Формирование антиинфекционной и противоопухолевой защиты при стимуляции врожденного иммунитета рекомбинантным белком теплового шока-70 в эксперименте. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Воробьёв, Денис Сергеевич

• Воробьёв, Денис Сергеевич
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Воробьёв, Денис Сергеевич

В в е д е н и е

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОБЩЕБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ

ТЕПЛОВОГО ШОКА

ГЛАВА 2. РОЛЬ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В СОЗДАНИИ

ЗАЩИТЫ ОТ ИНФЕКЦИИ

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1 Использованные препараты

1.2 Лабораторные животные

1.3 Штаммы микроорганизмы

1.4 Определение противоопухолевой активности рБТШ+ЛПС

1.5 Метод оценки взаимодействия рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4

1.6 Метод количественного определения содержания ЛПС в рекомбинантном белке теплового шока-70 (ЛАЛ-тест)

1.7 Методы определения действия рБТШ+ЛПС на элементы врожденного иммунитета

1.8 Метод проточной цитометрии

1.9 Метод иммуноферментного определения аутоантителt 1.10 Методы статистической обработки результатов

ГЛАВА 2. АНТИИНФЕКЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ

2.1 Влияние рБТШ+ЛПС на развитие у мышей бактериальной инфекции, вызванной представителями семейства Enterobacteriaceae и семейства Streptococcaceae

2.2 Изучение защитного действия рБТШ+ЛПС при заражении мышей вирусом гриппа птиц (H5N2)

2.3 Протективная активность рБТШ+ЛПС при разных схемах иммунизации

2.4 Влияние примеси ЛПС на протективную активность рекомбинантного белка теплового шока-70

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ рБТШ+ЛПС НА ФУНКЦИЮ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ЛИМФОЦИТОВ И СИНТЕЗ ЦИТОКИНОВ. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С TLR2 И TLR4

3.1 Влияние рБТШ+ЛПС на активацию дендритных клеток

3.2Взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими Толл-подобными рецепторами (TLRs)

3.3 Влияние рБТШ+ЛПС на цитотоксическую активность и иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров —

3.4 Спектр цитокинов в сыворотке крови мышей, получавших рБТШ+ЛПС

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА рБТШ+ЛПС

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ рБТШ+ЛПС В ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ НА МЫШАХ

5.1 Изучение синтеза аутоантител при иммунизации животных рБТШ+ЛПС

5.2 Исследование острой токсичности препарата рБТШ+ЛПС

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование антиинфекционной и противоопухолевой защиты при стимуляции врожденного иммунитета рекомбинантным белком теплового шока-70 в эксперименте.»

Актуальность темы. В 1996-98 гг. были описаны Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors - TLRs) врожденного иммунитета [103, 124]. После этого началась интенсивная работа по созданию нового класса иммунобиологических препаратов - модификаторов (активаторов — агонистов; ингибиторов — антагонистов) функций TLRs и их сигнальных путей [64, 91]. Полагают, что такие модификаторы станут эффективным средством иммунопрофилактики и иммунотерапии не только инфекционных болезней, но и аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний [152]. Модификаторы TLRs рассматривают как возможное средство защиты от пандемий и последствий биотеррористических актов.

В качестве модификаторов исследуют природные лиганды (патоген-ассоциированные молекулярные структуры (ПАМС) микроорганизмов) и их синтетические аналоги [91, 152].

Обширная литература посвящена исследованию роли представителей большой группы многофункциональных белков теплового шока (БТШ), которые взаимодействуют с TLRs. В эту группу входят различающиеся по молекулярной массе и структуре члены семейств: БТШ90, БТШ70, низкомолекулярные БТШ (15-35 kDa) и высокомолекулярные БТШ (М>110 kDa), [9]. Иммунологическая активность выявлена у БТШ70, gp96 (семейство БТШ90), БТШ110 и БТШ 170 [12].

Показано, что БТШ70 и gp96 являются элементами иммунологических событий и патогенеза инфекций, аутоиммунных и онкологических процессов [47, 167, 172].

Молекулы БТШ70 и gp96 служат лигандами для рецепторов антигенпредставляющих клеток (АПК) и других клеток врожденного иммунитета. Они активируют макрофаги и дендритные клетки (ДК), запускают экспрессию антигенпредставляющих и костимуляторных молекул [20, 21, 153, 154, 164, 173]; являются индукторами второго сигнала, который является необходимым компонентом формирования адаптивного иммунного ответа [36].

Белки теплового шока используют при конструировании разных вакцин (ДНК, пептидные), применяя их в качестве иммуногенного антигена или адъюванта [12].

Мы исследовали антиинфекционную и противоопухолевую активность рекомбинантного белка теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis1. Препарат содержал примесь липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli, поэтому БТШ описывали аббревиатурой рБТШ+ЛПС.

Изучена способность рБТШ+ЛПС создавать быструю (через 48-72 ч) защиту против патогенов разных таксономических групп: представителей разных семейств бактерий (Salmonella typhimurium 415 /, Streptococcus pneumoniae m.S N.3) и адаптированного к мышам вируса гриппа птиц (H5N2).

Определили роль примеси ЛПС при формировании антибактериальной защиты у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС.

В специальной серии опытов установили, что рБТШ+ЛПС обладает противоопухолевым действием в отношении меланомы В16.

Цель работы. Исследовать способность рБТШ+ЛПС создавать у животных защиту против патогенов разных таксономических групп и оказывать влияние на развитие экспериментальных опухолей.

Задачи исследования.

1. Оценить резистентность мышей к S. typhimurium, S. pneumoniae и вирусу гриппа птиц (H5N2) при различных схемах введения рБТШ+ЛПС.

1 Препарат был любезно предоставлен сотрудниками НИИ молекулярной диагностики и лечения проф. В.И. Киселевым и проф. П.Г. Свешниковым

2. Исследовать противоопухолевую (против меланомы В16 и карциномы яичников) активность рБТШ+ЛПС в экспериментах на мышах.

3. Установить роль ЛПС, входящего в состав рекомбинантного БТШ, при формировании у животных невосприимчивости к инфекциям.

4. Изучить действие рБТШ+ЛПС на функциональную активность ДК, функциональные свойства и фенотип мононуклеарных клеток, а также продукцию цитокинов.

5. Экспериментально определить возможность образования аутоантител к органонеспецифическим антигенам у мышей при введении рБТШ+ЛПС.

Научная новизна. Впервые показано, что рБТШ+ЛПС М. tuberculosis при однократном введении создает у мышей быструю (через 48-72 ч) защиту против микроорганизмов разных таксономических групп - бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц (H5N2). При трехкратном введении рБТШ+ЛПС в дозе 10 мкг/мышь формируется защита в течение всего срока наблюдения (21 день) от S. typhimurium.

Впервые выявлено, что наряду с антиинфекционной активностью рБТШ+ЛПС обладает способностью тормозить рост экспериментальных опухолей при пятикратной аппликации (меланома В16).

Впервые установлено, что примесь ЛПС в составе рекомбинантного белка теплового шока-70 усиливает антиинфекционную активность БТШ70.

Изучено взаимодействие рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4 человека, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях. При этом показана активация внутриклеточного ядерного фактора NF-кВ, который контролирует синтез цитокинов.

Установлено, что в ответ на введение рБТШ+ЛПС у интактных мышей повышался уровень IL-6 и IFN-y в сыворотке, а у иммунизированных и зараженных S. typhimurium животных уменьшался уровень IL-6 и TNF-a, но увеличивался синтез IFN-y.

Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулировал созревание ДК мышей и усиливал цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови человека в отношении клеток эритробластного лейкоза К-562. Под влиянием рБТШ+ЛПС возрастала экспрессия молекул CD25 и CD56 на мембране МНЛ.

Впервые в эксперименте на мышах показано, что введение рБТШ+ЛПС не сопровождалось выработкой аутоантител к органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин).

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований открывают перспективу использования рекомбинантного БТШ+ЛПС в качестве модификатора функций TLRs, с помощью которого можно создавать защиту против широкого круга патогенов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Воробьёв, Денис Сергеевич

выводы

1. В опытах in vivo и in vitro изучена функция рекомбинантного белка теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis (рБТШ+ЛПС) как модификатора функций TLRs и показано, что он обладает антиинфекционной и противоопухолевой активностью.

2. Показано, что рБТШ+ЛПС при однократном введении создает быструю (через 48-72 ч), но непродолжительную защиту против широкого круга микроорганизмов: бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц, адаптированного к мышам (H5N2). При трехкратном введении 10 мкг/мышь рБТШ+ЛПС формируется длительная (в течение 21 дня наблюдения) защита от заражения S. typhimurium.

3. Выявлена способность рБТШ+ЛПС тормозить рост некоторых экспериментальных опухолей при многократном введении. Этот эффект зарегистрирован при работе с меланомой В16 и не обнаружен в отношении карциномы яичников.

4. Доказано, что примесь липополисахарида в рекомбинантном белке теплового шока-70 усиливает антиинфекционное действие БТШ.

5. Продемонстрировано взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими TLR2 и TLR4, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях.

6. Установлено, что рБТШ+ЛПС индуцирует синтез IL-6 и IFN-y у интактных мышей. У зараженных S. typhimurium мышей после введения препарата снижается уровень сывороточных цитокинов IL-6 и TNF-a, но повышается уровень IFN-y.

7. Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулирует созревание дендритных клеток мышей, о чём свидетельствует повышение уровня костимуляторных молекул CD80, CD86; маркера терминальной дифференцировки дендритных клеток CD83; и усиливает цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека в отношении опухолевой линии клеток К-562 эритробластного лейкоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Общепризнано, что врожденный иммунитет является первой линией защиты от патогенов, поскольку он обеспечивает быстрое распознавание патогенов, их элиминацию и формирование адаптивного иммунитета [153, 176]. Распознавание микроорганизмов осуществляют несколько образ распознающих рецепторов (pattern-recognition receptors - PRRs), экспрессированные на мембране и в цитоплазме клеток врожденного иммунитета (дендритные клетки, фагоцитирующие клетки, тучные клетки, эпителиальные клетки и др.) [21, 102]. Наиболее изученными являются TLRs. Согласно современным представлениям индивидуальные TLRs способны распознавать лиганды нескольких микроорганизмов [152]. Так, TLR2 распознают лиганды бактерий, ряда вирусов, некоторых простейших и грибов [10]. Аналогичное многообразие распознавания выявлено у TLR4, TLR5, TLR9. Вероятно, распознавание у патогена разных лиганд является одним из факторов усиления реакций врожденного иммунитета, т.к. сигналы активированных TLRs вступают во взаимодействие между собой.

В настоящее время активно разрабатывается направление по созданию нового класса иммунобиологических препаратов — модификаторов (агонистов и антагонистов) функций TLRs. Исследователи полагают, что такие модификаторы будут активно защищать от инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний [152].

Активация этих рецепторов инициирует врожденный иммунный ответ через внутриклеточный ядерный фактор NF-kB, который индуцирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов [102]. В свою очередь, цитокиновые молекулы направляют дифференцировку Т-клеток либо по Th-1 (IFN-y, IL-12p70), либо по Th-2 (IL-4, IL-5, IL-13) пути, что в итоге способствует формированию адаптивного иммунитета.

Рядом исследователей [119] установлено, что вакцина против желтой лихорадки YF-17D создает эффективную защиту у людей, активируя TLR2, 7, 8 и 9 рецепторы на ДК человека. Другой группой ученых было показано, что иммунизация синтетическим олигодезоксинуклеотидом, содержащим в своем составе CpG-мотивы ДНК, вызывала резистентность у мышей против инфекции, вызванной Listeria monocytogenes [76]. Механизм такой защиты авторы связывают с активацией TLR9/MyD88-3aBHCHMoro сигнального пути, приводящего к синтезу IL-12 и IFN-y.

Одним из возможных модификаторов функций TLRs и активаторов врожденного иммунитета является БТШ. Мы исследовали способность рекомбинантного белка теплового шока-70 М. tuberculosis создавать защиту против микроорганизмов разных таксономических групп с помощью активации врожденного иммунитета.

В процессе эволюции эукариот некоторые БТШ приобрели функции, позволившие им интегрироваться в систему иммунитета. Роль БТШ в развитии реакций врожденного и приобретенного иммунитета определяется способностью активировать эффекторные клетки врожденного иммунитета, а также перехватывать антигенные пептиды и через взаимодействие с АПК представлять эти пептиды Т-лимфоцитам в контексте молекул ГКГС [79].

В настоящее время получены и продолжают активно разрабатываться и совершенствоваться профилактические и терапевтические БТШ-вакцины, предназначенные для борьбы с инфекционными и опухолевыми заболеваниями [12]. Прогрессу в создании таких вакцин способствуют успехи фундаментальной науки в исследовании биологических основ функционирования БТШ.

Большинство исследователей идет по пути создания БТШ-вакцин, применяя БТШ как адъювант для эффективного представления связанного с ним антигена Т-лимфоцитам [143, 17, 48, 107, 118, 151]. Однако немногие ученые используют БТШ как мощный активатор системы врожденного иммунитета, учитывая тот факт, что данный белок представлен во всех без исключения клетках биологических организмов.

Нам представлялось целесообразным изучить иммунотропные свойства БТШ, как такового, вне связи его с определенным антигеном. Белок теплового шока-70, с которым проводили эксперименты, как и многие другие продукты генно-инженерного происхождения, был контаминирован ЛПС микроба-донора. Поэтому правомерно говорить о сочетании рекомбинантного БТШ с ЛПС (рБТШ+ЛПС).

Изучение иммунотропных свойств рБТШ+ЛПС начали с экспериментов по заражению мышей летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и авирулентного для человека вируса гриппа птиц H5N2. Белым беспородным мышам вводили внутрибрюшинно однократно рБТШ-ЛПС в широком диапазоне доз (от 1 до 400 мкг/мышь) и через 24 часа заражали летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и вирусом гриппа птиц H5N2.

Было выявлено, что формировалась быстрая (через 48-72 ч), но непродолжительная защита при иммунизации дозами 100 мкг/мышь (S. typhimurium, S. pneumoniae) и 100 или 400 мкг/мышь (вирус гриппа птиц H5N2). Защита сохранялась до 10 дня наблюдения (40-50% выживших мышей в опыте) при гибели 80-100% животных в контроле на 4-6 сутки.

Для дальнейших экспериментов был выбран штамм S. typhimurium 415 f., поскольку сальмонеллезная инфекция является модельной инфекцией для мышей. Мы изучили способность рБТШ+ЛПС создавать защиту у животных от S. typhimurium (I25LD50) после трехкратной и однократной внутрибрюшинной иммунизации в дозах 10 и 100 мкг/мышь соответственно. Выявлено, что эффективная доза препарата при трехкратном введении составила 10 мкг/мышь. Она защищала 50% животных на протяжении всего опыта - 21 день наблюдения (р<0,05). При однократной инокуляции препарата эффективной дозой оказалась 100 мкг/мышь. Она защищала 70% мышей на 5 день эксперимента при 90% гибели животных в контроле (р<0,05). Таким образом, установлено, что рБТШ+ЛПС создает не только быструю (через 48-72 ч), но и длительную (21 день) защиту от S. typhimurium.

На следующем этапе работы важно было оценить, как влияет примесь ЛПС в препарате на защитные эффекты, полученные in vivo. Для решения данной задачи мы остановились на двух схемах иммунизации рБТШ+ЛПС, а именно: 10 мкг/мышь трехкратно ежедневно и 100 мкг/мышь однократно. Чтобы определить или исключить роль примеси ЛПС в препарате, белок денатурировали методом кипячения [42] или связывали ЛПС с помощью добавления к рБТШ+ЛПС полимиксина В (РМВ) по методу Н. Tsuzuki. Инактивацию ЛПС определяли в ЛАЛ-тесте. Нами было установлено, что 1 мг/мл БТШ содержал 5320 ЕЭ/мл, а после добавления РМВ в дозах 0,266 мкг и 2,66 мкг — 273 и 34 ЕЭ/мл соответственно. В качестве референс-контроля использовали коммерческие препараты РМВ (Fluka BioChemika, Denmark) и ЛПС Е. coli (SIGMA®, Germany).

Мышей иммунизировали (1) рБТШ+ЛПС; (2) рБТШ+ЛПС, в котором белок теплового шока был денатурирован методом кипячения [рБТШ+ЛПС(К)]; (3) рБТШ+ЛПС, в котором ЛПС был связан РМВ [рБТШ+ЛПС(РМВ)]; коммерческими препаратами (4) РМВ и (5) ЛПС Е. coli и через 24 часа заражали 63 LD50 S. typhimurium.

Показано, что рБТШ+ЛПС защищал мышей при однократной и трехкратной аппликации в дозах 100 мкг/мышь и 10 мкг/мышь соответственно (р<0,05). Однако степень защиты оказалась в 2 раза выше при трехкратном введении, чем при однократном введении препарата (80% выживших животных против 40% на 21 день наблюдения). Рекомбинантный БТШ+ЛПС, подвергавшийся кипячению, не защищал опытных животных также, как и коммерческие препараты: полимиксин В и ЛПС Е. coli. Рекомбинантный БТШ+ЛПС, в котором ЛПС инактивировали с помощью РМВ, защищал мышей только при трехкратной инокуляции в дозе 10 мкг/мышь (40% выживших животных, р<0,05), в то время как при однократном введении защита не формировалась.

По-видимому, формирование более выраженной защиты при иммунизации животных рБТШ+ЛПС можно связать с тем, что и БТШ и ЛПС являются лигандами для TLRs. Взаимодействуя одновременно с разными TLRs, эти вещества усиливают активацию врожденного иммунитета.

На 21 день наблюдения у животных изучали сыворотку крови с целью определения титров антител к ЛПС S. typhimurium. Выявлено, что у всех выживших опытных мышей титр антител к ЛПС S. typhimurium был выше по сравнению с интактными животными (титр 1:200) и отмечался на уровне оставшейся живой контрольной мыши (титр 1:3200).

Появление в сыворотке высоких титров антител к ЛПС S. typhimurium свидетельствует о формировании адаптивного иммунного ответа на фоне активации врожденного иммунитета рБТШ+ЛПС.

Исследована способность рБТШ+ЛПС стимулировать эффекторные функции врожденного иммунитета. Для этого изучили, как влияет препарат на созревание ДК и цитотоксическую активность мононуьслеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови человека in vitro.

Однократная и трехкратная аппликация рБТШ+ЛПС приводила к активации врожденного иммунитета. Это подтверждалось следующими фактами. Исследование иммунофенотипа ДК выявило существенное увеличение экспрессии молекул CD80, CD86, CD83 и уменьшение маркера макрофагов F4/80, что свидетельствовало о созревании ДК под влиянием рБТШ+ЛПС.

Учитывая данные литературы о том, что БТШ связывается с TLRs, необходимо было определить, взаимодействует ли использовавшийся в нашей работе рБТШ+ЛПС с TLRs. Для определения специфичного связывания человеческих TLRs с исследуемым препаратом в работе использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно экспрессирующие hTLR4/MD2-CD14 и hTLR2/CD14 [14]. В качестве контроля служили клетки 293-null, не экспрессирующие TLRs. Нами показано, что рБТШ+ЛПС в широком диапазоне доз (от 0,1 до 10 мкг/мл) взаимодействовал с TLR2 и TLR4, экспрессированными на клеточных линиях 293 эмбриональной почки человека. Доказательством такого взаимодействия являлось изменение окраски среды, свидетельствовавшей об активации внутриклеточного ядерного фактора NF-kB. В контроле после добавления рБТШ+ЛПС к клеткам линии 293-null активации NF-kB не происходило.

На основании полученных результатов мы предположили, что рБТШ+ЛПС может индуцировать одновременно TLR2 и TLR4, что приводит к усилению эффекторных функций врожденного иммунитета. Механизм такой индукции свидетельствует о способности рБТШ+ЛПС опосредованно активировать внутриклеточный ядерный фактор NF-kB через взаимодействие с TLR2 и TLR4.

Изучение цитокинового профиля у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС, выявило в ранние сроки увеличение синтеза IL-6, IFN-y, TNF-a. На фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, было отмечено повышение уровня IL-6, IL-12p70, IFN-y, TNF-a, однако пик этих цитокинов смещался во времени по сравнению с животными, получавшими только препарат. В то же время у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС и зараженных S. typhimurium, отмечался менее выраженный пик провоспалительных (IL-6, TNF-a) и более выраженный пик регуляторных (IFN-y) цитокинов по сравнению с животными, зараженными только S. typhimurium.

Повышение регуляторных цитокинов IL-12p70 и IFN-y в сыворотках иммунизированных и/или зараженных мышей с учетом отсутствия динамики IL-4 может свидетельствовать об активации механизмов, поляризующих иммунный ответ по Th-1 типу. Таким образом, мы полагаем, что с одной стороны рБТШ+ЛПС, вызывая повышение уровня провоспалительных и регуляторных цитокинов, балансирует иммунный ответ. С другой стороны, рБТШ+ЛПС на фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, снижает выброс IL-6 и TNF-a, предохраняя тем самым организм от «цитокиновой бури». Повышение регуляторного цитокина IFN-y на поздних сроках инфекции, вероятно, способствует защите организма хозяина посредством активации Т-клеточного звена иммунитета.

Токсического действия препарата на белых беспородных мышах выявлено не было.

В настоящее время рядом исследователей доказано, что БТШ, расположенные на поверхности опухолевых клеток, активируют эффекторные клетки врожденного иммунитета и в ряде случаев способствуют лизису опухолевых клеток, маркерами которых они являются [62, 63, 106, 121, 128].

Srivastava с соавт. показали, что БТШ, выделенные из опухолей, вызывают противоопухолевый иммунитет в эксперименте на животных. Белки теплового шока, выделенные из здоровых тканей, таким действием не обладают. Авторы предположили, что с БТШ опухолевого происхождения связаны низкомолекулярные опухолевые пептиды, которые индуцируют специфический противоопухолевый иммунитет [26, 107]. Все это привело к разработке аутологичных противоопухолевых вакцин на основе БТШ. Однако проведенные в последующем клинические испытания не выявили существенной регрессии опухоли при иммунизации пациентов с разными онкологическими заболеваниями подобными вакцинами [116, 92, 160].

Это определило в нашей работе поиск альтернативных путей противоопухолевой активности данного препарата. Рекомбинантный БТШ+ЛПС усиливал цитотоксическую активность MHJI в отношении опухолевой линии клеток эритробластного лейкоза К-562, а также повышал на мембране МНЛ экспрессию молекул CD25, CD56, но не влиял на молекулы CD4, CD 16. Это свидетельствовало об увеличении функционально активных лимфоцитов в популяции лимфоцитов (CD25) и появлении натуральных киллеров (CD56) - эффекторных клеток врожденного иммунитета.

На мышах были проведены эксперименты с 2 типами опухолей -меланомой В16 и карциномой яичников. Мы обнаружили, что при 5-кратной схеме иммунизации рБТШ+ЛПС в дозах 20 мкг/мышь или 100 мкг/мышь вызывал значимое торможение роста опухоли меланомы В16, в то время как на модели карциномы яичников противоопухолевой активности препарата выявлено не было.

Подобный эффект, по-видимому, можно объяснить тем, что рБТШ+ЛПС с одной стороны усиливает воспалительную реакцию за счет выброса провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-a, создавая защитный инфильтрационный вал вокруг опухоли, а с другой - активирует эффекторные клетки врожденного иммунитета, натуральные киллеры, которые осуществляют непосредственный лизис опухолевых клеток. Однако остается не ясным, почему в отношении одних опухолей данный механизм срабатывает, а в отношении других — противоопухолевого эффекта достичь не удается.

Ряд исследователей полагает, что БТШ могут вызывать аутоиммунные и аллергические заболевания. В некоторых работах показано, что введение экзогенного БТШ вызывает образование аутоантител к различным органам и тканям [167, 150, 44]. Другие авторы считают, что освободившийся из клеток БТШ приобретает свойства аутоантигена, «сигнала опасности», мобилизующего иммунную систему [104]. Однако БТШ находится в кровотоке и у здоровых людей [176]. Следовательно, необходимо было установить, образуются ли аутоантитела в ответ на иммунизацию рБТШ+ЛПС. Мы изучили сыворотки мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС (в которых определялся высокий титр антител к БТШ), на наличие IG-аутоантител к некоторым органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин). В итоге, таких антител обнаружено не было.

Проведенное исследование выявило перспективное направление создания неспецифической защиты против патогенов разных таксономических групп с помощью рБТШ+ЛПС. Очевидно, можно использовать рекомбинантный БТШ+ЛПС для активации внутриклеточных механизмов с поляризацией иммунного ответа и последующей активацией адаптивного иммунитета. Неизвестно, насколько эффективным будет данный препарат в клинической практике. Однако уже сейчас ясно, что рБТШ+ЛПС, действуя через TLRs врожденного иммунитета, активирует и балансирует иммунный ответ за счет уникальных возможностей, заложенных внутри клетки.

Изучив эти сложные механизмы на молекулярно-клеточном уровне, можно будет создавать с целью защиты целенаправленный иммунный ответ не только к разнообразным бактериальным и вирусным патогенам, но и к опухолевым антигенам, которые в настоящее время не являются качественными маркерами новообразований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Воробьёв, Денис Сергеевич, 2009 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград. 1962. - 180С.

2. Банников Г.А., Гелынтейн В.И., Глейберман B.C. и др. Явления индукции и дифференцировки при опухолевом росте. Изд-во «Наука» Москва. - 1981. - 262С.

3. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. Изд-во «Практика». — Москва. 1999. — 459С.

4. Дейчман Г.И. — Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение новых механизмов защиты. // Биохимия 2000. - №65. - С.92-111.

5. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Кузьмина Л.А. Итоги экспериментального и клинического изучения поликомпонентной вакцины из антигенов условно патогенных микроорганизмов. // Журн. микробиол. 1997. - №6. - С.96-101.

6. Киселев В.И., Северин Е.С., Пальцев М.А. Противоопухолевые вакцины. Белки теплового шока как индукторы противоопухолевого иммунитета. // Молекул, медицина. 2005. - №1. - С.3-10.

7. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке. // Цитология. - 2000. - Т.42. - С.323-342.

8. Мюльберг А.А. Фолдинг белка: Учебное пособие. СпбУ. - 2004. -156С.

9. Никитин К.Д., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока. // РБЖ. - 2007. — Т.6. - N.2. - С.3-12.

10. Онищенко Г .Г., Пальцев М.А.,' Зверев В.В. и др. Биологическая безопасность. Изд-во «Медицина». Москва. — 2006. - 304С.

11. Потебня Г.П. Противоопухолевые вакцины — перспективное терапевтическое направление в онкологии. // Статья опубликована на сайте: www.medafarm.ru

12. Свешников П.Г., Малайцев В.В., Киселев В.И. Функции белков теплового шока в системе адаптивного иммунитета. Конструирование вакцин. // Журн. микробиол. 2007. - №6. - С.108-117.

13. Ситдикова С.М., Киселевский М.И., Сельчук В.Ю. и др. Оценка эффективности иммунотерапии карциномы яичников мышей САО-1 вакцинами на основе дендритных клеток. // Бюл. экспер. биол. — 2009. Т. 147. - №2. - С.187-189.

14. Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П. Аутоантитела к ДНК и иммуноферментный метод их определения. // Сб. Трудов НИИВС им. И.И. Мечникова «Иммуноферментный анализ в диагностике заболеваний» М. - 1989. - С.110-125.

15. Amlie-Lefond С., Paz D.A., Connelly М.Р. et al. Innate immunity for biodefense: a strategy whose time has come. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2005. - Vol.116. -N.6. - P.1334-1342.

16. Arnold D., Faath S., Rammensee H., Schild H. Cross-priming of minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T cells upon immunization with the heat shock protein gp96. // J. Exp. Med. - 1995. - Vol.182. -N.3. — P.885-889.

17. Arnold-Schild D., Hanau D., Spehner D. et al. Cutting edge: receptormediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. // J. Immunol. 1999. - Vol.162. - N.7. - P.3757-3760.

18. Asea A. Hsp72 release: mechanisms and methodologies. // Methods. -2007. - Vol.43. -N.3. - P. 194-198.

19. Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of Hsp72. //Exerc. Immunol. Rev. - 2005. - Vol.ll. -P.34-45.

20. Asea A., Kraeft S.K., Kurt-Jones E.A. et al. HSP70 stimulates cytokine production through a CD14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. // Nat. Med. - 2000. - Vol.6. - P.435-442.

21. Basu S., Binder R.J., Ramalingam Т., Srivastava P.K. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. // Immunity. - 2001. - Vol. 14. - N.3. - P.303-313.

22. Basu S., Srivastava P.K. Calreticulin, a peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity. // J. Exp. Med. - 1999. - Vol.189. -N.5. -P.797-802.

23. Basu S., Srivastava P.K. Heat shock proteins: the fountainhead of innate and adaptive immune responses. // Cell Stress Chaperones. — 2000. -Vol.5.-N.5.-P.443-451.

24. Bechtold D.A., Rush S.J., Brown I.R. Localization of the heat-shock protein Hsp70 to the synapse following hyperthermic stress in the brain. // J. Neurochem. - 2000. - Vol.74. - P.641-646.

25. Becker Т., Hartl F.U., Wieland F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. // J. Cell Biol. - 2002. -Vol.158. -N.7. - P.1277-1285.

26. Beere H.M., Green D.R. Stress management heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. // Trends Cell Biol. - 2001. - Vol. 11. - N. 1. -P.6-10.

27. Beere H.M., Wolf B.B., Mosser D.D. et al. Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. // Nat. Cell Biol. - 2000. - Vol.2. - P.469-475.

28. Belli F., Testori A., Rivoltini L. et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous tumor-derived heat shock protein gp96-peptide complexes: clinical and immunologic findings. // J. Clin. Oncol. -2002. - Vol.20. -P.4169-4180.

29. Benjamin I.J., McMillan D.R. Stress heat shock proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. // Circ. Res. - 1998. — Vol.83.-N.2.-P.117-132.

30. Binder R.J., Han D.K., Srivastava P.K. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. //Nat. Immunol. -2000. - Vol.1. -N.2. -P.151-155.

31. Blachere N.E., Li Z., Chandawarkar R.Y. et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity. // J. Exp. Med'. - 1997. -Vol.186. -N.8. -P.1315-1322.

32. Blachere N.E., Udono H., Janetzki S. et al. Heat shock protein vaccines against cancer. // J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. - 1993. -Vol.14.-N.4.-P.352-356.

33. Bolhassani A., Rafati S. Heat-shock proteins as powerful weapons in vaccine development. // Expert Rev. Vaccines 2008. - Vol.7. - N.8. -P.l 185-1199.

34. Bonato V.L., Lima V.M., Tascon R.E. et al. Identification and characterization of protective T cells in hsp65 DNA-vaccinated and Mycobacterium tuberculosis-infected mice. // Infect. Immun. - 1998. -Vol.66.-N.1.-P.169-175.

35. Boon Т., van der Bruggen P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. // J. Exp. Med. - 1996. - Vol.183. - N.3. - P.725-729.

36. Born W., Hall L., Dallas A. et al. — Recognition of a peptide antigen by heat shock-reactive gamma delta T lymphocytes. // Science. 1990. -Vol.249. - N.4964. - P.67-69.

37. Bosshart H., Heinzelmann M. Targeting bacterial endotoxin: two sides of a coin. // Ann. N Y Acad. Sci. 2007. - Vol.1096. - P.l-17.

38. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1968. - Vol.97. - P.7.

39. Bulut Y., Michelsen K.S., Hayrapetian L. et al. Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins use diverse toll-like receptor pathways to active pro-inflammatory signals. // The Journal of Biological Chemistry. -2005. Vol.280. -N.22. -P.20961-20967.

40. Calderwood S.K., Mambula S.S., Gray P.J. Extracellular heat shock proteins in cell signaling and immunity. // Ann. N Y Acad. Sci. 2007. -Vol.1113. -P.28-39.

41. Chauhan S.K., Tripathy N.K., Sinha N. et al. Cellular and humoral immune responses to mycobacterial heat shock protein-65 and its human homologue in Takayasu's arteritis. // Clin. Exp. Immunol. 2004. -Vol.138.-P.547-553.

42. Chen D., Androlewicz M.J. Heat shock protein 70 moderately enhances peptide binding and tranport by the transporter associated with antigen processing. // Immunol. Lett. - 2001. - Vol.75. - N.2. - P.143-148.

43. Chen H.C., Guh J.Y., Tsai J.H., Lai Y.H. Induction of heat shock protein 70 protects mesangial cells against oxidative injury. // Kidney Int. - 1999. - Vol.56. - N.4. - P. 1270-1273.

44. Ciocca D.R., Calderwood S.K. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications. // Cell Stress Chaperones. -2005. - Vol.10. -N.2. -P.86-103.

45. Cohen I.R., Young D.B. — Autoimmunity, microbial immunity and the immunological homunculus. // Immunol. Today. — 1991. — Vol.12. — N.4. — P.105-110.

46. Corcoran L., Vremec D., Febbraio M. et al. Differential regulation of CD36 expression in antigen-presenting cells: Oct-2 dependence in В lymphocytes but not dendritic cells or macrophages. // Int. Immunol. -2002. - Vol.14. -N.10. - P. 1099-1104.

47. Del Giudice G., Gervaix A., Costantino P. et al. — Priming to heat shock proteins in infants vaccinated against pertussis. // J. Immunol. 1993. — Vol.150. -N.5. - P.2025-2032.

48. Delneste Y. Scavenger receptors and heat-shock protein-mediated antigen cross-presentation. // Biochem. Soc. Trans. - 2004. - Vol.32'. -N.4. - P.633-635.

49. Delneste Y., Magistrelli G., Gauchat J. et al. Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. // Immunity. — 2002. — Vol.17.-N.3.-P.353-362.

50. Donawho C., Kripke M.L. Immunogenicity and cross-reactivity of syngeneic murine melanomas. // Cancer Commun. — 1990. - Vol.2. -N.3. -P.101-107.

51. Ellis R.J. The molecular chaperone concept. // Semin. Cell Biol. - 1990. -N.l. -P.l-9.

52. Feder M.E., Hofmann G.E. Heat shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. // Annu Rev. Physiol. - 1999. - Vol.61. -P.243-282.

53. Ferrero R.L., Thiberge J.M., Kansau I. et al. The GroES homolog of

54. Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - Vol.92. - N.14. - P.6499-6503.

55. Flanagan S.W., Ryan A.J., Gisolfi C.V., Moseley P.L. Tissue-specific HSP70 response in animals undergoing heat stress. // Am. J. Physiol. — 1995. Vol.268. -N.l. -P.28-32.

56. Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. // Ann. Rev. Biochem. - 2001. - Vol.70. - P.603-664.

57. Fu Y.X., Vollmer M., Kalataradi H. et al. Structural requirements for peptides that stimulate a subset of gamma delta T cells. // J. Immunol. -1994. - Vol.152.-N.4. - P.1578-1588.

58. Gastpar R., Gehrmann M., Bausero M.A. et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. // Cancer Res. - 2005. - Vol.65. - N.12. -P.5238-5247.

59. Gastpar R., Gross C., Rossbacher L. et al. — The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. // J. Immunol. 2004. - Vol.172. - N.2. — P.972-980.

60. Gearing A.J.H. — Targeting toll-like receptors for drug development: a summary of commercial approaches. // Immunol, and Cell Biol. — 2007. -Vol.85.-P.490-494.

61. Gomez F.J., Allendoerfer R., Deepe G.S. Vaccination with recombinant heat shock protein 60 from Histoplasma capsulatum protects mice againstpulmonary histoplasmosis. // Infect. Immun. 1995. - Vol.63. - N.7. -P.2587-2595.

62. Gosslau A., Ruoff P., Mohsenzadeh S. et al. Heat shock and oxidative stress-induced exposure of hydrophobic protein domains as common signal in the induction of hsp68. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276. -N.3. -P.1814-1821.

63. Gunn J.S., Ernst R.K. The structure and function of Francisella lipopolysaccharide. // Ann. N Y Acad. Sci. 2007. - Vol.1105. - P.202-218.

64. Guzhova I.V., Arnholdt A.C., Darieva Z.A. et al. Effects of exogenous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization. // Cell Stress Chaperones. - 1998. - Vol.3. - P.67-77.

65. Guzhova I.V., Kislyakova K., Moskaliova O. et al. In vitro studies show that Hsp 70 can be released by glia and that exogenous Hsp 70 can enhance neuronal stress tolerance. // Brain Res. - 2001. - Vol.914. - P.66-73.

66. Haregewoin A., Soman G., Horn R.C., Finberg R.W. Human gamma delta+ T cells respond to mycobacterial heat-shock protein. // Nature. -1989. - Vol.340. - N.6231. - P.309-312.

67. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding. // Nature. -1996.-Vol.381.-P.571-579.

68. Henderson В., Allan E., Coates A.R. Stress wars: the direct role of host and bacterial molecular chaperones in bacterial infection. // Inf. and Immunity. - 2006. - Vol.74. - N.7. - P.3693-3706.

69. Hiromatsu K., Yoshikai Y., Matsuzaki G. et al. A protective role gamma/delta T cells in primary infection with Listeria monocytogenes in mice. // J. Exp. Med. - 1992. - Vol.175. -N.l. - P.49-56.

70. Holoshitz J., Koning F., Coligan J.E. et al. Isolation of CD4- CD8mycobacteria-reactive T lymphocyte clones from rheumatoid arthritis synovial fluid. //Nature. 1989. - Vol.339. -N.6221. -P.226-229.

71. Hsu K.F., Hung C.F., Cheng W.F. et al. Enhancement of suicidal DNA vaccine potency by linking Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70 to an antigen. // Gene Ther. -2001. - Vol.8.-N.5.- P.376-383.

72. Ishii K.J., Ito S., Tamura T. et al. CpG-activated Thyl.2+ dendritic cells protect against lethal Listeria monocytogenes infection. // Eur. J. Immunol. 2005. - Vol.35. - N.8. - P.2397-2405.

73. Ito A., Fujioka M., Tanaka K. et al. — Screening of cytokines to enhance vaccine effects of heat shock protein 70-rich tumor cell lysate. // J. Biosci. Bioeng. -2005. Vol.100. -N.l. -P.36-42.

74. Janetzki S., Palla D., Rosenhauer V. et al. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study. // Int. J. Cancer. - 2000. - Vol.88. - N.2. -Р.232-238.

75. Javid В., MacAry P.A., Lehner PJ. — Structure and function: heat shock proteins and adaptive immunity. // J. Immunol. 2007. - Vol.179. - N.4. -P.2035-2040.

76. Kaufmann S.H. — Heat shock proteins and the immune response. // Immunol. Today.- 1990.-Vol. 11.-N.4.-P.129-136.

77. Kaufmann S.H. — Heat-shock proteins and pathogenesis of bacterial infections. // Springer Semin. Immunopathol. 1991. - Vol.13. - N.l. -P.25-36.

78. Kaufmann S.H., Schoel В., Wand-Wurttenberger A. et al. T-cells, stressproteins, and pathogenesis of mycobacterial infections. // Curr. Top Microbiol. Immunol. 1990. - Vol.155. -P.125-141.

79. Kaufmann S.H., Vath U., Thole J.E. et al. Enumeration of T cells reactive with Mycobacterium tuberculosis organisms and specific for the recombinant mycobacterial 64-kDa protein. // Eur. J. Immunol. - 1987. -Vol.17.-N.3.-P.351-357.

80. Kelty J.D., Noseworthy P.A., Feder M.E. et al. Thermal preconditioning and heat-shock protein 72 preserve synaptic transmission during thermal stress. // J. Neurosci. - 2002. - Vol.22. - P.RC193.

81. Kimura Y., Tomida S., Matsumoto Y et al. Evidence for the early recruitment of T-cell receptor gamma delta+ T cells during rat listeriosis. //Immunology. - 1996. - Vol.87. -N.l. -P.21-28.

82. Kimura Y., Yamada K., Sakai T. et al. The regulatory role of heat shock protein 70-reactive CD4+ T cells during rat listeriosis. // Int. Immunol. -1998. - Vol.10. - N.2. - P. 117-130.

83. King Y.T., Lin C.S., Lin J.H., Lee W.C. Whole-body hyperthermia-induced thermotolerance is associated with the induction of heat shock protein 70 in mice. // J. Exp. Biol. 2002. - Vol.205. - P.273-278.

84. Koga Т., Wand-Wurttenberger A., DeBruyn J. et al. T cells against a bacterial heat shock protein recognize stressed macrophages. // Science. -1989. - Vol.245. - N.4922. - P. 1112-1115.

85. Kol A., Bourcier Т., Lichtman A.H., Libby P. Chlamydial and human heat shock protein 60s activate human vascular endothelium, smooth muscle cells, and macrophages. // J. Clin. Invest. — 1999. — Vol.103. — N.4. - P.571-577.

86. Kornbluth R.S., Stone G.W. Immunostimulatory combinations: designing the next generation of vaccine adjuvants. // J. Leukoc. Biol. -2006. - Vol.80. - P.1084-1102.

87. Krause S.W., Gastpar R., Andreesen R. et al. Treatment of colon andlung cancer patients with ex vivo heat shock protein 70-peptide-activated, autologous natural killer cells: a clinical phase I trial. // Clin. Cancer Res.- 2004. Vol.10. - P.3699-3707.

88. Li Z., Srivastava P.K. A critical contemplation on the role of heat shock proteins in transfer of antigenic peptides during antigen presentation. // Behring Inst. Mitt. - 1994. -N.94. - P.37-47.

89. Lindquist S. The heat-shock responses. // Annu Rev. Biochem. 1986. -Vol.55.-P.1151-1191.

90. Lowrie D.B., Tascon R.E., Colston M.J., Silva C.L. Towards a DNA vaccine against tuberculosis. // Vaccine. - 1994. - Vol.12. - B.16. -P.1537-1540.

91. MacAry P.A., Javid В., Floto R.A. et al. HSP70 peptide binding mutants separate antigen delivery from dendritic cell stimulation. // Immunity. -2004. - Vol.20. -N.l. -P.95-106.

92. Makki A., Weidt G., Blachere N.E. et al. Immunization against a dominant antigen abrogates immunogenicity of the tumor. // Cancer Immunity. - 2002. - Vol.2. - P.4.

93. Margulis B.A., Sandler S., Eizirik D., Welsh N., Welsh M. Liposomal delivery of purified heat shock protein hsp70 into rat pancreatic cells as protection against interleukin-ip-impaired B-cell disfunction. // Diabetes.1991. Vol.40. - P. 1418-1422.

94. Matthews R., Burnie J. The role of hsp90 in fungal infection. // Immunol. Today. - 1992. - Vol.13. -N.9. - P.345-348.

95. Matthews R.C., Burnie J.P., Howat D. et al. Autoantibody to heat-shock protein 90 can mediate protection against systemic candidosis. -Immunology. - 1991. - Vol.74. -N.l. -P.20-24.

96. McLennan N., Masters M. GroE is vital for cell-wall synthesis. // Nature. - 1998. - Vol.392. -N.6672. -P.139.

97. Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of theimmune response. // Nature. 2007. - Vol.449. - P.819-826.

98. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. - 1997. - Vol.388. -P.394-397.

99. Menoret A., Chandawarkar R.Y., Srivasrava P.K. // Natural autoantibodies against heat-shock proteins hsp70 and gp96: implications for immunotherapy using heat-shock proteins. // Immunology. 2000. -Vol.101.-N.3.-P.364-370.

100. Monach P.A., Meredith S.C., Siegel C.T., Schreiber H. A unique tumor antigen produced by a single amino acid substitution. // Immunity. - 1995. -Vol.2. -N.1.-P.45-59.

101. Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. // Int. J. Hyperthermia. - 2009. - Vol.25. -N.3. - P. 169-175.

102. Multhoff G. Heat shock proteins in immunity. // Handb. Exp. Pharmacol. -2006. -N. 172. -P.279-304.

103. Nieland T.J., Tan M.C., Monne-van Muijen M. et al. Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/GRP94. //Proc. Natl. Acad. Sci. - 1996. - Vol.93. -N.12. -P.6135-6139.

104. Noll A., Autenrieth I.B. Immunity against Yersinia enterocolitica by vaccination with Yersinia HSP60 immunostimulating complexes or Yersinia HSP60 plus interleukin-12. // Infect. Immun. - 1996. - Vol.64. -N.8. - P.2955-2961.

105. Noll A., Roggenkamp A., Heesemann J., Autenrieth I.B. Protective rolefor heat shock protein-reactive alpha beta T cells in murine yersiniosis. // Infect. Immun. 1994. - Vol.62. -N.7. -P.2784-2791.

106. O'Brien R.L., Fu Y.X., Cranfill R. et al. Heat shock protein Hsp60-reactive gamma delta cells: a large, diversified T-lymphocytes subset with highly focused specificity. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1992. - Vol.89. -N.10. - P.4348-4352.

107. Ohtsuka K., Suzuki T. Roles of molecular chaperones in the nervous system. //Brain Res. Bull. -2000. - Vol.53. -P.141-146.

108. Osterloh A., Meier-Stiegen F., Veit A. et al. Lipopolysaccharide-free heat shock protein 60 activates T cells. // J. Biol. Chem. - 2004. -Vol.279. - N.46. - P.47906-47911.

109. Panjwani N.N., Popova L., Srivastava P.K. — Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. // J. Immunol. — 2002. -Vol.168. -N.6. -P.2997-3003.

110. Parmiani G., Testori A., Maio M. et al. — Heat shock proteins and their use as anticancer vaccines. // Clin. Cancer Res. 2004. - Vol.10. -P.8142-8146.

111. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. // Annu Rev. Genet. - 1993. - Vol.27. -P.437-496.

112. Peng M., Chen M., Ling N. et al. Novel vaccines for the treatment of chronic HBV infection based on mycobacterial heat shock protein 70. // Vaccine. - 2006. - Vol.24. - P.887-896.

113. Querec Т., Bennouna S., Alkan S. et al. Yellow fever vaccine YF-17D activates multiple dendritic cell subsets via TLR2, 7, 8 and 9 to stimulate polyvalent immunity. // J. Exp. Med. 2006. - Vol.203. - N.2. - P.413-424.

114. Quintana F.J., Cohen I.R. DNA vaccines coding for heat-shock proteins (HSPs): tools for the activation of HSP-specific regulatory T cells. //

115. Expert Opin. Biol. Ther. 2005. - Vol.5. - N.4. - P.545-554.

116. Radons J., Multhoff G. Immunostimulatory functions of membrane-bound and exported heat shock protein 70. // Exerc. Immunol. Rev.2005.-Vol.11.-P. 17-33.

117. Ren W., Strube R.,Zhang X. Et al.- Potent tumor-specific immunity induced by an in vivo heat shock protein-suicide gene-based tumor vaccine.// Canc.Res. 2004. -Vol.64.-P.6645-6651.

118. Ritossa F.M. A new puffing pattern induced by a temperature shock and DNP in Drosophila. // Experiencia. - 1962. - Vol.18. - P.571-573.

119. Romagne F. Current and future drugs targeting one ckass of innate immunity receptors: the Toll-like receptors. // Drug Discov. Today. -2007. - Vol. 12. - N. 1/2. - P.80-87.

120. Rosat J.P., Schreyer M., Ohteki T. et al. Selective expansion of activated V delta 4+ cells during experimental infection of mice with Leishmania major. I I Eur. J. Immunol. - 1994. - Vol.24. - N.2. - P.496-499.

121. Russo D.M., Armitage R.J., Barral-Netto M. et al. J. Immunol. - 1993. -Vol.151. -N.7. -P.3712-3718.

122. Sastry S., Linderoth N. — Molecular mechanisms of peptide loading by the tumor rejection antigen/heat shock chaperone gp96 (GRP94). // J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274. -N. 17. - P.12023-12035.

123. Schmitt E., Gehrmann M., Brunet M. et al. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy. // J. Leukoc. Biol. - 2007. - Vol.81. - N. 1. - P. 15-27.

124. Segal B.H., Wang X-Y., Dennis C.G. et al. Heat shock proteins as vaccine adjuvants in infections and cancer. // Drug Discov. Today.2006. Vol. 11. - N. 11 -12. - P.534-540.

125. Shinnick T.M. Heat shock proteins as antigens of bacterial and parasitic pathogens. // Curr. Top Microbiol. Immunol. - 1991. - Vol.167. - P.145-160.

126. Silva C.L., Lowrie D.B. A single mycobacterial protein (hsp 65) expressed by a transgenic antigen-presenting cell vaccinates mice against tuberculosis. // Immunology. - 1994. - Vol.82. - N.2. - P.244-248.

127. Silva C.L., Silva M:F., Pietro R.C., Lowrie D.B. Protection against tuberculosis by passive transfer with T-cell clones recognizing mycobacterial heat-shock protein 65. // Immunology. - 1994. - Vol.83. -N.3. -P.341-346.

128. Srivastava P.K. Purification of heat shock protein-peptide complexes for use in vaccination against cancers and intracellular pathogens. // Methods. - 1997. - Vol.12. -N.2. - P. 165-171.

129. Srivastava P.K., Callahan M.K., Mauri M.M. Treating human cancers with heat shock protein-peptide complexes: the road ahead. // Expert Opin. Biol. Ther. - 2009. - Vol.9. -N.2. - P. 179-186.

130. Srivastava P.K., Das M.R. The serologically unique cell surface antigen of Zajdela ascitic hepatoma is also its tumor-associated transplantation antigen. // Int. J. Cancer. - 1984. - Vol.33. -N.3. - P.417-422.

131. Srivastava P.K., DeLeo A.B., Old L.J. Tumor rejection antigens of chemically induced sarcoms of inbred mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. -1986. - Vol.83. - N.l0. -P.3407-3411.

132. Srivastava P.K., Heike M. Tumor-specific immunogenicity of stress-induced proteins: convergence of two evolutionary pathways of antigenpresentation? // Semin. Immunol. 1991. - Vol.3. -N.l. -P.57-64.

133. Srivastava P.K., Maki R.G. Stress-induced proteins in immune response to cancer. // Curr. Top Microbiol. Immunol. - 1991. - Vol.167. - P. 109123.

134. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S. et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. // Immunity. - 1998. - Vol.8. -P.657-665.

135. Srivastava P.K., Old L.J. — Individually distinct transplantation antigens of chemically induced mouse tumors. // Immunol. Today. 1988. - Vol.9. -N.3. -P.78-83.

136. Srivastava P.K., Udono H., Blachere N.E., Li Z. — Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming. // Immunogenetics. 1994. - Vol.39. - N.2. - P.93-98.

137. Steinhoff U., Schotl В., Kaufmann S.H. Lysis of interferon-gamma activated Schwann cell by cross-reactive CD8+ alpha/beta T cells with specificity for the mycobacterial 65 kd heat shock protein. // Int. Immunol. - 1990. - Vol.2. -N.3. -P.279-284.

138. Suto R., Srivastava P.K. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. // Science. - 1995. - Vol.269. — P.1585-1588.

139. Tamura Y., Peng P., Liu К et al. — Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations. // Science. -1998. Vol.278. - P.l 17-120.

140. Tascon R.E., Colston M.J., Ragno S. et al. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. // Nat. Med. - 1996. - Vol.2. - N.8. -P.888-892.

141. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. // Mol. Biology. - 1974. - Vol.84. - N.3. - P.389-398.

142. Todryk S.M., Gough M.J., Pockley A.G. Facets of heat shock protein 70 show immunotherapeutic potential. // Immunol. - 2003. - Vol.110. - P.l-9.

143. Toomey D., Conroy H., Jarnicki A.G. et al. — Therapeutic vaccination with dendritic cells pulsed with tumor-derived Hsp70 and a COX-2 inhibitor induces protective immunity against В16 melanoma. // Vaccine. 2008. - Vol.26. - P.3540-3549.

144. Trinchieri G., Sher A. Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence. // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - Vol.7. - N.3. - P. 179190.

145. Tsan M.F., Gao B. Heat shock protein and innate immunity. // Cell Mol. Immunol. - 2004. - Vol. 1. - N.4. - P.274-279.

146. Tsan M-F., Gao B. Heat shock proteins and immune system. // J. Leukoc. Biol. - 2009. - Vol.85. - N.6. - P.905-910.

147. Tsuji M., Mombaerts P., Lefrancois L. et al. — Gamma delta T cells contribute to immunity against the liver stages of malaria in alpha beta T-cell-deficient mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - Vol.91. - N.l. -P.345-349.

148. Udono H., Srivastava P.K. Comparison of tumor-specific immunogenicities of stress-induced proteins gp96, hsp90, and hsp70. // J.1.munol. 1994. - Vol.152. - N.ll. -P.5398-5403.

149. Vabulas R.M., Ahmad-Nejad P., Ghose S. et al. HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/interleukin-1 receptor signal pathway. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol.277. -N. 17. -P.15107-15112.

150. Wang H-H., Mao C-Y., Teng L-S., Cao J. — Recent advances in heat shock protein-based cancer vaccines. // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. —2006. Vol.5. - N. 1. - P.22-27.

151. Wang H-q., Hu C-x., Hu L. et al. Anti-tumor effect of heat shock protein 70-peptide complexes on A-549 cells. // Chinese J. Cancer Res. —2007. Vol.19. -N.3. -P.210-215.

152. Wang Y., Kelly C.G., Karttunen J.T. et al. CD40 is a cellular receptor mediating mycobacterial heat shock protein 70 stimulation of CC-chemokines. // Immunity. - 2001. - Vol.15. -N.6. - P.971-983.

153. Wearsch P.A., Nicchitta C.V. Interaction of endoplasmic reticulum chaperone GRP94 with peptide substrates is adenine nucleotide-independent. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol.272. -N.8. - P.5152-5156.

154. Wu Y., Wan Т., Zhou X. et al. Hsp70-like protein 1 fusion proteinenhances induction of carcinoembryonic antigen-specific CD8+ CTL response by dendritic cell vaccine. // Cancer Res. 2005. - Vol.65. -N. 11. — P.4947-4954.

155. Xu Q. Role of heat shock proteins in atherosclerosis. // Arterioscler. Thromb. Vacs. Biol. 2002. - Vol.22. -N.10. - P. 1547-1559.

156. Young D.B. — Stress-induced proteins and the immune response to leprosy. // Microbiol. Sci. 1988. - Vol.5. -N.5. - P.143-146.

157. Young R.A. — Stress proteins and immunology. // Annu Rev. Immunol. -1990.-Vol.8.-P.401-420.

158. Zanin-Zhorov A., Cahalon L., Tal G. et al. Heat shock protein 60 enhances CD4+CD25+ regulatory T. cell function via innate TLR2 signaling. // J. Clin. Invest. - 2006. - Vol. 116. - N.7. - P.2022-2032.

159. Zanin-Zhorov A., Nussbaum G., Franitza S. et al. T cells respond to heat shock protein 60 via TLR2: activation of adhesion and inhibition of chemokine receptors. // FASEB J. - 2003. - Vol.17. - N.ll. - P.1567-1569.

160. Zhang Z.-Y., Zhang Z., Schluesener H.J. Toll-like receptor-2, CD 14 and heat-shock protein 70 in inflammatory lesions of rat experimental autoimmune neuritis. // Neurosci. 2009. - Vol.159. - P.136-142.

161. Zheng H., Dai J., Stoilova D., Li Z. Cell surface targeting of heat shock protein gp96 induces dendritic cell maturation and antitumor immunity. // J. Immunol. 2001. - Vol. 167. - N. 12. - P.6731 -673 5.

162. Zhu X., Zhao X., Burkholder W.F. et al. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone Dnak. // Science. - 1996. - Vol.272. -N.5268. -P.1606-1614.

163. Zugel U., Kaufmann S.H. Activation of CD8 T cells with specificity for mycobacterial heat shock protein 60 in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin-vaccinated mice. // Infect. Immun. - 1997. - Vol.65. -N.9. - P.3947-3950.

164. Zugel U., Kaufmann S.H. Role of heat shock proteins from and pathogenesis of infectious diseases. // Clin. Microbiol. Rev. - 1999. -Vol.12.-N.1.-P.19-39.