Формирование резистентности у вируса простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Гуськова, Анна Алексеевна

• Гуськова, Анна Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гуськова, Анна Алексеевна

тип1

2.1.2. .Тимидинкиназа ВПГ-1

2.1.2.1. Доноры фосфора

2.1.2.2. Акцепторы фосфора. Противогерпетические препараты

2.1.2.3. Механизм действия тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1

2.1.2.4. Структура активного центра тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1

2.1.3. ДНК-полимеразаВПГ-1

2.2. Исследование мутантных генотипов штаммов ВПГ-1, резистентных к антигерпетическим препаратам

3. Экспериментальная часть

3.1.Обоснование работы и поставленные задачи

3.2. Материалы и методы

3.2.1.Материалы и оборудование

3.2.1. Методы

3.3. Результаты и обсуждение

3.3.1. Изучение генов UL23 и UL 30 ВПГ-1 штаммов L2 и L2/R

3.3.1.1. Выделение и характеристика тимидинкиназы ВПГ-1 эталонного штамма L2

3.3.1.2. Изучение структуры генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 штаммов L2 и L2/R

3.3.1.3. Установление ферментативной активности тимидинкиназы штамма L2/R

3.3.2. Изучение генов Ш23 и ШЗО ВПГ-1 штаммов, резистентных к Н-

фосфонату ацикловира

3.3.2.1. Анализ теиаШ23 (тимидинкиназы)

3.3.2.2. Анализ гена ШЗО (ДНК-полимеразы)

4. Общее заключение

4.1. Анализ связи между структурой генов ТК и ДНК-полимеразы и резистентностью к АСУ и НрАСУ

5. Выводы

6. Список литературы

7. Список сокращений

8. Благодарности

9. Приложение 1

10. Приложение 2

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование резистентности у вируса простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира»

1. Введение

Одним из самых распространенных патогенов человека является вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1). По данным всемирной организации здравоохранения носителями данного вируса являются 95% населения Земли. У большинства инфицированных людей данное заболевание протекает в виде везикулярных высыпаний на слизистых оболочках. Однако при иммунодефицитом состоянии пациента, которое может быть вызвано ВИЧ-инфекцией или процедурами, необходимыми при пересадке органов, ВПГ-1 часто приводит к летальному исходу. ВПГ-1, попадая внутрь организма, остаётся там пожизненно. В настоящий момент не разработано лекарственных средств, которые полностью уничтожали бы ВПГ-1. За последние полвека было предложено много антигерпетических средств различной природы, однако, наибольшее распространение получили модифицированные нуклеозиды, в том числе ациклические нуклеозидные аналоги (ацикловир, ганцикловир и др.), некоторые из них вошли в широкую медицинскую практику для терапии герпетических инфекций.

Механизм действия таких нуклеозидных препаратов хорошо известен. Сначала при помощи вирусного фермента - тимидинкиназы - осуществляется фосфорилирование нуклеозида до нуклеозид-5'-монофосфата, затем происходят два последовательных фосфорилирования с использованием ферментов клетки-хозяина до соответствующего трифосфатного производного нуклеозида. На следующем этапе, полученный модифицированный нуклеотид включается вирусспецифической ДНК-полимеразой во вновь синтезируемую цепь ДНК, что приводит к терминации биосинтеза вирусной ДНК.

Однако длительное применение нуклеозидных антигерпетических препаратов приводит к появлению штаммов ВПГ-1, устойчивых к действию этих соединений. Резистентность ВПГ-1 к нуклеозидным препаратам обусловлена одним из следующих факторов или их сочетанием: (а) полной потерей активности, изменением субстратной специфичности или понижением

экспрессии вирусной тимидинкиназы, (б) понижением активности или изменением субстратной специфичности вирусной ДНК-полимеразы. Появление таких резистентных к антигерпетическим препаратам штаммов ВПГ-1 вынуждает вести поиск новых лекарственных препаратов. Данная работа является частью этого исследовательского направления.

2. Литературный обзор

2.1. Вирус герпеса простого тип 1.

Самыми распространенными возбудителями инфекционных заболеваний являются вирусы семейства герпеса. Наиболее часто заболевания вызывают следующие вирусы: вирус простого герпеса I и II типов, вирус ветряной оспы (или герпес варицелла-зостер), вирус Эпштейна-Барр (или вирус инфекционного мононуклеоза), цитомегаловирус (ЦМВ), вирус герпеса 6-го типа и др.

Вирус герпеса человека (вирус простого герпеса) тип 1 (ВПГ-1) является самым распространенным возбудителем герпетических инфекционных заболеваний. Попадая в организм, вирус остается там пожизненно. В состоянии покоя вирус находится в отростках нейронов спинного мозга, но при развитии острой фазы заболевания данный вирус вызывает поражения слизистой оболочки полости рта, глаз и кожи и реже поражение гениталий в виде везикулярных высыпаний. Однако при иммунодефицитом состоянии пациента ситуация может резко ухудшаться и приводить к летальному исходу. Кроме того, показано, что ВПГ-1 и ВПГ-2 могут быть причиной редких, но серьезных заболеваний, таких как энцефалит или обширная неонатальная инфекция [1].

В настоящее время не найдено лекарственное средство полностью уничтожающее данный вирус. Используемые в медицинской практике антигерпетические препараты направлены на снятие острой фазы заболевания. На сегодняшний день используется несколько химических веществ для лечения герпетических инфекций [2]. Большинство из них является нуклеозидными аналогами, и их действие основывается на разнице субстратной специфичности вирусных ферментов: тимидинкиназы и ДНК-полимеразы, и ферментов клетки-хозяина [3;4].

2.1.1. Характеристика ферментов вируса герпеса простого тип 1.

ВПГ-1 содержит двухцепочечную ДНК, и его геном составляет 153 кб, в которой GC состав 68%. [5]. На сегодняшний день аннотировано 77 кодирующих областей генома ВПГ-1. Данные кодирующие области с обеих сторон фланкированы длинными терминальными повторами (9,2 и 6,6 кб). Кроме концевых повторов, в геноме вируса имеются малые микросателлитные повторы (<100 н.п.) и короткие тандемные повторы (<500 н.п.), а также встречается класс повторов VNTR [5, 6, 7].

На сегодняшний день одними из наиболее изученных генов ВПГ-1 являются гены UL23 и UL30, кодирующие тимидинкиназу и ДНК-полимеразу, соответственно. Интерес к данным генам объясним, поскольку наличие мутаций именно в этих генах приводит к возникновению резистентности штаммов ВПГ-1 к антигерпетическим препаратам.

2.1.2. Тимидинкиназа ВПГ-1.

Первое упоминание о тимидинкиназной активности ВПГ-1 было сделано в 1963 году. В этой работе было показано, что клетки, исходно дефицитные по тимидинкиназе, после инфицирования вирусом герпеса, восстанавливали способность утилизировать тимидин-НЗ (Kit S. 1963). Нуклеотидная последовательность гена тимидинкиназы ВПГ-1 была определена в 1980 году методом Максама-Гилберта [8]. Было установлено, что ген тимидинкиназы содержит открытою рамку считывания, содержащую 376 кодонов. Тремя годами позже Вальдманн установил, что тимидинкиназа вируса имеет субъединицу массой 42 кД и может образовывать димерную структуру. Этот факт он подтвердил при помощи гельфильтрации на Sephadex G100 и центрифугированием в градиенте глицерина [9]. Исследование значимости димерной структуры тимидинкиназы in vitro показало, что диссоциация димера на мономеры не влияет на полную вторичную и третичную структуры фермента [10].

Первые исследования тимидинкиназы ВПГ-1 проводились в основном на зараженных клетках Vero. Надо отметить, что основные кинетические характеристики фермента и его физико-химические свойства исследовались на клеточных лизатах или частично очищенных белковых фракциях. В ходе развития методов молекулярной биологии и биоинженерии, были использованы новые подходы к получению герпесвирусной тимидинкиназы: клонирование гена в экспрессионном векторе, наработка рекомбинантного белка в E.coli и его выделение из E.coli или инфицированных эукариотических клеток с помощью аффинной хромотографии. Благодаря разработке этих методов в сочетании с использованием сайт-направленного мутагенеза, возникла возможность наработки значительного количества чистого фермента, достаточного для изучения его физико-химических и энзимологических свойств, а также проведения рентгеноструктурного анализа. Однако не было проведено повторное полное исследование биохимических свойств очищенного фермента. До сих пор в литературе ученые цитируют часто противоречивые и не всегда достоверные данные, полученные на ранних этапах изучения тимидинкиназы вируса герпеса.

В 1978 году впервые в литературе встречается упоминание о том, что тимидинкиназа ВПГ-1 обладает второй ферментативной активностью. Так Чен и его сотрудники установили, что этот фермент является мультифункциональным, поскольку проявляет помимо тимидинкиназной активности еще и тимидилаткиназную активность, т.е. тимидинкиназа может фосфорилировать как тимидин, так и тимидинмонофосфат [И]. Эти две активности, не удалось разделить ни путем изоэлектрической фокусировки, ни при помощи аффинной хроматографии или центрифугирования в градиенте глицерина. Различие было отмечено только в инактивации фермента при его инкубации при 37°С, тимидинкиназная активность оказалась более лабильной, по сравнению с тимидилаткиназной активностью. Факт наличия второй активности был подтвержден и другими работами [12]. Следует подчеркнуть, что тимидинкиназная и тимидилаткиназная реакции различны между собой по

термодинамическим характеристикам и аналогов подобных ферментов пока более не обнаружено. На сегодняшний день достаточно подробно изучен механизм фосфорилирования тимидина, но каким образом происходит фосфорилирование тимидинмонофосфата до сих пор не известно.

2.1.2.1. Доноры фосфора.

Ещё в ранних исследованиях тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1 было показано, что данный фермент может использовать в качестве доноров фосфора не только АТР, но и GTP, UTP и СТР [13]. Исключением является ТТР, который ингибирует работу тимидинкиназы вируса на 50%, если его количество аналогично количеству присутствующего тимидина. Этими свойствами тимидинкиназа вируса герпеса похожа на митохондриальные тимидинкиназы человека и мыши [14].

Константа Михаэлиса тимидинкиназы вируса для АТР составляет порядка ЗОцМ. Необходимо отметить, что в разных статьях можно встретить различные значения констант Михаэлиса для данного фермента. Это объясняется тем, что вирус герпеса простого имеет большую вариабельность, и даже немутантные штаммы, которые в литературе описаны как дикий тип, имеют различия. Поэтому тимидинкиназы, полученные из разных штаммов, имеют различные кинетические характеристики. Так, константа Михаэлиса для АТФ может иметь значения от ЗОцМ до 118|iM.

Самым эффективным донором фосфора являются АТР и dATP. За тем идет по убывающей эффективности: СТР, dCTP, UTP, dUTP, GTP, dGTP.

2.1.2.2. Акцепторы фосфора. Противогерпетические препараты.

Как уже упоминалось выше, тимидинкиназа вируса герпеса простого тип 1 может фосфорилировать достаточно широкий спектр соединений. Акцепторами фосфора могут являться как природные соединения, так и их синтетические аналоги.

Природными акцепторами фосфора помимо тимидина и тимидинмонофосфата являются дезоксицитидин и дезоксиуридин [15]. Была определена константа Михаэлиса для дезоксицитидина, которая составила 5цМ.

Вследствие того, что вирус герпеса простого тип 1 является инфекционным возбудителем, достаточно много работ было проведено с целью поиска лекарственных противогерпетических препаратов. На сегодняшний день существует огромное множество разнообразных синтетических соединений, подавляющих размножение вируса в клетках хозяина. Но далеко не все из этих соединений вошли в повседневную медицинскую практику.

ню„

о

« А

*1 ш

N

J

«

Г '

X,

но

на'

0

1

кг Ч

ИСКУ

о

соон

Рис. 1. Структурные формулы соединений: а - ацикловир (АСУ); б -пенцикловир; в - сидофовир; г - ганцикловир (ОСУ); д - фоскарнет.

Как уже упоминалось выше, действие противогерпетических препаратов (рис.1) основывается на разнице в сродстве тимидинкиназы и ДНК-полимеразы вируса и клетки-хозяина к этим противогерпетическим средствам. Одними из наиболее распространенных препаратов являются следующие соединения: ацикловир, пенцикловир, ганцикловир, сидофовир (рис.1). Де-Клерком были подробно изучены механизмы действия данных соединений [16]. Несмотря на большое разнообразие противогерпетических препаратов, ацикловир является одним из самых эффективных и распространенных лекарственных средств.

Механизм действия ациклических нуклеозидных аналогов был впервые изучен

на примере ацикловира.

Ацикловир, 9-(2-гидроксиэтоксиметил) гуанин, представляет собой ациклический аналог гуанозина. На первой стадии метаболического пути происходит фосфорилирование ацикловира, с образованием монофосфата ацикловира при помощи тимидинкиназы вируса герпеса. Данный факт подтверждался тем, что способность фосфорилировать и тимидин, и ацикловир теряется в мутантных штаммах вируса герпеса простого тип 1, дефицитных по тимидинкиназе. Также на это указывает совместная миграция обоих ферментативных активностей при электрофорезе в полиакриламидном геле, и их совместная очистка при помощи аффинной хроматографии, разделяющей вирусную и клеточную тимидинкиназы [17]. Надо заметить, что при изучении субстратной специфичности тимидинкиназ вируса и клетки было показано существенно большее сродство ацикловира и его аналогов (ганцикловира и пенцикловира) к вирусной тимидинкиназе, чем к клеточной.

Вторая и третья стадии заключаются в образовании сначала дифосфата, а затем и трифосфата ацикловира. Эти этапы фосфорилирования осуществляют клеточные ферменты: ОМР-киназа и нуклеозид-дифосфат киназа [18, 19]

Трифосфат ацикловира избирательно узнается только вирусной ДНК-полимеразой и встраивается в цепь. Поскольку у трифосфата ацикловира отсутствует гидроксил в 3'-положении, то дальнейшая элонгация цепи невозможна [20]. Необходимо также отметить, что и 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы ВПГ-1 не может удалить терминальный 3'-АСУ-монофосфатный остаток, следовательно, происходит терминация репликации ДНК вируса. [21, 22].

Позднее было показано, что пенцикловир и ганцикловир действуют аналогичным образом, но являются более токсичными для клетки, чем ацикловир, поскольку их фосфорилированные производные обладают большим сродством к клеточной ДНК-полимеразе, чем фосфорилированный ацикловир.

Их противогерпетическое действие менее эффективно, и в клинической практике они применяются реже.

В неинфицированных вирусом герпеса клетках все описанные реакции фосфорилирования ацикловира происходят в очень незначительном объеме [23].

Другое соединение - сидофовир (рис.7) является с химической точки зрения С-фосфонатом и аналогом 5'-dCMP. Следовательно, фосфорилирование до монофосфата ему не требуется. То есть стадия с участием тимидинкиназы вируса в данном случае пропускается. Сидофовир сразу фосфорилируется клеточными ферментами до фосфанат-дифосфата (аналог dCTP), узнается только ДНК-полимеразой вируса, встраивается в растущую цепь, терминируя тем самым процесс репликации. Поэтому резистентность к данному препарату возникает только за счет мутаций в гене ДНК-полимеразы вируса (UL30) [24].

Помимо общеизвестного ацикловира и его аналогов, было показано, что репликация геномной ДНК вируса герпеса заметно ингибируется в клетках широким спектром пиримидновых, дезоксирибо- и арабинонуклеозидов [25]. Как было показано в работе Асвелла, механизм ингибирования репликации при помощи данных соединений основывается также на разнице в субстратной специфичности тимидинкиназы вируса герпеса и тимидинкиназы клетки-хозяина [26].

Были изучены аналоги тимидина, имеющие свободную 5'-ОН группу, такие как: 5-замещенные этил-, винил-, аллил-, пропил-, иодо- и бромо-дезоксиуридин и дезоксицитидин, а также арабинозилтимидин. Все эти соединения обладают противогерпетической активностью, имеют хорошее сродство к тимидинкиназе вируса герпеса, и являются ингибиторами этого фермента.

Другое соединение - 9-(1,3-дигидрокси-2-пропоксиметил) гуанин (DHPG) обладает in vivo большей противогерпетической активностью, чем ацикловир, но в условиях in vitro и ацикловир, и DHPG имеют одинаковую эффективность действия [27]. В другой работе было показано, что тио-производное DHPG имеет

также антивирусную активность по отношению к вирусу герпеса простого тип 1

(Е)-5-(2-бромовинил)-дезоксиуридин (рис.2) и (Е)-5-(2-иодовинил)-дезоксиуридин показали заметное ингибирование вирусного размножения [29]. Соединение бромвинил-дезоксиуридин (ВУТШ), попадая в клетку, взаимодействует с тимидинкиназой вируса, которая фосфорилирует данное соединение до монофосфата. Затем уже клеточные ферменты проводят последовательные фосфорилирования до ди- и трифосфата. Трифосфат бромвинил- дезоксиуридина узнается только ДНК-полимеразой вируса и встраивается в растущую цепь, терминируя тем самым процесс репликации. Все известные на сегодняшний день штаммы, устойчивые к данному соединению, имеют мутации только в гене тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1. Это можно объяснить тем, что ВУОи с химической точки зрения очень похож на тимидин, и если происходит мутация в гене ДНК-полимеразы, меняя специфическое узнавание ВУБИ трифосфата, то и тимидин трифосфат перестает узнаваться данным ферментом. Такой штамм вируса является нежизнеспособным. Таким образом, резистентность к ВУБИ автоматически указывает на то, что в данном штамме имеются мутации в гене тимидинкиназы (■Ш23).

Рис. 2. Структурная формула (Е)-5-(2-бромовинил)-дезоксиуридин

Позднее, обнаружили ингибирующую способность других 5-(2-галогеновинил)-2'-дезоксиуридинов и установили константы ингибирования для данных соединений [15].

В работе Фильда было показано, что существуют соединения, например 9-{[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этокси]метил}гуанин (2'№Х}), которые могут

[28].

н

фосфорилироваться как тимидинкиназой вируса герпеса, так и тимидинкиназой клетки-хозяина [30]. Но противогерпетическая активность таких соединений основывается на том, что их трифосфаты узнаются только ДНК-полимеразой вируса, и не узнаются полимеразами клетки. Так для 2'NDG было показано, что его ингибирующая способность в 30 раз выше, чем у ацикловира.

2.1.2.3. Механизм действия тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1.

При изучении активности тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1

было показано, что фермент испытывает необходимость в двухвалентных

2+

катионах [31]. Наибольшую активность фермент проявляет в присутствии Mg , далее следуют по убыванию следующие катионы: Mn2+' Са2+, Fe2+ , фермент не проявляет активности в присутствии Zn2+, Cu2+. Было установлено, что количество Mg2+ необходимое для наилучшей активности зависит от количества АТР, оптимальная концентрация Mg2+ должна быть сопоставима с концентрацией АТР. Значительный избыток Mg2+ ингибирует реакцию.

Кинетика ферментативной реакции, осуществляемой тимидинкиназой вируса, может быть описана математической моделью Михаэлиса-Ментена. Были определены константы Михаэлиса для тимидина и тимидилата , которые составили 0,8jiM, 25р.М.

При изучении механизма ферментативных реакций высказывались различные предложения. Так, например, существовала гипотеза, о том, что присоединение субстратов (тимидина и ATP*Mg2+ или тимидилата и ATP*Mg ) происходит неупорядочено, тогда как отсоединение продуктов - упорядоченно, при этом первым отсоединяется комплекс ADP*Mg2+ [32]. Были установлены константы диссоциации для комплекса фермент*АТР*1У^2+ и для комплекса фермент*тимидин*АТР*М^2+, которые составили 28|iM и 2,2цМ, соответственно.

Однако, в дальнейших работах при исследовании кинетики реакций, осуществляемых тимидинкиназой вируса герпеса, было показано, что присоединение происходит упорядоченно. Преимущественный порядок

присоединения субстратов следующий: тимидин присоединяется первым, затем уже присоединяется АТР*1У^ [33].

Было исследовано влияние связи фермента с субстратом на его конформационную и структурную стабильности [34]. Результаты работы показали, что свободная тимидинкиназа менее упорядоченная и менее стабильна по сравнению с фермент-субстратным комплексом.

2.1.2.4. Структура активного центра тгшидинкиназы вируса герпеса простого тип 1.

На сегодняшний день существует два основных подхода к изучению структуры ферментов: сайт-направленный мутагенез и рентгеноструктурный анализ. Необходимо отметить, что данные, полученные при использовании этих методов, не являются взаимозаменяющими, а наоборот дополняют друг друга, создавая более полную картину.

Первый подход - изучение структуры ферментов с использованием сайт-направленного мутагенеза. С помощью данного метода можно оценить функциональную значимость изучаемых аминокислотных остатков, находящихся в активном центре фермента.

Второй подход - это использование рентгеноструктурного анализа. На данный момент этот метод стал широко доступен из-за упрощения методики получения очищенных белков, их кристаллических структур и рентгенограмм. Вследствие технического прогресса, появившиеся компьютерные мощности позволяют за короткий срок расшифровать получаемые рентгенограммы высокой сложности. Для сравнения, в 1960 году Уотсону и Крику понадобилось больше года, чтобы расшифровать рентгенограмму двуспирального участка ДНК. Вследствие этого, в последние годы появилось большое количество публикаций, посвященных установлению третичной структуры белка с помощью рентгеноструктурного анализа, в том числе и тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1.

А. Структурно-функциональный анализ гена тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1.

В 1986 году Дабри, путем сравнения нуклеотидных последовательностей кодирующей части гена тимидинкиназы трех мутантных штаммов вируса герпеса и штамма SC16, являющегося диким типом, выявил три отдельных района в гене, ответственных за изменения биохимических свойств фермента

[35]. В дальнейшем по каждому району велись отдельные исследования.

В 1988 году Луи исследовал один из данных трех консервативных районов

[36]. Данный район имел в своем составе родственные последовательности АТР-связывающего сайта многих белков, что давало основание авторам предполагать, что этот участок фермента ответственен за связывание АТР. Луи провел направленный мутагенез пяти аминокислотных остатков внутри этого участка. Данными аминокислотными остатками были три глицина (60-62), лизин (63) и трионин (64). Были произведены следующие замены: лизин 63 на изолейцин, трионин 64 на аланин, один из трех глицинов (позиция 61) на валин. Все полученные мутантные белки теряли свою активность. Но, когда трионин 64 был заменён на близкий по биохимическим свойствам серин, фермент не потерял свою активность, но при этом увеличились константы Михаэлиса для тимидина и ATP (Km=2.3 jiM и 60=р.М, соответственно). Таким образом, было показано, что этот район является весьма важным для функционирования фермента.

В дальнейших работах была представлена модель трехмерной структуры активного центра тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1 [37]. Эта модель была создана при помощи анализа первичных и вторичных структур различных киназ. Исходя из этих данных, было предсказано, что активный центр фермента имеет центральное ядро, состоящее из (3-слоёв, соединенных при помощи изгибов (loops), и а-спиралей. Фосфатсвязывающий сайт состоит из высоко консервативной глицин-богатой петли, расположенной на N-конце белка, и консервативного района на С-конце белка. Сайт распознавания тимидина расположен на 100 аминокислот дальше по цепи от фосфатсвязывающей петли. В нем были выявлены три высококонсервативных аминокислотных остатка, а

именно: Asp 162, His 163 и Argl64. Был проведен сайт-направленный мутагенез этих аминокислотных остатков, в результате которого мутантный фермент терял свою активность [38].

В 1996 году этими же авторами была проведена работа, в которой они показали, что тимидин и тимидилат имеют в активном центре фермента общий, или перекрывающиеся между собой сайты связывания. На этот факт указывают полученные данные, а именно: у мутантного фермента, имеющего аминокислотную замену в 162 позиции, Asp на Gly, константа Михаэлиса для тимидина в 12 раз выше таковой дикого типа, также произошло заметное увеличение константы ингибирования для дезокситимидинмонофосфата, но не произошло никаких изменений в значении константы Михаэлиса для АТР. Эта гипотеза была подтверждена и другими методами. Речтин использовал прямое связывание фотоаффинных нуклеотидных аналогов, протеазы и электрофорез в полиакриламидном геле для анализа структурного взаиморасположения сайтов связывания тимидина и тимидилата в активном центре фермента [39]. Для

32

анализа тимидилатсвязывающего сайта использовался [ Р]5-азидо-дезоксиуридин специфично фотовключаемый в активный центр тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1. Так как последовательность аминокислотных остатков фермента была известна, то, используя трипсин или химотрипсин, была создана карта белков с фотовключением путем разделения их на полиакриламидном геле. Анализ результатов показал, что фотопробы локализованы в одном регионе, включающем в себя аминокислотные остатки 11е112-Туг132. Фотомечение этого участка показало, что тиминовое основание тимидина и тимидилата связываются с одним общим сайтом активном центре тимидинкиназы вируса.

К 1998 году активный центр тимидинкиназы был достаточно подробно изучен. Была выяснена роль отдельных аминокислотных остатков в ферментативной реакции [33]. Так, было показано, что Thr63 важен для связывания Mg2+, А1а168 ограничивает доступное пространство в активном центре и при замене данного аминокислотного остатка на более "крупный",

тимидинкиназа теряет возможность присоединять аналоги нуклеозидов, крупнее, чем её природные субстраты. А^176 важен для электронного баланса внутри активного центра.

Также был проведен сайт-направленный мутагенез аминокислотного остатка 01п125. Мутант, имеющий в данной позиции аминокислотный остаток лейцина, оказался способен фосфорилировать только тимидин, а если там находился остаток аспарагина, то фермент связывал и тимидин, и ацикловир. Но при замене остатка глутаминовой кислоты на глутамин, тимидинкиназа вируса теряла полностью ферментативную активность. В дальнейшем, в работе Хиндса была окончательно определена роль аминокислотного остатка 01п125 [40]. В ходе данной работы были получены три мутантных фермента. Во всех трех случаях был заменен аминокислотный остаток ОЫ25, на аспарагиновую аминокислоту, аспарагин и на глутаминовую аминокислоту, соответственно. По сравнению с диким типом у всех трех мутантов тимидилаткиназная активность уменьшилась более чем на 90%. Тимидинкиназная активность также заметно снизилась. Если константа Михаэлиса фермента для тимидина у дикого типа составляет порядка 0,9цМ, то у полученных мутантных белков она увеличилась до ЗОООцМ в случае замены на аспарагин, до 20р.М в случае замены на аспарагиновую аминокислоту и до ЗцМ в случае замены на глутаминовую аминокислоту.

На основе этих данных был сделан вывод, что аминокислотный остаток глутамина в позиции 125 играет ключевую роль в связывании фермента с нуклеотидом. Однако с этими данными не согласуются результаты, полученные в ходе рентгеноструктурного анализа. Так был получен комплекс мутантного фермента С1п125А8п с тимидином. Было показано, что ни способ связывания тимидина в нуклеотид-связывающем сайте, ни основная конформация фермента практически не изменяются. Исключение составляет только то, что две основные водородные связи тимидина с ферментом были заменены одной водородной связью через молекулу воды, что повысило сродство мутантного фермента к ацикловиру и ганцикловиру по сравнению с природными субстратами.

Были проведены работы, в которых объяснялось, почему же тимидинкиназа вируса герпеса простого тип 1 имеет такой широкий спектр субстратов, с точки зрения структурных особенностей самого фермента. Были получены мутантные белки, способные распознавать только природные субстраты, или наоборот, только синтетические аналоги нуклеотидов. Так в работе Пилджера была исследована триада аминокислотных остатков His58/Met 128/Tyr 172 [41]. Мутация Metl28 на Phe и двойная мутация Metl28 на Phe, Туг 172 на Phe приводили к потере активности фермента. Однако при тройной мутации His58 на Leu, Metí 28 на Phe и Туг 172 на Phe активность восстанавливалась, но данный мутант был ацикловир-резистентным. Путем сайт-направленного мутагенеза Alai 67 на Туг были получены мутанты, у которых полностью отсутствовала тимидилатная активность, но сохранялась активность по отношению к ацикловиру и его аналогам [42].

Были проведены исследования структуры активного центра и на резистентных к ацикловиру штаммах. Так Ретчин сделал фотоаффинное мечение тимидинкиназы вируса герпеса простого тип1 дикого типа и мутантной

32

тимидинкиназы вируса, с подтвержденной ацикловир-резистентностью, [а- Р]5-

32

азидо-2'-дезоксиуридин-5 ' -монофосфатом и [у- Р]8-азидоаденозин-5 -трифосфатом [43]. У данного мутанта была произведена замена Cys336 на Туг. Разница в схемах ингибирования фотовключения такими субстратами, как: тимиин, тимидилат, АСУ, 5-бромовинил-2'-дезоксиуридин и АТР; коррелировала с разницей в кинетике обоих ферментов. Суммарный результат позволил предположить, что ACV-резистентная мутация цистеина 336 затрагивает АТР связывающий сайт. Дальнейшие исследования при помощи компьютерного моделирования показали, что 336 цистеин входит в АТР-связывающий центр. Но в отличии от аминокислотных остатков в позициях с 51 по 63, связывающихся с фосфорными остатками, цистеин 336 координирует адениновое кольцо АТФ.

В некоторых работах высказывались предположения, о том, что аминокислотные остатки 251, 321 и 348 входят в состав АТР-связывающего

сайта. Но в работе Михаэля при помощи сайт-направленного мутагенеза было однозначно показано что, ни один из данных аминокислотных остатков не связывается с субстратом [44].

Исследование показало, что некоторые мутанты имеют более высокое сродство к ацикловиру и его аналогам по сравнению с тимидином. Схематическое изображение структуры тимидинкиназы показано на рисунке 3.

A) I1SV-I ЛЛ

IM

¡51 I1SV-2-АА

Я

Cvst.W,

—+—

-Ci- 4/.у.

»I!JS5 [««¡Г Kl .¿1

7Я» ЙГ«

-ISi-SS Ж-Ь4 SUM» l».'d> KS! W №"fc

4(4

SC» 'ifs

«ft-ta

0t Iii

4CS,

C>st33T

h

\"r

I

SS. 4<»

пя-|- ii-).;: icsi ij;

4SJ-» ¡а-й!

ATP/Site 1

Säte 2

Site}

зга m:< ss. rt» SI*S1 S51-5Ä МЫ*И «1Ы M. >.r-'i' int

SSSiSlf 4

Site?

Sit« 6

R5JW

VMäti-a

ÜSftSfV

PST»

ижг

<559RiV G5»P

•Ü61V Kvl'.N

't6:i,vus

EfSK. j 1 DltiiA .t.WH

QIC1I lÄajp Q1DSI1 AlfiTV

ällOSP

QI2STVT.

ГШЗ

ТШР

Ai да K2i®CS Küffl mm

iciaxi'H

Ä175V 1ШЮ 1СГЧ1

R -AQ l!l~W

C33SV C327Y

LM-H'

<äU*4N Lti№

T243M: S1S2V QlSsR V137M A139V

oäoüc

1*20! I'

StZiü ШШ

! •V-N

Рис.3 Схема расположения консервативных регионов и доменов в гене UL23 ВПГ-1 и ВПГ-2. Показано расположение шести высококонсервативных областей: с 56 по 62 ак. (1 регион), с 83 по 88 ак. (2 регион), с 162 по 164 ак. (3 регион), с 171 по 173 ак. (4 регион), с 216 по 222 ак. (5 регион) и с 284 по 289 ак. (6 регион) для ВПГ-1 и с 56 по 62, с 83 по 88, с 163 по 165, с 172 по 174, с 217 по 223 и с 285 по 290 ак. для ВПГ-2. Известные инсерции (а) и (а/ё)/или делеции (d) в в гомополимерных участках показаны с указанием нуклеотидных координат (Nt). Аминокислотные замеы, обнаруженные в гене UL23 в штаммах, резистентных к антигерпетическим препаратам, приведены внизу. Замены, указанные в рамке попадают в консервативный регион, те что указаны вне рамки не попадают в консервативную область. Подчеркнутые аминокислотные замены были обнаружены у ВПГ-2.

В своей работе Бланк использовали случайный мутагенез для создания мутантной тимидинкиназы более специфичной к аналогам нуклеозидов, таким как ганцикловир и ацикловир [45]. Из 426 активных мутантных ферментов 26 продемонстрировали повышенную чувствительность к ганцикловиру и 54 - к ацикловиру, только 6 мутантных ферментов показали повышенную чувствительность к обоим соединениям.

Б. Исследования структуры фермента при помощи рентгеноструктурного анализа.

Первый кристалл тимидинкиназы вируса был получен в 1995 году в работе Вильда [46]. Надо отметить, что был закристаллизован фермент не целиком, а только его N-конец, но при этом все же сохранялась ферментативная активность. Усеченная тимидинкиназа была закристаллизована в комплексе с тимидином и с АТР. Это подтверждало полученные ранее данные о наличии в структуре тимидинкиназы АТР-связывающего сайта, затрагивающий аминокислоты с 51 по 63, и нуклеозид-связывающего сайта, занимающего позиции с 168 по 176 аминокислоту [35].

Помимо АТР-связывающего и нуклеозид-связывающего сайтов в белке выделяют 6 консервативных регионов, соответствующих позициям 50-66, 79-91, 162-178, 212-226, 281-292 а/к [47]. Рентгеноструктурный анализ подтвердил, что аминокислотные остатки, входящие в состав данных районов, действительно могут играть координирующую роль в прохождении ферментативной реакции.

В работе Брауна были получены кристаллические структуры тимидинкиназы вируса герпеса в комплексе с природным субстратом -дезокситимидином и с ганцикловиром - синтетическим аналогом гуанозина [48]. Было продемонстрировано, что активный центр молекулы имеет структурное сходство с аденилаткиназой и другими нуклеотид-связывающими белками. Браун с соавторами показал, что Ж в своем составе содержит а-спирали (15 штук) и (3-слои (7штук) [48]. Пять параллельно расположенных (3-слоев являются частью активного центра фермента. Активный центр состоит из нуклеозид-

связывающего кармана, DRH мотива (с 162 по 164 ак) и АТР-нуклеотид связывающей петли. АТР-присоединяется в виде комплекса с Mg2+, который координируется остатком аспарагиновой кислоты в 162 позиции. Кроме того, имеется LID-домен (216-222 ак), который содержит в своем составе большое количество остатков аргинина и лизина, формируя тем самым оболочку, закрывающую активный центр.

Для каталитической реакции необходима активация у-фосфата у АТР и 5'-ОН у дезоксирибозы. Позитивно заряженный кластер LID-домена и Mg2+ делают атом фосфора доступным для нуклеофильной атаки 5'-ОН дезоксирибозы, который также является поляризованным за счет действия двух остатков глутаминовых кислот в позиции 225 и 83 [49].

Субстрат, связывающий сайт, состоит в основном из аминокислотных остатков, которые входят в состав параллельных спиралей [50]. Спирали располагаются в N-концевом участке белка и заканчиваются глицин-богатой петлей, которая также взаимодействует с АТР. Высоко консервативный остаток цистейна в 336 кодоне располагается близко к АТР-связывающему и нуклеотид-связывающему сайтам и является координатором взаимодействия этих сайтов.

На основе сопоставления структур активных центров тимидинкиазы и других нуклеотид-связывающих белков были выдвинуты гипотезы о возможном механизме фосфорилирования нуклеозида тимидинкиназой вируса. Так в работе Анны Гардберг были сравнены третичные структуры тимидин киназ человека, вирусов герпеса простого тип 1 и тип 4 [51]. Известно, что фосфор тимидинмонофосфата в нуклеотид-связывающем сайте тимидинкиназы человека координируется с противоположных сторон двумя аминокислотными остатками аргинина, вследствие чего создается жесткая структура. Из-за такой жесткости, как утверждают авторы, тимидинкиназа человека лишена тимидилаткиназной активности. Наличие данной активности у тимидинкиназ вирусов герпеса простого тип 1 и тип 4 объясняется, вероятно, тем, что в нуклеотид-связывающем сайте данных ферментов один остаток аргинина замещен на остаток метионина. В результате такого замещения фосфор у

тимидинмонофосфата в активном центре координируется лишь одним аминокислотным остатком аргинина, и поэтому он может уйти в образовавшийся "карман", освобождая пространство для присоединения второго фосфора. Необходимо отметить, что такая теория вероятна, но нуждается в дальнейшем подтверждении с использованием метода сайт-направленного мутагенеза.

Как уже говорилось выше, тимидинкиназа может фосфорилировать в качестве субстрата не только тимидин, но и некоторые синтетические нуклеозидные аналоги. Для выяснения структурных факторов, влияющих на сродство некоторых 5-замещенных 2'-дезоксиуридинов к тимидинкиназе вируса были рассмотрены кристаллические структуры фермента с этими соединениями [52]. Расчеты показали, что энергии связывания тимидина и 5-замещенных 2'-дезоксиуридинов по своим значениям близки.

Также были получены структуры комплексов тимидинкиназы с ацикловиром и пенцикловиром [53]. Основываясь на полученных данных, было показано, что в активном сайте вирусной тимидинкиназы пиримидиновое кольцо нуклеозида входит в углубление, сформированное двумя аминокислотными остатками, Туг172 и МеИ28, в результате чего образуется структура в виде "сэндвича". Для исследования природы взаимодействия тимидина и углубления фермента были проведены определенные математические расчеты, которые показали, что роль аминокислотного остатка МеИ28 в фиксации субстрата стерическая и гидрофобная, а взаимодействие субстрата и аминокислотного остатка Туг 172 по своей природе - ионное [54]. Исследование каталитических свойств мутантов по позиции 128 подтвердило полученные Альбертом результаты.

В 2000 году Фогт первым закристаллизовал полноразмерную тимидинкиназу вируса герпеса как в комплексе фермента с аналогом аденина, так и в свободном состоянии [55]. Было показано, что в свободном виде фермент имеет четыре молекулы воды в "кармане" тимидина.

В заключении следует отметить, что все третичные структуры тимидинкиназы вируса герпеса полученные с помощью рентгеноструктурного

анализа были получены для кристаллов, не содержащих магний в активном центре фермента, что ставит под сомнение достоверность полученных результатов.

2.1.3. ДНК-полимераза ВПГ-1.

ДНК-полимераза ВПГ-1 представляет собой гетеродимер состоящий из продуктов генов 11130 и Ш42. Ген ШЗО кодирует каталитическую субъединицу, а ген иЬ42 кодирует фосфопротеин, который обеспечивает соединение ДНК-полимеразного комплекса с двухцепочечной ДНК. ДНК-полимераза ВПГ-1 является мультифункциональным ферментом. Она обладает полимеразной активностью [56], корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью [57], а также ККАзе-Н активностью, которая по-видимому служит для удаления РНК-праймеров, инициирующих синтез фрагментов Оказаки [59]. С-конец каталитической субъединицы ШЗО взаимодействует с фактором процессивности Ш42 [59, 60].

ДНК-полимераза ВПГ-1 относится к группе а-подобных ДНК-полимераз, которые однако тесно связаны с ДНК-полимеразами группы 5 [61]. Все ДНК-полимеразы группы а имеют высокую гомологию в С-концевом домене каталитической субъединицы. Консервативные регионы пронумерованы с I по VII по мере убывания консервативности (I регион является самым консервативным). По мимо данных регионов каталитическая единица ДНК-полимеразы ВПГ-1 содержит в своем составе регион 5-С, который обладает высокой гомологией с эукариотическими ДНК-полимеразами группы 5 [61]. В ДНК-полимеразе ВПГ-1 данные регионы расположены в следующем порядке IV,5-С, И, VI, III, I, VII иV (см. рис. 4).

Основываясь на гомологии с 3'-5'-экзонуклеазным доменом ДНК-полимераз семейства а, у ДНК-полимеразы ВПГ-1 в 3'-5'-экзонуклеазном домене выделяют консервативные регионы: Ехо1, ЕхоП и ЕхоШ. Данные регионы расположены на И-конце полипептида и локализуются между позиций 363-373 в IV и 5-С регионах [62].

На основе кристаллографических исследований в ДНК-полимеразе выделяют 6 структурных доменов: pre-NH2 домен, МН2-домен, а 3'-5'-экзонуклеазный домен, полимеразная ладонь, пальцевые домены и домен большого пальца [63]. Консервативные регионы I, II и VII локализованы на "ладони", V консервативный регион расположен в домене большого пальца, (см. рис. А) [63]. Эти 4 региона фланкируют каталитический сайт ДНК-полимеразы в домене ладонь и содержат каталитическую триаду остатков аспарагиновой кислоты (позиции 717, 886 и 888), которая может существенно влиять на каталитическую активность фермента. Консервативные регионы III и IV входят в состав пальцевых доменов и влияют на позиционирование матрицы и праймеров при работе фермента.

KNasc h tfojtsia

Onalyfk1. dojiski

VIA" binding dülä&ll

Nil,

ML

BSV-I

i-itglon С

AA

Exal

Pi.l;r I'ir^-ri Pllhtt

П vi ш I MI v

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Гуськова, Анна Алексеевна

5. Выводы

1. Получена и охарактеризована тимидинкиназа ВПГ-1 из эталонного для России штамма Ь2. Определены Кт: для тимидина -1 мкМ и ацикловира - 200 мкМ.

2. Установлено, что Н-фосфонат ацикловира ингибирует ферментативную активность тимидинкиназы ВПГ-1 штамма Ь2 по смешанному механизму.

3. Для эталонного штамма ВПГ-1 Ь2 установлена нуклеотидная и аминокислотная последовательности генов ИЬ23 и ИЬЗО (тимидинкиназы и ДНК-полимеразы).

4. Установлена нуклеотидная и аминокислотная последовательности генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 лабораторного штамма Ь2/Я, глубоко резистентного к ацикловиру. Выявлены мутации в гене 11Ь23 (ТК) данного штамма, обуславливающие его резистентность: "^8813., Я220Н.

5. Установлена нуклеотидная и аминокислотная последовательности генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 9 штаммов, резистентных к Н-фосфанату ацикловира. Выявлена общая для всех штаммов мутация в гене ТК-С841Т, приводящая к получению укороченного белка, частично сохраняющего свою активность. Установлен необычный спектр мутаций в генах ТК и ДНК-полимеразы у штаммов, резистентных к Н фосфонату ацикловира.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гуськова, Анна Алексеевна, 2012 год

6. Список литературы.

1. Piret J., Boivin G. Resistance of herpes simplex viruses to nucleoside analogues: mechanisms, prevalence, and management // Antimicrob Agents Chemother. 2011. Feb;55(2):459-72.

2. De Clercq E. Antivirals for the treatment of Herpesvirus infections // J. Antimicrobial. Chemotherapy Suppl. 1993. A 32:121-132.

3. Chen M.S., Prusoff W.H. Phosphorylation of 5-iodo-5'-amino-2',5',dideoxyuridine by herpes simplex virusT type 1 encoded thymidine kinase // J Biol Chem. 1979. Oct 25;254(20): 10449-52.

4. Ilslye D.D., Lee S.H., Miller W.H., Kuchta R.D. Aciclic guanosine analogs inhibit DNA polymerases a, 5 and s with very different potencies and have unique mechanisms of action // Biochemistry. 1995. 34: 2504-2510.

5. McGeoch D.J., Dalrymple M.A., Davison A.J., Dolan A., Frame M.C., McNab D., Perry L.J., Scott J.E., Taylor P. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1 // J. Gen. Virol. 1988. Jul;69 ( Pt 7):1531-74. Review.

6. Deback C., Boutolleau D., Depienne C, Luyt C.E., Bonnafous P., Gautheret-Dejean A., Garrigue I., Agut H. Utilization of microsatellite polymorphism for differentiating herpes simplex virus type 1 strains // J. Clin. Microbiol. 2009. 47:533-540.

7. McGeoch D.J., Dolan A., Donald S., Brauer D.H. Complete DNA sequence of the short repeat region in the genome of herpes simplex virus type 1 // Nucleic Acids Res. 1986. 14:1727-1745.

8. McKnight S.L. The nucleotide sequence and transcript map of the herpes simplex virus thymidine kinase gene // Nucleic. Acids. Res. 1980. 8(24):5949-64.

9. Waldman A.S., Wild K., Bohner T., Aubry A., Folkers G., Schulz G.E. The three-dimensional structure of thymidine kinase from herpes simplex virus type 1 //FEBS. Lett. 1995. 368(2):289-92.

10. Wurth C., Thomas R.M., Folkers G., Scapozza L. Folding and self-assembly of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase. J. Mol. Biol. 2001. Oct 26;313(3):657-70.

11. Chen M.S., Prusoff W.H. Association of thymidylate kinase activity with pyrimidine deoxyribonucleoside kinase induced by herpes simplex virus // J Biol Chem. 1978. Mar 10;253(5):1325-7.

12. Kit S. Thymidine kinase // Microbiol Sci. 1985. Dec;2(12):369-75. Review.

13. Kit S., Leung W.C., Trkula D., Dubbs D.R., Jorgensen G. Gel electrophoresis, isoelectric focusing, and localization of thymidine kinase in normal and simian virus 40-infected monkey cells // Intervirology. 1973. 2(3): 137-51.

14. Leung W.C., Dubbs D.R., Trkula D., Kit S. Mitochondrial and herpesvirus-specific deoxypyrimidine kinases // J. Virol. 1975. Sep; 16(3):486-97.

15. Cheng Y.C., Dutschman G., De Clercq E., Jones A.S., Rahim S.G., Verhelst G., Walker R.T. Differential affinities of 5-(2-halogenovinyl)-2'-deoxyuridines for deoxythymidine kinases of various origins // Mol. Pharmacol. 1981. Jul;20(l):230-3.

16. De Clercq E., Naessens L., De Bolle L., Schols D., Zhang Y., Neyts J. Antivirial agents active against Human Herpesviruses // Rev. Med. Virol. 2001. 11:381-95.

17. Fyfe J.A., Keller P.M., Furman P.A., Miller R.L., Elion G.B. Thymidine kinase from herpes simplex virus phosphorylates the new antiviral compound, 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine // J. Biol. Chem. 1978. Dec 25;253(24):8721-7.

18. Miller W.H., Miller R.L. Phosphorylation of acyclovir (acycloguanosine) monophosphate by GMP kinase // J. Biol. Chem. 1980. 255:7204-7207.

19. Miller W.H., Miller R.L. Phosphorylation of acyclovir diphosphate by cellular enzymes //Biochem. Pharmacol. 1982. 31:3879-3884.

20. Elion G.B. Acyclovir: discovery, mechanism of action and selectivity // J. Med. Virol. 1993. Sl:2-6.

21. Derse D., Cheng Y.C., Furman P.A., Clair M.H.St., Elion G.B. Inhibition of purified human and herpes simplex virus-induced DNA polymerases by 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine triphosphate. Effects on primer-template function //J. Biol. Chem. 1981. 256:11447-11451.

22. Reardon J.E., Spector T. Herpes simplex virus type 1 DNA polymerase. Mechanism of inhibition by acyclovir triphosphate // J. Biol. Chem. 1989. 264:7405-7411.

23. Elion G.B., Furman P.A., Fyfe J.A., de Miranda P., Beauchamp L., Schaeffer H.J. Selectivity of action of an antiherpetic agent, 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1977. Dec;74(12):5716-20.

24. Blot N., Schneider P., Young P., Janvresse C., Dehesdin D., Tron P., Vannier J.P. Treatment of an acyclovir and foscarnet-resistant herpes simplex virus infection with cidofovir in a child after an unrelated bone marrow transplant // Bone Marrow Transplant. 2000. 26(8):903-5.

25. De Clercq E., Krajewska E., Descamps J., Torrence P.F. Anti-herpes activity of deoxythymidine analogues: specific dependence on virus-induced deoxythymidine kinase //Mol. Pharmacol. 1977. Sep;13(5):980-4.

26. Aswell J.F., Allen G.P., Jamieson A.T., Campbell D.E., Gentry G.A. Antiviral activity of arabinosylthymine in herpesviral replication: mechanism of action in vivo and in vitro // Antimicrob. Agents. Chemother. 1977. Aug;12(2):243-54.

27. Smee D.F., Boehme R., Chernow M., Binko B.P., Matthews T.R. Intracellular metabolism and enzymatic phosphorylation of 9-(l,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine and acyclovir in herpes simplex virus-infected and uninfected cells //Biochem. Pharmacol. 1985. Apr 1;34(7): 1049-56.

28. McGee D.P.C., Martin J.C., Smee D. F., Matthews T. R., Verheyden J.P.H. Synthesis and antiherpes simplex virus activity of 9-[l,3-Dihydroxy- 2-propylthio)methyl]guanine // J.Med.Chem. 1985. 28, 1242-1245.

29. De Clercq E., Descamps J., De Somer P., Barr P.J., Jones A.S., Walker R.T. (E)-5-(2-Bromovinyl)-2'-deoxyuridine: a potent and selective anti-herpes agent // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Jun;76(6):2947-51.

30. Field A.K., Davies M.E., DeWitt C., Perry H.C., Liou R., Germer, Shausen J., Karkas J.D., Shton W.T., Johnston D.B., Tolman R.L. 9-([2-hydroxy-l-(hydroxymethyl)ethoxy]methyl)guanine: a selective inhibitor of herpes group virus replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. Jul;80(13):4139-43.

31. Cheng Y.C. Deoxythymidine kinase induced in the HELA TK- cells by herpes simplex virus type I and type II. Substrate specificity and kinetic behavior//Biochim. Biophys. Acta. 1976. Dec 8;452(2):370-81.

32. Chen M.S., Summer W.P., Walker J., Summers W.C., Prusoff W.H. Characterization of pyrimidine deoxyribonucleoside kinase (thymidine kinase) and thymidine kinase as a multifunctional enzyme in cells transformed by herpes simplex virus type 1 and in cells infected with mutant strains of herpes simplex virus // J Virol. 1979. 30: 942-945.

33. Kussmann-Gerber S., Kuonen O., Folkers G., Pilger B.D., Scapozza L. Drug resistance of herpes simplex virus type 1-structural considerations at the molecular level of the thymidine kinase // Eur. J. Biochem. 1998. Jul 15;255(2):472-81.

34. Wurth C., Kessler U., Vogt J., Schulz G.E., Folkers G., Scapozza L. The effect of substrate binding on the conformation and structural stability of Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase // Protein Sci. 2001. Jan;10(l):63-73.

35. Darby G., Lader B.A., Inglis M.M. Evidens that the active center of the Herpes simplex virus thymidine kinase involves an interaction between three distinct regions of the polypeptide // J. Gen. Virol. 1986. 11: 381-95.

36. Liu Q., Summers W.C. Site-directed mutagenesis of a nucleotide-binding domain in HVS-1 thymidine kinase: effects on catalytic activity // Virology. 1988. 163,638-642.

37. Folkers G., Trumpp-Kallmeyer S., Gutbrod O., Krickl S., Fetzer J., Keil G.M. Computer-aided active-site-directed modeling of the herpes simplex virus 1 and human thymidine kinase // J. Comput. Aided. Mol. Des. 1991. 0ct;5(5):385-404.

38. Black M.E., Lawrence A.L. Identification of important residues within the putative nucleoside binding site of HVS-1 thymidine kinase by random sequence selection: analysis of selected mutants in vitro // Biochemistry. 1993. 32, 11618-11626.

39. Rechtin T.M., Black M.E., Drake R.R. Proteolytic mapping of the thymidine/thymidylate binding site of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase: a general photoaffinity labeling method for identifying active-site peptides //Anal. Biochem. 1996. May 15;237(l):135-40.

40. Hinds T.A., Compadre C., Hurlburt B.K., Drake R.R. Conservative mutations of glutamine-125 in herpes simplex virus type 1 thymidine kinase result in a ganciclovir kinase with minimal deoxypyrimidine kinase activities // Biochemistry. 2000. Apr 11;39(14):4105-11.

41. Pilger B.D., Perozzo R., Alber F., Wurth C., Folkers G., Scapozza L. Substrate diversity of herpes simplex virus thymidine kinase. Impact Of the kinematics of the enzyme //J. Biol Chem. 1999. Nov 5;274(45):31967-73.

42. Balzarini J., Liekens S., Esnouf R., De Clercq E. The A167Y mutation converts the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase into a guanosine analogue kinase // Biochemistry. 2002. May 21;41(20):6517-24.

43. Rechtin T.M., Black M.E., Mao F., Lewis M.L., Drake R.R. Purification and photoafflnity labeling of herpes simplex virus type-1 thymidine kinase // J. Biol. Chem. 1995. Mar 31;270(13):7055-60.

44. Michael M., Fetzer J., Folkers G. Site-directed mutagenesis of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase opposes the importance of amino acid positions 251, 321 and 348 for selective recognition of substrate analogs // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Apr 26;209(3):966-73.

45. Black M.E., Newcomb T.G., Wilson H-M.P., Loeb L.A. Creation of drug-specific herpes simplex virus type 1 thymidine kinase mutants for gene therapy //Prot. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93, 3525-3529.

46. Wild K., Bohner T., Aubry A., Folkers G., Schulz G.E. The three-dimensional structure of thymidine kinase from herpes simplex virus type 1 // FEBS Lett. 1995. 368(2):289-92.

47. Balasubramaniam N.K., Veerisetty V., Gentry G.A. Herpesviral deoxythymidine kinases contain a site analogous to the phosphoryl-binding arginine-rich region of porcine adenylate kinase; comparison of secondary structure predictions and conservation // J. Gen. Virol. 1990. 71 (Pt 12):2979-87.

48. Brown D.G., Visse R., Sndhu G., Davies A., Rizkallah P.J., Melitz C., Summers W.C., Sanderson M.R. Crystl structures of the thymidine kinase from herpes simrlex virus type 1 in complex with deoxythymidine and Ganciclovir // Nature structual Biology. 1995. 2: 876-881.

49. Wild K., Bohner T., Folkers G., Schulz G.E. The structures of thymidine kinase from herpes simplex virus type 1 in complex with substrates and a substrate analogue //Protein Sci. 1997. 6:2097-2106.

50. Evans J.S., Lock K.P., Levine B.A., Champness J.N., Sanderson M.R., Summers W.C., McLeish P.J., Buchan A. Herpesviral thymidine kinases: laxity and resistance by design // J. Gen. Virol. 1998. 79:2083-2092.

51. Gardberg A., Shuvalova L., Monnerjahn C., Konrad M., Lavie A. Structural basis for the dual thymidine and thymidylate kinase activity of herpes thymidine kinases // Structure (Camb). 2003. Oct;l 1(10): 1265-77.

52. De Winter H., Herdewijn P. Understanding the binding of 5-substituted 2'-deoxyuridine substrates to thymidine kinase of herpes simplex virus type-1 // J. Med. Chem. 1996. Nov 22;39(24):4727-37.

53. Champness J.N., Bennett M.S., Wien F., Visse R., Summers W.C., Herdewijn P., de Clerq E., Ostrowski T., Jarvest R.L., Sanderson M.R. Exploring the active site of herpes simplex virus type-1 thymidine kinase by X-ray crystallography of complexes with aciclovir and other ligands // Proteins. 1998. Aug 15;32(3):350-61.

54. Alber F., Kuonen O., Scapozza L., Folkers G., Carloni P. Density functional studies on herpes simplex virus type 1 thymidine kinase-substrate interactions: the role of Tyr-172 and Met-128 in thymine fixation.// Proteins. 1998. Jun l;31(4):453-9.

55. Vogt J., Perozzo R., Pautsch A., Prota A., Schelling P., Pilger B., Folkers G., Scapozza L., Schulz GE. Nucleoside binding site of herpes simplex type 1 thymidine kinase analyzed by X-ray crystallography // Proteins. 2000. Dec l;41(4):545-53.

56. Lehman I.R., Boehmer P. E. Replication of herpes simplex virus DNA // J. Biol. Chem. 1999.274:28059-28062.

57. Knopf K.W. Properties of herpes simplex virus DNA polymerase and characterization of its associated exonuclease activity // Eur. J. Biochem. 1979. 98:231-244.

58. Crate J.J., Lehman I.R. Herpes simplex-1 DNA polymerase. Identification of an intrinsic 5'—3' exonuclease with ribonuclease H activity // J. Biol. Chem. 1989. 264:19266-19270.

59. Digard P., Bebrin W.R., Weisshart K., Coen D. M. The extreme C terminus of herpes simplex virus DNA polymerase is crucial for functional interaction with processivity factor UL42 and for viral replication // J. Virol. 1993. 67:398-406.

60. Gottlieb J., Marcy A.I., Coen D.M., Challberg M.D. The herpes simplex virus type 1 UL42 gene product: a subunit of DNA polymerase that functions to increase processivity// J. Virol. 199064:5976-5987.

61. Zhang J., Chung D.W., Tan C.K., Downey K.M., Davie E.W., So A.G. Primary structure of the catalytic subunit of calf thymus DNA polymerase delta: sequence similarities with other DNA polymerases // Biochemistry. 1991. Dec 24;30(51):11742-50.

62. Bernad A., Blanco L., Lazaro J.M., Martin G, Salas M. A conserved 3'— 5' exonuclease active site in prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases // Cell. 1989. 59:219-228.

63. Liu S., Knafels J.D.,. Chang J.S, Waszak G.A., Baldwin E.T., Deibel M.R., Thomsen D.R., Homa F.L., Wells P.A., Tory M.C., Poorman R.A., Gao H., Qiu X., Seddon A.P. Crystal structure of the herpes simplex virus 1 DNA polymerase //J. Biol. Chem. 2006. 281:18193-18200.

64. Chatis P.A., Miller C.H., Schrager L.E., Crumpaker C.S. Successful treatment with foscarnet of an acyclovir resistant mucocutaneous infection with herpes simplex virus in a patient with acquired immunodeficiency syndrome // New Engl. J. Med. 1989. 320: 297-300.

65.De Clercq E., Sakuma Tk>, Baba Mio, Pauwels Rio, Balzarini Jk>, Rosenberg I. Holy A Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines // Antiviral Res. 1987. Dec;8(5-6):261-72.

66. Larder B.A., Cheng Y-C., Darby G. Characterization of abnormal thymidine kinases induced by drug-resistant strains of herpes simplex virus type 1 // J. Gen. Virol. 1983. 64: 523-32.

67. Gaudreau A., Hill E., Balfour H.H.Jr., Erice A., Boivin G. Phenotypic and genotypic characterization of acyclovir-resistant herpes simplex viruses from immunocompromised patients // J. Infect. Dis. 1998. 178:297-303.

68. Hill E.L., Hunter G.A., Ellis M.N. In vitro and in vivo characterization of herpes simplex virus clinical isolates recovered from patients infected with human immunodeficiency virus // Antimicrob. Agents. Chemother. 1991. 35(11):2322-8.

69. Morfin F., Souillet G., Bilger K., Ooka T., Aymard M., Thouvenot D. Genetic characterization of thymidine kinase from acyclovir-resistant and -susceptible herpes simplex virus type 1 isolated from bone marrow transplant recipients //J. Infect. Dis. 2000. 182(l):290-3.

70. Kudo E., Shiota H., Naito T., Satake K., Itakura M. Polymorphisms of thymidine kinase gene in herpes simplex virus type 1: analysis of clinical isolates from herpetic keratitis patients and laboratory strains // J. Med. Virol. 1998. Oct;56(2):151-8.

71. Saijo M., Suzutani T., Niikura M., Morikawa S., Kurane I. Importance of C-terminus of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase for maintaining thymidine kinase and acyclovir-phosphorylation activities // J. Med. Virol. 2002. Mar;66(3):388-93.

72. Suzutani T., Ishioka K., De Clercq E., Ishibashi K., Kaneko H., Kira T., Hashimoto K., Ogasawara M., Ohtani K., Wakamiya N., Saijo M. Differential mutation patterns in thymidine kinase and DNA polymerase genes of herpes simplex virus type 1 clones passaged in the presence of acyclovir or penciclovir // Antimicrob Agents Chemother. 2003. May;47(5):1707-13.

73. Bestman-Smith J., Schmit I., Papadopoulou B., Boivin G. Highly reliable heterologous system for evaluating resistance of clinical herpes simplex virus isolates to nucleoside analogues // J. Virol. 2001. 75:3105-3110.

74. Pottage J.C., Kessler H.A. Herpes simplex virus resistance to acyclovir: clinical relevance // Infect. Agents Dis. 1995. 4:115-124. 166.

75. Oram R.J., Marcellino D., Strauss D., Gustafson E., Talarico C.L., Root A.K., Sharma P.L., Thompson K., Fingeroth J.D., Crumpacker C., Herold B.C. Characterization of an acyclovir-resistant herpes simplex virus type 2 strain isolated from a premature neonate // J. Infect. Dis. 2000. Apr; 181(4): 1458-61.

76. Hwang C.B., Horsburgh B., Pelosi E., Roberts S., Digard P., Coen D.M. A net +1 frameshift permits synthesis of thymidine kinase from a drug-resistant herpes simplex virus mutant // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91(12):5461-5.

77. Sasadeusz J.J., Tufaro F., Safrin S., Schubert K., Hubinette M.M., Cheung P.K., Sacks S.L. Homopolymer mutational hot spots mediate herpes simplex virus resistance to acyclovir // J Virol. 1997. May;71(5):3872-8.

78. Palu G., Gerna G., Bevilacqua F., Marcello A. A point mutation in the thymidine kinase gene is responsible for acyclovir-resistance in herpes simplex virus type 2 sequential isolates // Virus Res. 1992. 25:133-144.

79. Kit S., Sheppard M., Ichimura H., Nusinoff-Lehrman S., Ellis M.N., Fyfe J. A., Otsuka H. Nucleotide sequence changes in thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 2 clones from an isolate of a patient treated with acyclovir // Antimicrob. Agents. Chemother. 1987. 0ct;31(10):1483-90.

80. Chibo D., Druce J., Sasadeusz J., Birch C. Molecular analysis of clinical isolates of acyclovir resistant herpes simplex virus // Antiviral. Res. 2004. 61:83-91.

81. Frobert E., Cortay J.C., Ooka T., Najioullah F., Thouvenot D., Lina B., Morfin F. Genotypic detection of acyclovir-resistant HSV-1: characterization of 67 ACV-sensitive and 14 ACV-resistant viruses // Antiviral Res. 2008. 79, 2836.

82. Saijo M., Yasuda Y., Yabe H., Kato S., Suzutani T., De Clercq E., Niikura M., Maeda A., Kurane I., Morikawa S. Bone marrow transplantation in a child with Wiskott-Aldrich syndrome latently infected with acyclovir-resistant (ACV(r)) herpes simplex virus type 1: emergence of foscarnet-resistant virus originating from the ACV(r) virus // J. Med. Virol. 2002. Sep;68(l):99-104.

83. Schmit I., Boivin G. Characterization of the DNA polymerase and thymidine kinase genes of herpes simplex virus isolates from AIDS patients in whom acyclovir and foscarnet therapy sequentially failed // J. Infect. Dis. 1999. 180:487-490.

84. Stranska R., van Loon A.M., Bredius R.G., Polman M., Nienhuis E., Beersma M.F., Lankester A.C., Schuurman R. Sequential switching of DNA polymerase and thymidine kinase-mediated HSV-1 drug resistance in an immunocompromised child // Antivir. Ther. 2004. Feb;9(l):97-104.

85. Collins P., Larder B.A., Oliver N.M., Kemp S., Smith I.W., Darby G. Characterization of a DNA polymerase mutant of herpes simplex virus from a severely immunocompromised patient receiving acyclovir // J. Gen. Virol. 1989. Feb;70 ( Pt2):375-82.

86. Hwang C.B., Ruffher K.L., Coen D.M. A point mutation within a distinct conserved region of the herpes simplex virus DNA polymerase gene confers drug resistance // J. Virol. 1992. 66:1774-1776.

87. Kuhn F.J., Knopf C.W. Herpes simplex virus type 1 DNA polymerase. Mutational analysis of the 3'-5'-exonuclease domain // J. Biol. Chem. 1996. 271:29245-29254.

88. Gibbs J.S., Chiou H.C., Bastow K.F., Cheng Y.C., Coen D.M. Identification of amino acids in herpes simplex virus DNA polymerase involved in substrate and drug recognition // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. 85:6672-6676.

89. Larder B.A., Kemp S. D., Darby G. Related functional domains in virus DNA polymerases // EMBO J. 1987. 6:169-175.

90. Saijo M., Suzutani T., Morikawa S., Kurane I. Genotypic characterization of the DNA polymerase and sensitivity to antiviral compounds of foscarnet-resistant herpes simplex virus type 1 (HSV-1) derived from a foscarnet-sensitive HSV-1 strain//Antimicrob. Agents Chemother. 2005. 49:606-611.

91. Hwang Y.T., Liu B.Y., Coen D.M., Hwang C.B. Effects of mutations in the Exo III motif of the herpes simplex virus DNA polymerase gene on enzyme activities, viral replication, and replication fidelity // J. Virol. 1997. 71:77917798.

92. Hwang Y.T., Smith J.F., Gao L., Hwang C.B. Mutations in the Exo III motif of the herpes simplex virus DNA polymerase gene can confer altered drug sensitivities. Virology. 1998. 246:298-305.

93. Burrel S., Deback C., Agut H., Boutolleau D. Genotypic characterization of UL23 thymidine kinase and UL30 DNA polymerase of clinical isolates of herpes simplex virus: natural polymorphism and mutations associated with resistance to antivirals // Antimicrob Agents Chemother. 2010 Nov;54(l 1):4833-42.

94. Duffy K.E., Quail M.R., Nguyen T.T., Wittrock R.J., Bartus J.O, Halsey W.M., Leary J.J., Bacon T.H., Sarisky R.T. Assessing the contribution of the herpes simplex virus DNA polymerase to spontaneous mutations // BMC Infect. Dis. 2002. 2:7.

95. Duan R., de Vries R.D., van Dun J.M., van Loenen F.B., Osterhaus A.D., Remeijer L., Verjans G.M.. Acyclovir susceptibility and genetic characteristics of sequential herpes simplex virus type 1 corneal isolates from patients with recurrent herpetic keratitis // J. Infect. Dis. 2009. 200:1402-1414

96. Sauerbrei A., Deinhardt S., Zell R., Wutzler P. Phenotypic and genotypic characterization of acyclovir-resistant clinical isolates of herpes simplex virus // Antiviral Res. 2010. 86:246-252

97. Schulte E.C., Sauerbrei A., Hoffmann D., Zimmer C., Hemmer B., Mu.hlau M.. Acyclovir resistance in herpes simplex encephalitis // Ann. Neurol. 2010. 67:830-833

98. Graham D., Larder B.A., Inglis M.M. Evidence that the 'active centre' of the herpes simplex virus thymidine kinase involves an interaction between three distinct regions of the polypeptide // J. Gen. Virol. 1986. 67(4):753- 758.

99. Prichard M.N., Quenelle D.C., Hartline C.B., Harden E.A., Jefferson G., Frederick S.L., Daily S.L., Whitley R.J., Tiwari K.N., Maddry J.A., Secrist J.A., Kern E.R. Inhibition of herpesvirus replication by 5-substituted 4'-

thiopyrimidine nucleosides // Antimicrob. Agents. Chemother. 2009. Dec;53(12):5251-8.

100. Bestman-Smith J., Boivin G. Drug resistance patterns of recombinant herpes simplex virus DNA polymerase mutants generated with a set of overlapping cosmids and plasmids // J. Virol. 2003. 77:7820-7829.

101. Bestman-Smith J., Boivin G. Herpes simplex virus isolates with reduced adefovir susceptibility selected in vivo by foscarnet therapy // J. Med. Virol. 2002. 67:88-91.

102. Bestman-Smith J., Boivin G. Herpes simplex virus isolates with reduced adefovir susceptibility selected in vivo by foscarnet therapy // J. Med. Virol. 2002. 67:88-91.

103. Szpara M.L., Parsons L., Enquist L.W. Sequence Variability in Clinical and Laboratory Isolates of Herpes Simplex Virus 1 Reveals New Mutations // J. of Virol. 2010. p. 53 03-5313.

104. Sun N., Cassell M.D., Perlman S. Anterograde, transneuronal transport of herpes simplex virus type 1 strain HI 29 in the murine visual system // J. Virol. 1996. 70:5405-5413.

105. Zemanick M.C., Strick P.L., Dix R.D. Direction of transneuronal transport of herpes simplex virus 1 in the primate motor system is strain-dependent // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. 88:8048-8051.

106. Dix R.D., McKendall R.R., Baringer J.R. Comparative neurovirulence of herpes simplex virus type 1 strains after peripheral or intracerebral inoculation ofBALB/c mice //Infect. Immun. 1983. 40:103-112.

107. Kienzle T.E., Henkel J.S., Ling J.Y., Banks M.C., Beers D.R., Jones B., Stroop W.G. Cloning and restriction endonuclease mapping of herpes simplex virus type-1 strains H129 and -GC // Arch. Virol. 1995. 140:1663- 1675.

108. Ling J.Y., Kienzle T.E., Chen T.M., Henkel J.S., Wright G.C., Stroop W. G.. Comparative analyses of the latency-associated transcript promoters from herpes simplex virus type 1 strains HI 29, -GC and KOS-63 // Virus Res. 1997. 50:95-106.

109. Ejercito P.M., Kieff E.D., Roizman B. Characterization of herpes simplex virus strains differing in their effects on social behaviour of infected cells // J. Gen. Virol. 1968. 2:357-364.

110. Buchman T.G., Simpson T., Nosal C., Roizman B., Nahmias A.J. The structure of herpes simplex virus DNA and its application to molecular epidemiology//Ann. N. Y. Acad. Sci. 1980. 354:279-290.

111. Chaney S.M., Warren K.G., Kettyls J., Zbitnue A., Subak-Sharpe J.H. A comparative analysis of restriction enzyme digests of the DNA of herpes simplex virus isolated from genital and facial lesions // J. Gen. Virol. 1983. 64(2):357-371.

112. Orvedahl A., Alexander D., Talloczy Z., Sun Q., Wei Y., Zhang W., Burns D., Leib D.A., Levine B. HSV-1 ICP34.5 confers neurovirulence by targeting the Beclin 1 autophagy protein // Cell Host Microbe. 2007. 1:23-35.

113. Bower J.R., Mao H., Durishin C., Rozenbom E., Detwiler M., Rempinski D., Karban T.L., Rosenthal K.S. Intrastrain variants of herpes simplex virus type 1 isolated from a neonate with fatal disseminated infection differ in the ICP34.5 gene, glycoprotein processing, and neuroinvasiveness // J. Virol. 1999. 73:38433853.

114. Mao H., Rosenthal K.S. An N-terminal arginine-rich cluster and a proline-alanine-threonine repeat region determine the cellular localization of the herpes simplex virus type 1 ICP34.5 protein and its ligand, protein phosphatase 1 // J. Biol. Chem. 2002. 277:11423-11431.

115. He B., Chou J., Liebermann D.A., Hoffman B., Roizman B. The carboxyl terminus of the murine MyDl 16 gene substitutes for the corresponding domain of the -134.5 gene of herpes simplex virus to preclude the premature shutoff of total protein synthesis in infected human cells // J. Virol. 1996. 70:84-90.

116. Baird N.L., Yeh P.C., Courtney R.J., Wills J. W.. Sequences in the UL11 tegument protein of herpes simplex virus that control association with detergent-resistant membranes // Virology. 2008. 374:315-321.

117. Leege T., Fuchs W., Granzow H., Kopp M., Klupp B.G., Mettenleiter T.C. Effects of simultaneous deletion of pULll and glycoprotein M on virion maturation of herpes simplex virus type 1 // J. Virol. 2009. 83:896-907.

118. Loomis J.S., Courtney R.J., Wills J.W. Packaging determinants in the UL11 tegument protein of herpes simplex virus type 1 // J. Virol. 2006. 80:10534-10541.

119. Yeh P.C., Meckes D. G., Wills J.W. Analysis of the interaction between the UL11 and UL16 tegument proteins of herpes simplex virus // J. Virol. 2008.82:10693-10700.

120. McGraw H.M., Awasthi S., Wojcechowskyj J.A., Friedman H.M. Anterograde spread of herpes simplex virus type 1 requires glycoprotein E and glycoprotein I but not Us9 // J. Virol. 2009. 83:8315-8326.

121. Snyder A., Polcicova K., Johnson D.C. Herpes simplex virus gE/gl and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons // J. Virol. 2008. 82:10613-10624.

122. Norberg P., Bergstrom T., Rekabdar E., Lindh M., Liljeqvist J.A. Phylogenetic analysis of clinical herpes simplex virus type 1 isolates identified three genetic groups and recombinant viruses // J. Virol. 2004. 78:10755-10764.

123. Norberg P., Olofsson S., Tarp M.A., Clausen H., Bergstrom T., Liljeqvist J.A. Glycoprotein I of herpes simplex virus type 1 contains a unique polymorphic tandem-repeated mucin region // J. Gen. Virol. 2007. 88:16831688.

124. Coen D.M. The implications of resistance to antiviral agents for herpesvirus drug targets and drug therapy // Antiviral. Res. 1991. 15,287-300.

125. Jamieson A.T., Subak-Sharpe J.H. Biochemical studies on the herpes simplex virus-specified deoxypyrimidine kinase activity // J. Gen. Virol. 1974. Sep;24(3):481-92.

126. Cheng Y.C., Ostrander M. Deoxythymidine kinase induced in HeLa TK-cells by herpes simplex virus type I and type II. II. Purification and characterization//J. Biol. Chem. 1976. May 10;251(9):2605-10.

127. Suzutani T., Saijo M., Nagamine M., Ogasawara M., Azuma M. Rapid phenotypic characterization method for herpes simplex virus and Varicella-Zoster virus thymidine kinases to screen for acyclovir resistant viral infection // J. Clin. Microbiol. 2000. 38, 1839-1844.

128. Kost R.G., Hill E.L., Tigges M., Straus S.E. Briefreport: recurrent acyclovir_resistant genital herpes in an immunocompetent patient // N. Engl. J. Med. 1993.329,1777-1782.

129. Skoblov Y.S., Karpenko I.L., Jasko M.V., Kukhanova M.K., Andronova V.L., Galegov G.A., Sidorov G.V.,Myasoedov N.F. Cell metabolism of acyclovir phosphonate derivatives and antiherpesvirus activity of theircombinations with alpha2-interferon // Chem. Biol. Drug. Des. 200. 69, 429-434.

130. Andrei G., Fiten P., Froeyen M., De Clercq E., Opdenakker G., Snoek R. DNA polymerase mutations in drug-resistant herpes simplex virus mutations determine in vivo neurovirulentce and drug-enzyme interactions.// Antivir. Ther. 2007. 12:719-732.

131. Coen D.M. Antiviral drug resistance in herpes simplex virus // Adv. Exp. Med. Biol. 1996. 394:49-57.

132. Gibbs J.S., Chiou H.C., Hall J.D., Mount D., Retondo M.J., Weller S.K., Coen D. Sequence and mapping analyses of the herpes simplex virus DNA polymerase gene predict a C-terminal substrate binding domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. 82:7969-7973.

133. Morfin F., Thouvenot D. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs // J. Clin. Virol. 2003 Jan;26(l):29-37. Review.

134. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // Мир 1984.

135. Chen M.S., Walker J., Prusoff W.H. Kinetic studies of herpes simplex virus type 1-encoded thymidine and thymidylate kinase, a multifunctional enzyme // J Biol Chem. 1979. Nov 10;254(21): 10747-53.

136. Диксон, Э. Уэбб. "Ферменты"— В 3-х т. — Пер. с англ. — Т.1-2. — М.: Мир, 1982. — 808.

137. Галегов Г.А., Шобухов В.М., Леонтьева Н.А., ЯськоМ.В. // Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 906-909.

7. Список сокращений.

ВПГ-1— вирус герпеса простого тип 1

ТК—тимидинкиназа;

ACV— ацикловир

HpACV— Н-фосфонат ацикловира;

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота;

ПНР — полимеразная цепная реакция;

т. п. н. — тысяча пар нуклеотидов;

п. н. — пара нуклеотидов;

SDS — додецилсульфат натрия

АТР (АТФ) — аденозинтрифосфат

TMP —тимидинмонофосфат

ПААГ — полиакриламидный гель

d2C - 2',3'-_,Дидезоксицитидин

d2T - 3,_1-дезокситимидин

d4T - 3 '^-д езокси-^2',3 '-■-дид егидротими дин

FLT - 3 '~,-фтор-~,3 '-•-д езокситимидин

ЗТС - Р-~'Т-~12',3,_'-дезокси-,-3'_'-тиацитидин

а.к. - аминокислота (аминокислотный остаток)

8. Благодарности.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю, без руководства и помощи которого, данная работа была бы вряд ли возможна.

Автор благодарит коллектив Лаборатории терапии герпетических инфекций Научно-исследовательского Института вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН (зав. лаб. д.б.н., профессор Г.А. Галегов) за многолетнее плодотворное сотрудничество и помощь в проведении данной работы.

Автор выражает свою признательность коллективу лаборатории биотехнологий ИБХ РАН за помощь в экспрессии и выделении тимидинкиназы эталонного штамма Ь2.

Особую признательность автор выражает Ясько М.В. (ИМБ РАН) за предоставленные химические соединения, необходимые для выполнения работы.

Также автор выражает глубокую признательность Скоблову Михаилу Юрьевичу из лаборатории генетической эпидемиологии Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического центра РАМН, за неоценимую помощь и поддержку в данной работе.

Особую благодарность автор выражает своей семье и друзьям за терпение и поддержку в данной работе.