Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Яковлева, Марина Андреевна

• Яковлева, Марина Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яковлева, Марина Андреевна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Липофусциновые гранулы.

1.1.1. Образование липофусциновых гранул в клетках ретинального пигментного эпителия.

1.1.2. Содержание липофусциновых гранул в клетках ретинального пигментного эпителия в зависимости от патологии и возраста.

1.1.3. Физико-химические свойства липофусциновых гранул.

1.13.1. Спектральные характеристики.

1.1.3.2. Генерация активных форм кислорода при действии света.

1.1.3.3. Спектр действия фотопоглощения кислорода липофусциновыми гранулами и его хлороформным экстрактом.

1.2. Флуорофоры липофусциновых гранул.

1.2.1. Зрительный цикл. Полностью m/мшс-ретиналь - источник флуорофоров липофусциновых гранул.

1.2.2. Продукты превращения полностью-яи/мнс-ретиналя.

1.2.2.1. М-ретинипиден-№ретшшлэтаноламин (А2Е) и его производные.

1.2.2.2. А2-дигидропиридип-фосфатидилэтаноламин и А2дигидропиридин-этаноламин.

1.2.2.3. Полностыо-транс-ретиналь димер и его производные.

1.2.3. Ретинил пальмитат и фототокснчность липофусциновых гранул глаза человека, индуцированная синим светом.

1.2.4. Хлороформ растворимые и хлороформ нерастворимые компоненты липофусциновых гранул.

1.3. Флуорофоры липофусциновых гранул и аутофлуоресценция глазного дна как новый неинвазивный метод диагностики глазных заболеваний.

1.3.1. Основы и принципы аутофлуоресцентного анализа глазного

1.3.2. Особенности, проблемы и перспективы применения диагностического метода аутофлуоресценцин глазного дна.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологический материал для получения липофусциновых гранул - кадаверные глаза человека.

2.2. Выделение липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.

2.3. Регистрация спектров поглощения и флуоресценции суспензии липофусциновых гранул и их хлороформного экстракта, а также раствора А2Е в метаноле.

2.4. Получение хлороформного экстракта из суспензии липофусциновых гранул клеток ретинального пигментного эпителия.

2.5. Облучение суспензии липофусциновых гранул и их хлороформного экстракта, а также раствора А2Е в метаноле.

2.6. Окисление А2Е в темноте.

2.7. Разделение флуорофоров хлороформного экстракта из липофусциновых гранул методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.8. Химический синтез А2Е.

2.9. Масс-спсктрометрия А2Е и продуктов его окисления.

2.10. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Сравнительный анализ влияния видимого света на спектральные характеристики липофусциновых гранул и синтетического А2Е.

3.1.1. Изменение спектров поглощения липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом.

3.1.2. Изменение флуоресцентных свойств липофусциновых гранул и синтетического А2Е до и после их облучения видимым светом.

3.1.3. Спектры возбуждения флуоресценции суспензии липофусциновых гранул.

3.2. Изучение механизмов окисления А2Е как модельной системы.

3.3. Анализ содержания флуорофоров в хлороформном экстракте из липофусциновых гранул в зависимости от возраста доноров и действия видимого света на ЛГ.

3.3.1. Хроматографический анализ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул и А2Е в метаноле до и после их облучения видимым светом.

3.3.2. Зависимость относительного содержания различных флуорофоров в липофусциновых гранулах от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий (см. Приложение 1).

3.4. Изучение флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров и/или их групп в составе хлороформного экстракта липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.

3.4.1. Спектры поглощения суспензии и хлороформного экстракта липофусциновых гранул.

3.4.2. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использованием спектрофотометрии и изучение спектров поглощения отдельных фракций хлороформного экстракта из ЛГ.

3.4.3. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использованием флуоресцентной спектрофотометрии и изучение спектров флуоресценции отдельных фракций хлороформного экстракта ил ЛГ.

3.5. Флуоресцентный анализ нерастворимой фракции липофусциновых гранул.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Вызванные видимым светом изменения спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека, а также синтетического А2Е.

4.2. Изучение механизмов окисления А2Е как модельной системы.

4.3. Анализ содержания флуорофоров в хлороформном экстракте из липофусциновых гранул в зависимости от возраста доноров и действия видимого света на липофусциновые гранулы.

4.4. Изучение флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров и/или их групп в составе хлороформного экстракта липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.

4.5. Флуоресцентный анализ нерастворимой фракции липофусцинвых гранул.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека»

Актуальность проблемы

Липофусциновые гранулы (ЛГ) — сложные образования липиднобелковой природы, которые в течение жизни накапливаются в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) человеческого глаза. Долгое время они считались безопасным побочным продуктом жизнедеятельности клеток. Оказалось, однако, что ЛГ обладают способностью к фотоиндуцированной генерации активных форм кислорода (Островский и др., 1992; Boulton et al., 1993), что лежит в основе их потенциальной фототоксичности в отношении клетки РПЭ. Исследования последних лет выявили корреляцию между накоплением1 ЛГ в РПЭ и некоторыми офтальмологическими заболеваниями человека. Это, в первую очередь, старческая макулярная дегенерация сетчатки, которая является основной причиной слабовидения и слепоты пожилых людей, болезнь Штаргардта и другие дегенеративные заболевания. Фототоксичностью ЛГ может быть обусловлена опасность усугубляющего действия коротковолнового (фиолетово-синего) видимого света при дегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Структура и состав ЛГ клеток РПЭ; а также влияние процесса старения и действия света на них остаются малоизученными. Протеомный анализ белков ЛГ из клеток РПЭ показал, что в составе гранул присутствуют как специфические для наружных сегментов палочек (НСП) белки (например, рековерин), так и неспецифические белки цитоскелета, ферменты, белки-шапероны и канальные белки. Наличие фрагментов белков митохондриального происхождения показывает, что в формировании вещества липо фу спиновых гранул участвуют не только остатки обломков НСП, не до конца подвергшиеся химическому и ферментативному разложению, но и продукты аутофагоцитоза органелл клеток РПЭ. Показано, что, в отличие от липофусцина из клеток других тканей, флуорофоры ЛГ из РПЭ состоят в основном из производных ретиналя. Идентифицирован и подробно охарактеризован только один из флуорофоров - так называемый И-ретинилиден-1Ч-решнилэтаноламин, или А2Е. Существуют данные, что А2Е может вызывать фотоповреждение клеток.

В связи с этим понимание процессов, происходящих в , липофусциновых гранулах РПЭ глаза человека при действии видимого света (изменение содержания в них различных флуорофоров) и в зависимости от возраста, может пролить свет на понимание их роли в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза.

Цель диссертационной работы:

Изучить влияние видимого света и процесса старения доноров на состав флуорофоров, перешедших в хлороформный экстракт из ЛГ клеток РПЭ кадаверного глаза человека. Определить флуоресцентные характеристики флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ из клеток РПЭ. Провести сравнительную оценку вклада этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.

Основные задачи исследования:

1. Провести компонентный анализ флуорофоров/групп флуорофоров липофусциновых гранул, выделенных из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека, и определить их спектральные характеристики

2. Сравнить компонентный состав флуорофоров/групп флуорофоров из липофусциновых гранул, выделенных из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека различных возрастных групп.

3. Исследовать действие видимого света на липофусциновые гранулы, их флуорофор А2Е и другие компоненты хлороформного экстракта из липо фу сциновых гранул 4. Провести оценку возможного вклада отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из. липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. ,

Научная новизна

Впервые детально описаны; спектры флуоресценции отдельных флуорофоров/групп флуорофоров хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, выделенных из ретинального пигментного эпителия; кадаверных глаз человека; Проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции’ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Показано, что А2Е не является; основным флуорофором хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. ,

Показано, что с возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается.

Показано, что реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм; эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.

Научная и практическая ценность работы Полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение для понимания природы и состава флуорофоров, содержащихся и накапливающихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия с возрастом и при патологии. Знание спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, особенно в зависимости от возраста, представляет практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна, а именно для разработки его компонентного спектрального анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определены спектральные свойства отдельных флуорофоров/групп флуорофоров липофусциновых гранул клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека.

2. А2Е не является основным флуорофором в суммарном спектре флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают вещества, более полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.

3. С возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается.

4. Реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм, эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов; одним из которых является радикал супероксида.

Апробация диссертации и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. (Москва, 2007); итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007), итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); конференции и семинары по научным направлениям программы «Фундаментальные науки — медицине» (Москва, 2010).

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Яковлева, Марина Андреевна

выводы.

1. Из липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека выделены отдельные флуорофоры и их группы, и определены их флуоресцентные характеристики.

2. Показано, что А2Е не является основным флуорофором в суммарном спектре флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают флуорофоры, более полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.

3. Исследовано действие света на флуорофоры липофусциновых гранул и отдельно на А2Е а) Показано, что в результате фотоокисления флуорофоров липофусциновых гранул максимумы спектров их флуоресценции смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм. б) Показано, что при фотоокислении раствора А2Е образуются как эпокси-, так и фураноидные его формы, а сама реакция протекает при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.

4. Исследовано относительное содержание неокисленных и окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах в зависимости от возраста (кадаверные глаза без видимых офтальмологических патологий согласно протоколу, представленному МНТК «Микрохирургия глаза») а) Показано, что в процессе старения относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается. б) Регистрация флуоресценции неокисленных и окисленных форм флуорофоров может лежать в основе разработки компонентного спектрального анализа аутофлуоресценции глазного дна — нового неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных глазных заболеваний.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность Михаилу Аркадьевичу Островскому за чуткое руководство и предоставленную возможность работать в области липофусциногенеза; всем сотрудникам лаборатории физико-химических основ рецепции ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН, а особенно Татьяне Борисовне Фельдман — за внимание и поддержку.

Благодарю за соавторство, планирование, осуществление и обсуждение экспериментов Кононихина Алексея и Николаева Евгения Николаевича сотрудников ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН).

Благодарю Ходонова Андрея Александровича (профессор Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносов) за помощь в работе над диссертацией.

Благодарю Павла Павловича Зака и Александра Евгеньевича Донцова (сотрудников ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН) за доброжелательное отношение и помощь в обсуждении результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Яковлева, Марина Андреевна, 2011 год

1. Terman A., Brunk U. Т. Lipofuscin // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2004. — V. 36. — PP. 1400-1404.

2. Feeney L. Lipofuscin and melanin of human retinal pigment epithelium. Fluorescence, enzyme cytochemical, and ultrastructural studies // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1978. - V. 17(7). PP. 583-600.

3. Yin D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores // Free Radical Biology and Medicine. — 1996. — V. 21(6). — PP. 871-888.

4. Weiter J. J., Delori F. C., Wing G. L., Fitch K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1986. - V. 27. - PP. 145-152.

5. Katz M. L., Redmond Т. M. Effect of Rpe65 knockout on accumulation of lipofuscin fluorophores in the retinal pigment epithelium // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2001. — V. 42. PP. 3023-3030.

6. Katz M.L., Drea C.M., Eldred G.E., Hess H.H., Robison W.G.Jr. Influence of early photoreceptor degeneration on lipofuscin in' the retinal pigment epithelium // Experimental Eye Research. —1986. V. 43(4). — PP. 561-573.

7. Feeney-Bums L., Eldred G.E. The fate of the phagosome: conversion to 'age pigment' and impact in human retinal pigment epithelium // Transactions of the ophthalmological societies of the United Kingdom. 1983. - V. 103(4). -PP. 416-421.

8. Brunk U., Ericsson J.L. Electron microscopical studies on rat brain neurons. Localization of acid phosphatase and mode of formation of lipofuscin bodies // Journal of ultrastructure research. 1972. - V. 38(1). - PP. 1-15.

9. Clark V.M. The cell biology of the retinal pigment epithelium. In: Adler R., Färber D. (eds): The retina-A model for cell biology. Part II. // Orlando, FL.: Academic Press. - 1986.— PP. 129-168.

10. Каламкаров Г. P., Островский М. А. Молекулярные механизмы зрительной рецепции // М.: Наука. — 2002. С. 7.

11. Burke J.M., Skumatz С.М. Autofluorescent inclusions in long-term postconfluent cultures of retinal pigment epithelium // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1998. —V. 39(8). — PP. 1478-1486.

12. Geng L., Wihlmark U., Algvere P.V. Lipofuscin accumulation in iris pigment epithelial cells exposed to photoreceptor outer segments // Experimental Eye Research. 1999. - V. 69(5). — PP. 539-546.

13. Schutt F., Ueberle В., Schnolzer М., Holz F. G., Kopitz J. Proteome analysis of lipofiiscin in human retinal pigment epithelial cells // FEBS Lett. 2002. — V. 528.-PP. 217-221.

14. Murdaugh L.S., Mandai S., Dill A.E., Dillon J., Simon J.D., Gaillard E.R. Compositional studies of human RPE lipofiiscin: mechanisms of molecular modifications // Journal of Mass Spectrometry. — 2011. V. 46(1). — PP. 9095.

15. Boulton M.5 Rôzanowska М., Wess T. Ageing of the retinal pigment epithelium: implications for transplantation // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 2004. - V. 242(1). — PP. 76-84.

16. Delori F.C., Staurenghi G., Arend O., Dorey C.K., Goger D.G., Weiter J.J. In vivo measurement of lipofiiscin in Stargardt's disease—Fundus flavimaculatus // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1995. -V. 36(11).-PP. 2327-2331.

17. Nowak J.Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy // Pharmacological Reports. 2006. — V. 58(3). - PP. 353-363.

18. Островский M.A., Донцов A.E., Боултон М. Исследование про- и антиоксидантных свойств липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека // Биологические мембраны. -1991. Т. 8(11). - С. 1198-1200.

19. Boulton М., Dontsov А.Е., Ostrovsky М.А., Jarvis-Evans J., Svistunenko D. Superoxide radical generation by human RPE lipofiiscin: a photoinducibleeffect // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1992. - V.33(4). -PP. 919. .

20. Boulton М., Dontsov A.E., Ostrovsky M.A., Jarvis-Evans J., Svistunenko D. Lipofuscin is a photoinducible free radical generator // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1993. - V. 19: - PP. 201-204.

21. Донцов A.E., Сакина H.JL, Островский M.A- Разнонаправленностъ действия линофусциновых гранул и меланосом из ретинального пигментного эпителия глаза человека при фотоокислении кардиолипина// Биофизика. 1999. - Т. 44(5). — С. 880-886.

22. Marmorstein A.D., Marmorstein L.Y., Sakaguchi Н., Hollyfield J.G.

23. Spectral Profiling of Autofluorescence Associated with Lipofuscin, Bruch’s Membrane, and Sub-RPE Deposits in Normal and AMD Eyes // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2002. — V. 43(7). — PP; 2435-2441: . . ,

24. Rozanowska M:, Jarvis-Evans J., Korytowski W., Boulton М. E. Blue light-induced reactivity of retinal age pigment // Journal of Biological Chemistry.- 1995. -V. 270. PP. 18825-18830.

25. Pawlak A., Rozanowska М., Zareba М., Lamb L.E., Simon J.D., Sama T. Action spectra for the photoconsumption of oxygen by human ocularlipofuscin and lipofuscin extracts // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2002. - V. 403. - PP. 59-62.

26. Wassell J., Davies S., Bardsley W., Boulton M. The photoreactivity of the retinal age pigment lipofuscin // Journal of Biological Chemistry. 1999. — V. 274.-PP. 23828-23832.

27. Sakai N., Decatur J., Nakanishi K., Eldred G. Ocular age pigment “A2-E”: an unprecedented pyridinium bisretinoid // Journal of the American Chemical Society. 1996. -V. 148. - PP. 1559-1560.

28. Eldred G. E., Katz M. L. Fluorophores of the human retinal pigment epithelium: separation and spectral characterization // Experimental Eye Research. 1988. - V. 47. - PP. 71-86.

29. Bui T.V., Han Y., Radu R.A., Travis G.H., Mata N.L. Characterization of native retinal fluorophores involved in biosynthesis of A2E and lipofuscin-associated retinopathies // Journal of Biological Chemistry. — 2006. V. 281(26).-PP. 18112-18119.

30. Fishkin N.E., Jang Y.-P., Itagaki Y., Sparrow J.R., Nakanishi K. A2-Rhodopsin: a new fluorophore isolated from photoreceptor outer segments // Organic and Biomolecular Chemistry. 2003. - V. 1. - PP. 1101-1105.

31. Hargrave P.A. Rhodopsin structure, function and topography. The Friedenwald Lecture // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2001. -V. 42.-PP. 3-9.

32. Schoenlein R.W., Peteanu L.A., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision: femtosecond isomerization of rhodopsin // Science. 1991. - V. 254. -PP. 412-415.

33. Peteanu L.A., Schoenlein R.W., Wang Q., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision occurs in femtoseconds: complete blue and red spectral studies // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. -1993.-V. 90.-PP. 11762-11766.

34. Смитиенко O.A., Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Фельдман Т Б., Надточенко

35. В.А., Саркисов О.М., Островский М.А. Когерентные процессы при образовании первичных продуктов* фотолиза зрительного пигмента родопсина // Доклады академии наук. 2008. - Т. 421. - С. 1-5.

36. Kim J.E., Tauber M.J., Mathies R.A. Wavelength dependent cis-trans isomerization in vision // Biochemistry. — 2001. — V.40 (46). PP. 13774— 13778.

37. Rozanowska М., Sama T. Light-induced damage to the retina: role of rhodopsin chromophore revisited // Photochemistry and Photobiology. -2005.-V.81.-PP. 1305-1330.

38. Lamb T.D., Pugh E.N. Jr. Dark adaptation and the retinoid cycle of vision // Progress of retinal and eye research. 2004. - V. 23. - PP. 307-380.

39. Palczewski K., Jager S., Buczylko J., Crouch R.C., Bredberg D,L., Hofmann K.P., Asson-Batres M.A., Saari J.C. Rod Outer Segment Retinol Dehydrogenase: Substrate Specificity and role in phototransduction // Biochemistry. 1994. -V. 33. - PP. 13741-13750.

40. Fine S.L., Berger J.W., Maguire M.J. Age-related macular degeneration // The New England Journal of Medicine. — 2000. V. 342. - PP. 483-492.

41. Mata N.L, Weng J, Travis G.H. Biosynthesis of a major lipofuscin fluorophore in mice and humans with ABCR-mediated retinal and macular degeneration // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2000. - V. 97. - PP. 7154-7159.

42. Sachs K., Maretzki D., Meyer C.K., Hofmann K.P. Diffusible ligand all-/raws-retinal activates opsin via palmitoylation-dependent mechanism // Journal of Biological Chemistry. 2000. - V. 275(9). - PP. 6189-6194.

43. Buczylko J., Saari J.C., Crouch R.K., Palczewski K. Mechanisms of opsin activation // Journal of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - PP. 2062120630.

44. Bartl F.J., Ritter E., K.K.Hofmann Signaling states of rhodopsin: activationof light in active metarhodopsin II generates an all-/r<ms-retinal bound inactive state // Journal of Biological Chemistry. — 2001. — V. 276(32). — PP. 30161-30166. .

45. Jager S., Palczewski K., Hofmann K.P. Opsin/all-trans-Retinal Complex Activates Transducin by Different Mechanism Than Photolyzed Rhodopsin // Biochemistry. 1996. - V. 35. - PP. 2901-2908.

46. Beharry S., Zhong M., Molday R.S. N-retinylidene-phosphatidyl-ethanolamine is the preferred retinoid substrate for the photoreceptor-specific ABC transporter ABCA4 (ABCR) // Journal of Biological Chemistry. 2004. - V. 279. - PP. 53972-53979.

47. Weng J., Mata N.L., Azarian S.M., Tzekov R.T., Birch D.G., Travis G.H. Insights into the function of rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt’s disease from fenotype in aber knockout mice // Cell! — 1999. -V. 98.-PP. 13-23.

48. Saari J.C., Garwin G.G., Van Hooser J.P., Palczewski K. Reduction of all-trans-retinal limits regeneration of visual pigment in mice // Vision research.- 1998. V. 38. - PP. 1325-1333.

49. Katz M.L., Gao C-L., Rice L.M. Formation of lipofuscin-like fluorophores by reaction of retinal with photoreceptor outer segments and liposomes // Mechanisms of ageing and development. 1996. - V. 92. — PP. 159-174.

50. Darrow R.A., Darrow R.M., Organisciak D:T. Biochemical characterization of cell specific enzymes in light-exposed, rat retinas: oxidative loss of all-trans retinal dehydrogenase activity // Current Eye Research. — 1996. V.16.-PP. 144-151.

51. Shaw N.S., Noy N. Interphotoreceptor retinoid-binding protein contains three retinoid binding sites // Experimental Eye Research. — 2001. V. 72. -PP. 183-190.

52. Moiseyev G., Chen Y., Takahashi Y., Wu B.X., Ma J-X. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. -2005. -V. 102(35).-PP. 12413-12418.

53. Haeseleer F., Jang G.F., Imanishi Y., Driessen C., Matsumura M., Nelson P.S., Palczewski K. Dual-substrate specificity short-chain retinol dehydrogenases from the vertebrate retina // Journal of Biological Chemistry. 2002. - V. 277. - PP. 45537-45546.

54. Henselman R.A., Cusanovich M.A. Characterization of the recombination reaction of rhodopsin // Biochemistry. 1976. - V. 15(24). — PP. 53215325.

55. Kim S.R., He J., Yanase E., Jang Y.P., Berova N., Sparrow J.R., Nakanishi K. Characterization of Dihydro-A2PE: An Intermediate in the A2E Biosynthetic Pathway // Biochemistry. 2007. - V. 46 (35). - PP. 10122— 10129.

56. Ben-Shabat S., Parish C. A., Vollmer H. R., Itagaki Y., Fishkin N.,

57. Nakanishi K, Sparrow J. R. Biosynthetic studies of A2E, a major fluorophore of retinal pigment epithelial lipofuscin // Journal of Biological Chemistry. 2002. - V. 277. - PP. 7183-7190. '

58. Sparrow J. R., Parish C. A., Hashimoto M, Nakanishi K. A2E, a lipofuscin fluorophore, in human retinal pigmented epithelial cells in culture // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1999. - V. 40. - PP. 2988-2995.

59. Davies S., Elliott M. H., Floor E., Truscot T. G., Zareba M., Sama T., Shamsi F. A., Boulton M. E. Photocytotoxicity of lipofuscin in human retinal pigment epithelial cells // Free Radical Biology and Medicine. 2001. -V.31.-PP. 256-265.

60. Ren R. X. F., Sakai N., Nakanishi K. Total synthesis of the ocular age pigment A2-E: a convergent pathway // Journal of the American Chemical Society.- 1997.-V. 119.-PP. 3619-3620.

61. Tanaka K., Katsumura S. Novel synthesis of the ocular age pigment A2-E: new method for substituted pyridine synthesis via azaelectrocyclization // Organic Letters. 2000. — V. 2. — PP. 373—375.

62. Lamb L. E., Ye T., Haralampus-Grynaviski N. M.s Williams T. R., Pawlak A., Sama T., Simon J. D. Primary photophysical properties of A2E in solution // Journal of Physical Chemistry B. 2001. — V. 105. — PP. 1150711512.

63. Ragauskaite L.,. Heckathom R. C, Gaillard E. R. Environmental effects on the photochemistry of A2-E, a component of human retinal lipofuscin // Journal of Photochemistry and Photobiology. 2001. — V. 74. - PP. 483488.

64. Cantrell A., McGarvey D. J., Roberts J., Sama T., Truscott T. G. Photochemical studies of A2-E // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2001. —V. 64. - PP. 162—165.

65. Broniec A., Pawlak A., Sama T., Wielgus A., Roberts J.E., Land E.J., Truscott T.G., Edge R., Suppiah Navaratnam S. Spectroscopic properties and reactivity of free radical forms of A2E // Free Radical Biology and Medicine. -2005.-V. 38.-PP. 1037-1046.

66. Pawlak A., Wrona M., Rozanowska M., Zareba M., Lamb L.E., Roberts J.E., Simon J.D., T. Sama T. Comparison of the aerobic photoreactivity of A2E with its precursor retinal // Journal of Photochemistry and Photobiology. - 2003. - V. 77. - PP. 253-258.

67. Kanofsky J. R., Sima P. D., Richter C. Singlet-oxygen generation from A2E // Journal of Photochemistry and Photobiology. - 2003. - V. 77. - PP. 235-242.

68. Dillon J., Wang Z., Avalle L.B., Gaillard E.R. The photochemical oxidation of A2E results in the formation of a 5,8,5',8'-bis-furanoid oxide // Experimental Eye Research. 2004. — V. 79. - PP. 537-542.

69. Sparrow J. R., Nakanishi K., Parish C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000. — V. 41. — PP. 1981-1989.

70. Sparrow J.R., Vollmer-Snarr H.R., Zhou J.L., Jang Y.P., Jockusch S., Itagaki Y., Nakanishi K. A2E-epoxides Damage DNA in Retinal Pigment Epithelial Cells // Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278. — PP. 18207-18213.

71. Wielgus A. R., Collier R.J., Martin E., Lih F. B., Tomer K. B., Chignell

72. C.F., Roberts J.E. Blue light induced A2E oxidation in rat eyes — experimental animal model of dry AMD // Photochemical and Photobiological Sciences. -2010. -V. 9. PP. 1505-1512.

73. Wang Z., Keller L.M.M., Dillon J., Gailard E. Oxidation of A2E results in the formation of highly reactive aldehydes and ketons. // Journal of Photochemistry and Photobiology. -2006. V. 82. - PP. 1251-1257.

74. Schutt F., Davies S., Kopitz J., Holz F. G., Boulton M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E a retinoid component of lipofuscin // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000. — V. 41. - PP. 2303-2308.

75. Sparrow J. R., Cai B. Blue light-induced apoptosis of A2E-containing RPE: involvement of caspase-3 and protection by Bcl-2 // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2001. - V. 42. - PP. 1356-1362.

76. Sparrow J. R., Zhou J., Ben-Shabat S., Vollmer H., Itagaki Y., Nakanishi K. Involvement of oxidative mechanisms in blue light induced damage to A2E-laden RPE // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2002. - V.43.-PP. 1222-1227.

77. Sparrow J. R., Zhou J., Cai B. (2003). DNA is a target of the photodynamic effects elicited in A2E-laden RPE by blue light illumination // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2003. - V. 44. - PP. 2245-2251.

78. Sparrow J.R., Fishkin N., Zhou J., Cai B., Jang Y.P., Krane S., Itagaki Y., Nakanishi K. A2E, a byproduct of the visual cycle // Visual Research. -2003. V. 43. - PP. 2983-2990

79. De S., Sakmar T. P. Interaction of A2E with model membranes. Implications to the pathogenesis of age-related macular degeneration // Journal of General Physiology. 2002. - V. 120. — PP. 147-157.

80. Bermann M., Schutt F., Holz F. G., Kopitz J. Does A2E, a retinoid component of lipofuscin and inhibitor of lysosomal degradative functions,directly affect the activity of lysosomal hydrolases? // Experimental Eye Research. -2001. -V. 72. PP. 191-195.

81. Wu Y., Fishkin N.E., Pande A., Pande J., Sparrow J.R. Novel lipofuscin bisretinoids prominent in human retina and in a model of recessive Stargardt disease // Journal of Biological Chemistry. 2009. - V. 284.-PP. 20155-66.

82. Sparrow J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium // Atlas of Fundus Autofluorscence Imaging. —2007. — PP. 3-16.

83. Bimbach C.D., Jarvelainen M., Possin D.E., Milam A.H.

84. Histopathology and immunocytochemistry of the neurosensory retina in fundus flavimaculatus // Ophthalmology. 1994. - V. 101. - PP. 1211— 1219. ,

85. Fishkin N., Pescitelli G., Sparrow J.R., Nakanishi K., Berova N. Absolute configurational determination of an all-/ram-retinal dimer isolated from photoreceptor outer segments // Chirality. 2004. - V. 16(9). — PP. 637-641.

86. Lamb L.E., Zareba M., Plakoudas S.N., Sama T., Simon J.D. Retinyl Palmitate and the Blue-Light-Induced Phototoxicity of Human Ocular Lipofuscin // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2003. — V. 393(2). -PP. 316-320.

87. Chen Y., Buck J., Derguini F. Anhydroretinol induces oxidative stress and cell death // Cancer Research. — 1999. V. 59(16). - PP.3985-3990.

88. Simon J.D., Rozanowska M., Pawlak A., Rozanowski B., Skumatz C., Zare M., Boulton M.E., Burke J.M., Sama T. Age-Related Changes in the

89. Photoreactivity of Retinal Lipofuscin Granules: Role of Chloroform'1.soluble Components. // Investigative Ophthalmology and Visual Science. -2004.-V. 45(4).-PP. 1052-1060.

90. Schmitz-Vaickenberg S., Holz F.G., Bird A.C., Spaide R.F. Fundus autofluorescence imaging: review and perspectives. // Retina. — 2008. — V. 28(3).-PP. 385-409.

91. Choudhry N., Giani A., Miller J.W. Fundus autofluorescence in geographic atrophy: a review // Seminars in Ophthalmology. 2010. — V. 25(5-6).-PP. 206-213.

92. Fleckenstein M., Wolf-Schnurrbusch U., WolfS., von Strachwitz C., Holz F.G., Schmitz-Valckenberg S. Imaging diagostics of geographic atrophy//Ophthalmologe.-2010.-V. 107(11).-PP. 1007-1015.

93. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. // Практика, М.: 1998. — С.459.

94. White A. Effect of pH on fluorescence of tryosine, tryptophan and related compounds // Biochemical Journal. 1959. — V. 71. - PP. 217-220.

95. Radu R.A., Mata N.L., Bagla A., Travis G.H. Light exposure stimulates formation of A2E oxiranes in a mouse model of Stargardt's macular degeneration. // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2004.-Vol. 101(16).-P. 5928-5933.

96. Avalle B., Wang Z., Dillon J.P., Gaillard E.R. Observation of A2E oxidation products in human retinal lipofuscin // Experimental Eye Research. 2004. - V. 78. - PP. 895-898.

97. Руководителю лаборатории физико-химических основ рецепции ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля, академику РАН М.А. Островскому

98. Глубокоуважаемый Михаил Аркадьевич!

99. В ответ на Ваш запрос о качестве поставляемых в вверенную Вам лабораторию трупных донорских глаз для экспериментальных целей могу сообщить следующее.

100. Лаборатория трансплантологии с Глазным банком нашего Учреждения оснащена всем необходимым лабораторным и клинико-диагностическим офтальмологическим оборудованием для качественного проведения работ согласно п.п. 2.1.-2.3. выше названного Договора.

101. Заведующий лабораторией трансплантологии с Глазным банком, член-корр. РАЕН, д.м.н.31 марта 2010 г.1. Подгкссб £еме#*сс.спец осанист ' ' 0f.O4.SOe.

102. УТВЕРЖДАЮ» Директор ИБХФ РАН им.

103. ГУ- МШІС «Микрохирургия глаза»г* и

104. УТВЕРЖДАЮ» Генеральный дарехтор1. ДОГОВОРо научном сотрудничестве между Институтом биохимической физики Российской академии наук им. акад.

105. Н.М. Эмануэля и ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» имени акад.' С.Н. Федорова

106. По теме: «ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ (ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ) СЕТЧАТКИ И РАДУЖНОЙ ОБОЛОЧКИ ТРУПНЫХ ДОНОРСКИХ ГЛАЗ ЧЕЛОВЕКА В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ»1. ПРЕДМЕТ ДОГОВОРА

107. Сотрудники ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова обязуются:

108. Производить отбор трупного донорского материала по возрасту, полу, клиническому итанатологическому диагнозу после забора роговичных трансплантатов для последующего физикохимического анализа; ■

109. Обеспечивать надлежащее хранение (консервацию) отобранных образцов в лаборатории трансплантологии до их передачи в лабораторию физико-химических основ рецепции;

110. Передавать отобранные образцы донорского материала в лабораторию физикохимических основ рецепции для анализа;

111. Сотрудники ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля обязуются:

112. Производить препаровку и выделение липофусциновых гранул из сетчатки и радужной оболочки поставленных трупных донорских глаз;

113. Производить физико-химический анализ липофусциновых гранул из выделенных образцов и веста вторичную документацию.3. УСЛОВИЯ СОТРУДНИЧЕСТВА

114. Сотрудничество осуществляется в интересах сторон, заключивших настоящий договор.

115. Сотрудничество заключается:в обмене информационными материалами и результатами исследований; в совместном анализе полученных данных; ,в совместных публикациях п научных и лпугих тпшшях. •

116. Права на интеллектуальную собственность, приобретённую в результате исследования, принадлежат договаривающимся сторонам на паритетных началах.5. ОТВЕТСТВЕННОСТЬ СТОРОН

117. Настоящий договор не предусматривает финансовых обязательств договаривающихся сторон. Возникающие конфликты решаются путем переговоров сотрудничающих сторон в соответствии с законодательством РФ.6.СР0К ДЕЙСТВИЯ ДОГОВОРА

118. Настоящий договор заключается сроком на пять лет с возможностью его продления по согласованию сторон.1. Координаторы:

119. От ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля руководитель лаборатории физико-химических основ рецепции академик РАН М. А. Островский1. Исполнители:

120. От ГУ МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова главный научный консультант ГУ МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова профессор Л.Ф. Лннннк

121. От ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля старший научный сотрудниклаборатории физико-химических основ рецепции ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля, к.б.н. Т.Б. Фельдман

122. Настоящая лнцпоня предоепшлйи на ертх’до.--. ;ч.'У ■ ’•/ -. V': V ,/на оатвлшш решапи .«щенанрующгго ¿praiia от . -. . V'' V ■ ■ ; ’ ;