Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Логвина, Наталия Александровна

• Логвина, Наталия Александровна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Логвина, Наталия Александровна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор Литературы. Взаимодействие белков с в-квадруплексами.

2.1. в-квадруплексы.

2.2. Белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами.

2.3. Теломерные и теломер-ассоциированные белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами.

2.3.1. Белки ТЕВР и их структурные гомологи.

2.3.2. Репликативный белок А ^РА).

2.3.3. Белки, взаимодействующие с двухцепочечной теломерной ДНК - Иар1 и ТКР2.

2.3.4. Белки комплекса М1*Х.

2.3.5. Хеликазы.

2.3.6. Белок ЕбП.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3»

На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры - теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Недорепликация концов хромосом при каждом клеточном делении приводит к укорочению теломер, в результате которого клетка перестаёт делиться, входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, например в раковых, стволовых и эмбриональных клетках млекопитающих, а также в одноклеточных эукариотических организмах существует механизм поддержания стабильности длины теломер с помощью достраивания теломерных повторов ферментом теломеразой. Изучение работы и регуляции теломеразного комплекса вызывает большой интерес во всем мире, так как открывает возможности для лечения онкологических заболеваний путём восстановления контроля числа клеточных делений в раковых клетках. Работы по созданию противоопухолевых препаратов, ингибирующих теломеразную активность, в частности, за счёт стабилизации квадруплексов на теломерных повторах, ведутся уже много лет. Очевидно, что для дальнейшего развития этого направления необходимо детальное понимание не только механизма работы теломеразного комплекса, но и особенностей взаимодействия теломерных квадруплексов с теломеразой как in vivo, так и in vitro.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, являясь одноклеточными эукариотами и одновременно одним из наиболее изученных организмов, в геном которого легко вносить необходимые изменения, представляют собой удобную модельную систему для изучения теломеразного комплекса. В теломеразный комплекс дрожжей входят 4 незаменимых in vivo компонента: теломеразная обратная транскриптаза Est2, теломеразная РНК tlcl и два регуляторных белка - Est3 и Estl. Est3 является наименее изученным компонентом теломеразного комплекса, его структура и функция остаются неизвестными. Только в последние несколько лет стали известны некоторые его биохимические свойства, в частности, ГТФазная активность и способность к димеризации, взаимодействие Est3 с теломерными олигонуклеотидами, однако основная функция белка Est3 до сих пор не ясна.

Основой для данной работы стала гипотеза о взаимодействии белка Est3 с ДНК-квадруплексами на концах теломер и необходимости этого взаимодействия для регуляции теломеразной активности в дрожжах. На сегодняшний день известно несколько белков, входящих в теломеразный комплекс других организмов, и взаимодействующих с квадруплексами. Например, структурный гомолог Est3 - ТЕВР(3 простейших - в паре с ТЕВРа способствует формированию G-квадруплексов in vivo. В то же время, другой структурный гомолог Est3 - ТРР1 человека - образует димер Potl/TPPl, который расплетает ДНК-квадруплексы и является фактором процессивности для теломеразы человека. Последние данные свидетельствуют, что для привлечения Est3 на теломеры необходимо взаимодействие с другим незаменимым /л vivo белком теломеразного комплекса - Estl. Кроме того, недавно было показано, белок Estl способен формировать ДНК-квадруплексы. Подтверждение предполагаемого взаимодействия Est3 с ДНК квадруплексами будет означать, что регуляция теломеразной активности за счёт формирования квадруплексов является консервативным механизмом.

Целью работы являлась проверка гипотезы о взаимодействии Est3 с ДНК-квадруплексами, поиск возможной роли этого взаимодействия в функционировании теломеразного комплекса дрожжей 5. cerevisiae, и определение связи с ГТФазной активностью и димеризацией белка Est3 S.cerevisiae.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Логвина, Наталия Александровна

5. Выводы

1. Белок Est3 специфично взаимодействует с ДНК- и РНК-квадруплексами in vitro.

2. Узнавание различных квадруплексов белком Est3 основано на взаимодействии с петлёй в составе ДНК-квадруплекса.

3. ДНК-квадруплекс ингибирует гидролиз ГТФ белком Est3.

4. ГТФазная активность белка Est3 коррелирует с димеризацией молекул белка.

5. Димеризация белка Est3 стимулируется присутствием ионов магния.

3.6. Заключение.

Таким образом, в представленной работе впервые показано, что белок Est3 способен взаимодействовать с ДНК- и РНК-квадруплексами, образованными теломерными повторами. Получены и охарактеризованы белки Est3 S.cerevisiae с заменами аминокислотных остатков, подтверждающими важность взаимодействия белка Est3 с ДНКквадруплексами для работы теломеразного комплекса in vivo. Показана специфичность взаимодействия с межмолекулярными квадруплексами, определены константы диссоциации с различными типами квадруплексов. Обнаружено, что в узнавании и связывании ДНК-квадруплексов белком Est3 важную роль играет не только структура квадруплекса, но и нуклеотидная последовательность между гуаниновыми трактами, образующими G-квартеты. Установлено, что Est3 взаимодействует с квадруплексами преимущественно в виде димера. Однако количество трактов G-квартетов, как и наличие и структура петель между ними могут изменять кооперативность образования комплекса.

Достаточно странным является отсутствие взаимосвязи между гидролизом ГТФ и взаимодействием белка Est3 с теломерной ДНК. Обычно гидролиз ГТФ приводит к изменению конформации белка, которое, в свою очередь, вызывает изменение его свойств. Однако не стоит забывать, что белок Est3 взаимодействует и с другими компонентами теломеразного комплекса. Гидролиз ГТФ может регулировать взаимодействие с одним из этих компонентов, например обратной транскриптазой Est2 или квадруплекс-формирующим белком Estl. Ранее уже высказывалось предположение, что активация белком Estl удлинения теломер может быть следствием его взаимодействия с Est3 [284]. Действительно, взаимодействие Est3 с теломеразным комплексом на теломерах регулируется в течение клеточного цикла и зависит от Estl[284], Поскольку Estl формирует ДНК-квадруплексы, взаимодействие с ними белка Est3 может дополнительно стабилизировать теломеразный комплекс, а гидролиз ГТФ участвовать в активации удлинения теломер обратной транскриптазой Est2.

Достаточно интересным также представляется сравнение белков Est3 в S.cerevisiae с ТЕВРР в S.lemnae и ТРР1 человека. Из результатов представленной работы очевидно, что способность ТЕВРр формировать теломерные ДНК-квадруплексы в процессе эволюции была отделена от функции, выполняемой консервативным для ТЕВР(3, ТРР1 и Est3 OB-fold доменном. Можно предположить, что в S.cerevisiae эту функцию /л vivo выполняет белок Estl. Наличие взаимодействия между Estl и Est3 в сочетании со способностью Est3 образовывать комплексы с теломерными квадруплексами предполагает тем не менее наличие тесной взаимосвязи между формированием квадруплексов и основной функцией OB-fold домена белка Est3. Также можно утверждать, что Est3 является одиним из звеньев консервативного механизма регуляции стабильности и длины теломер с помощью образования квадруплексов. Роль ТЕВРа, партнёра TEBPß, по всей видимости, выполняют Cdcl3 в S.cerevisiae и Potl в делящихся дрожжах, M.musculus и H.sapiens.

Неизвестной пока остаётся роль взаимодействия Est3 с теломерными РНК-квадруплексами. Однако то, что нарушение этого взаимодействия в белке Est3D164A приводит к проявлению сенессенс фенотипа, предполагает его важность для регуляции теломеразной активности в клетке. Теломерные РНК-повторы представлены в клетке в виде недавно обнаруженной РНК - TERRA. Роль TERRA в регуляции теломеразной активности пока не выяснена, и взаимодействие с ней абсолютного необходимого in vivo компонента теломеразного комплекса Est3 является весьма интригующим.

4. Материалы и методы

4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы,

В работе были использованы следующие реактивы и препараты:

-NaCI, NaOAc, Na2HP04, КН2Р04, KCl, KOAc, MgCI2, Mg(OAc)2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, НЗВОЗ, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, имидазол, глицерин фирмы Merk, Германия

-Доде ци л сульфат натрия, акриламид, 1\1,1\1'-метиленбисакриамид, ТЕМЕД, Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия

-уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, ацетон, фирмы Химмед, Россия

-водонасыщенный фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германия -этанол фирмы Ферейн, Россия

-азотистые основания: аденин, урацил; аминокислоты: лейцин, триптофан, гистидин, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин; сахара: глюкоза, галактоза, арабиноза, сахароза, стеклянные шарики диаметром, 425-600 микрон, LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ДНК спермы лосося, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол, ампициллин, генетицин, протеиназа К, РНКаза А фирмы Sigma, Германия

-полиэтиленгликоль 6000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия

-бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, YNB (Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids), мочевина фирмы Difco, США

- амициллин, канамицин фирмы Invitrogen, США

-[у-32Р]АТР, фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, США -Zymolyase фирмы Seikagatu, Япония

-Ni-сефароза (Ni Sepharose High Performance) фирмы GE Healthcare, США

-голубой декстран, БСА, овальбумин, химотрипсиноген А, цитохром С фирмы Invitrogen, США

-Т4 ДНК-лигаза, Т4 ДНК-полимераза, Taq-полимераза, эндонуклеазы рестрикции фирмы MBI Fermentas, Литва

-олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол, Россия и фирмой Sigma, Великобритания

-набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Fermentas мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, Amersham-Pharmacia Biotech, США

- набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Германия

- секвеназа 2.0 фирмы USB Corporation, США

-первичные антитела кролика против белков Est3 и HSP 70/80, вторичные антитела козы против постоянной части антител кролика, коньюгированные с пероксидазой фирмы Promega, США

- фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta

-плазмиды pE3N3 и pET30a-Tev6His-S-EST3 были любезно предоставлены Шараповым Ю.С. -штамм DBY-746 а был любезно предоставлен М.Д. Тер-Аванесяном (Москва) Таблица 10. Растворы, использовавшиеся в работе.

LB 1% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl (1.5% бакто-агар для твердой среды)

Буфер А 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 1% Triton Х-100

Буфер Б-100 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 100 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин

Буфер Б-20 50 мМ Tris-HCI pH 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 20 мМ имидазол

Буфер Б-40 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 40 мМ имидазол

Буфер Б-60 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 60 мМ имидазол

Буфер Б-300 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 300 мМ имидазол

LA 0,1% ксиленцианол, ОД % бромфеноловый синий, 0,5% SDS, 0,1 М ЭДТА рН 8,0, 50% глицерин

ТВ 2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 8,55 мМ NaCI, 2,5 мМ KCI, 0,5 мМ MgCI2 lxPBS 140 мМ NaCI, 2.7 мМ KCI, 10 мМ Na2HP04, 1.8 мМ КН2Р04, рН 7.3 ни (200 мМ трис(гидроксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 8 М мочевина, 5%ный додецилсульфат натрия, 1.5%ный 1.4дитио01.треитол, рН 6.8)

SB 62,5 мМ Tris-HCI рН 6,8, 10% глицерин, 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 0,1 % бромфеноловый синий

TGS 25 мМ Tris-HCI рН 8,3, 250 мМ глицин, 0,1% SDS

TGB 25 мМ Tris-HCI рН 8,3, 250 мМ глицин, 0,1% SDS, 20% Этанол

БСА-ТБСТ 20 мМ Tris-HCI рН 7,6, 150 мМ NaCI, 0,1% Tween 20, 5% БСА

Буфер Б100-1 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 1% глицерин

ТБСТ 20 мМ Tris-HCI рН 7,6,150 мМ NaCI, 0,1% Tween 20

Раствор М 1,18% (NH4)6Mo7024*4H20, 0,07% малахитовый зеленый, 4н H2S04

1хТВ ОД М Tris, ОД М Н3ВО3, рН 8,3 lxTE 10 мМ Tris-HCI рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

STOP 1М TrisCI (рН 7,5), 1М (3-меркаптоэтанол, ОД М ЭДТА

Sc-His 0,67% YNB, 2% глюкоза, 0,01% аденин, 0,02% урацил, 0,01% лейцин, 0,01% триптофан, 0,02% треонин, 0,002% аргинин, 0,003% изолейцин, 0,003% лизин, 0,002% метионин, 0,005% фенилаланин, 0,003% тирозин, 0,015% валин (2% бакто-агар для твердой среды, 250 мкл 2М NaOH на 200 мл твёрдой среды).

YPD 2% бакто-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза (2% бакто-агар для твердой среды)

Sc 0,67% YNB, 2% глюкоза, 0,01% аденин, 0,02% урацил, 0,01% лейцин, 0,01% триптофан, 0,005% гистидин, 0,02% треонин, 0,002% аргинин, 0,003% изолейцин, 0,003% лизин, 0,002% метионин, 0,005% фенилаланин, 0,003% тирозин, 0,015% валин (2% бакто-агар для твердой среды, 250 мкл 2М NaOH на 200 мл твердой среды).

LiCI Трис-HCI, рН 8.1 ЮтМ, LiCl 250тМ, NP40 1%, ЭДТА 1тМ

Lysis Трис-HCI, рН 8.1 50mM, SDS 1%, ЭДТА ЮтМ, коктейль ингибиторов протеаз

TES 10 мМ Tris-HCI рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1% SDS

RllOEFwd GAAAGGACTCATAATTGCGAGATCACATCTGAGACGACC

RllOERev GGTCGTCTCAGATGTGATCTCGCAATTATGAGTCCTTTC

D164AFwd ACCAGGCC ACGATATTTGCTATTGATCAA GTCGGATCG

D164ARev CGATCCGACTTGATCAATAGCAAATATCGTGGCCTGGT

BDH2-1 G CCTTAG CGTATTTCGGTAAAG

BDH2-2 GTACTTTGTAGCAGTGAGATTCGTT

Yal069-2 ATATGG TG G GTAG AAG AA ACG С ATT

Tel01L-5 ACACCCACACACCCACAC

Up-fwd GTGAGTACTAGTCGACGGATGA

H3-fwd CTTGGGGAAGCTACATCGTCATC

H3-rev GATGACGATGTAGCTTAACAAG

E3-Fwd CTGAGTATGTTGGCTTTGAATGAG

E3-rev CTCATTCAACGACAACAGACTCAG

Down-rev CTGTCTTTGGACTGAGTGCAG

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Логвина, Наталия Александровна, 2012 год

1. Watson, J. D., and Crick, F. H., Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. // Nature, 1953,171, 737-738.

2. Fry, M., Tetraplex DNA and its interacting proteins. // Front Biosci, 2007,12, 4336-4351.

3. Davis, J. T., G-Quartets 40 Years Later: From 5'-GMP to Molecular Biology and Supramolecular Chemistry. // Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 2004, 668 698.

4. Oxford, G. S., and Gillespie, R. G., Evolution and ecology of spider coloration. // Annu Rev Entomol, 1998, 43, 619-643.

5. Yafe, A., Etzioni, S., Weisman-Shomer, P., and Fry, M., Formation and properties of hairpin and tetraplex structures of guanine-rich regulatory sequences of muscle-specific genes. // Nucleic Acids Res, 2005, 33, 2887-2900.

6. Xu, Y., and Sugiyama, H., Formation of the G-quadruplex and ¡-motif structures in retinoblastoma susceptibility genes (Rb). // Nucleic Acids Res, 2006, 34, 949-954.

7. Dexheimer, T. S., Sun, D., and Hurley, L. H., Deconvoluting the structural and drug-recognition complexity of the G-quadruplex-forming region upstream of the bcl-2 PI promoter. // J Am Chem Soc, 2006, 128, 54045415.

8. Hammond-Kosack, M. C., and Docherty, K., A consensus repeat sequence from the human insulin gene linked polymorphic region adopts multiple quadriplex DNA structures in vitro. // FEBS Lett, 1992, 301, 79-82.

9. Woodford, K. J., Howell, R. M., and Usdin, K., A novel K(+)-dependent DNA synthesis arrest site in a commonly occurring sequence motif in eukaryotes. // J Biol Chem, 1994, 269, 27029-27035.

10. Zahler A.M., W. J. R., Cech T.R. and Prescott D.M., Inhibition oftelomerase by G-quartet DNA structures. // Nature, 1991, 350, 718-720.

11. Oganesian, L., Moon, I. K., Bryan, T. M., and Jarstfer, M. B., Extension of G-quadruplex DNA by ciliate telomerase. // EMBO J, 2006, 25,1148-1159.

12. Oganesian, L., Graham, M. E., Robinson, P. J., and Bryan, T. M., Telomerase recognizes G-quadruplex and linear DNA as distinct substrates. // Biochemistry, 2007, 46,11279-11290.

13. Chang, C. C., Kuo, I. C., Ling, I. F., Chen, C. T., Chen, H. C., Lou, P. J., Lin, J. J., and Chang, T. C., Detection of quadruplex DNA structures in human telomeres by a fluorescent carbazole derivative. // Anal Chem, 2004, 76, 4490-4494.

14. Chang, T.-C., and Chang, C.-C., Detection of G-Quadruplexes in Cells and Investigation of G-Quadruplex Structure ofd(T2AG3)4 in K+ Solution by a Carbazole Derivative: BMVC. //, 2010, 608,183-206.

15. Feuerhahn, S., Iglesias, N., Panza, A., Porro, A., and Lingner, J., TERRA biogenesis, turnover and implications for function. U FEBS Lett, 2010, 584, 3812-3818.

16. Uliel, L., Weisman-Shomer, P., Oren-Jazan, H., Newcomb, T., Loeb, L. A., and Fry, M., Human Ku antigen tightly binds and stabilizes a tetrahelical form of the Fragile X syndrome d(CGG)n expanded sequence. // J Biol Chem, 2000, 275, 33134-33141.

17. Plyler, J., Jasheway, K., Tuesuwan, B., Karr, J., Brennan, J. S., Kerwin, S. M., and David, W. M., Real-time investigation of SV40 large T-antigen helicase activity using surface plasmon resonance. // Cell Biochem Biophys, 2009, 53, 43-52.

18. Wu, Y., Sommers, J. A., Khan, I., de Winter, J. P., and Brosh, R. M., Jr., Biochemical characterization of warsaw breakage syndrome helicase. // J Biol Chem, 2012, 287,1007-1021.22