Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Ивличева, Наталья Александровна

• Ивличева, Наталья Александровна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ивличева, Наталья Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Криоконсервация. Биофизические аспекты.

1.1.1. Основные этапы криоконсервации.

1.1.2. Причины повреждений клеток при замораживании.

1.1.3. Кристаллизация воды.

1.1.3.1. Кристаллы и микрочастицы льда в процессе замораживания

1.1.3.2. Рекристаллизация.

1.1.4. Режимы замораживания-оттаивания (скорости).

1.1.4.1. Низкие скорости замораживания.

1.1.4.2. Высокие скорости замораживания. Витрификация.

1.1.4.3. Режимы замораживания нервных клеток и ткани.

1.1.5. Протекторы.

1.1.5.1. Основные свойства криопротекторов.

1.1.5.2. Криопротекторы, используемые для защиты нервных клеток и ткани при криоконсервации.

1.1.5.3. Протекторные добавки в криозащитные среды.

1.2. Современное состояние и перспективы криоконсервации нервной ткани.

1.2.1. Криоконсервация эмбриональных нервные клеток и ткани.

1.2.2. Криоконсервация дифференцированной нервной ткани.

1.2.3. Криоконсервация нервных стволовых клеток.

1.2.4. Использование альтернативных объектов для изучения последствий криоконсервации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.»

Длительное сохранение жизнеспособной нервной ткани в замороженном состоянии (криоконсервация в жидком азоте, при -196°С) является современной и актуальной проблемой в связи с развитием в последние годы методов трансплантологии в нейромедицине и, соответственно, необходимостью создания запаса нейронального материала в криобанках.

В настоящее время криоконсервация стала обычной процедурой для длительного сохранения многих типов клеток животных, таких как клетки крови, клетки костного мозга, сперматозоиды, клеточные культуры, и др. Успешные протоколы криоконсервирования в основном разработаны для однородных клеточных суспензий (Фуллер и др., 2003; Meryman, 2007; Choi, Bischof, 2010; Seth, 2012). Изолированные ткани плохо переносят низкотемпературную криоконсервацию, а для целых органов эти методы пока не разработаны. Клетки в составе ткани, создавая определенную архитектуру функциональной единицы, более плотно упакованы, чем в клеточных суспензиях, с которыми исследователи чаще всего имеют дело. Гетерогенный клеточный состав нейрональной ткани (разного типа нейроны и глиальные клетки) и экстраклеточная структура, - все вместе могут создавать проблемы при попытке экстраполировать протоколы криоконсервирования с клеточных суспензий на кусочки органов, ткани, нейросферы (Fagy et al., 2004; Pegg, 2007; Paynter, 2008). Одна из таких проблем заключается в том, что экстраклеточные структуры и межклеточные связи могут быть не менее важными объектами криоконсервирования, чем сами клетки, особенно, если они плотно упакованы в структуре ткани (Acker et al., 2000; Müller-Schweinitzer, 2009; Pegg, 2010). Поэтому в настоящее время являются особенно актуальными исследования механизмов криоповреждений и криозащиты нервной ткани как неделимой интегрированной структуры.

В этой связи в качестве модельных объектов интерес представляют нервные системы беспозвоночных, как например, мозг моллюска Lymnaea stagnalis L., который представляет собой гетерогенную ткань, включающую полифункциональные нейроны разного размера и обширные вненейрональные области, по многим свойствам сходные с аналогичными структурами позвоночных. Хорошо отлаженные способы регистрации электрической активности нейронов, разработанные методы клеточной и органной культуры (Гелетюк и др., 1970; Костенко и др. 1972; Wong et al., 1981; Ивличева, Гахова, 2007), а также доступность объекта для исследователей в любое время года, делают мозг моллюска привлекательной моделью для исследования в области криобиологии (Гахова и др., 1989; Дмитриева, 2004; Ивличева, Гахова, 2007). Изучение особенностей криоповреждений и криозащиты мозга моллюска как целой интегральной структуры позволит определить области криоповреждений, прогнозировать степень восстановления и оценить возможности режимов криоконсервации и создания оптимальных криозащитных сред.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении последствий криоконсервации на функциональную и регенеративную способность зрелых нейронов на примере криоконсервирования изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.

В соответствии с целью были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить электрическую активность нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре без криоконсервации и после криоконсервации: мембранные потенциалы (МП), генерацию потенциалов действия (ПД) и постсинаптических потенциалов (ПСП), рецепторные ответы на медиаторы.

2. Провести поиск синаптических связей между нейронами переживающего мозга моллюска в органной культуре после криоконсервации.

3. Исследовать в клеточной культуре выживаемость и регенеративные способности нейронов, выделенных из замороженно-оттаянного мозга моллюска.

4. Выявить характер протективного действия (крио- или нейро-протекторное) пептида Thr-Ser-Lys-Tyr (TSKY) выделенного из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates. Определить его влияние на выживаемость и регенеративные способности нейронов в культуре на разных этапах криоконсервирования.

5. Проанализировать влияние пептида TSKY на кристаллизацию и формирование микрочастиц льда в криозащитных растворах в процессе замораживания до температуры жидкого азота.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Ивличева, Наталья Александровна

выводы

1. Показано, что после криоконсервацин изолированного мозга моллюска Ьутпаеа stagnalis Ь. нейроны сохраняют жизнеспособность и электрическую активность (МП, ПД, ПСП) при органотипическом культивировании. Зарегистрированы ответы нейронов криоконсервированного мозга моллюска на аппликацию серотонина.

2. Синаптические связи между идентифицированными нейронами не были зарегистрированы в криоконсервированном мозге, в отличие от контроля. Связи не восстанавливались на протяжении 16 суток органотипического культивирования. Предположено, что причинами отсутствия связей могут быть криоповреждения межклеточных структур в нейропиле и комиссурах.

3. В клеточной культуре показано, что нейроны после криоконсервациц сохраняют функциональную активность: формируют нервные отростки и устанавливают контакты друг с другом.

4. Впервые показано нейропротекторное действие пептида Т8КУ, выделенного из мозга зимоспящих животных, на стадии оттаивания криоконсервированного мозга моллюска. При замораживании изолированного мозга моллюска пептид Т8КУ не проявлял криопротекторных свойств.

5. Анализ видеоизображений процесса замораживания до температуры жидкого азота показал, что пептид ТБКУ не влияет на характер кристаллизации и формообразование МКЧ льда, что подтверждает отсутствие у ТБКУ криопротективных свойств в период замораживания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований мы получили данные, которые свидетельствуют, что после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. нейроны сохраняются живыми (флуоресцентный анализ Live/Dead) и восстанавливают функциональную активность. Размеры мозга моллюска, состоящего из ганглиев, соединенных комиссурами, не превышают 1.5 - 2.7 мм. Тем не менее, это орган, состоящий из -20000 полифункциональных нейронов и включающий богатые вненейропальные области, состоящие из нескольких видов глиальных клеток, длинных аксонов, синаптических структур* Криоконсервации таким образом подвергалась интегрированная структура, включающая разнородные элементы.

Мы изучили электрические характеристики нейронов в органной культуре до и после криоконсервации изолированного мозга моллюска. На протяжении 16 суток культивирования у 86,3 % нейронов из некриоконсервированных ганглиев (контроль) и 84% нейронов криоконсервированных (опыт) сохранялась электрическая активность (МП, ПД, частота генерации ПД, ПСП), характерная для нейронов данного вида моллюска. В обеих группах ганглиев зарегистрированы ответы нейронов на аппликацию серотонина (3-10° М).

Однако, после криоконсервации в более чем 20 попытках, обнаружить синаптические связи между идентифицированными нейронами локализованных в разных ганглиях не удалось. В контроле они всегда регистрировались. Чтобы исключить возможное токсическое действие ДМСО мы инкубировали ганглии в среде с 2 М ДМСО без замораживания, и результаты показали отсутствие эффекта ДМСО на функционирование синаптических связей. Мы предположили, что отсутствие синаптических связей в заморожено-оттаянных ганглиях, является следствием криоповреждений межклеточных структур в нейропиле и комиссурах, и связано с физическими процессами, сопровождающими криоконсервацию.

К настоящему времени установлено, что в процессе замораживания и оттаивания в основе многочисленных повреждающих факторов лежит внутриклеточное формирование льда (Mazur, 1965, 1977). Вероятность внутриклеточного замораживания контролируется скоростью охлаждения и проницаемостью клеток к воде. Но это в полной мере относится к однородной суспензии клеток, концентрация которых в растворе такова, что клетки находятся на достаточно большом расстоянии друг от друга (Mazur, 1985, Pegg, Diaper, 1983). Попытки использовать протоколы криоконсервации, разработанные для клеточных суспензий, безуспешны для замораживания тканей и органов (Pegg, 2010). Прежде всего, здесь имеет значение так называемый «эффект упаковки», который наглядно продемонстирован на примере замораживания взвеси эритроцитов (Рамазанов, Бондаренко, 2009) и ядерных клеток (De Loecker et al, 1998). Авторы показали, что в зависимости от плотности упаковки клеток и от скорости замораживания и отогревания образование кристаллов льда может происходить внутри клеток во время замораживания, снаружи во время оттаивания вследствие рекристаллизации льда. В обоих случаях кристаллизация (как внутри-, так и межклеточная) оказывает повреждающее действие. Эти наблюдения могут иметь отношение к криоконсервации тканей и органов. Кроме этого, криоконсервация ткани, и особенно органов, осложняется еще и тем обстоятельством, что они состоят из гетерогенной (а не однородной) популяции клеток, и разного рода межклеточных структур и межклеточных связей (Pegg et al, 2006; Taylor, 2006). Именно экстраклеточный матрикс может оказывать большое влияние на процесс замораживания ткани/органа, в связи с особенностями формирования льда в клетках и межклетниках (Taylor, Pegg, 1983; Müller-Schweinitzer Е, 2009; Pegg, 2010).

Мы показали, что в клеточной культуре нейроны, выделенные из криоконсервированного мозга, сохраняли способность к регенерации

70 нервных отростков и формированию контактов. На этом основании можно предположить, что при определенных условиях в органной культуре поврежденные области нервной ткани могут быть также восстановлены.

Таким образом, успех криоконсервации ткани/органов требует развития методов, которые полностью предотвращают формирование льда, или как альтернатива, предотвращают повреждения, либо способствуют репарации клеточных структур, поврежденных при замораживании-оттаивании.

Исследования, направленные на предотвращение криоповреждений путем модификации криозащитных сред, имеют большое значение. Так например, результаты криоконсервации нейросфер, которые можно рассматривать как модели ткани, могут быть улучшены предварительной обработкой или после оттаивания факторами роста, антиоксидантами или ингибиторами апоптоза (Mattson, Rychlik, 1990; Milosevic et al., 2005).

Привлекательно использовать для этих целей природные агенты, участвующие в биохимических механизмах холодо- и морозоустойчивости (Kramarova et al., 2004; Крамарова и др., 2009). Интерес представляют, с пашей точки зрения, те, которые могут снижать уровень метаболизма ткани (или органа), т.к. в гипометаболическом состоянии клетки более устойчивы к стрессовым ситуациям. Предположительно такими свойствами может обладать пептид TSKY (Thr-Ser-Lys-Tyr), выделенный из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates (Ziganshin et al., 1994; Kramarova et al., 1996). Изучение влияния пептида TSKY на точку кристаллизации растворов, характер начала кристаллизации и формирование микрочастиц льда при температуре жидкого азота с помощью криомикроскопии не выявило у этого вещества криопротекторных свойств.

Однако, нам удалось впервые показать, что пептид TSKY, добавленный в криозащитный раствор на стадии оттаивания, может проявлять нейропротекторные свойства и оказывать гипометаболический эффект,

71 увеличивая жизнеспособность ткани мозга моллюска на этапе размораживания. Эти результаты расширяют возможности в усовершенствовании криозащитных сред, которые будут использованы для криоконсервации нервной ткани.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ивличева, Наталья Александровна, 2013 год

1. Андреев A.A., Садикова Д.Г, Лаббе К, Ананьев В.И, Курников A.JT. Влияние липидов на образование льда при замерзании криозащитных растворов. //Биофизика. 2008. Т. 53(4). С. 598-601

2. Андреев A.A., Садикова Д.Г, Гахова Э.Н, Пашовкин Т.Н., Тихомирова A.M. Замерзание криозащитных растворов и выживание спермиев рыб при криоконсервации. // Биофизика. 2009. Т. 54(5). С. 869875

3. Бабийчук Г.А, Ломако В.В, Шуляк Л.И, Шило A.B., Ломакин И.И. Функциональное состояние фрагментов эмбриональной нервной ткани после гипотермического хранения и трансплантации реципиенту. // Проблемы криобиологии. 2000. №2. С. 40-48

4. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. 1994. Киев: Наукова Думка. 432с.

5. Белоус А. М, Гордиенко Е.А, Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. // Биохимия мембран. 1987. М.: Высш.шк. 80с.

6. Виленчик М.М. Сколько лет можно хранить зародышевые клетки в криоконсервированном состоянии без существенного повреждения их генома. // Консервация генетических ресурсов. 1983. Пущино. ОНТИ ПНЦ РАН. 21с.

7. Гахова Э.Н, Чекурова Н.Р, Кислов А.Н, Вепринцев Б.Н. Гигантские нейроны сохраняют жизнеспособность после глубокого замораживания мозга пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. // Криобиология. 1989. №1. С. 19-23

8. Гахова Э.Н. Корн О.М, Буцук C.B. Замораживание личинок усоногого рака Baianus impovisus до температуры -196°С. // Биология моря. Т.4. С. 62-65

9. Гелетюк В.И., Орлова A.A., Вепринцев Б.Н. Электрическая активность нейронов изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. при переживании в течение двух месяцев в различных питательных средах. // ВИНИТИ. 1970. № 2899-71

10. Дмитриева Е.В., Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации. // Автореф. дис . канд. биол. наук. 2004. Пущино. 22с.

11. Дмитриева Е.В., Мошков Д.А., Гахова Э.Н. Ультраструктурные изменения нейрона МПЗ моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации изолированного мозга. // Цитология. 2006. Т. 48(6). С. 480-485

12. Дьяконова Т.Л., Вепринцев Б.Н., Особенности структурной и функциональной организации и метаболической активности нейронов прудовика. //ВИНИТИ. 1969. №816-69

13. Жадин В.И. Моллюски пресных вод СССР. 1952. М.: Изд-во акад. наук СССР. 376с.

14. Игнатьев Д.А., Загнойко В.И., Сухова Г.С., Баканева В.Ф., Сухов В.П. Биологически активные субстанции в тканях гибернирующих животных. //Ж. общ. биол. 1995. Т. 56(4). С. 450-469

15. Игнатьев Д. А., Воробьёв В.В., Зиганшин Р.Х. Влияние синтетического аналога пептида TSKY, выделенного из мозга зимнеспящего суслика, на крыс и мышей. // Высш. нерв. деят. 2005(а). Т. 55(1). С. 84-90

16. H.A. Ивличева, Э.Н. Гахова. Культура дифференцированных нейронов взрослого моллюска альтернативная модель изучения процессов регенерации нервной системы. // Биомедицина. 2007. Т. 6. С. 89-96

17. Каранова М.В., Цветкова Л.И., Межевикина Л.М., Григорьев П.А. Антифризные гликопротеины как дополнительные компоненты криозащитных сред. // Цитология. 1999. Т.41(3/4). С. 275-276

18. Кислов А.Н., Пластинкин Д.В. Действие некоторых криопротекторов на мембрану нейронов моллюска. // Биофизика живой клетки. 1994. Т.6. С. 118-120

19. Костенко М.А. Внутриклеточная регуляция дифференцировки и регенерации нейронов в культуре: Дис. . д-ра биол. наук. Пущино. 1985. 360с.

20. Костенко М.А. Выделение одиночных нервных клеток из мозга моллюска Lymnaea stagnalis для дальнейшего культивирования их in vitro. //Цитология. 1972. Т. 14(10). С. 1274-1278

21. Костенко М.А. Цитофизиологические характеристики изолированних нейронов моллюска Lymnaea stagnalis in vitro: Автореф. дис . канд. биол. наук. Пущино. 1973. 26с.

22. Костенко М.А., Вепринцев Б.Н., Культивирование нервной ткани взрослого моллюска Lymnaea stagnalis L. в органных культурах in vitro. 11 Цитология. 1972. Т. 14(11). С. 1392-1397

23. Костенко М.А., Смолихина Т.П. Метод получения изолированных нейронов моллюсков с высокой регенерационной активностью: A.c. СССР, 913254 Б.И. 1982. № 10.

24. Крамарова Л.И., Зиганшин Р.Х., Гахова Э.Н. Эндогенныегипометаболические-гипотермические факторы и их возможное применение для жизни в холоде. // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35(5). С. 597-609

25. Межевикина JIM., Каранова М.В. Использование антифризных гликопротеинов при замораживании в жидком азоте ранних эмбрионов мышей. // Известия РАН. Серия биологич.1995. Т. 2. С. 172-177

26. Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Проявление и устранение эффекта «упаковки» в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами. // Проблемы криобиологии. 2009. Vol. 19 (3). Р. 312323

27. Сотников О.С. Статика и структурная кинетика живых асинаптических дендритов. 2008. СПб.: Наука. 397с.

28. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование для создания банка клеток: современные концепции на рубеже XXI столетия // Проблемы криобиологии. 2003. Т. 2. С. 62-83

29. Цуцаева A.A., Попов В.Г., Сыткник K.M. Криобиология и биотехнология. 1987. Наукова Думка. Киев. 216 с.

30. Чекурова Н.Р. Действие криопротекторов на электрические характеристики клеточной мембраны: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Москва. 1992. 16с.

31. Чекурова Н.Р., Кислов А.Н., Вепринцев Б.Н. Действие некоторых криопротекторов на ионные каналы мембраны нейронов. // Криобиология. 1987. №1. С. 21-25

32. Чекурова Н.Р. Использование электрофизиологического метода для изучения механизмов криоповреждений и способов криозащиты. // Биофизика живой клетки. 1994. Т.6. С. 121-126

33. Acker J.P., McGann L.E. Cell-cell contact affects membrane integrityafter intracellular freezing. // Cryobiology. 2000. Vol. 40(1). P. 54-63

34. Amorim C.A., Curaba M., Van Langendonckt A., Dolmans M.M., Donnez J., Gritti A., Galli R., Vescovi A.L. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. // Reprod. Biomed. Online. 2011. Vol. 23(2). P. 160-186

35. Asher I.M. Effects of DMSO on the electrical response of Homarus nerves frozen to -20 °C, -30 °C and at room temperature. // Cryobiology. 1972. Vol. 9(3). P. 153-162

36. Baudot A., Alger L., Boutron P. Glass-forming tendency in the system water-dimethyl sulfoxide. //Cryobiology. 2000. Vol. 40(2). P. 151-158

37. Bell H.J., inoue T., Shum K., Luk C., Syed N.I. Peripheral oxygen-sensing cells directly modulate the output of an identified respiratory central pattern generating neuron. // Eur. J. Neurosci. 2007. Vol. 25(12). P. 3537-3550

38. Benjamin P.R., Winlow W. The distribution of three wide-acting inputs to identified neurons in the isolated brain of Lymnaea stagncilis. II Comp. Biochem. Physiol. 1981. Vol. 70A. P. 293-307

39. Ben-Hur T., Tdelson M., Khaner H., Pera M., Reinhartz E., Ttzik A., Reubinoff B.E. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves behavioral deficit in Parkinsonian rats. // Stem. Cells. 2004. Vol. 22. P. 1246-1255.

40. Bithell A., Williams B.P. Neural stem cells and cell replacement therapy: making the right cells.//Clinical Science. 2005. Vol. 108. P. 13-22

41. Bray D. Membrane biophysics: the dynamics of growing axons. // Curr. boil. 1996. Vol. 6(3). P. 241-243

42. Brunei J-F., Pellerin L., Magostretti P., Villemure J-G. Cryopreservation of human brain tissue allowing timely production of viable human brain cells for autologous transplantation. // Cryobiology. 2003. Vol. 47(2). P. 179-183

43. Brundin P., Karlsson J., Emgard M., Schierle G.S., Hansson O., Petersen A., Castilho R.F. Improving the survival of grafted dopaminergic neurons: a review over current approaches. // Cell Transplant. 2000. Vol. 9(2). P. 179-195

44. Cai Ch., Grabel L. Directing the Differentiation of Embryonic Stem Cells to Neural Stem Cells. // Develop. Dynam. 2007. Vol. 236. P. 3255-3266

45. Choi J., Bischof J.C. Review of biomaterial thermal property measurements in the cryogenic regime and their use for prediction of equilibrium and non-equilibrium freezing applications in cryobiology. // Cryobiology. 2010. Vol. 60(1). P. 52-70

46. Collier T.J., Gash D.M., Sladek J.R.Jr. Transplantation of norepinephrine neurons into aged rats improves performance of a learned task. // Brain. Res., 1988. Vol. 448(1). P. 77-87

47. Collier T.J., Gallagher M.J., Sladek C.D. Cryopreservation and storage of embryonic rat mesencephalic dopamine neurons for one year: comparison to fresh tissue in culture and neural grafts. // Brain. Res. 1993. Vol. 623(2). P. 249256

48. Decherchi P., Lammari-Barreault N., Cochard P., Carin M., Rega P., Pio J., Pellissier J-F., Ladaique P., Novakovitch G., Gauthier P. CNS Axonal Regeneration within Peripheral Nerve Grafts Cryopreserved by Vitrification:

49. Cytological and Functional Aspects. // Cryobiology. 1997. Vol. 34. P. 214-239

50. De Loecker W., Koptelov V.A., Geshenko V.I., De Loecker P. Effects of cell concentration on viability and metabolic activity during cryopreservation. // Cryobiology. 1998. Vol. 37. P. 103-109

51. Dinsmore J.H. Treatment of neurodegenerative diseases with neural cell transplantation. // Expert. Opin. Investig. Drugs. 1998. Vol. 7(4). P. 527-534

52. Fahy G.M., MacFarlane D.R., Angell C.A., Meryman FI.T. Vitrification as an approach to cryopreservation. // Cryobiology 1984. Vol. 21. P. 407-426

53. Fahy, G.M. The relevance of cryoprotectant «toxity» to cryobiology. // Cryobiology. 1986a. Vol. 23. P. 1-13

54. Fahy, G.M. Vitrification: A new approach to organ cryopreservation. In «Progress in Clinical and Bological Research. Transplantation: Approaches to Graft Rejection» (T. H. Meryman, Ed.). 1986. A.R. Liss. New York. Vol. 224. P. 305-335

55. Fahy G.M., Wowk B., Wu J., Paynter S. improved vitrification solutions based on the predictability of vitrification solution toxicity. // Cryobiology. 2004a. Vol. 48. P. 22-35

56. Fahy G.M., Wowk B., Wu J., Phan J, Rasch Ch., Chang A., Zendejas E., Cryopreservation of organs by vitrification; perspectives and recent advances // Cryobiology. 2004. V. 48(2). P. 157-178

57. Fahy GM. Cryoprotectant toxicity neutralization. // Cryobiology. 2010 Vol. 60(3 Suppl). P. 45-53

58. Fujikawa S., Steponkus P. L. Plasma membrane ultrastructural changesby vitrification procedures. // Jpn. J. Freezing Drying. 1991. Vol. 37. P. 25-29

59. Gewartowska M., Olszewski W.L. The new approaches to preservation of graft cell integrity in preservation for transplantation. // Ann Transplant. 2005. Vol. 10(4). P.6-10

60. Gritti A., Galli R., Vescovi A.L. Clonal analyses and cryopreservation of neural stem cell cultures. //Methods Mol Biol. 2008. Vol. 438. P. 173-184

61. Ha S.Y., Jee B.C., Suh C.S., Kim H.S., Oh S.K., Kim S.H., Moon S.Y. Cryopreservation of human embryonic stem cells without the use of a programmable freezer. // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20. P. 1779-1785

62. Hancock C.R., Wetherington J.P., Lambert N.A., Condie B.G. Neuronal differentiation of cryopreserved neural progenitor cells derived from mouse embryonic stem cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 271 P. 418-421

63. Heng B.C., Kuleshova L.L., Bested S.M., Liu II., Cao T. The cryopreservation of human embryonic stem cells. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2005. Vol. 41 P. 97-104

64. I-Iiggins A.Z., Cullen D.K., LaPlaca M.C., Karlsson J.O. Effects of freezing profile parameters on the survival of cryopreserved rat embryonic neural cells. //J. Neurosci. Methods. 2011 Vol. 201(1) P. 9-16

65. Ishiguro H, Kataori A, Nozawa M. Three-dimensional microscopic behavior of ice crystals and cells during directional solidification of muscle tissues treated with DMSO // Cryobiology. 2009. Vol. 59. P. 410

66. Ishine N, Rubinsky B, Lee C.Y. Transplantation of mammalian livers following freezing: vascular damage and functional recovery. // Cryobiology. 2000. Vol. 40(1). P. 84-89

67. Jensen S, T. Sorensen, A.G. Moller, J. Zimmer. Intraocular grafts of fresh and freeze-stored rat hippocampal tissue: a comparison of survivability and histological and connective organization. // J. Comp. Nerol. 1984. Vol. 227. P. 558-568

68. Kuleshova L.L, Goulc S.S, Hutmacher D.W. Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs. // Biomaterials. 2007. Vol.28. P. 1585-1596

69. Lane M., Maybach J.M., Gardner D.K. Addition of ascorbate during cryopreservation stimulates subsequent embryo development. // Human Reproduction. 2002. Vol. 17(10). P. 2686-2693

70. Lawson A., Ahmad H., Sambanis A. Cytotoxicity effects of cryoprotectants as single-component and cocktail vitrification solutions. // Cryobiology. 2011. Vol. 62. P. 115-122

71. Lindvall O., Bjorlclund A. Cell replacement therapy: helping the brain to repair itself. //NeuroRx. 2004. Vol. 1(4). P. 379-381

72. Luyet B.J. The vitrification of organic colloids and protoplasm. // Biodinamica. 1937. Vol. 29. P. 1-14

73. Luyet B., Gonzales F. Growth of nerve tissue after freezing in liquid nitrogen. //Biodynamica. 1953.V. 7, p. 171-173.

74. Ma X.H., Shi Y., Hou Y., Liu Y., Zhang L., Fan W.X., Ge D., Liu T.Q., Cui Z.F. Slow-freezing cryopreservation of neural stem cell spheres with different diameters. // Cryobiology. 2010. Vol. 60(2). P. 184-191

75. Magoski N.S., Bulloch A.G.M. Dopamine activates two different receptors to produce variability in sign at an identified synapse. // J.Neurophys. 1999. Vol. 81(3). P. 1330-1340

76. Meryman H.T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. // Transfusion. 2007. Vol. 47(5). P.935-945

77. Martinez-Paramo S., Barbosa V., Perez-Cerezales S., Robles V., Herraez M.P. Cryoprotective effects of antifreeze proteins delivered into zebrafish embryos. // Cryobiology. 2009. Vol. 58(2). P. 128-133

78. Matthes G., Hubner U., Granz M., Schutt M., Hackensellner H.A. Antioxidants increase the cryoresistance of GM-CFC. // Folia Haematologica. 1987. Vol. 114(4). P. 482-483.

79. Mattson M.P., Kater S.B. Isolated hippocampal neurons in cryopreserved long-term cultures: development of neuroarchitecture and sensitivity to NMDA. // Int. J. Dev. Neurosci. 1988. Vol. 6. P. 439-452

80. Mattson M.P., Rychlik B. Cell culture of cryopreserved human fetal cerebral cortical and hippocampal neurons: neuronal development and responses to trophic factors. // Brain Res. 1990. Vol. 522. P. 204-214

81. Mazur P. Causes of injury in frozen and thawed cells. // Fed. Proc. 1965. Vol. 24. P. 175

82. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems // Science. 1970. Vol. 168(3933). P. 939-949

83. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates. // Cryobiology. 1977. Vol. 14. P. 254.

84. Mazur P., Rail W.F., Rigopoulos N. The relative contributions of the fraction of unfrozen water and of salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. // Biophys. J. 1981. Vol. 36. P. 653

85. Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the contribution of unfrozen fractions and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. // Cryobiology/ 1985. Vol. 22. P. 509-536

86. Mazur P. Equilibrium quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos // Cell Biophysics. 1990. Vol. 17. P. 53-92

87. Milosevic J., Storch A., Schwarz J. Cryopreservation does not affect proliferation and multipotency of murine neural precursor cells. // Stem Cells. 2005. Vol. 23. P. 681-688

88. Mori S., Choi J., Devireddy R.V., Bischof J.C. Calorimetric measurement of water transport and intracellular ice formation during freezing in cell' suspensions. // Cryobiology. 2012 Vol. 65(3). P. 242-255

89. Muir J.K., Raghupathi R., Saatman K.E., Wilson C.A., Lee V.M.,

90. Trojanowski J.Q. Terminally differentiated human neurons survive and integrate following transplantation into the traumatically injured rat brain. // J. Neurotrauma. 1999. Vol. 16. P. 403-414

91. Muldrew K., McGann L.E. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury. // Biophysical Journal. 1994. Vol. 66. P. 532-541

92. Miiller-Schweinitzer E. Cryopreservation of vascular tissues. // Organogenesis. 2009. Vol. 5(3). P. 97-104

93. Murthy S.S.N. Some Insight into the Physical Basis of the Cryoprotective Action of Dimethyl Sulfoxide and Ethylene Glycol. // Cryobiology. 1998. Vol. 36(2). P. 84-96

94. Negishi T., Ishii Y., Kawamura S., Kuroda Y., Yoshikawa Y. Cryopreservation of brain tissue for primary culture. // Exp.Anim. 2002. Vol. 51(4). P. 383-390

95. Neronov A.J., Mihailova-Boiadjieva A. Cryopreservation of rabbit cornea with polyethylene oxide-400. A scanning electron microscopy study // Cryo-Letters. 1989. Vol. 10. P. 279-288

96. Noday D.A., Steif P.S., Rabin Y. Viscosity of cryoprotective agents near glass transition: a new device, technique, and data on DMSO, DP6, and VS55 // Exp. Mech. 2009 Vol. 49(5). P. 663-672

97. Otto F., Gortz P., Fleischer W., Siebler M. Cryopreserved rat cortical cells develop functional neuronal networks on microelectrode arrays. // J. Neurosci. Methods. 2003. Vol. 128. P. 173-81

98. Pascoe J.E., The survival of the rat's superior cervical ganglion after cooling to -76 °C. //Proc.R. Soc. Ser. 1957. Vol. B(147). P. 510-519

99. Pasic M., De Sa Faria Lj. Effects of cryoprotective agents and freezing on abdominal ganglia of Aplysia // Cryobiology. 1979. Vol. 16(4). P. 390-400

100. Paynter S.J. Principles and practical issues for cryopreservation of nervecells. // Brain Res Bull. 2008. Vol. 75(1). P. 1-14

101. Pegg D.E. Ice crystals in tissues and organs. // In: The Biophysics of Organ Cryopreservation. D.E. Pegg, A.M. KarowJr. (Eds.). Plenum Publishing Corporation. 1978. P. 117-136

102. Pegg D.E., Diaper M.P. The packing effect in erythrocyte freezing. // Cryo-letters. 1983. Vol. 4. P. 129-136

103. Pegg D.E., Wang L., Vaughan D., Hunt C.J. Cryopreservation of articular cartilage. Part 2: mechanisms of cryoinjury. // Cryobiology. 2006.Vol. 52. P. 347-359

104. Pegg D.E. Principles of cryopreservation. // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 368. P. 39-57

105. Pegg D.E. The relevance of ice crystal formation for the cryopreservation of tissues and organs. // Cryobiology. 2010. Vol. 60(3 Suppl). P. 36-44

106. Pichugin Y., Fahy G.M., Morin R. Cryopreservation of rat hippocampal sliccs by vitrification. // Cryobiology. 2006. Vol. 52. P. 228-240

107. Poncet J.M., Lebel J.M. Influence of cryoprotective agent and cooling rate on frozen and thawed hemocytes from the Mollusk Haliotis tuberculata. // Cryobiology. 2003 Vol. 47(2). P. 184-189

108. Rabin Y., Bell E. Thermal expansion measurements of cryoprotective agents. Part II: measurements of DP6 and VS55, and comparison with DMSO. //Cryobiology. 2003. Vol. 46(3). P. 264-270

109. Rabin Y., Steif P.S., Hess K.C., Jimenez-Rios J.L., Palastro M.C. Fracture formation in vitrified thin films of cryoprotectants. // Cryobiology. 2006. Vol. 53. P. 75-95

110. Rahman A.S., Parvinjah S., Hanna M.A., Helguera P.R., Busciglio J. Cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures. //J. Vis. Exp. 2010. Vol. 11(45). P. 2384

111. Rail W. F. Factors affecting the survival of mouse embryo cryopreserve by vitrification. // exobiology. 1987. Vol. 24. P. 367-402

112. Reynolds B.A., Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. // Science. 1992. Vol. 255. P. 1707-1710

113. Robbins R.J., Torres-Alemán I., Leranth C., Bradberry C.W., Deutch A.Y., Welsh S., Roth R.I I., Spenser D., Redmond E., Naftolin F. Cryopreservation of human brain tissue. // Exp. Neurology. 1990. Vol. 107. P. 208-213

114. Rubinsky B., Arav A., DeVries A.L. The cryoprotective effect of antifreeze glycopeptides from Antarctic fishes. // Cryobiology. 1992. Vol. 29. P. 69-79.

115. Sauer H., Frodl E.M., Kupsch A., ten Bruggencate G., Oertel W.H. Cryopreservation, survival and function of intrastriatal fetal mesencephalic grafts in a rat model of Parkinson's disease. // Exp. Brain Res. 1992. Vol. 90. P. 54-62

116. Sautter J., Strecker S., Kupsch A., Oertel W.H. Methylcellulose during cryopreservation of ventral mesencephalic tissue fragments fails to improve survival and function of cell suspension grafts. // J. Neurosci. Methods. 1996. Vol. 64(2). P. 173-179

117. Schock S.C., Jolin-Dahel K.S., Schock P.C., Theiss S., Arbuthnott G.W., Garcia-Munoz M., Staines W.A. Development of dissociated cryopreserved rat cortical neurons in vitro. //Neurosci Methods. 2012. Vol. 205(2). P. 324-333

118. Seki S., Mazur P. The temperature and type of intracellular ice formation in preimplantation mouse embryos as a function of the developmental stage. // Biol. Reprod. 2010. Vol. 82(6). P. 1198-1205

119. Sengoku R. The current state of the New York Brain Bank and a proposal for the establishment of the brain bank network in Japan. // Brain Nerve. 2010. Vol. 62(10). P. 1035-1042

120. Seth G. Freezing mammalian cells for production of biopharmaceuticals. //Methods. 2012. Vol. 56(3). P. 424-431

121. Sharon J. Paynter. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. // Brain Research Bulletin. 2008. Vol. 75. P. 1-14

122. Shear D.A., Tate M.C., Archer D.R., Hoffman S.W., Hulce V.D., Laplaca M.C., Stein D.G. Neural progenitor cell transplants promote long-term functional recovery after traumatic brain injury. // Brain Res. 2004. Vol. 1026(1). P. 11-22

123. Silani V., Pizzuti A., Strada O., Falini A., Buscaglia M., Scarlato G. Human neuronal cell viability demonstrated in culture after cryopreservation. // Brain Res. 1988. Vol. 473. P. 169-174

124. Sinclair B.J., Renault D. Intracellular ice formation in insects: unresolved after 50 years? // Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2010. Vol. 155(1). P. 14-18

125. Spencer G.E, Lukowiak K, Syed N. I. Transmitter-receptor interactions between growth cones of identified Lymnaea neurons determine target cell selection in vitro. // J. of Neurosc. 2000. Vol. 20(21). P. 8077-8086

126. Spindler R, Rosenhahn B, Hofmann N, Glasmacher B. Video analysis of osmotic cell response during cryopreservation. // Cryobiology. 2012. Vol. 64(3). P. 250-260

127. Steif P.S, Noday D.A, Rabin Y. Can thermal expansion differences between cryopreserved tissue and cryoprotective agents alone cause cracking? // Cryo Letters. 2009. Vol. 30(6). P. 414-421

128. Sweet J.W, Paramore C.G, Turner D.A. Quantitative estimation of cryopreservation viability in rat fetal hippocampal cells. // Exp Neurol. 1994. Vol. 129(2). P. 330-334

129. Syed N.I, Bulloch A.G, Lukowiak K. In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea II Science. 1990. Vol. 250. P. 282-285

130. Syed N.I, Winlow W. Coordination of locomotor and cardiorespiratory networks of Lymnaea stagnalis by a pair of identified interneurones. // J. Exp. Biol. 1991. Vol. 158. P. 37-62

131. Sorensen T, Jensen S, Moller A, Zimmer J. Intracephalic transplants of freeze-stored rat hippocampal tissue. // J. Comp. Neurol. 1986. Vol. 252. P. 468-482

132. Tan F.C., Lee K.H., Gouk S.S., Magalhaes R., Poonepalli A., Hande M.P., Dawe G.S., Kuleshova L.L. Optimization of cryopreservation of stem cells cultured as NSC spheres: comparison between vitrification. // Cryo Letters. 2007. Vol. 28. P. 445-460

133. Taylor M.J. Biology of Cell Survival in the Cold: The Basis for Biopreservation of Tissues and Organs. Ch 2. // In: Baust, J.G., and Baust, J.M. (eds). Advances in Biopreservation. Boca Raton. CRC Taylor &Francis. 2006. P. 15-62

134. Taylor M.J., Pegg D.E. The effect of ice formation on the function of smooth muscle tissue stored at -21°C or -60°C. // Cryobiology. 1983. Vol. 20. P. 36-40

135. Toner M., Cravalho E.G., Stachecki J., Fitzgerald T., Tompkins R.G., Yarmuch M.L., Armant D.R. Nonequilibrium freezing of one-cell mouse embryos. //Biophys. J. 1993. Vol. 64. P. 1980-1921

136. Trad F.S., Toner M., Biggers J.D. Effects of cryoprotectants and iceseeding temperature on intracellular freezing and survival of human oocytes. // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14(6). P. 1569-1577

137. Vasudevan A., Bhide P.G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. // Cell Adh. Migr. 2008 Vol. 2(3). P. 167-169

138. Walker P.A., Shah S.K., Harting M.T., Cox Jr.C.S. Progenitor cell therapies for traumatic brain injury: barriers and opportunities in translation. // Dis. Model. Mech. 2009. Vol. 2. P. 23-38

139. Ware C., Nelson A.M., Blau C.A. Controlled-rate freezing of human ES cells. //BioTechniques. 2005. Vol. 38. P. 879-883

140. Wildering W. C., Hermann P. M., Bulloch A.G.M. Lymnaea Epidermal Growth Factor Promotes Axonal Regeneration in CNS Organ Culture. // J. of Neurosc. 2001. Vol. 21(23). P. 9345-9354

141. Wong R.G., Hadley R.D., Kater S.B., Hauser G.C. Neurite outgrowth in molluscan organ and cell cultures: the role of conditioning factor (s). // The J. of Neuros. 1981. Vol. 1(9,). P. 1008-1021

142. Wowk B., Leitl E., Rasch C.M. Vitrification enhancement by synthetic ice blocking agents. // Cryobiology. 2000. Vol. 40. P. 228-236

143. Yavin S., Arav A. Measurement of essential physical properties of vitrification solutions. // Theriogenology. 2007. Vol. 67. P. 81-89

144. Yoshimoto Y., Date I., Ohmoto T. Improved cryopreservative medium suitable for the freeze-storage and transplantation of fetal neural tissues. // Res. Neurol. Neurosci. 1993. Vol. 6. P. 73-81

145. Younis A.I., Rooks B., Khan S., Gould K.G. The effects of antifreeze peptide III (AFP) and insulin transferrin selenium (ITS) on cryopreservation of chimpanzee {Pan troglodytes) spermatozoa. // J. of Andrology. 1998. Vol. 19(2). P. 207-214

146. Zachariassen K.E. Physiology of cold tolerance in insects. // Physiological Reviews. 1985. Vol. 65. P. 799-832

147. СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ1. ДМСО диметилсульфоксид1. ЭГ этиленгликоль1. ФА формамид1. НС нервная система

148. НСК нервные стволовые клетки

149. НПК нервные прогениторные клетки

150. Л/П БГ левый и правый буккальные ганглии

151. Л/П ЦеГ правый и левый церебральные ганглии

152. Л/П ПеГ левый и правый педальные ганглии

153. Л/П ПлГ левый и правый плевральные ганглии

154. Л/П ПаГ левый и правый париетальные ганглии

155. ВГ непарный висцеральный ганглий1. МП мембранный потенциал1. ПД потенциал действия

156. ВПСП возбуждающий постсинаптиеский потенциал ТПСП - тормозной постсинаптический потенциал МКЧЛ - микрочастица льда

157. КСНП культуральная среда для нейронов прудовика Ь-15 - среда для культивирования (ЬеШохуИг) Т8КУ - пептид ТЪг-Бег-Ьуз-Туг

158. Л/П Б1, Б2, БЗ, Б4, Б4кл -буккальный первый, второй, третий, четвёртый и кластерные нейроны в области Б4 нейрона в левом или правом буккальных ганглиях

159. ВД1, ВД4 висцеральный дорзальный первый и четвёртый нейроны в висцеральном ганглии

160. Л/П ПеД1 -педальный дорзальный первый нейрон в левом или правом педальном ганглии

161. Л/П ЦеЦ1 -церебральный первый нейрон в левом или правом церебральном ганглии

162. Л/П ПеАкл нейроны А-кластера в левом или правом педальном ганглии ВАкл - нейроны А-кластера в висцеральном ганглии.

163. Низкий поклон Марине Александровне Костенко, которая открыла для меня удивительный и красивый мир нейрона в культуре in vitro. За поддержку на начальном этапе исследований благодарю Владимира Николаевича Казаченко.