Флоротаннины арктических бурых водорослей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.21.03, кандидат наук Дружинина Анна Сергеевна

• Дружинина Анна Сергеевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Дружинина Анна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

1 ВОДОРОСЛИ АРКТИЧЕСКИХ МОРЕЙ КАК УНИКАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Морские водоросли как возобновляемый природный ресурс

1.2 Характеристика компонентного состава бурых водорослей

1.2.1 Основной химический состав

1.2.2 Минеральные вещества

1.2.3 Липидно-пигментный комплекс

1.2.4 Полифенолы

1.2.5 Азотсодержащие вещества

1.2.6 Структурные и запасные углеводы

1.3 Биосинтез, морфология и свойства флоротаннинов

1.4 Способы выделения флоротаннинов

1.4.1 Выделение флоротаннинов из биомассы водорослей

1.4.2 Выделение полифенольной фракции из экстрактов

1.5 Методы исследования полимолекулярного состава флоротаннинов

1.6 Методы количественного определения и структурного анализа флоротаннинов

1.7 Биологическая активность флоротаннинов

1.8 Выводы, постановка цели и задач исследований

2 МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1 Объект исследований и маршруты экспедиционных работ

2.2 Отбор и консервация проб

2.3 Оборудование и реактивы

2.4 Методы экстракции водорастворимых веществ

2.5 Исследование химического состава биомассы водорослей

2.5.1 Исследование общего химического состава

2.5.2 Определения содержания общего азота

2.5.3 Определение содержания липидов

2.5.4 Определение содержания пигментов

2.5.5 Определение легкогидролизуемых полисахаридов

2.5.6 Определение содержания полифенолов

2.6 Определение ионного состава экстрактов

2.7 Разделение и анализ полифенольных фракций

2.7.1 Разделение полифенольной фракции

2.7.2 Изучение молекулярно -массового распределения

52

методом гель-проникающей хроматографии

2.7.3 Масс-спектрометрия МАЛДИ

2.7.4 Хромато-масс-спектрометрический анализ

53

полифенольных соединений

2.7.5 Исследование полифенольной фракции методом

55

флуоресцентной спектроскопии

2.8 Медико-биологическая характеристика полифенольных

55

фракций

2.8.1 Определение антиоксидантной активности полифенольных фракций

2.8.2 Исследование бактериостатической активности полифенольных фракций

2.8.3 Исследование фунгистатической активности полифенольных фракций

2.8.4 Исследование фагоцитарной активности полифенольных фракций

3 РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНОЙ ФРАКЦИИ АРКТИЧЕСКИХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)

3.1 Изучение содержания полифенолов в арктических бурых

водорослях

3.2 Разработка схемы селективного выделения полифенольной фракции арктических бурых водорослей

3.2.1 Предлагаемая схема выделения полифенольной фракции

3.2.2 Стадия выделения липидно-пигментного комплекса

3.2.3 Стадия выделения водорастворимых веществ

3.2.4 Стадия деминерализации водного экстракта I

3.2.5 Стадия выделения структурных и запасных углеводов из

66

водного экстракта II

3.2.6 Стадия выделения полифенолов

3.2.6.1 Стадия выделения полифенолов из водно-спиртового экстракта II

3.2.6.2 Стадия выделения полифенолов из водного

ттт

экстракта III

3.2.7 Оценка эффективности выделения полифенольной фракции по разработанной схеме

4 ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА, СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)

4.1 Характеристика полимолекулярного состава полифенольной фракции

4.2 Исследование компонентного состава полифенолов методами

80

масс-спектрометрии

4.3 Установление взаимосвязи полимолекулярного состава и антиоксидантной активности полифенольных компонентов

4.3.1 Фракционный состав полифенольной фракции

4.3.2 Характеристика полифенольных подфракций

4.3.3 Взаимосвязь молекулярной массы и антиоксидантной

активности полифенолов

4.4 Медико-биологическая характеристика полифенольных

фракций

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

В настоящем текстовом документе применяются следующие определения, обозначения и сокращения:

ESI - electrospray ionization - ионизация распылением в электрическом поле (электроспрей)

FAB - fast atom bombardment - бомбардировка быстрыми атомами

TOF - time of flight - времяпролетная масс-спектрометрия

АОА - антиоксидантная активность

А.с.м. - абсолютно сухая масса

БАВ - биологически активные вещества

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДФПГ - дифенилпикрилгидразил

ЕОП - единицы оптической плотности

ЖХ - жидкостная хроматография

ЖХ-МС - жидкостная хроматография, объединенная с масс -спектрометрией

ИЖ - ионная жидкость

МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

МС - масс-спектрометрия

МС/МС - тандемная масс-спектрометрия

НМС - низкомолекулярные соединения

ПФ - полифенолы

СКФЭ - сверхкритическая флюидная экстракция УФ-излучение - ультрафиолетовое излучение ФГЭ - флороглюцин эквиваленты ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Флоротаннины арктических бурых водорослей»

ВВЕДЕНИЕ

Арктические бурые водоросли являются уникальным по составу сырьем для получения целого ряда веществ, обладающих широким спектром потребительских свойств. Их состав характеризуется содержанием минеральных веществ, пигментов, липидов, полифенолов, белков, аминокислот, целлюлозы, альгиновых кислот, маннита, ламинарана и фукоидана.

Одной из наиболее значительных групп соединений, определяющих фармакологическое значение арктических бурых водорослей, являются полифенолы, а именно полимеры флороглюцина - флоротаннины, содержание которых в биомассе варьируется в зависимости от вида бурых водорослей и места их произрастания и может достигать до 20 % от а.с.м. Флоротаннины различаются по строению и степени полимеризации, что обуславливает разнообразие биологической активности данных соединений, к которой относят антиоксидантные свойства, гепатопротекторную, противоаллегренную, противоопухолевую, противовоспалительную, антибактериальную и антидиабетическую активности.

Несмотря проведенные обширные исследования в области флоротаннинов, актуальными остаются задачи разработки методологии эффективного выделения данных соединений из биомассы бурых водорослей в соответствии с принципами «зеленой химии», дальнейшей идентификации индивидуальных компонентов, характеристики свойств и выявления зависимостей биологической активности от полимолекулярных свойств флоротаннинов. Решение этих задач позволит использовать полифенолы арктических бурых водорослей в качестве препарата фармацевтического назначения.

Работа выполнена в рамках проектной части государственного задания Министерства образования и науки РФ № 4.3273.2017/4.6 с использованием оборудования ЦКП НО «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова.

1 ВОДОРОСЛИ АРКТИЧЕСКИХ МОРЕЙ КАК УНИКАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ

1.1 Морские водоросли как возобновляемый природный ресурс

Морские водоросли издавна привлекают к себе внимание как возобновляемое сырье для получения разнообразных веществ, обладающих широким спектром потребительских свойств.

Согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций ^АО) за 2016 год крупнейшие производители водорослей - Китай и Индонезия, где активно продвигается культивирование тропических аквакультур. На долю этих двух стран приходится 86,6 % от общего количества водорослей, произведенных в 2016 году. К другим странам-производителям, имеющим высокие объемы производства, относятся Республика Корея, Япония, Малайзия, Филиппины и КНДР [1]. Ежегодно наблюдается прирост производства водорослевых культур, что указывает на высокую ценность последних в хозяйственной деятельности людей. Наибольшими мировыми масштабами переработки отличаются бурые водоросли, в основном за счет крупных объемов производства ламинарии в Китае [1, 2].

Промысловыми в России являются порядка 19 видов водорослей [2]. Промысел водорослей ведется на Белом и Баренцевом морях, а также на Дальнем Востоке - преимущественно в южном Приморье, у Южных Курил и Сахалина [3]. Среди бурых доминирующими являются ламинариевые и

фукусовые, среди красных - почти единственной является анфельция, добываемая в дальневосточных морях. Добыча водорослей в России не так масштабна, однако ресурсный потенциал российских морей достаточно велик. Так, например, из общих запасов в Белом и Баренцевом морях освоенными являются лишь 10 % от прогнозируемого вылова. Запасы водорослей находятся в стабильном состоянии [4]. Так же стоит отметить, что водорослевые сообщества обладают очень высокой продуктивностью и восстанавливают сообщество, выбранное на 70 % всего за 2-3 года.

Согласно отчету о состоянии биоресурсов России за 2008 год, акватория Белого моря обладает потенциальной возможностью ежегодного сбора до 36 тысяч тонн ламинариевых и 6,4 тысячи тонн фукусовых. По состоянию на 2015 год добыча сырца ламинарии и фукуса составила 905,082 т при разрешенном объеме в 2035,2 т сырца. Стоит отметить, что ежегодно наблюдается прирост разрешенного объема вылова [5]. В западном сегменте Арктики в Баренцевом и Белом морях главные виды арктических бурых водорослей, образующие их основные запасы — это Saccharina latissima (Linnaeus) C.E. Lane, C. Mayes, Druehl & G.W. Saunders), Laminaria digitata (Hudson) J.V. Lamouroux, Fucus vesiculosus (Linnaeus) и Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le Jolis. У берегов архипелага Шпицберген доминирующими видами бурых водорослей являются L. digitata, S. latissima и A. esculenta [6,

7].

Все вышесказанное показывает перспективность переработки биомассы бурых водорослей. Поэтому во многих странах, имеющих выход к морю, развиваются научные центры по исследованию видового разнообразия морских водорослей, условий их произрастания, изучению компонентного состава водорослевой биомассы и разработки методов переработки данных аквакультур с целью получения эффективных продуктов (рисунок 1.1, таблица 1.1).

Рисунок 1.1 - Мировые центры исследования морских водорослей

Таблица 1.1 - Приложение к рисунку 1.1.

№ Точки Страна, город Организация

1 2 3

США, Сан-Диего Калифорнийский университет:

1 Калифорнийский центр биотехнологии водорослей

2 Канада, Фредериктон Университет Нью-Брансуика: Центр экологических и молекулярных исследований водорослей

3 Исландия, Рейкьявик Университет Исландии

4 Португалия, Фару Университет Алгарве: Центр морских наук

Франция, Роскоф Университет Сорбонны - Биологическая

5 Станция Роскофф: Национальный центр научных исследований

6 Нидерланды, Вагенингенский университет и научно -

Вагенинген исследовательский центр

7 Дания, Люнгбю Датский технический университет

8 Норвегия, Буде Нордский университет

9 Чехия, Академия наук Чешской Республики:

Тршебонь Альгатех Центр

10 Россия, Мурманский морской биологический

Мурманск институт Кольского научного центра РАН

11 Россия, Северный (Арктический) федеральный

Архангельск университет им. М.В. Ломоносова

12 Россия, Всероссийский научно -исследовательский

Москва институт рыбного хозяйства и океанографии

13 Россия, Тихоокеанский океанологический институт

Владивосток им. В.И. Ильичева ДВО РАН

14 Индия, Центральный исследовательский институт

Бхавнагар химии морских солей и соединений

15 Китай, Китайская академия наук: Институт

Ухань гидробиологии

16 Китай, Циндао Океанский университет Китая

17 Китай, Восточно-Китайский университет науки и

Шанхай техники

18 Южная Корея, Корейский полярный научно -

Инчхон исследовательский институт

Продолжение таблицы 1.1

1 2 3

19 Южная Корея, Чеджу Национальный университет Чеджу

20 Южная Корея, Пусан Национальный университет Пусана

21 Япония, Саппоро Университет Хоккайдо

22 Япония, Токио Университет Токио

1.2 Характеристика компонентного состава бурых водорослей 1.2.1 Основной химический состав

Химический состав арктических бурых водорослей представлен следующими группами компонентов: минеральные вещества, в том числе микроэлементы; органические вещества: липидно-пигментный комплекс (жирные кислоты, пигменты), полифенольные вещества, азотсодержащие вещества (белки и свободные аминокислоты), структурные углеводы (альгиновые кислоты, фукоидан, целлюлоза) и запасные углеводы (маннит, ламинаран) (рисунок 1.2).

Бурые водоросли Минеральные вещества

Лшшдно-пигментный комплекс (жирные кислоты, пигменты)

Органические вещества

\ Полифенольные вещества

Структурные (альгиновые килосты, фукоидан. целлюлоза) и запасные (маннит. ламинаран) углеводы Азотсодержащие Еещества (белки и свободные аминокислоты)

Рисунок 1.2 - Основной химический состав бурых

водорослей

1.2.2 Минеральные вещества

Морские водоросли накапливают большое количество макро- и микроэлементов, в том числе необходимых для человека [8, 9]. Содержание золы в бурых водорослях зависит от их вида и в среднем составляет 20—35 %масс [9, 10]. Водоросли обладают избирательной кумулятивной способностью, в результате чего в их биомассе содержится разнообразный комплекс макро- и микроэлементов, причем в слоевищах концентрация некоторых из них в десятки (кальций), сотни (бром, хром) и тысячи (иод, цинк, барий) раз превышает их содержание в морской воде [11]. Водоросли концентрируют в своих тканях и токсичные тяжелые металлы, что делает бурые водоросли хорошим биоиндикатором загрязнения морей, в которых они произрастают [12].

1.2.3 Липидно-пигментный комплекс

Липиды - группа соединений, включающая в себя воска, жиры, стеролы, жирорастворимые витамины (А, Э, Е, К), диглицериды, фосфолипиды, моно-, ди- и триацилглицеролы и другие соединения. Водоросли содержат ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты с цепочками от 14 до 22 атомов углерода. Основной составляющей полиненасыщенных жирных кислот являются омега-3 и омега-6 жирные кислоты [13]. Некоторые исследователи отмечают, что содержание липидов в водорослях, произрастающих в северных морях, выше, чем у водорослей тропических регионов [14]. В среднем их содержание в водорослевой биомассе находится в интервале 1-5 %масс [15, 16], жирные кислоты, как правило, составляют до 50 %отн от общего содержания липидов [17].

Основными пигментами бурых водорослей являются каротиноиды, фукоксантин и хлорофиллы [18]. Хлорофиллы - это жирорастворимые пигменты, представляющие собой комплекс ионов магния с порфириновым

кольцом. При участии хлорофиллов происходит процесс фотосинтеза. Общее содержание хлорофиллов в бурых водорослях достигает 0,02 мг/г, что значительно меньше, чем в микроводорослях.

Каротиноиды - линейные полиены, функционирующие как поглотители световой энергии. Каротиноиды проявляют свойства антиоксидантов, инактивируя реакционно -способные формы кислорода [19]. Содержание данных компонентов в бурых водорослях невелико и достигает 0,2-0,3 мг/г. Основным каротиноидом, содержащимся в значительных количествах в биомассе бурых водорослей, является Р-каротин [20]. Ксантофиллы представляют собой группу

кислородосодержащих пигментов класса каротиноидов. Фукоксантин

является основным ксантофиллом бурых водорослей, также были обнаружены виолаксантин, неоксантин, фукоксантинол, антераксантин и зеаксантин [18, 21, 22].

1.2.4 Полифенолы

Полифенолы являются одной из наиболее значительных групп соединений, определяющих фармакологическое значение водорослей. Бурые водоросли накапливают большое количество полифенольных соединений, а именно флороглюцина и его полимеров - флоротаннинов [23]. Флоротаннины представляют собой разнородную группу молекул, различаясь структурой и степенью полимеризации [24].

Установлено, что концентрация полифенолов значительно варьируется в пределах вида водорослей. Так, содержание полифенолов в бурых водорослях некоторых видов может достигать более 20 %масс [25], тогда как у других видов их содержание может быть близко к нулю.

1.2.5 Азотсодержащие вещества

Основными азотсодержащими веществами бурых водорослей являются белки, свободные аминокислоты и небелковый азот. В белках бурых водорослей содержатся все незаменимые для человека аминокислоты, за исключением триптофана. Содержание аминокислот зависит от сезонных изменений. Так, наибольшее содержание аминокислот наблюдается в весенний, а наименьшее - в осенний период [26]. В биомассе бурых водорослей содержание белков варьируется от 5 до 15 % сухого вещества. В белках бурых водорослей обнаруживают от 15 до 24 аминокислот [26, 27] с небольшими количественными колебаниями. В бурых водорослях содержится значительное количество свободных аминокислот, легко усваиваемые организмом, а так же моно - и дийодаминокислоты [27].

1.2.6 Структурные и запасные углеводы

В биомассе морских водорослей содержится большое количество полисахаридов, включая структурные (альгиновые кислоты, целлюлоза, фукоидан) и запасные (маннит и ламинаран) [28, 29]. Общая концентрация полисахаридов в бурых водорослях варьируются от 4 до 76 % масс.

Альгиновая кислота - смесь полисахаридов, состоящих из остатков О-маннуроновой и L-гулуроновой кислот. Альгинаты концентрируются в основном в клеточных стенках. В бурых водорослях содержание альгиновых кислот зависит от сезона сбора и таксономической принадлежности и варьируется от 15 до 40 %, в [30].

Бурые водоросли содержат целлюлозу, несколько отличающуюся от обычной, поэтому ее называют альгулезой. В водорослях доля альгулезы варьируется от 2 до 17 %масс. Так, содержание водорослевой целлюлозы у вида Ь. digitata достигает 3,7 %масс, у Ь. 8ассИатта — 5,7 %масс. [31].

Фукоидан - сульфатированный полисахарид бурых водорослей. Наибольшее количество данного полисахарида, до 20 % от сухой массы, содержится в семействе фукусовых. У ламинариевых его содержание не превышает 5 %масс [30].

Маннит представляет собой шестиатомный углеводородный спирт из группы сахаров. Содержание маннита в биомассе подвержено сильным колебаниям и варьируется от вида водоросли, сезона сбора и части слоевища, из которого он извлекается, и находится в пределах 1-28 %масс от массы сухого вещества.

Ламинаран встречается почти во всех видах бурых водорослей. Содержание ламинарана в семействе ламинариевых составляет от 5 до 10 %масс, тогда как в фукусовых - до 5 %масс.

Компонентный состав арктических бурых водорослей, исследуемых в данной работе в качестве источника полифенольных соединений, представлен в таблице 1.2.

Таблица 1.2 - Компонентный состав арктических бурых водорослей, по литературным данным [9, 32, 33], %масс

Группа компонентов Семейство

Ламинариевые Фукусовые

Минеральные вещества 20 - 43 20 - 33

Липофильные вещества:

-хлорофилл до 0,60 до 0,41

- каротиноиды до 0,0019 до 0,0052

- липиды 3,8 - 5,7 8,2 - 8,4

Полифенольные вещества - 9,4

Аминокислоты 14 - 18 14 - 16

Углеводы:

-альгиновые кислоты 22 - 23 31 - 34

-маннит 16 - 17 7 - 13

-полисахариды 17 - 20 19 - 26

1.3 Биосинтез, морфология и свойства флоротаннинов

Биосинтез флороглюцина в водорослях идет по поликетидному пути через С-С связи (рисунок 1.3). На первой стадии биосинтеза флороглюцина три молекулы малонилкофермента А конденсируются в 3,5-дикетогептандионат. Последующие декарбоксилирование 3,5-дикетогептандионата и его циклизация приводят к образованию трикетида, который претерпевает трансформацию в термодинамически более стабильную ароматическую форму - флороглюцин, содержащий три фенольные гидроксильные группы [34, 35]. Далее происходит полимеризация флороглюцина с образованием более чем 150 флоротаннинов [ 36].

НО ,ЭСоА

""С"'

3 х || ||

о о

Малонилкофермент А

-2С02 -ЗНБСоА

о о о о

3,5-дикетогептандионат

Флороглюцин

Рисунок 1.3 - Схема биосинтеза флороглюцина [32].

Флоротаннины являются основными цитоплазматическими компонентами бурых водорослей и содержатся внутри клетки, как в свободном, так и в связанном состоянии [37]. Около 90 % от общего количества флоротаннинов находится в свободном состоянии в мембранно -связанных везикулах, называемых физодами. Остальная часть полифенольных соединений содержится в клеточной стенке, где они связаны в комплекс с альгиновой кислотой за счет ковалентных эфирных и

полуацетальных связей, и действуют в качестве структурного компонента, регулируя осмотическое давление [35, 38]. Некоторые флоротаннины могут находиться в водорослях в сульфатированном или галогенированном состоянии [25].

Исследования распределения флоротаннинов в тканях бурых водорослей показали, что данные соединения аккумулируются преимущественно в наружных клетках эпидермиса [39] и во внешнем кортикальном слое [40] талломов, причем авторы работы [40] отметили, что картина распределения полифенолов не зависит от вида бурой водоросли и стадии ее роста. Накопление флоротаннинов во внешних слоях таллома позволяет им быстро реагировать на стресс и выполнять защитные функции. Так, флоротаннины защищают водоросли от повреждения во время отливов за счет способности поглощать ультрафиолетовое излучение и проявлять значительные антиоксидантные свойства [41]. Флоротаннины также являются основной группой соединений, защищающих бурые водоросли от эпифитов [42].

На данный момент собрано большое количество данных по зависимости суммарного содержания флоротаннинов от вида водорослей, места их произрастания, а также от сезона сбора [43-47]. Так, в работе [43] авторы показали высокое содержание полифенолов в водорослях вида Fucus vesiculosus (15,4 - 18,6 % а.с.м.) и Ascophyllum nodosum (14,6 - 14,8 % а.с.м.), произрастающих в Белом и Баренцевом морях. Ранее норвежская группа исследователей [44] также сделала вывод о высоком содержании полифенолов в данных видах водорослей, при этом, максимальное количество целевых компонентов наблюдалось в зимний период (11-14 %), тогда как в апреле-мае снижалась до 8-10 процентов. Проведенные исследования содержания полифенолов в разных частях таллома в трех видах водорослей семейства Fucaceae показало, что в зоне прикрепления к субстрату находится 7-9 %масс полифенолов в свободном состоянии, в центральной части - 8-16 %масс, в зоне роста - 10-25 %масс, а в

репродуктивных органах - 5-8 %масс [48]. Содержание связанных полифенолов на порядок ниже и наибольшее содержание было обнаружено в зоне прикрепления таллома к субстрату (0,5-1,5 %масс).

Наличие полифенольных соединений отмечено в составе и других классов морских водорослей. Так, в работе показано [45] низкое содержание полифенолов в зеленых (1,8 %) и красных (1,8-3,2 %) водорослях по сравнению с бурыми водорослями вида Б18вта ЫсусИ8 (19,3 %). Стоит отметить, что наибольшая концентрация флоротаннинов отмечена в водорослях, произрастающих в литоральной зоне.

Сопоставительные данные по содержанию полифенольных соединений в красных, зеленых и бурых морских водорослях, произрастающих на побережьях различных стран (таблица 1.3), свидетельствуют о повышенном содержании полифенолов в бурых водорослях семейства Бисасвае северных регионов.

По структуре и полимерным свойствам флоротаннины представляют собой обширную группу молекул, различающихся характером связей между единицами флороглюцина и количеством гидроксильных групп (рисунок 1.4). В зависимости от типа связи между мономерами, флоротаннины могут быть разделены на 4 подкласса: флоретолы и фугалолы (арил-эфирные связи), фуколы (фенильные связи), фукофлоретолы (арил-эфирные и фенильные связи), эколы и кармалолы (производные флоретолов, содержащие фрагмент дибензодиоксина) [49]. Учитывая степень полимеризации, структурное разнообразие флоротаннинов и наличие конформационных изомеров [24] становится необходимым использование более точной их классификации. Так, авторы работы [50] предлагают в подклассах выделить группы линейных и разветвленных флоротаннинов.

Таблица 1.3 - Содержание полифенолов в морских водорослях

Вид водорослей Место произрастания Содержание полифенолов, %масс Литературный источник

Rhodophyta

Porphyra purpurea Дания 0,4 [46]

Porphyra tenera Япония 1,8 [45]

Chlorophyta

Chlorella pyrenoidosa Тайвань 1,8 [45]

Enteromorpha intestinalis Дания 0,3 [46]

Cladophora rupestris Франция 2,0 [51]

Codium fragile Франция 0,2 [51]

Phaeophyceae

Eisenia bicyclis Корея 0,6 - 2,1 [47]

Eisenia bicyclis Япония 19,3 [45]

Fucus vesiculosus Дания 1,0 [46]

Cystoseira sedoides Тунис 2,6 [52]

Fucus vesiculosus Тронхеймс-фьорд, Норвегия 11 - 13 [44]

Ascophyllum nodosum Тронхеймс-фьорд, Норвегия 12 - 14 [44]

Fucus vesiculosus Белое, Баренцево моря, Россия 15,4 - 18,6 [43]

Ascophyllum nodosum Белое, Баренцево моря, Россия 14,6 - 14,8 [43]

Молекулярная масса полифенолов бурых водорослей варьируется в широком диапазоне от 126 Да до 650 кДа [53], но большинство из них обладают массой от 10 кДа до 100 кДа [54]. Есть предположение, что структура флоротаннинов может изменяться на разных стадиях роста и развития слоевища - олигомеры преобразуются в более сложные полифенолы [55].

Рисунок 1.4 - флороглюцин (1) и представители полифенолов бурых водорослей: 2 - тетрафукол А, 3 - экол, 4 - тетрафлоретол Б, 5 -флорофукофуроэкол, 6 - тетрафугалол А

Фармакологическая значимость полифенолов связана с их структурой и, в особенности, со степенью полимеризации. Однако стоит заметить, что взаимосвязь между молекулярной массой и антиоксидантной активностью флоротаннинов бурых водорослей до сих пор является предметом изучения [56]. Так, Ферререс [57] с соавторами отметили более высокую антиоксидантную активность высокомолекулярных флоротаннинов по сравнению с низкомолекулярной полифенольной фракцией, тогда как в исследованиях [52, 58-61] показано, что увеличение молекулярной массы выделенных флоротаннинов приводит к снижению антиоксидантной способности. При проведении подобных исследований Ванг с соавторами [56] не обнаружили четкой взаимосвязи между антиоксидантной способностью и молекулярной массой флоротаннинов.

1.4 Способы выделения флоротаннинов

1.4.1 Выделение флоротаннинов из биомассы водорослей

При разработке методов извлечения флоротаннинов из водорослей важно учитывать, с одной стороны, термическую нестабильность выделяемых компонентов, их реакционную способность и способность флоротаннинов легко окисляться, а с другой - требования к эксперессности метода, полноте выделения, селективности и чистоте получаемого продукта.

Для извлечения полифенолов из морских водорослей традиционно применяется экстракция органическими растворителями. В качестве экстрагентов используют такие полярные растворители как этанол, метанол, ацетон, а также их смеси с водой в различных соотношениях [53, 55, 56, 62]. Самым распространенным реагентом для выделения флоротаннинов являются водные растворы ацетона или этанола. Экстракцию, обычно, проводят при температуре не более 50 °С, поскольку при температуре выше 70 °С происходит деградация полифенольных соединений [63].

В работе [56] в качестве экстрагентов для выделения полифенолов из водорослей вида Fucus vesiculosus авторы использовали воду, 80 % метанол, 80 % этилацетат, 80 % этанол, 50 % этанол, 70 % ацетон и сделали вывод, что полярные органические растворители извлекают флоротаннины более селективно по сравнению с водой. Так, при использовании 70 %-ного водного раствора ацетона наблюдается самое высокое содержание флоротаннинов в экстракте. Аналогичный результат представлен в работе [55], в которой показано, что эффективным экстрагентом для флоротаннинов из водорослей вида Fucus vesiculosus является 70 %-ный водный раствор ацетона: содержание полифенолов в экстракте при использовании 70 %-го ацетона составило около 6,3 % от массы сухой водоросли, а при экстракции биомассы этилацетатом, ацетоном, метанолом и этанолом содержание полифенолов в экстрактах составило менее 0,2 %. Предполагается, что ацетон обладает способностью ингибировать образование комплекса

полифенолов с белками во время экстракции [64]. Повышение растворимости полифенолов в органических растворителях при добавлении воды может быть связано с ослаблением водородных связей внутри комплекса [ 65].

В исследованиях [62] наибольшее содержание полифенолов (17 % от массы сухих водорослей) в водорослях Fucus vesiculosus наблюдалось при экстракции водой, а при использовании ацетона, водных растворов ацетона и этанола содержание исследуемых компонентов варьировалось в интервале 13-14 %, в то время как использование этанола привело к наименьшему выходу полифенолов (7 % от массы сухих водорослей). Также авторами исследований отмечено, что использование экстрагентов различной природы не влияет на антиоксидантную активность выделенных флоротаннинов.

Авторы работы [66] предлагают применение водно -спиртовой экстракции для выделения полярных фенольных соединений, с последующим использованием водно-ацетонового экстрагента для выделения более неполярных полимеров полифенолов. На основе анализа работы [66] можно сделать вывод, что использование поэтапной экстракции бурых водорослей органическими растворителями с различной полярностью позволяет более полно выделять полифенолы из биомассы.

Таким образом, классические методы экстракции широко применимы для выделения флоротаннинов из водорослей, однако, они имеют ряд значительных недостатков, таких как низкая селективность выделения целевого компонента, длительное время экстракции для достижения высоких выходов фракции полифенолов, а также необходимость очистки экстракта от больших объемов органических растворителей.

Более эффективными методами выделения полифенолов из растительного сырья могут служить ультразвуковая, микроволновая, ферментативная экстракции, жидкостная экстракция под давлением и сверхкритическая флюидная экстракция (СКФЭ) [53, 63, 67, 68]. Основным преимуществом данных методов является увеличение выхода экстракта при отсутствии деструкции термолабильных соединений.

Так, в процессе ультразвуковой экстракции происходит активизация массопереноса путем разрушения клеточных стенок растений и уменьшения размера частиц [67, 69]. Использование ультразвука для извлечения флоротаннинов разбавленным раствором соляной кислоты (0,03 М) из бурых водорослей вида Ascophyllum nodosum описано в работе [70]. Извлеченные с помощью данного метода полифенолы содержали до 12 структурных единиц флороглюцина, что позволило авторам сделать вывод об эффективности ультразвуковой экстракции, в частности, для выделения высокомолекулярных флоротаннинов. Оптимизация условий ультразвуковой экстракции бурой водоросли вида Hormosira banksii проведена в работе [71]. В результате было установлено, что наиболее эффективными параметрами извлечения флоротаннинов являются растворитель 70%-ый этанол, температура 30 0С, время экстракции 60 мин и мощность ультразвука 150 Вт, при этом содержание полифенолов в экстракте составило 2,32 %масс, что больше, чем при традиционной экстракции. В другом исследовании [72] наибольший выход флоротаннинов был получен при параметрах 50 ос, 45 мин и 250 Вт.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дружинина Анна Сергеевна, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ФАО. Состояние мирового рыболовства и аквакультуры 2018 -Достижение целей устойчивого развития. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных наций. - Рим. - 2018. - 209 с.

2. Вилкова О.Ю. Место России в мировой добыче морских водорослей // Рыбпром. - 2010. - № 3. - С. 4-8.

3. Государственный доклад "О состоянии и об охране окружающей среды Российской Федерации в 2017 году". - М.: Минприроды России; НИА-Природа

- 2018. - 888 с.

4. Государственный доклад "О состоянии и об охране окружающей среды Российской Федерации в 2016 году". - М.: Минприроды России; НИА-Природа

- 2017. - 760 с.

5. Состояние и охрана окружающей среды Архангельской области за 2015 год. Доклад. Министерство природных ресурсов и лесопромышленного комплекса Архангельской области. - Архангельск. - 2016. - 432 с.

6. Флора и фауна Белого моря: иллюстрированный атлас / под ред. А.Б. Цетлина - М.: Изд-во КМК. - 2010. - 471 с.

7. Nielsen R. et al. Distributional index of the benthic marine macroalgae of the Baltic Sea area // Acta Botanica Fennica. - 1995. - Vol. 155. - Р. 1-70.

8. Лемеза Н.А. Альгология и микология. Практикум: учеб. пособие.

- М.: Высшая школа. - 2008. - 203 с.

9. Боголицын К.Г. и др. Особенности минерального состава бурых водорослей Белого и Баренцева морей // Химия растительного сырья. - 2014.

- № 1. - С. 243-250.

10. Аминина Н.М. и др. Состав и возможности использования бурых водорослей дальневосточных морей // Вестник ДВО РАН. - 2007. - № 6.

- С. 123-130.

11. Гудимов А.В. Мидия Mytilus edulis L. Промысловые и перспективные для использования водоросли и беспозвоночные Баренцева и Белого морей.

- Апатиты: Изд-во КНЦ РАН. - 1998. - С. 529-581.

12. Conti ME. et al. Baseline trace metals in seagrass, algae, and mollusks in a southern tyrrhenian ecosystem (Linosa Island, Sicily) // Archives of Environmental Contamination and Toxicology. - 2010. - Vol. 58, №2 1. - P. 79-95.

13. Narayan B. et al. Physiological effects of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) — a review // Food Reviews International. - 2006.

- Vol. 22, № 3. - P. 291-307.

14. Sanchez-Machado D.I. et al. An HPLC method for the quantification of sterols in edible seaweeds // Biomedical Chromatography. - 2004. - Vol. 18, № 3.

- P. 183-190.

15. Fleurence J. et al. Fatty acids from 11 marine macroalgae of the French Brittany coast // Journal of Applied Phycology. - 1994. - Vol. 6, № 5-6. - P. 527532.

16. Муравьева Е.А Комплексная технология получения экстрактивных БАВ из бурых водорослей Белого моря // Рыбная промышленность. - 2010.

- № 3. - С. 54-57.

17. Gosch B.J. et al. Total lipid and fatty acid composition of seaweeds for the selection of species for oil-based biofuel and bioproducts // GCB Bioenergy. - 2012.

- Vol. 4, № 6. - P. 919-930.

18. Rowan K.S. Photosynthetic pigments of algae. - Cambridge: Cambridge university press. - 1989. - 334 p.

19. Von Elbe J.H., Schwartz S.J. Colorants. - New York: Marcel Dekker.

- 1996. - 300 p.

20. Jensen A. Tocopherol determination in seaweeds // Proceedings of the Fifth International Seaweed Symposium. - 1966. - P. 281-286.

21. Haugan J.A., Liaaen-Jensen S. Isolation and characterisation of four allenic (6'S)-isomers of fucoxanthin // Tetrahedron Letters. - 1994. - Vol. 35, № 14.

- P. 2245.

22. Nietsche L. Determination of carotenoids in brown а^ае // Food Chemistry. - 1976. - Vol. 1, № 1. - P. 34-42.

23. Van Alstyne K.L. A comparison of three methods for quantifying brown algal polyphenolic compounds // Journal of Chemical Ecology. - 1995. - Vol. 21, № 1. - P. 45-58.

24. Heffernan N. et al. Profiling of the molecular weight and structural isomer abundance of macroalgae-derived phlorotannins // Marine Drugs. - 2015. - Vol. 13, № 1. - P. 509-528.

25. Ragan M.A, Glombitza K.W. Phlorotannins, brown algal polyphenols // In Progress in Phycological Research - 1986. - Vol. 4, № 1. - P. 129-241.

26. Ericson L.E., Sjostrom A.G.M. Amino acids in marine Laminaria saccharina, Fucus vesiculosus, Sphaceiaria arctica // Acta Chemica Scandinavica.

- 1962. - Vol. 6. - P. 305-309.

27. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. - М.: Пищ. промышленность. - 1972. - 336 с.

28. Murata M., Nakazoe J. Production and use of marine algae in Japan // Japan Agricultural Research Quarterly. - 2001. - Vol. 35, № 4. - P. 281-290.

29. Kumar C.S. et al. Seaweeds as a source of nutritionally beneficial compounds — a review // Journal of Food Science and Technology. - 2008.

- Vol. 45, № 1. - P. 1-13.

30. Клочкова Н.Г., Березовская В.А. Водоросли камчатского шельфа. Распространение, биология, химический состав. - Владивосток: Дальнаука

- 1997. - 155 с.

31. Frei E., Preston R.D. Configuration of alginic acid in marine brown algae // Nature. - 1962. - Vol. 196, № 1. - P. 130-134.

32. Боголицын К.Г. и др. Комплексное исследование химического состава бурых водорослей Белого моря // Химия растительного сырья. - 2012. - № 4.

- С. 153-160.

33. Боголицын К.Г. и др. Жирнокислотный состав и биологическая активность сверхкритических экстрактов арктической бурой водоросли Fucus

105

vesiculosus // Сверхкритические флюиды: теория и практика. - 2016. - Т. 11, № 3. - C. 58-70.

34. Achkar J. et al. Biosynthesis of phloroglucinol // Journal of the American chemical society. - 2005. - Vol. 127, №№ 5. - P. 5332-5333.

35. Koivikko R. Brown algal phlorotannins: Improving and applying chemical methods: doctoral dissertation (article-based). - Turku: University of Turku. - 2008. - 61 p.

36. Vo T.S., Ngo D.H., Kim S.K. Marine algae as a potential pharmaceutical source for anti-allergic therapeutics // Process Biochemistry. - 2012. - Vol. 47, № 3.

- P. 386-394.

37. Schoenwaelder M.E.A., Clayton M.N. Secretion of phenolic substances into the zygote wall and cell plate in embryos ofHormosira and Acrocarpia (Fucales, Phaeophyceae) // Journal ofPhycology. - 1998. - Vol. 34, №№ 4. - P. 969-980.

38. Schoenwaelder M.E.A The occurrence and cellular significance of physodes in brown algae // Phycologia. - 2002. - Vol. 41, №2 2. - P. 125-139.

39. Luder U.H., Clayton M.N. Induction of phlorotannins in the brown macroalga Ecklonia radiata (Laminariales, Phaeophyta) in response to simulated herbivory-the first microscopic study // Planta. - 2004. - Vol. 218, № 6. - P. 928937.

40. Shibata T. et al. Local and chemical distribution of phlorotannins in brown algae // Journal of Applied Phycology. - 2004. - Vol. 16, №2 4. - P. 291-296.

41. Fairhead V.A. et al. Variation in phlorotannin content within two species of brown macroalgae (Desmarestia anceps and D. menziesii) from the Western Antarctic Peninsula // Polar Biology. - 2005. - Vol. 28, № 9. - P. 680-686.

42. Nagayama K. et al. Algicidal effect of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome on red tide microalgae // Aquaculture. - 2003. - Vol. 218, № 1-4.

- P. 601-611.

43. Клиндух М.П., Облучинская Е.Д. Сравнительное исследование

химического состава бурых водорослей Fucus vesiculosus и Ascophyllum

nodosum // Вестник МГТУ. - 2013. - Т. 16, №2 3. - C. 466-471.

106

44. Ragan MA, Jensen A. Quantitative studies on brown algal phenols. II Seasonal variation in polyphenol content of Ascophyllum nodosum (L.) Le Jol. and Fucus vesiculosus // Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. - 1978.

- Vol. 34, № 3. - P. 245-258.

45. Machu L. et al. Phenolic content and antioxidant capacity in algal food products // Molecules. - 2015. - Vol. 20, № 1. - P. 1118-1133.

46. Farvin S.K.H., Jacobsen C. Phenolic compounds and antioxidant activities of selected species of seaweeds from Danish coast // Food Chemistry. - 2013.

- Vol. 138, № 2-3. - P. 1670-1681.

47. Kim S.M. et al. Determination of major phlorotannins in Eisenia bicyclis using hydrophilic interaction chromatography: Seasonal variation and extraction characteristics // Food Chemistry. - 2013. - Vol. 138, № 4. - P. 2399-2406.

48. Лемешева В.С. Содержание и HPLC-MS - анализ растворимых и связанных с клеточной стенкой флоротаннинов в разных зонах таллома бурых водорослей пор. Fucales // Материалы X Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты».

- М.: Издательство "PRESS-BOOK.RU". - 2018. - Т. 2. - Р. 253-257.

49. Padua D. et al. Bioactive compounds from brown seaweeds: Phloroglucinol, fucoxanthin and fucoidan as promising therapeutic agents against breast cancer // Phytochemistry Letters. - 2015. - Vol. 14. - P. 91-98.

50. Martinez I., Castaneda T. Preparation and chromatographic analysis of phlorotannins // Journal of Chromatographic Science. - 2013. - Vol. 51, № 8.

- P. 825-838.

51. Surget G. et al. Marine green macroalgae: a source of natural compounds with mineralogenic and antioxidant activities // Journal of Applied Phycology.

- 2017. - Vol. 29, № 1. - P. 575-584.

52. Abdelhamid A. et al. Phytochemical analysis and evaluation of the antioxidant, anti-inflammatory, and antinociceptive potential of phlorotannin-rich fractions from three Mediterranean brown seaweeds // Marine Biotechnology.

- 2018. - Vol. 20, № 1. - P. 60-74.

53. Kadom S.U., Tiwari B.K., O Donneli C.P. Application of novel extraction technologies for bioactives from marine algae // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2013. - Vol. 61, № 20. - P. 4667-4675.

54. Boettcher A.A., Targett N.M. Role of polyphenolic molecular-size in reduction of assimilation efficiency in Xiphister mucosus // Ecology. - 1993.

- Vol. 74, № 3. - P. 891-903.

55. Koivikko R. et al. Contents of soluble, cell-wall-bound and exuded phlorotannins in the brown alga Fucus vesiculosus, with implications on their ecological functions // Journal of Chemical Ecology. - 2005. - Vol. 31, № 1.

- P. 195-212.

56. Wang T. et al. Antioxidant capacities of phlorotannins extracted from the brown algae Fucus vesiculosus // Agricultural and Food Chemistry. - 2012. - Vol. 60, № 23. - P. 5874-5883.

57. Ferreres F. et al. Phlorotannin extracts from Fucales characterized by HPLC-DAD-ESI-MSn: approaches to hyaluronidase inhibitory capacity and antioxidant properties // Marine Drugs. - 2012. - Vol. 10, № 12. - P. 2766-2781.

58. Audibert L. et al. Phenolic compounds in the brown seaweed Ascophyllum nodosum: Distribution and radical-scavenging activities // Phytochemical Analysis.

- 2010. - Vol. 21, № 5. - P. 399-405.

59. Shibata T. et al. Antioxidant activities of phlorotannins isolated from Japanese Laminariaceae // Journal of Applied Phycology. - 2008. - Vol. 20, № 5.

- P. 705-711.

60. Liu H., Gu L. Phlorotannins from brown algae (Fucus vesiculosus) inhibited the formation of advanced glycation end products by scavenging reactive carbonyls // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2012. - Vol. 60, № 5.

- P. 1326-1334.

61. Nakamura T. et al. Antioxidant activity of phlorotannins isolated from brown alga Eisenia bicyclis // Fisheries Science. - 1996. - Vol. 62, № 5. - P. 923926.

62. Spurr H.I. Extraction, separation and purification of polyphenols, polysaccharides and pigments from British seaweed for high-value applications: thesis (PhD). - Leeds: University of Leeds. - 2014. - 224 p.

63. Mojzer E.B. et al. Polyphenols: extraction methods, antioxidative action, bioavailability and anticarcinogenic effects // Molecules. - 2016. - Vol. 21, № 7.

- P. 901-939.

64. Hagerman A.E. Extraction of tannin from fresh and preserved leaves // Journal of Chemical Ecology. - 1988. - Vol. 14, № 2. - P. 453-461.

65. Wissam Z. et al. Effective extraction of polyphenols and proanthocyanidins from pomegranate's peel // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. - 2012. - Vol. 4, № 3. - P. 675-682.

66. Diaz-Rubio M.E., Perez-Jimenez J., Saura-Calixto F. Dietary fiber and antioxidant capacity in Fucus vesiculosus products // International Journal of Food Sciences and Nutrition. - 2009. - Vol. 60, № 1. - P. 23-34.

67. Rajbhar K., Dawda H., Mukundan U. Polyphenols: methods of extraction // Scientific Reviews and Chemical Communications. - 2015. - Vol. 5, № 1. - P. 1-6.

68. Ibanez E. et al. Extraction and characterization of bioactive compounds with health benefits from marine resources: macro and micro algae, cyanobacteria, and invertebrates // Marine bioactive compounds: sources, characterization and applications - New York : Springer - 2012. - P. 55-98.

69. Crisan C.C. et al. Techniques for extracting polyphenols from Coreopsis tinctoria nutt. fruits // UPB Scientific Bulletin, Series B: Chemistry and Materials Science. - 2013. - Vol. 75, № 4. - P. 169-178.

70. Kadam S.U. et al. Optimization of ultrasound assisted extraction of bioactive components from brown seaweed Ascophyllum nodosum using response surface methodology // Ultrasonics Sonochemistry. - 2015. - Vol. 23. - P. 308-316.

71. Dang T.T. et al. Optimisation of ultrasound-assisted extraction conditions for phenolic content and antioxidant activities of the alga Hormosira banksii using response surface methodology // Journal of Applied Phycology.

- 2017. - Vol. 29, № 6. - P. 3161-3173.

72. Topuz O.K. et al. Optimisation of antioxidant activity and phenolic compound extraction conditions from red seaweed (Laurencia obtusa) // Journal of Aquatic Food Product Technology. - 2016. - Vol. 25, № 3. - P. 422-424.

73. Pan X., Niu G., Liu H. Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves // Chemical Engineering and Processing.

- 2003. - Vol. 42, № 2. - P. 129-133.

74. Michalak I.L., Chojnacka T.K. Seaweed extract by microwave assisted extraction as plant growth biostimulant // Open Chemistry. - 2015. - Vol. 13, № 1.

- P. 1183-1195.

75. Li Z. et al. Preparation and antioxidant property of extract and semipurified fractions of Caulerpa racemosa // Journal of Applied Phycology. - 2012. - Vol. 24, № 6. - P. 1527-1536.

76. Zhang D. et al. Comparative analysis of oxidative mechanisms of phloroglucinol and dieckol by electrochemical, spectroscopic, cellular and computational methods // RSC Advances. - 2018. - Vol. 8, № 4. - P. 1963-1972.

77. Landbo A, Meyer A. Enzyme-assisted extraction of antioxidative phenols from Black Currant juice press residues (Ribes nigrum) // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2001. - Vol. 49, № 7. - P. 3169-3177.

78. Wang T. et al. Enzyme-enhanced extraction of antioxidant ingredients from red algae Palmaria palmata // Food Science and Technology. - 2010. - Vol. 43, № 6.

- P. 1387-1393.

79. Siriwardhana N. et al. Optimisation of hydrophilic antioxidant extraction from Hizikia fusiformis by integrating treatments of enzymes, heat and pH control // International Journal of Food Science and Technology. - 2008. - Vol. 43, № 4.

- P. 587-596.

80. Puspita M. et al. Total phenolic content and biological activities of enzymatic extracts from Sargassum muticum (Yendo) Fensholt // Journal of Applied Phycology. - 2017. - Vol. 29, № 5. - P. 2521-2537.

81. Leyton A. et al. Improvement in carbohydrate and phlorotannin

extraction from Macrocystis pyrifera using carbohydrate active enzyme from

110

marine Alternaria sp. as pretreatment // Journal of Applied Phycology. - 2017.

- Vol. 29, № 4. - P. 2039-2048.

82. Xi J. et al. Characterization of polyphenols from green tea leaves using a high hydrostatic pressure extraction // International Journal of Pharmaceutics. - 2009.

- Vol. 382, № 1-2. - P. 139-143.

83. Onofrejova L. et al. Bioactive phenols in algae: The application of pressurized-liquid and solid-phase extraction techniques // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2010. - Vol. 51, № 2. - P. 464-470.

84. Meireles M.A.A. Supercritical CO2 extraction of bioactive components from algae // Functional Ingredients from Algae for Foods and Nutraceuticals.

- Cambridge: Woodhead Publishing Limited. - 2013. - P. 561-584.

85. Tanniou A. et al. Green improved processes to extract bioactive phenolic compounds from brown macroalgae using Sargassum muticum as model // Talanta.

- 2013. - Vol. 104. - P. 44-52.

86. Sivagnanam S.P. et al. Biological properties of fucoxanthin in oil recovered from two brown seaweeds using supercritical CO2 extraction // Marine Drugs. - 2015.

- Vol. 13, № 6. - P. 3422-3442.

87. Saravana P.S. et al. Influence of co-solvents on fucoxanthin and phlorotannin recovery from brown seaweed using supercritical CO2 // The Journal of Supercritical Fluids. - 2017. - Vol. 120, № 2. - P. 295-303.

88. Kim S.M. et al. Isolation of phlorotannins from Eisenia bicyclis and their hepatoprotective effect against oxidative stress induced by tert-butyl hyperoxide // Applied Biochemistry and Biotechnology. - 2011. - Vol. 165, № 5-6. - P. 12961307.

89. Goo H.R., Choi J.S., Na D.H. Quantitative determination of major phlorotannins in Ecklonia stolonifera // Archives of pharmacal research - 2010.

- Vol. 33, № 4. - P. 539-544.

90. Lee J.H. et al. Preparative isolation and purification of phlorotannins from

Ecklonia cava using centrifugal partition chromatography by one-step // Food

Chemistry. - 2014. - Vol. 158. - P. 433-437.

111

91. Zou Y. et al. Antioxidant effects of phlorotannins isolated from Ishige okamurae in free radical mediated oxidative systems // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2008. - Vol. 56, № 16. - P. 7001-7009.

92. Hermund D.B. et al. Characterisation and antioxidant evaluation of Icelandic F. vesiculosus extracts in vitro and in fish-oil-enriched milk and mayonnaise // Journal ofFunctional Foods. - 2015. - Vol. 19, № 2. - P. 828-841.

93. Audibert L. et al. Phenolic compounds in the brown seaweed Ascophyllum nodosum: distribution and radical-scavenging activities // Phytochemical Analysis.

- 2010. - Vol. 21, № 5. - P. 399-405.

94. Leyton A. et al. Purification of phlorotannins from Macrocystis pyrifera using macroporous resins // Food Chemistry. - 2017. - Vol. 237. - P. 312-319.

95. Li Y. et al. Chemical components and its antioxidant properties in vitro: an edible marine brown alga, Ecklonia cava // Bioorganic and Medicinal Chemistry.

- 2009. - Vol. 17, № 5. - P. 1963-1973.

96. Amarowicz R., Troszynska A., Shahidi F. Antioxidant activity of almond seed extract and its fractions // Journal of Food Lipids. - 2005. - Vol. 12, № 4.

- Р. 344-358.

97. Ahn G.-N. et al. Antioxidant activities of phlorotannins purified from Ecklonia cava on free radical scavenging using ESR and H2O2-mediated DNA damage // European Food Research and Technology. - 2007. - Vol. 226, № 1-2.

- P. 71-79.

98. ГОСТ ИСО 14502-1-2010. Чай. Метод определения общего содержания полифенолов. - М.: Стандартинформ. - 2010. - 14 с.

99. Kim A.R. et al. Isolation and identification of phlorotannins from Ecklonia stolonifera with antioxidant and anti-inflammatory properties // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2009. - Vol. 57, № 9. - P. 3483-3489.

100. Leyton A. et al. Identification and efficient extraction method of phlorotannins from the brown seaweed Macrocystis pyrifera using an orthogonal experimental design // Algal Research. - 2016. - Vol. 16. - P. 201-208.

101. Devi G.K. et al. In vitro antioxidant activities of selected seaweeds from Southeast coast of India // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. - 2011.

- Vol. 4, № 3. - P. 205-211.

102. Vijayan R. et al. Exploring bioactive fraction of Sargassum wightii: In vitroelucidation of angiotensin-I-converting enzyme inhibition andantioxidant potential // International Journal Of Food Properties. - 2018. - Vol. 21, № 1.

- P. 674-684.

103. Yotsu-Yamashita M. et al. Isolation and structural determination of two novel phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome Okamura, and their radical scavenging activities // Marine Drugs. - 2013. - Vol. 11, № 1. - P. 165-183.

104. Sugiura Y. et al. Isolation of a new anti-allergic phlorotannin, phlorofucofuroeckol-B, from an edible brown alga, Eisenia arborea // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. - 2006. - Vol. 70, № 11. - P. 2807-2811.

105. Imbs T.I. et al. Fucoidanase inhibitory activity of phlorotannins from brown algae // Algal Research. - 2018. - Vol. 32. - P. 54-59.

106. Zhang R. et al. A comparative assessment of the activity and structure of phlorotannins from the brown seaweed Carpophyllum flexuosum // Algal Research. - 2018. - Vol. 29. - P. 130-141.

107. Parys S. et al. Evaluation of quantitative methods for the determination of polyphenols in algal extracts // Journal of Natural Products. - 2007. - Vol. 70, № 12.

- P. 1865-1870.

108. Jegou C. et al. NMR use to quantify phlorotannins: The case of Cystoseira tamariscifolia, a phloroglucinol-producing brown macroalga in Brittany (France) // Talanta. - 2015. - Vol. 135, № 1. - P. 1-6.

109. Vissers A.M. et al. Phlorotannin composition of Laminaria digitata // Phytochemical analysis. - 2017. - Vol. 28, № 6. - P. 487-495.

110. Hermund D.B. et al. Structure dependent antioxidant capacity of phlorotannins from Icelandic Fucus vesiculosus by UHPLC-DAD-ECD-QTOFMS // Food Chemistry. - 2018. - Vol. 240. - P. 904-909.

111. Truus K. et al. Analysis of bioactive ingredients in the brown alga Fucus vesiculosus by capillary electrophoresis and neutron activation analysis // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2004. - Vol. 379, № 5-6. - P. 849-852.

112. Koivikko R. et al. High-performance liquid chromatographic analysis of phlorotannins from the brown alga Fucus vesiculosus // Phytochemical Analysis.

- 2007. - Vol. 18, № 4. - P. 326-332.

113. Koivikko R. et al. Variation of phlorotannins among three populations of Fucus vesiculosus as revealed by HPLC and colorimetric quantification // Journal of Chemical Ecology. - 2008. - Vol. 34, № 1. - P. 57-64.

114. Li Y. et al. Extraction and identification of phlorotannins from the brown alga, Sargassum fusiforme (Harvey) setchell // Marine Drugs. - 2017.

- Vol. 15, № 2. - P. 1-15.

115. Zenthoefer M. et al. Isolation of polyphenols with anticancer activity from the Baltic Sea brown seaweed Fucus vesiculosus using bioassay-guided fractionation // Journal of Applied Phycology. - 2017. - Vol. 29, № 4. - P. 20212037.

116. Tierney M.S. et al. Enrichment of polyphenol contents and antioxidant activities of Irish brown macroalgae using food-friendly techniques based on polarity and molecular size // Food Chemistry. - 2013. - Vol. 139. - P. 753-761.

117. Steevensz A J. et al. Profiling phlorotannins in brown macroalgae by liquid chromatography-high resolution mass spectrometry // Phytochemical analysis.

- 2012. - Vol. 23, № 5. - P. 547-553.

118. Aparna C. et al. A review on matrix assisted laser desorption/ionization mass spectroscopy // Asian journal of pharmaceutical and clinical research - 2015.

- Vol. 8, № 5. - P. 28-33.

119. Karthik R. et al. Structural characterization and comparative biomedical properties of phloroglucinol from Indian brown seaweeds // Journal of Applied Phycology. - 2016. - Vol. 28, № 6. - P. 3561-3573.

120. Klervi L.L. et al. Sunscreen, antioxidant, and bactericide capacities of phlorotannins from the brown macroalga Halidrys siliquosa // Journal Of Applied Phycology. - 2016. - Vol. 28, № 6. - P. 3547-3559.

121. Sugiura Y. et al. Anti-Allergic Phlorotannins from the Edible Brown Alga, Eisenia Arborea // Food Science and Technology Research. - 2007.

- Vol. 13, № 1. - P. 54-60.

122. Sugiura Y. et al. Isolation of a new anti-allergic phlorotannin, phlorofucofuroeckol-B, from an edible brown alga, Eisenia arborea // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. - 2006. - Vol. 70, № 11. - P. 2807-2811.

123. Kim D.-H. et al. Deodorizing effects of phlorotannins from edible brown alga Eisenia bicyclis on methyl mercaptan // Journal of Agricultural Science. - 2013.

- Vol. 5, № 1. - P. 95-103.

124. Parys S. et al. In vitro chemopreventive potential of fucophlorethols from the brown alga Fucus vesiculosus L. by anti-oxidant activity and inhibition of selected cytochrome P450 enzymes // Phytochemistry. - 2010. - Vol. 71, № 2-3. - P. 221229.

125. Lopes G. et al. Profiling phlorotannins from Fucus spp. of the Northern Portuguese coastline: Chemical approach by HPLC-DAD-ESI/MSn and UPLC-ESI-QTOF/MS // Algal Research. - 2018. - Vol. 29. - P. 113-120.

126. Kirke D.A. et al. The chemical and antioxidant stability of isolated low molecular weight phlorotannins // Food Chemistry. - 2017. - Vol. 221. - P. 11041112.

127. Урванцева А.М. и др. Выделение очищенного фукоидана из природного комплекса с полифенолами и его характеристика // Химия растительного сырья. - 2004. - № 3. - С. 15-24.

128. Shakambari G., Ashokkumar G.B., Varalakshmi P. Phlorotannins from brown algae: inhibition of advanced glycation end products formation in high glucose induced Caenorhabditis elegans // Indian Journal of Experimental Biology. - 2015.

- Vol. 53, № 6. - P. 371-379.

129. Ryu Y.B. et al. Influenza virus neuraminidase inhibitory activity of phlorotannins from the edible brown alga Ecklonia cava // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2011. - Vol. 59, № 12. - P. 6467-6473.

130. Gupta S., Abu-Ghannam N. Bioactive potential and possible health effects of edible brown seaweeds // Trends in Food Science and Technology. - 2011.

- Vol. 22, № 6. - P. 315-326.

131. Kong C.S. et al. Induction of apoptosis by phloroglucinol derivative from Ecklonia cava in MCF-7 human breast cancer cells // Food and Chemical Toxicology.

- 2009. - Vol. 47, № 7. - P. 1653-1658.

132. Li Y. et al. Cytotoxic activities of phlorethol and fucophlorethol derivatives isolated from Laminariaceae Ecklonia cava // Journal of Food Biochemistry. - 2011. - Vol. 35, № 2. - P. 357-369.

133. Lezcano V. et al. Antitumor and antioxidant activity of the freshwater macroalga Cladophora surera // Journal of Applied Phycology. - 2017. - Vol. 30, № 5. - P. 2913-2921.

134. Kim R-K. et al. Phloroglucinol suppresses metastatic ability of breast cancer cells by inhibition of epithelial-mesenchymal cell transition // Cancer Science. - 2015. - Vol. 106, № 1. - P. 94-101.

135. Kim E-K. et al. First evidence that Ecklonia cava-derived dieckol attenuates MCF-7 human breast carcinoma cell migration // Marine Drugs. - 2015.

- Vol. 13, № 4. - P. 1785-1797.

136. Hyun K.H. et al. Eckol suppresses maintenance of stemness and malignancies in glioma stem-like cells // Toxicology and Applied Pharmacology.

- 2011. - Vol. 254, № 1. - P. 32-40.

137. Yoon N.Y. et al. In vitro and intracellular antioxidant activities of brown alga Eisenia bicyclis // Fisheries and Aquatic Sciences. - 2011. - Vol. 14, № 3.

- P. 179-185.

138. Artan M. et al. Anti-HIV-1 activity of phloroglucinol derivative, 6,6' -bieckol, from Ecklonia cava // Bioorganic and Medicinal Chemistry. - 2008.

- Vol. 16, № 17. - P. 7921-7926.

139. Jung H.A. et al. Molecular docking studies of phlorotannins from Eisenia bicyclis with BACE1 inhibitory activity // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. - 2010. - Vol. 20, № 11. - P. 3211-3215.

140. Yoon N.Y., Lee S.H., Kim S.K. Phlorotannins from Ishige okamurae and their acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitory effects // Journal of Functional Foods. - 2009. - Vol. 1, № 4. - P. 331-335.

141. Kojima-Yuasa A. Biological and pharmacological effects of polyphenolic compounds from Ecklonia cava // Polyphenols: mechanisms of action in human health and disease (Second Edition). - USA: Academic Press.

- 2018. - Ch. 5. - P. 41-52.

142. Jung H.A. et al. Evaluation of the inhibitory effects of eckol and dieckol isolated from edible brown alga Eisenia bicyclis on human monoamine oxidases A and B // Archives of Pharmacal Research. - 2017. - Vol. 40, № 4. - P. 480-491.

143. Bae J.-S. Antithrombotic and profibrinolytic activities of phloroglucinol // Food and Chemical Toxicology. - 2011. - Vol. 49, № 7. - P. 1572-1577.

144. Lee M.H. et al. Antifungal activities of dieckol isolated from the marine brown alga Ecklonia cava against Trichophyton rubrum // Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry. - 2010. - Vol. 53, № 4. - P. 504-507.

145. Urquiaga I., Leighton F. Plant polyphenol antioxidants and oxidative stress // Biological Research. - 2000. - Vol. 33, № 1. - P. 55-64.

146. Kim S.-K., Himaya S.W.A. Medicinal effects of phlorotannins from marine Brown Algae // Advances in Food and Nutrition Research - 2011. - Vol. 64.

- P. 97-108.

147. Lee S.-H., Jeon Y.-J. Anti-diabetic effects of brown algae derived phlorotannins, marine polyphenols through diverse mechanisms // Fitoterapia.

- 2013. - Vol. 86. - P. 129-136.

148. Li Y.-X., Wijesekara I., Li Y. Phlorotannins as bioactive agents from brown algae // Process Biochemistry. - 2011. - Vol. 46, № 12. - P. 2219-2224.

149. Sivagnanam S.P. et al. Biological properties of fucoxanthin in oil recovered from two brown seaweeds using supercritical CO2 extraction // Marine Drugs. - 2015. - Vol. 13, № 6. - P. 3422-3442.

150. Barbosa M. et al. Edible seaweeds' phlorotannins in allergy: A natural multi-target approach // Food Chemistry. - 2018. - Vol. 265. - P. 233-241.

151. Nagayama K. et al. Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome // Antimicrob Chemotherapy. - 2002. - Vol. 50, № 6. - P. 889893.

152. Lopes G. et al. Can phlorotannins purified extracts constitute a novel pharmacological alternative for microbial infections with associated inflammatory conditions? // Public Library of Science ONE. - 2012. - Vol. 7, № 2. - P. 1-9.

153. Kim H-J. et al. In vitro antibacterial activity of phlorotannins from edible brown algae, Eisenia bicyclis against streptomycin-resistant listeria monocytogenes // Indian Journal of Microbiology. - 2018. - Vol. 58, № 1.

- P. 105-108.

154. Kim K-H. et al. Fucofuroeckol-A from edible marine alga Eisenia bicyclis to restore antifungal activity of fluconazole against fluconazole-resistant Candida albicans // Journal of Applied Phycology. - 2018. - Vol. 30, № 1.

- P. 605-609.

155. Yeo M., Jung W., Kim G. Fabrication, characterisation and biological activity of phlorotannin-conjugated PCL/p-TCP composite scaffolds for bone tissue regeneration // Journal of Materials Chemistry. - 2012. - Vol. 22, № 8. - P. 35683577.

156. Kim M., Kim G. Electrospun PCL/phlorotannin nanofibres for tissue engineering: physical properties and cellular activities // Carbohydrate Polymers.

- 2012. - Vol. 90, № 1. - P. 592-601.

157. Спрыгин В.Г. и др. Гепатопротекторные свойства экстракта из бурой водоросли Saccharina japonica // Биология моря. - 2013. - Т. 39, № 1. - С. 50-54.

158. Sprygin V.G. et al. The influence of an extract from the marine brown

alga sargassum pallidum on the metabolic reactions in the liver under experimental

118

toxic hepatitis // Russian Journal of Marine Biology. - 2017. - Vol. 43, № 6.

- P. 479-484.

159. Khair N.H. et al. The evaluation of cardioprotective activity of Ecklonia cava extract in rats // World Journal of Pharmaceutical Research. - 2018. - Vol. 7, № 16. - P. 696-706.

160. Krentz A.J., Bailey C.J. Oral antidiabetic agents: current role in type 2 diabetes mellitus // Drugs. - 2005. - Vol. 65, № 3. - P. 358-411.

161. Park S.R. et al. Inhibitory activity of minor phlorotannins from Ecklonia cava on a-glucosidase // Food Chemistry. - 2018. - Vol. 257. - P. 128134.

162. Подкорытова А.В., Кадникова И.А Качество, безопасность и методы анализа продуктов из гидробионтов. Вып. 3. Руководство по современным методам исследований морских водорослей, трав и продуктов их переработки.

- М.: ВНИРО. - 2009. - 108 с.

163. Heo S.-J. et al. Antioxidant activities of enzymatic extracts from brown seaweeds // Bioresource technology. - 2005. - Vol. 96, № 14. - P. 1613-1623.

164. Angel A., Carillo O. Utilisation of Chlorella Vulgaris biomass for the production of enzymatic protein hydrolisates // Bioresource Technology. - 2008.

- Vol. 99, № 16. - P. 7723-7729.

165. ГОСТ 26185-84. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа. - Введ. 1985-01-01. - М.: Стандартинформ.

- 2010. - 34 с.

166. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. - 1959. - Vol. 37, № 8. - P. 911-917.

167. Пат. 2240329 Российская Федерация, МПК C 08 B 37/00, A 23 L 1/0532. Способ получения биологически активного кислого сульфатированного полисахарида из морских водорослей - фукоидана / А.М. Дядицына, Е.А. Калинина, А.С. Евдокимова; заявитель и патентообладатель Государственное унитарное предприятие "Северное

119

отделение полярного научно -исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии", А.М. Дядицына - № 2001124124/13; заявл. 29.08.2001; опубл. 20.11.2004. - 5 с.

168. Михалева М.С., Комисарова Н.Г., Егуткин Н.Л. Высаливание фенола при его экстракции метил-трет-бутиловым эфиром из водных растворов // Башкирский химический журнал. - 2008. - Т. 15, № 2. - С. 133-134.

169. Егуткин Н.Л., Сыркин А.М. Экстракция фенола из водных растворов метил-трет-бутиловым эфиром // Нефтегазовое дело: электронный научный журнал. - 2014. - № 1. - С. 193-205.

170. Taghdiri M. et al. Application of Sephadex LH-20 for microdetermination of dopamine by solid phase spectrophotometry // ISRN Pharmaceutics. - 2012. - Vol. 2012. - Р. 1-5.

171. Kumoroa A.C., Hasana M., Singha H. Effects of solvent properties on the Soxhlet extraction of diterpenoid lactones from Andrographis paniculata leaves // Science Asia. -2009. - Vol. 35. - P. 306-309.