источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 микроРНК

1.1.1 Открытие микроРНК регуляции

В 1993 году была открыта первая микроРНК lin-4 (Lee R.C. 1993), спустя 7 лет была открыта и изучена вторая микроРНК let-7 (Reinhart 2000) на том же модельном организме C. elegans. Было показано, что черви, имеющие мутации в микроРНК let-7 и в гене lin-4 неспособны к нормальному развитию, а именно - теряют нормальное для развития переключение между личиночными стадиями. Было также показано, что микроРНК let-7 содержит последовательность, комплементарную 3' некодирующей области генов lin-14, lin-28, lin-41, lin-42 и daf-12, а также let-7 влияет на уровень экспрессии данных генов. Малая некодирующая РНК lin-4 по праву считается первой открытой микроРНК, хотя термин "микроРНК" (или «миРНК») появился только через несколько лет.

В 1998 году, Фаер и коллеги опубликовали статью в Nature, описывающую введение двухцепочечной некодирующей РНК в гонады С. Elegans, приводившие к сильному подавлению уровня экспрессии определенного набора генов (Fire 1998). Последующие эксперименты показали, что введение различных двухцепочечных РНК приводят к ген-специфическому снижению уровня экспрессии. Наблюдаемое явление замалчивание гена в последствии было названо РНК-интерференцией, по аналогии с физическим явлением «интерференции света», но при этом, естественно, имеющим совершенно другую природу. РНК-интерференция - это механизм регуляции экспрессии генов, благодаря которому происходит специфичное замалчивание («нокдаун») генов с помощью малых некодирующих РНК (Рисунок 1).

Нормальная регуляция

Белок

РНК-интерференция

Супрессия или деградация мРНК

Рисунок 1. Схематическое представление механизма РНК интерференции.

Через год эта же лаборатория в коллаборации с другой лабораторией выпустила статью в журнале Nature, где они показали наличие микроРНК let-7 длиной в 21 нт у большого количества животных, включая позвоночных (Pasquinelli 2000). А в конце 2001 года, одновременно три исследовательские группы независимо ввели термин микроРНК (miRNA) для обозначения малых эндогенных некодирующих РНК (Lee 2001), (Lagos-Quintana 2001), (Lau 2001). Важно подчеркнуть, что микроРНК являются именно эндогенными, при этом среди интерфериющих РНК бывают и экзогенные.

По результатам статьи стало понятно, что РНК и ее «анти-РНК» нейтрализуют друг друга, через образование двухцепочечной молекулы. Получалось, что из-за образования такого дуплекса с кодирующей РНК не мог транслироваться белок. При этом механизм образования был объяснен позже, и именно за это объяснение в 2006 году Эндрю Фаер и Крэйг Мелло получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

РНК-интерференция позволяет организму защищаться от вирусов, геномы которых состоят из двухцепочечных молекул РНК. Также он позволяет контролировать внутреннюю активность мобильных элементов - ретротранспозонов. Понимание того, какие микроРНК с какими мРНК взаимодействуют, позволяет не только понять процессы в клетках, но и посмотреть на уровень глубже: на причины возникновения ряда болезней, вызванные нарушением экспрессии генов.

1.1.2 Биогенез микроРНК

микроРНК - это семейство небольших некодирующих РНК, имеющих длину от 18 до 25нт (в среднем 22нт), встречающихся в большинстве эукариотических организмов (Bino John 2004) (Carthew R. W. 2009). Канонический путь образования микроРНК (Рисунок 2) включает в себя два основных этапа: процессинг в ядре клетке и последующие преобразования в цитоплазме. Транскрипция участков, содержащих микроРНК, может происходить как с участков ДНК, принадлежащих белок-некодирующим генам, так и с участков, являющихся интронами мРНК. Как правило транскрибируются эти участки при помощи полимеразы-II, реже с участием полимеразы-III. В результате, в ядре клетки образуется при-микроРНК (pri-miRNA, primary-miRNA), длина которой около 70-ти нуклеотидов. При-микроРНК имеет форму шпильки, которая распознаётся большим белковым комплексом (microprocessor complex), главными компонентами которого являются РНКаза III Drosha и белок DGCR8. Данный комплекс делает разрез на расстоянии примерно 11 нт от основания («свободного конца») шпильки при-микроРНК и, тем самым, образует пре-микроРНК (Stroynowska-Czerwinska A. 2014).

Ядро

Цитоплазма

^ Транскрипция

\ЛЛ

Предшественик при-микроРНК

микроРНК дуплекс

/

TRBP

m

AGO ÏÏTÏÏTTT

DICER 1 мРНК

RISC

/

Пассажирская цепь

AGO

\

Деградация пассажирской цепи микроРНК

Деградация или ингибирование трансляции мРНК

Рисунок 2. Схема канонического пути образования микроРНК у человека

Белок Exportin-5 (XPO5) распознает пре-микроРНК по двум выступающим нуклеотидам на З'-конце пре-микроРНК и транспортирует пре-микроРНК из ядра в цитоплазму. В цитоплазме, на втором этапе созревания, РНКаза III и белок Dicer в комплексе с белками AGO1, TRBP и (или) PACT узнают пре-микроРНК и разрезают её так, что образуется двуцепочечная микроРНК длиной около 22нт. Полученная микроРНК загружается в комплекс RISC (Stroynowska-Czerwinska A. 2014), (D. P. Bartel 2004). Другая цепь микроРНК, называемая «пассажирской» подвергается деградации.

Главной компонентой комплекса RISC является белок AGO из семейства аргонавтов, в котором у человека описано четыре белка AGO. Белок аргонавт состоит из четырёх доменов: PAZ (взаимодействует с З'-концом микроРНК), Mid (взаимодействует с фосфатной группой на 5'-конце микроРНК), C-terminal PIWI (может проявлять эндонуклеотическую активность) и N-terminal (вклинивается между цепями микроРНК) (Stroynowska-Czerwinska A. 2014), (D. P. Bartel 2004).

Первым шагом образования комплекса RISC является транспортировка микроРНК к белку AGO в комплекс RISC-LC (RISC loading complex). Во втором шаге участвует N-домен белка-аргонавта - он «вклинивается» между цепями двойной спирали микроРНК и проявляет эндонуклеазную активность, раскручивая двойную спираль микроРНК. «Пассажирская» цепь микроРНК удаляется из комплекса и деградирует в цитоплазме. Оставшаяся цепь микроРНК и белок-аргонавт формируют комплекс RISC, готовый связываться с участком на мРНК (Stroynowska-Czerwinska A. 2014). Эндонуклеазная активность внутри комплекса RISC обеспечивается доменом PIWI, находящимся в белке-аргонавте.

Механизм РНК-интерференции могут запускать, как микроРНК так и короткие интерферирующие РНК - siRNA. В отличие от микроРНК, короткие интерферирующие РНК продуцируются из длинных двуцепочечных РНК. Они образуются при помощи фермента DICER, путем разрезания данным ферментом длинной РНК на короткие двухцепочечные РНК, длиной около 21 нт и имеющих по выступающему нуклеотиду на 3' концах. После этого, полученная siRNA взаимодействует с комплексом белков, образуя комплекс RISC, в состав которого входит только одна цепь от данной РНК, вторая цепь деградирует в цитоплазме. Получившийся комплекс может связываться с участком мРНК, образуя частично или полностью комплементарный РНК-дуплекс (Ma Y. 2007), (Stroynowska-Czerwinska A. 2014), (D. P. Bartel 2009).

1.2 Экспериментальные методы определения микроРНК-мРНК взаимодействий

Для человека сейчас известно около 20 тысяч белок кодирующих мРНК и 2,5 тысячи микроРНК. При этому в разных клетках организма происходит экспрессия различных наборов мРНК и микроРНК, которые могут образовывать друг с другом разные взаимодействия. При этом экспериментальных данных о взаимодействующих микроРНК и мРНК мало. Ниже описаны существующие экспериментальные подходы для определения микроРНК- мРНК взаимодействий.

1.2.1 Конструкции с репортерным белком

Метод создания репортерных конструкций активно используется при проверки взаимодействия микроРНК и мРНК. Существенным ограничением данного метода является возможность проверять в одном эксперименте только одно взаимодействие. Метод заключается в создании генно-инженерной конструкции, которая содержит:

• небольшой регион нуклеотидной последовательности потенциальной мишени (например, З'-нетранслируемая область мРНК);

• Репортерный ген, по изменению уровня экспрессии которого можно определить есть ли взаимодействие с исследуемым регионом или нет.

В качестве репортерного гена часто используют ген люцифиразы (Luc) или ген кодирующий зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein - GFP). Для определения взаимодействия проводится совместная трансфекция генно-инженерной конструкции и изучаемой микроРНК в эукариотические клетки. Последующий анализ активности репорторного белка в клетке позволяет определить, есть ли взаимодействие между микроРНК и исследуемой" РНК: при наличии взаимодействия микроРНК блокирует образование химерной конструкции с репортерным геном и уровень экспрессии люциферазы снижается (Рисунок ЗА). При отсутствии взаимодействия репортерный ген беспрепятственно транслируется (Рисунок ЗБ).

Рисунок 3. Схема проведения эксперимента с использованием репортерной конструкции для изучения наличия взаимодействия микроРНК с изучаемой последовательностью-мишенью

(показана рыжим). Активность продукта репортерного гена (обозначен фиолетовым) снижается при взаимодействии (А) и остается высокой при отсутствии взаимодействия (Б).

Таким образом данный метод является одним из основных методов для проверки единичных гипотез о взаимодействии интересующей микроРНК с мРНК. Также, данный метод позволяет определять влияние мутации в регионах мРНК на взаимодействия с микроРНК. Для таких исследований также используют плазмидные конструкции с двумя репортерными генами: уровень активности первого репортерного гена говорит об уровне эффективности трансфекции, а второй репортерный ген - об активности изучаемого региона. Полученный уровень экспрессии второго репортерного гена нормируется на уровень экспрессии первого репортерного гена, таким образом учитывается эффективность трансфекции в разных экспериментах.

1.2.2 Косвенное определение микроРНК взаимодействий по изменению уровня

экспрессии генов

Данная группа методов не позволяет точно установить - взаимодействует ли микроРНК с мишенью или нет, поэтому их называют «косвенными». Однако, они позволяют находить потенциальные взаимодействия при анализе уровня экспрессии большого количества микроРНК и их мишеней, например, для дальнейшей проверки с помощью репортерных конструкций, или для биоинформатического анализа природы изменяющихся процессов. В основе данного подхода лежит сравнение уровней экспрессии двух групп образцов, например: в клетках разных тканей, разных состояниях (клетки здоровых и больных доноров), до/после воздействия и др. Например, проводя дифференциальный анализ экспрессии микроРНК в мышечной ткани между группой больных миодистрофией Дюшена и контрольной группой здоровых людей была выявлена микроРНК miR-21 как активно экспрессирующаяся у больных и микроРНК miR-29 с пониженным уровнем экспрессии (Zanotti S. 2015). Далее авторы более детально изучали функциональную роль данных микроРНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кудряшова Ольга Михайловна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

0rom, Ulf Andersson, Finn Cilius Nielsen, and Anders H. Lund. «MicroRNA-10a binds the 5' UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation.» Molecular cell 30.4 (2008): 460-471.

Abelson JF, Kwan KY, O'Roak BJ, Baek DY, Stillman AA, Morgan TM, Mathews CA, Pauls DL, Rasin MR, Gunel M, Davis NR, Ercan-Sencicek AG, Guez DH, Spertus JA, Leckman JF, Dure LS 4th, Kurlan R, Singer HS, Gilbert DL, Farhi A, Louvi A, Lifton RP, Sestan N, State MW. «Sequence variants in SLITRK1 are associated with Tourette's syndrome.» Science 310(5746) (2005): 317-320.

Agarwal V., Bell G.W., Nam J.W., Bartel D.P. «Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.» eLife 4 (2015): e05005.

Annese, T., Tamma, R., De Giorgis, M., Ribatti, D. «microRNAs Biogenesis, Functions and Role in Tumor Angiogenesis.» Frontiers in Oncology 10 (2020).

Asada-Senju M., Maeda T., Sakata T., et. al. «Molecular analysis of the transferrin gene in a patient with hereditary hypotransferrinemia.» Journal of human genetics 47(7) (2002): 355-9.

Axtell, M.J., Westholm, J.O., Lai, E.C. «Vive la différence: biogenesis and evolution of microRNAs in plants and animals.» Genome Biology 12(4) (2011): 221.

Azzouzi I, Moest H, Winkler J, Fauchere JC, Gerber AP, Wollsc- heid B, Sto el M, Schmugge M, Speer O. «MicroRNA-96 directly inhibits y-globin expression in human erythropoiesis.» PLoS One. 6(7) (2011): e22838.

Baccarini A., Brown B.D. «Monitoring microRNA activity and validating microRNA targets by reporter-based approaches.» Methods Mol. Biol. 667 (2010): 215-233.

Ballarino, M, Cazzella, V, D'Andrea, D, Grassi, L, Bisceglie, L, Cipriano, A, Santini, T, Pinnaro, C, Morlando, M, Tramontano, A, Bozzoni, I. «Novel long noncoding RNAs (lncRNAs) in myogenesis: a miR-31 overlapping lncRNA transcript controls myoblast differentiation.» Mol Cell Biol. 35(4) (2015): 728-736.

Bandiera, S., Pernot, S., El Saghire, H., Durand, S. C., umann, C., Crouchet, E., et al. «Hepatitis C virus-induced upregulation of microRNA miR- 146a-5p in hepatocytes promotes viral infection and deregulates metabolic pathways associated with liver disease pathogenesis.» J. Virol. 90(14) (2016): 6387- 6400.

Bartel, David P. «MiRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.» Cell 116.2 (2004): 281-297.

Bartel, David P. «MiRNAs: target recognition and regulatory functions.» Cell 136 №2 (2009): 215233.

Basu, U., Lozynska, O., Moorwood, C., Patel, G., Wilton, S. D., Khurana, T. S. «Translational regulation of utrophin by miRNAs.» PloS one 6(12) (2011): e29376.

Bi Y., He Y., Huang J., et al. «Functional characteristics of reversibly immortalized hepatic progenitor cells derived from mouse embryonic liver.» Cell. Physiol. Biochem. 34(4) (2014): 1318-1338.

Bino John, Anton J Enright, Alexei Aravin, Thomas Tuschl, Chris Sander, Debora S Marks. «Human MicroRNA Targets.» PLoS Biol 2(11) (2004): e363.

Biso De Carvalho J, Loss de Morais G, dos Santos Vieira TC, Chaves Rabelo N, Llerena JrC, de Carvalho Gonzalez SM, Ribeiro de Vasconcelos AT. «miRNA genetic variants alters their secondary structure and expression in patients with RASopathies syndromes.» Frontiers in Genetics 10 (2019): 1144.

Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., and Pachter, L. «Near-optimal probabilistic RNA-seq quanti cation.» Nat. Biotechnol. 34(5) (2016): 525-527.

Cacchiarelli, D, Incitti, T, Martone, J, Cesana, M, Cazzella, V, Santini, T, Sthandier, O, Bozzoni, I. «miR-31 modulates dystrophin expression: new implications for Duchenne muscular dystrophy therapy.» EMBO Rep. 12(2) (2011): 136-141.

Cacchiarelli, D, Martone, J, Girardi, E, Cesana, M, Incitti, T, Morlando, M, Nicoletti, C, Santini, T, Sthandier, O, Barberi, L, Auricchio, A, Musaro, A, Bozzoni, I. «MicroRNAs involved in molecular circuitries relevant for the Duchenne muscular dystrophy pathogenesis are controlled by the dystrophin/nNOS pathway.» Cell Metab 12(4) (2010): 341-351.

Carthew R. W., Sontheimer E. J. «Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs.» Cell 136(4) (2009): 642-655.

Chancellor, DR, Davies, KE, De Moor, O, Dorgan, CR, Johnson, PD, Lambert, AG, Lawrence, D, Lecci, C, Maillol, C, Middleton, PJ, Nugent, G, Poignant, SD, Potter, AC, Price, PD, Pye, RJ, Storer, R, Tinsley, JM, van Well, R, Vickers, R, Vile, J, Wilkes, FJ, Wilson, FX, Wren, SP, Wynne, GM. «Discovery of 2-arylbenzoxazoles as upregulators of utrophin production for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.» J Med Chem. 54(9) (2011): 3241-3250.

Chi S. W., Zang J. B., Mele A., Darnell R. B. «Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.» Nature 460.7254 (2009): 479-486.

Chu, Y. W., Chang, K. P., Chen, C. W., Liang, Y. T., Soh, Z. T., Hsieh, L. C. «miRgo: integrating various off-the-shelf tools for identification of microRNA-target interactions by heterogeneous features and a novel evaluation indicator.» Scientific reports 10(1) (2020): 1-11.

Consortium, GTEx. «The Genotype-Tissue Expression (GTEx) pilot analysis: Multitissue gene regulation in humans.» Science 348(6235) (2015): 648-660.

Corcoran, D. L., Georgiev, S., Mukherjee, N., Gottwein, E., Skalsky, R. L., Keene, J. D., et al. «PARalyzer: de nition of RNA binding sites from PAR-CLIP short-read sequence data.» Genome Biol. 12(8) (2011): R79.

de Almeida, R. C., Chagas, V. S., Castro, M. A., Petzl-Erler, M. L. «Integrative analysis identifies genetic variants associated with autoimmune diseases affecting putative microRNA binding sites.» Frontiers in Genetics 9 (2018): 139.

Ding, J., Li, X., Hu, H. «TarPmiR: a new approach for microRNA target site prediction.» Bioinformatics 32(18) (2016): 2768-2775.

Doench J. G., Sharp P. A. «Specificity of microRNA target selection in translational repression.» Genes & development 18.5 (2004): 504-511.

Fabbri, E, Borgatti, M, Montagner, G, Bianchi, N, Finotti, A, Lampronti, I, Bezzerri, V, Dechecchi, MC, Cabrini, G, Gambari, R. «Expression of microRNA-93 and Interleukin-8 during Pseudomonas

aeruginosa-mediated induction of Proinflammatory responses.» American journal of respiratory cell and molecular biology 50(6) (2014): 1144-1155.

Ferrante M., Conti G. O. «Environment and neurodegenerative diseases: an update on miRNA role.» Microrna 6(3) (2017): 157-165.

Finn Grey, Rebecca Tirabassi , Heather Meyers , Guanming Wu, Shannon McWeeney, Lauren Hook, Jay A. Nelson. «A viral microRNA down-regulates multiple cell cycle genes through mRNA 5' UTRs.» PLoS Pathog 6.6 (2010): e1000967.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., & Mello, C. C. « Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.» nature 391(6669) (1998): 806-811.

Fitriawan, A. S., Kartika, A. I., Chasanah, S. N., Aryandono, T., Haryana, S. M. «Expression of Circulating MicroRNA-141 in Epithelial Ovarian Cancer.» The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS 27(6) (2020): 27.

Frankish, A., Diekhans, M., Ferreira, A. M., Johnson, R., Jungreis, I., Loveland, J., et al. «GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes.» Nucleic Acids Res 47(D1) (2018): D766-D773.

Frazier, S. E. «Investigating placental microRNAs in preeclampsia and optimising a gene therapy strategy for targeting the placenta.» University of Glasgow, 2021: Diss.

Gao, L., Zhao, Y., Ma, X., Zhang, L. «Integrated analysis of lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA network and the potential prognosis indicators in sarcomas.» BMC Medical Genomics 14(1) (2021): 111.

Gasparello J, Fabbri E, Bianchi N, Breveglieri G, Zuccato C, Borgatti M, Gambari R, Finotti A. «BCL11A mRNA targeting by miR-210: a possible network regulating y-globin gene expression.» Int J Mol Sci. 18 (2017): E2530.

Gillen, A. E., Gosalia, N., Leir, S. H., Harris, A. «MicroRNA regulation of expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene.» Biochemical Journal 438(1) (2011): 25-32.

Greco, S, De Simone, M, Colussi, C, Zaccagnini, G, Fasanaro, P, Pescatori, M, Cardani, R, Perbellini, R, Isaia, E, Sale, P, Meola, G, Capogrossi, MC, Gaetano, C, Martelli, F. «Common micro-RNA signature in skeletal muscle damage and regeneration induced by Duchenne muscular dystrophy and acute ischemia.» FASEB J. 23(10) (2009): 3335-3346.

Grigelioniene G, Suzuki HI, Taylan F, Mirzamohammadi F, Borochowitz ZU, Ayturk UM, Tzur S, Horemuzova E, Lindstrand A, Weis MA, Grigelionis G, Hammarsjö A, Marsk E, Nordgren A, Nordenskjöld M, Eyre DR, Warman ML, Nishimura G, Sharp PA, Kobayashi T. «Gain-of-function mutation of microRNA-140 in human skeletal dysplasia.» Nature medicine 25(4) (2019): 583-590.

Hafner M., Landthaler M., Burger L., et al. «PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins.» Journal of Visualized Experiments 41 (2010): e2034.

Hansen T.B., Jensen T.I., Clausen B.H., et al. «Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.» Nature 495(7441) (2013): 384-388.

Harafuji N, Schneiderat P, Walter MC, Chen YW. «miR-411 is up-regulated in FSHD myoblasts and suppresses myogenic factors.» Orphanet J Rare Dis. 8(1) (2013): 55.

Hassan, F., Nuovo, G. J., Crawford, M., Boyaka, P. N., Kirkby, S., Nana-Sinkam, S. P., Cormet-Boyaka, E. «MiR-101 and miR-144 regulate the expression of the CFTR chloride channel in the lung .» PloS one 7(11) (2012).

Heberle, H., Meirelles, G. V., da Silva, F. R., Telles, G. P., and Minghim, R. «InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams.» BMC Bioinformatics 16 (2015): 169.

Helwak A., Kudla G., Dudnakova T., Tollervey D. «Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding .» Cell 153(3) (2013): 654-665.

Hildyard, J. C., Wells, D. J. «Investigating synthetic oligonucleotide targeting of Mir31 in Duchenne muscular dystrophy.» PLoS currents 8 (2016).

Hrach H. C., Mangone M. «miRNA Profiling for Early Detection and Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy.» International journal of molecular sciences 20(18) (2019): 4638.

Hu, B., Yang, Y. C. T., Huang, Y., Zhu, Y., and Lu, Z. J. «POSTAR: a platform for exploring post-transcriptional regulation coordinated by RNA-binding proteins.» Nucleic Acids Res. 45(D1) (2016): D104-D114.

Hussen, B.M., Hidayat, H.J., Salihi, A., Sabir, D.K., Taheri, M., Ghafouri-Fard, S. «MicroRNA: A signature for cancer progression.» Biomedicine & Pharmacotherapy 138 (2021): 111528.

Jenkinson, E. M., Rodero, M. P., Kasher, P. R., et. al. «Mutations in SNORD118 cause the cerebral microangiopathy leukoencephalopathy with calcifications and cysts.» Nature genetics 48(10) (2016): 1185-1192

Jin Jung, Hwa, h Yousin Suh. «MicroRNA in aging: from discovery to biology.» Current genomics 13.7 (2012): 548-557.

John B., Enright A.J., Aravin A., et al. «Human microRNA targets .» PLoS Biol. 2 (2004): e363.

König J., Zarnack K., Rot G., Curk T., Kayikci M., Zupan B., Turner D.J., Luscombe N.M., Ule J. «iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.» Nat Struct Mol Biol 17 (2010): 909-915.

Karolchik, D., Hinrichs, A. S., Furey, T. S., Roskin, K. M., Sugnet, C. W., Haussler, D., et al. «UCSC Table Browser data retrieval tool.» Nucleic Acids Res 32 (Database issue) (2004): D493-D496.

Kertesz M., Iovino N., Unnerstall U., et al. «The role of site accessibility in microRNA target recognition .» Nat. Genet. 39 (2007): 1278-1284.

Kim J.E., Hong J.W., Lee H.S., et al. «Hsa-miR-10a-5p downregulation in mutant UQCRB-expressing cells promotes the cholesterol biosynthesis pathway.» Sci. Rep. 8 (1) (2018): 12407.

Kong Q., Zhang S., Liang C., et al. «LncRNA XIST functions as a molecular sponge of miR-194-5p to regulate MAPK1 expression in hepatocellular carcinoma cell.» J. Cell. Biochem 119(6) (2018): 44584468.

Kozomara, A., and Gri ths-Jones, S. «miRBase: annotating high con dence microRNAs using deep sequencing data.» Nucleic Acids Res 42 (Database issue) (2014): D68-D73.

Krüger, J., Rehmsmeier, M. «RNAhybrid: microRNA target prediction easy, fast and flexible.» Nucleic acids research 32(2) (2006): W451-W454.

Krek A., Grün D., Poy M.N., et al. «Combinatorial microRNA target predictions.» Nat. Genet. 37 (2005): 495-500.

Kuhn, R. M., Haussler, D., and Kent, W. J. «UCSC genome browser and associated tools.» Brief. Bioinformatics 14(2) (2012): 144-161.

Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. «Identification of novel genes coding for small expressed RNAs.» Science 294(5543) (2001): 853-858. .

Lall S., Grün D., Krek A., et al. «A genome-wide map of conserved microRNA targets in C. elegans.» Curr. Biol. 16 (2006): 460-471.

Lau, N.C., Lim, L.P.,Weinstein, E.G., Bartel, D.P. «An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.» Science 294(5543) (2001): 858-862.

Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. «The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.» Cell 75(5) (1993): 843-854.

Lee, R.C., Ambros, V. «An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans.» Science 294(5543) (2001): 862-864.

Li H., Xie S., Liu X., et al. «Matrine alters microRNA expression profiles in SGC-7901 human gastric cancer cells.» Oncol. Rep. 32 (2014): 2118-2126.

Li J., Liu S., Zhou H., Qu L., Yang J. «starBase v2.0: decoding miRNA-ceRNA, miRNA-ncRNA and protein-RNA interaction networks from large-scale CLIP-seq data.» Nucl. Acids Res. 42 (2014): D92-D97.

Li Y, Liu D, Zhang X, Li Z, Ye Y, Liu Q, Shen J, Chen Z, Huang H, Liang Y, Han X, Liu J, An X, Mohandas N, Xu X. «miR-326 regulates HbF synthesis by targeting EKLF in human erythroid cells.» Experimental Hematology 63 (2018): 33-40.

Lin S., Gregory R.I. «MicroRNA biogenesis pathways in cancer.» Nature reviews cancer 15(6) (2015): 321-333.

Love, M. I., Huber, W., and Anders, S. «Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.» Genome Biol. 15(12) (2014): 550.

Lu, Y., Leslie, C.S. «Learning to predict miRNA-mRNA interactions from AGO CLIP sequencing and CLASH data.» PLoS computational biology 12(7) (2016): e1005026.

Ludwig, N., Leidinger, P., Becker, K., Backes, C., Fehlmann, T., Pallasch, C., et. al. «Distribution of miRNA expression across human tissues.» Nucleic acids research 44(8) (2016): 3865-3877.

Lulli V, Romania P, Morsilli O, Cianciulli P, Gabbianelli M, Testa U, Giuliani A, Marziali G. «MicroRNA-486-3p regulates y-globin expres- sion in human erythroid cells by directly modulating BCL11A.» PLoS One. 8 (2013): e60436.

Luna, J. M., Scheel, T. K., Danino, T., Shaw, K. S., Mele, A., Fak, J. J., et al. «Hepatitis C virus RNA functionally sequesters miR-122.» Cell 160(6) (2015): 1099-1110.

Ma Y., Chan C. Y., He M. L. «RNA interference and antiviral therapy.» World journal of gastroenterology 13 №39 (2007): 5169.

Manca S, Magrelli A, Cialfi S, Lefort K, Ambra R, Alimandi M, Biolcati G, Uccelletti D, Palleschi C, Screpanti I, Candi E, Melino G, Salvatore M, Taruscio D, Talora C. «Oxidative stress activation of

miR-125b is part of the molecular switch for Hailey-Hailey disease manifestation.» Exp Dermatol. 20(11) (2011): 932-937.

Medina-Trillo C., Aroca-Aguilar J.D., Ferre-Fernandez J.J., et al. «The Role of hsa-miR-548l Dysregulation as a Putative Modifier Factor for Glaucoma-Associated FOXC1 Mutations.» Microrna 4(1) (2015): 50-56.

Megiorni, F., Cialfi, S., Dominici, C., Quattrucci, S., Pizzuti, A. «Synergistic post-transcriptional regulation of the Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) by miR-101 and miR-494 specific binding.» Plos One 6(10) (2011).

Miranda K.C., Huynh T., Tay Y., et al. «A pattern-based method for the identification of microRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.» Cell 126 (2006): 1203-1217.

Mishra, M. K., Loro, E., Sengupta, K., Wilton, S. D., Khurana, T. S. «Functional improvement of dystrophic muscle by repression of utrophin: let-7c interaction.» PloS one 12(10) (2017): eCollection.

Moore M.J., Scheel T.K., Luna J.M., et al. «miRNA-target chimeras reveal miRNA 3'-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity.» Nature communications 6(1) (2015): 1-17.

Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., and Darnell, R. B. «Mapping argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.» Nat. Protoc. 9(2) (2014): 263-293.

Murakawa, Y., Hinz, M., Mothes, J., Schuetz, A., Uhl, M., Wyler, E., et al. «RC3H1 post-transcriptionally regulates A20 mRNA and modulates the activity of the IKK/NF-kB pathway.» Nat. Commun. 6 (2015): 7367.

Najafipour, R., Momeni, A., Yousefipour, F., Mousavi, S., Moghbelinejad, S. «Underexpression of hsa-miR-449 family and their promoter hypermethylation in infertile men: A case-control study.» International Journal of Reproductive BioMedicine 19(1) (2021): 23-34.

Ni, W. J., Leng, X. M. «Dynamic miRNA-mRNA paradigms: new faces of miRNAs.» Biochem. Biophys. Rep. 4 (2015): 337-341.

Parpart S., Roessler S., Dong F., et al. «Modulation of miR-29 expression by a-fetoprotein is linked to the hepatocellular carcinoma epigenome.» Hepatology 60(3) (2014): 872-883.

Pasquinelli, A.E., Reinhart, B.J., Slack, F. et al. «Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.» Nature 408(6808) (2000): 86-89.

Pla, A., Zhong, X., Rayner, S. «miRAW: A deep learning-based approach to predict microRNA targets by analyzing whole microRNA transcripts.»plos computational biology 14(7) (2018): e1006185.

Plotnikova, O., Baranova, A., Skoblov, M. «Comprehensive analysis of human microRNA-mRNA interactome.» Frontiers in genetics 10 (2019): 933.

Pule GD, Mowla S, Novitzky N, Wonkam A. «Hydroxyurea down-regulates BCL11A, KLF-1 and MYB through miRNA-mediated actions to induce y-globin expression: implications for new therapeutic approaches of sickle cell disease.» Clinical and translational medicine 5(1) (2016): 1-15.

Qi Y., Li Y., Zhang L., Huang J. «microRNA expression profiling and bioinformatic analysis of dengue virusinfected peripheral blood mononuclear cells.» Mol. Med. Rep. 7 (2013): 791-798.

Ramachandran, S., Karp, P. H., Jiang, P., Ostedgaard, L. S., Walz, A. E., Fisher, J. T., ... & Behlke, M. A. «A microRNA network regulates expression and biosynthesis of wild-type and AF508 mutant

cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.» Proceedings of the National Academy of Sciences 109(33) (2012): 13362-13367.

Ramachandran, S., Karp, P. H., Osterhaus, S. R., Jiang, P., Wohlford-Lenane, C., Lennox, K. A., ... & Xing, Y. «Post-transcriptional regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator expression and function by microRNAs.» American journal of respiratory cell and molecular biology 49(4) (2013): 544-551.

Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M. et al. «The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.» Nature 403(6772) (2000): 901-906.

Rohani, N., Moughari, F. A., Eslahchi, C. «DisCoVering potential candidates of RNAi-based therapy for COVID-19 using computational methods.» PeerJ9 (2021): e10505.

Sankaran VG, Menne TF, Scepanovic D, Vergilio JA, Ji P, Kim J, Thiru P, Orkin SH, Lander ES, Lodisha HF. «MicroRNA-15a and -16-1 act via MYB to elevate fetal hemoglobin expression in human trisomy 13.» Proc Natl Acad Sci USA 108 (2011): 1519-1524.

Schober, A., Maleki, S. S., Nazari-Jahantigh, M. «Regulatory Non-coding RNAs in Atherosclerosis.» Handbook of Experimental Pharmacology, 2020.

Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., Rajewsky, N. «Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.» Nature 455(7209) (2008): 58-63.

Sondka Z., Bamford S., Cole C.G., et. al. «The COSMIC Cancer Gene Census: describing genetic dysfunction across all human cancers.» Nature Reviews Cancer 18(11) (2018): 696-705.

Stenson, P.D., Ball, E.V., Mort, M., Phillips, A.D., Shaw, K., Cooper, D.N. «The Human Gene Mutation Database (HGMD) and Its Exploitation in the Fields of Personalized Genomics and Molecular Evolution.» Curr Protoc Bioinformatics Unit 39(1) (2012): 1-13.

Stroynowska-Czerwinska A., Fiszer A., Krzyzosiak W. J. «The panorama of miRNA-mediated mechanisms in mammalian cells.» Cellular and Molecular Life Sciences 71 №12 (2014): 2253-2270.

Talukder, A., Li, X., Hu, H. «Position-wise binding preference is important for miRNA target site prediction.» Bioinformatics 36(12) (2020): 3680-3686.

Teimouri, M., Hosseini, H., Shabani, M., Koushki, M., Noorbakhsh, F., Meshkani, R. «Inhibiting miR-27a and miR-142-5p attenuate nonalcoholic fatty liver disease by regulating Nrf2 signaling pathway.» IUBMB life 72(3) (2020): 361-372.

Telford, B.J., Yahyanejad, S., de Gunst, T., et. al. «Multi-modal effects of 1B3, a novel synthetic miR-193a-3p mimic, support strong potential for therapeutic intervention in oncology.» Oncotarget 12(5) (2021): 422.

Tinsley J, Deconinck N, Fisher R, Kahn D, Phelps S, Gillis JM, Davies K. «Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice.» Nat Med 4(12) (1998): 1441-1444.

Tinsley JM, Fairclough RJ, Storer R, Wilkes FJ, Potter AC, Squire SE, Powell DS, Cozzoli A, Capogrosso RF, Lambert A, Wilson FX, Wren SP, De Luca A, Davies KE. «Daily treatment with SMTC1100, a novel small molecule utrophin upregulator, dramatically reduces the dystrophic symptoms in the mdx mouse.» PLoS One 6(5) (2011): e19189.

Tsujimura K, Irie K, Nakashima H, Egashira Y, Fukao Y, Fujiwara M, Itoh M, Uesaka M, Imamura T, Nakahata Y, Yamashita Y, Abe T, Takamori S, Nakashima K. «miR-199a Links MeCP2 with mTOR

Signaling and Its Dysregulation Leads to Rett Syndrome Phenotypes.» Cell reports 12(11) (2015): 18871901.

Ueno, D., Mikami, M., Yamasaki, S., Kaneko, M., Mukuta, T., Demura, T., Kato, K. «Changes in mRNA degradation efficiencies under varying conditions are regulated by multiple determinants in Arabidopsis thaliana.» Plant and Cell Physiology, 2020.

Vannan, A., Powell, G. L., Dell'Orco, M., et. al. «microRNA regulation related to the protective effects of environmental enrichment against cocaine-seeking behavior.» Drug and Alcohol Dependence 221 (2021): 108585.

Wang, K., Li, M., and Hakonarson, H. «ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.» Nucleic Acids Res 38 (16) (2010): e164.

Wang, L., Zhou, L., Jiang, P., Lu, L., Chen, X., Lan, H., Guttridge, DC., Sun, H., Wang, H. «Loss of miR-29 in myoblasts contributes to dystrophic muscle pathogenesis.» Molecular therapy 20(6) (2012): 1222-1233.

Wang, X. «Improving microRNA target prediction by modeling with unambiguously identified microRNA-target pairs from CLIP-ligation studies.» Bioinformatics 32(9) (2016): 1316-1322.

Wang, Y., Jiang, Q., Chakravarti, A., Cai, H., Xu, Z., Wu, W., Gu, B., Li, L., Cai, W. «MicroRNA-4516-mediated regulation of MAPK10 relies on 3' UTR cis-acting variants and contributes to the altered risk of Hirschsprung disease.» Journal of Medical Genetics 0 (Feb 2020): 1-9.

Wen, M., Cong, P., Zhang, Z., Lu, H., & Li, T. (2018). «DeepMirTar: a deep-learning approach for predicting human miRNA targets.» Bioinformatics 34(22) (2018): 3781-3787.

Wissink, E. M., Fogarty, E. A., and Grimson, A. «High-throughput discovery of post-transcriptional cis-regulatory elements.» BMC Genomics 17 (2016): 177.

Witkos T.M., Koscianska E., Krzyzosiak W.J. «Practical aspects of microRNA target prediction.» Curr. Mol. Med. 11 (2011): 93-109.

Wong, L. L., Wang, J., Liew, O. W., Richards, A. M., Chen, Y. T. «MicroRNA and heart failure.» International journal of molecular sciences 17(4) (2016): 502.

Yang, H., and Wang, K. «Genomic variant annotation and prioritization with ANNOVAR and wANNOVAR.» Nat. Protoc. 10(10) (2015): 1556-1566.

Yates, A., Beal, K., Keenan, S., McLaren, W., Pignatelli, M., Ritchie, G. R., et al. «Ensembl REST API: Ensembl data for any language.» Bioinformatics 31(1) (2014): 143-145.

Yung-Chun Chang, Cen-Chieh Chen, Yu-Lun Hsieh, Chien Chin Chen, Wen-Lian Hsu. «Linguistic Template Extraction for Recognizing Reader-Emotion and Emotional Resonance Writing Assistance.» ACL-IJCNLP, 2015: 775-780.

Zanotti S., Gibertini S., Curcio M., Savadori P., Pasanisi B., Morandi L., Cornelio F., Mantegazza R., Mora M. «Opposing roles of miR-21 and miR-29 in the progression of fibrosis in Duchenne muscular dystrophy.» Biochim Biophys Acta. 1852(7) (2015): 1451-1464.

Zhang Z., Huang L., Yu Z., et. al. «Let-7a functions as a tumor suppressor in Ewing's sarcoma cell lines partly by targeting cyclin-dependent kinase 6.» DNA and cell biology 33(3) (2014): 136-47.

Климентова, Е.А., Гилязова, И.Р., Кунсбаева, Г.Б., Измайлов, А.А., Султанов, И. М., Павлов, В. Н., Хуснутдинова, Э. К. «Ассоциация полиморфного варианта сайта связывания микроРНК

ге10491534 гена ТБС1 с тяжестью течения рака почки.» Медицинская генетика 15(4) (2016): 5052.

Плотникова О.М., Скоблов М.Ю. «Эффективность программ, предсказывающих микрорнк-мрнк взаимодействия.» Молекулярная биология 52(3) (2018): 543-554.

Плотникова, О.М., Скоблов, М.Ю. «Роль микроРНК в патогенезе наследственных заболеваний.» Медицинская генетика 19(9) (2020): 5-17.