Физиолого-биохимические механизмы формирования гипобиотических состояний высших растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, доктор биологических наук Рогожин, Василий Васильевич

• Рогожин, Василий Васильевич
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Рогожин, Василий Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

РАЗДЕЛ 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ

МЕХАНИЗМОВ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ. И

РАЗДЕЛ 2. РАЗВИТИЕ ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ У ВЫСШИХ

ОРГАНИЗМОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССЙРУЮЩХ ФАКТОРОВ.

РАЗДЕЛ 3. АДАПТАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ К УСЛОВИЯМ СРЕДЫ.

3.1. Влияние температуры на адаптационный потенциал растений.

3.2. Адаптационные механизмы холодоустойчивых растений. 2?

3.3. Адаптационные механизмы солеустойчивых растений.

РАЗДЕЛ 4. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОКОЯ СЕМЯН.

РАЗДЕЛ 5. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ.

РАЗДЕЛ б. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ.

РАЗДЕЛ ?. АНТИОКСИДАНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Исходные вещества.

1.1 Сбор лекарственного сырья.

1.2 Сушка заготовленного сырья.

1.3 Экстракция биологически активных веществ из растительных тканей. ?

2. Использованная аппаратура. ?

3. Приготовление рабочих растворов. ?

4. Методики проведения физиолого-биохимических исследований. ?

4.1 Методики исследования пероксидазы. ?

4.2. Методики определения реакции пероксидазного окисления

- 3 аскорбиновой кислоты и гидрохинона. ?

4.3. Методики исследования алкогольдегидрогеназы растений.

4.4. Определение активности NADP-зависимой изоцитратдегид-рогеназы. ?

4.5. Методики исследования глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и дегидрогеназы 6-фосфоглюконовой кислоты. ?

4.6. Исследование перекисного окисления липидов.

4.?. Определение содержания антиоксидантов.

4.8. Определение содердания стероидных гликозидов.

4.9. Определение содержания аскорбиновой кислоты.

4.10. Определение содержания хлорофилла.

4.11. Изучение экзогенного влияния строфантина на жизнеспособность семян.

4.12. Изучение комплексообразования пикриновой кислоты с пикратом натрия и стероидными гликозидами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ГИП0БИ03А.

1.1. Молекулярные механизмы действия пероксидазы.

1.1.1. Особенности строения пероксидазы, роль доступных карбоксильных групп фермента в пероксидазном катализе.

1.1.2. Роль Функционально важных карбоксильных групп пероксидазы в механизме действия фермента.

1.1.3. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы.

1.1.4. Механизм совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона.

1.1.5. Влияние антиоксидантов на каталитические свойства пероксидазы хрена.

- 4 i.1.6. Регулирование реакций пероксидазного окисления быстро окисляемых субстратов пероксидазы индолил-З-уксусной кислотой.

1.1.7. Регулирование реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты с помощью индолил-3-уксусной кислоты.

1.2. Физико-химические свойства дегидрогеназ.

1.2.1. Физико-химические свойства алкогольдегидрогеназы из различных растений.

1.2.2. Функционально важные SH-группы активного центра алкогольдегидрогеназы, участвующие в ферментативном катализе.

1.2.3. Возможные механизмы регулирования активности глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы избытком субстрата и кофермента.

1.3. Механизм взаимодействия стероидных гликозидов с пикратом натрия.

РАЗДЕЛ 2. РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ, ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И УСЛОВИЙ СРЕДИ В ФОРМИРОВАНИИ ГИПОБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

2.1. Особенности действия алкогольдегидрогеназы из семян пшеницы и пырея ползучего при формировании механизмов покоя.

2.2. Влияние экзогенных этанола и ацетальдегида на жизнеспособность семян пшеницы.

2.3. Влияние высоких положительных температур на резистентность семян пшеницы и караганы древовидной.

2.4. Влияние рН и природы ионов среды набухания на прорастание семян пшеницы.

2.5. Влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы.

2.5.1. Роль малых доз ультрафиолетового излучения на динамику активности ферментов зерна пшеницы.2?

2.5.2. Влияние малых доз ультрафиолетового облучения семян на состояние антиоксидантной системы, прорастающих зерен пшеницы.

- 5

2.5.3. Влияние УФ-облучения семян на состояние антиокси-дантной системы защиты проростков пшеницы.30?

2.6. Действие строфантина на прорастание семян.

РАЗДЕЛ 3. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ КОМПОНЕНТАМИ ОСНОВНЫХ

МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ, ПРИНИМАЮЩИХ УЧАСТИЕ В

ФОРМИРОВАНИИ ГИПОБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ.32?

3.1. Участие стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в формировании покоя семян растений.32?

3.2. Роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в онтогенезе растений.

3.3. Взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в прорастании семян пшеницы.

3.4. Участие экзогенных антиоксидантов в формировании покоя семян пшеницы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физиолого-биохимические механизмы формирования гипобиотических состояний высших растений»

Гипобиоз - это состояние пониженной функциональной активности живых организмов, обусловленное факторами среды (низкая и высокая температура, отсутствие влаги и т.д.), при сохранении их высокой жизнеспособности. Однако после восстановления нормальных условий для существования организмов происходит возобновление активной деятельности всех его функциональных систем. В реализации гипобио тических состояний используются адаптационные механизмы, обуслов ливающие приспособление к условиям окружающей среды растений и жи вотных, которые заложены в их анатомо-физиологических и молеку лярно-генетических и биохимических особенностях строения.

Действие приспособительного потенциала на биохимическом уров не проявляется участием белков и функционально активных молекул в регуляции метаболических процессов. В работах последних лет показано, что температура, рН-среды, УФ-облучение и другие факторы окружающей среды могут оказывать влияние на кинетические и структурные свойства ферментов, которые в живых организмах выполняют каталитические функции, определяя молекулярную природу приспособительных механизмов организмов к меняющимся факторам сре ды. В частности, показано, что одной из наиболее общих особенностей воздействия температуры на ферментативные реакции следует считать влияние на степень сродства фермента к субстрату. Измене ние кинетического параметра (константы Михаэлиса-Ментен) в облас ти оптимальных температур имеет минимальное значение и положение этого минимума соответствует оптимальным температурным условиям обитания живых организмов, находящихся в разных температурных ус ловиях, а также при акклиматизации к различным температурам. Во многих случиях влияние температуры на сродство фермента к субстра

- 9 ту осуществляется через изменение внутриклеточного рН, что вызывает структурные перестройки в ферментах, реализуя таким образом на молекулярном уровне адаптивные возможности, заложенные в лабильности белковых глобул, обеспечиваемых за счет перераспределения водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Кроме этого приспособительный потенциал живых организмов может реализоваться путем синтеза новых белков и изоформ некоторых ферментов. Эти виды прояв ления действия стрессирующих факторов на ферментативный аппарат клетки живых организмов служит примером биохимических адаптаций к меняющимся условиям внешней среды, что, возможно, наиболее резко должно наблюдаться у организмов обитающих в районах с резким конти нентальным климатом, к которым относится Якутия.

В экстремальных условиях Якутии, где температура летом +30°С, зимой доходит до -50°С, растения и животные плохо приспособленные к данным условиям, с низким адаптационным потенциалом, не смогли бы выжить. Однако особенности природно-климатических условий Якутии, разнообразие географических зон обусловливают специфику обмен ных процессов, протекающих в растительных и животных организмах, способствуют синтезу и накоплению в них функционально активных веществ, обеспечивающих высокий потенциал жизнеспособности организмов. Растения вынуждены за короткое жаркое лето активно вырабатывать в больших количествах различные стимуляторы обменных процессов, для того чтобы ускорить протекание метаболических процессов. За счет накопления биологически активных веществ в летний период растения обеспечивают стабильное поддержание высокой реактивности и резистентности функциональных систем как активно вегетирующего растения, так и семян, находящихся в состоянии гипобиоза. Мизне-способность которых в зимний период поддерживается за счет угнетения оксидазных процессов и переключение энергетики клетки на деги

- 10 дрогеназные метаболические пути. Однако недостаточно изученными являются биохимические механизмы, обеспечивающие высокую жизнеспо собность семян в состоянии покоя, а также причины, вызывающие тор можение прорастания покоящихся семян.

- 11

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР РАЗДЕЛ 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ 1ИВЫХ ОРГАНИЗМОВ Неотъемлемый элемент жизнедеятельности организмов - постоянное взаимодействие их с внешней средой. Современная эволюционная теория исходит из того, что в процессе эволюции у видов вырабатывается система защитно-приспособительных механизмов, позволяющих растениям и животным отвечать на изменения среды приспособительны ми реакциями, обеспечивающими выживание вида. Структура защитно-приспособительного комплекса определяется особенностями почвенно-климатических и биотических условий в которых проходила эволюция вида. В свою очередь, дальнейшая экологическая и географическая дифференциация вида, формирование его эколого-географического полиморфизма зависят от специфики защитно-приспособительного комплекса вида С1,2 3.

Адаптация к условиям окружающей среды - необходимое условие выживания и жизнедеятельности организмов любого уровня эволюционного развития. Способность к жизнедеятельности в условиях постоян ных изменений факторов среды определяется разными приспособительными механизмами (биохимическими, физиологическими, морфологическими, поведенческими).

Механизмы адаптации возникли одновременно с самой жизнью и развивались прогессивно вместе с усложнением жизненных процессов Чем выше уровень эволюционного развития организма, тем совершен нее и разнообразнее у него адаптационные процессы [31.

Развитие приспособительных механизмов организма соответству ет потребностям, многообразие и сложность которых также увеличива ются в эволюционном ряду, и находят свое проявление в поведении

- 12 важнейшем способе адаптации к среде. Это определяется тем, что потребности отражают избирательную зависимость живых организмов от факторов внешней среды, существенных для самосохранения и саморазвития, и служат источником активности живых систем, побуждением и целью их поведения в окружающем мире [43.

Удивительная способность живых систем к адаптации - их основное отличительное свойство. Не случайно проблема адаптации всегда была концепцией в биологии и занимала центральное место в сельском хозяйстве. Для адаптивности (приспособленности) и процесса адаптации (приспособления), отражающих все многообразие отношений организмов с окружающей средой, характерно единство таких противоположностей, как изменчивость и стабильность, гибкость и устойчивость, дифференцированость и функциональная устойчивость [5].

Адаптация организмов к условиям внешней среды достигается моди фикационной и генотипической изменчивостью, которые на уровне ге-терозигот гетерогенных популяций оказываются взаимосвязанными. При зтом высокий потенциал их онтогенетической приспособленности как бы "буферирует" реализацию потенциала генотипической изменчивости, обеспечивая, таким образом, зволюционный компромисс между высокой приспособленностью в онтогенезе и сохранением генетической гибкости в Филогенезе. Именно эти главные механизмы саморегуляции дают возможность организмам обеспечивать динамическое равновесие потоков веществ, энергии и информации варьирующих условиях внешней среды. Несмотря на универсальность основных путей адаптации у всех живых организмов, адаптивный потенциал каждого вида, характеризующий его способность к выживанию, воспроизведению и саморазвитию в результате взаимосвязанного функционирования генетических программ онтогенетической и филогенетической адаптации, специфичен и зволю-ционно обусловлен [б,?]. Доказано, что характерной особенностью

- 13 адаптивных реакций высших эукариот является их интегрированность вследствие функциональной коадаптации генетического материала, что опровергает представление о геноме как "мешке с бобами" и об адаптивных реакциях целостного организма как "реестре" отдельных признаков [83. Понимание двойственности и специфики адаптивного потенциала каждого вида позволяет определить наиболее эффективные подходы к управлению процессами его онтогенетической и филогенетической адаптации, базируясь при этом на эволюционной стратегии естественной флоры и Фауны, в основе которой лежит взаимосвязь генетического полиморфизма и эволюционной специализации [51.

Адаптация - это реализация тех резервных возможностей, которые заложены в любом живом активно функционирующем организме, позволяющие ему выживать в экстремальных условиях.

В 1936 г. Г. Селье [9,10] проводя исследования на животных впервые предложил синдром, вызываемый различными вредоносными аген тами, названный впоследствии как общий адаптационный синдром, или синдром биологического стресса.

В развитии стресса Селье выделяет три стадии: 1) реакция тревоги, 2) стадия устойчивости, 3) стадия истощения.

Для реакции тревоги характерно уменьшение размеров тимуса, се лезенки и лимфатических узлов, количество жировой ткани, появление язв желудка и кишечника, исчезновение эозинофилов в крови и гранул липидов в надпочечниках. Сильный стрессор может привести к гибели организма уже на стадии тревоги. Однако, если действие стрессора совместимо с адаптационными возможностями организма, животное спо собно адаптироваться, активируя механизмы противодействия. Резистентность организма генетически детерминирована и зависит от силы и продолжительности действия стрессора. При продолжительном воздействии, резервные возможности организма истощаются и сопративля

- 14 емость может понизиться, что приводит к его гибели.

Ответная реакция зависит от стабильности и реактивности организма, изменяющихся в зависимости от внутренних и внешних условий. Селье указывает на специфичность действия стрессирующего агента, которое может вызывать абсолютно одинаковые ответы. Раздражитель действует на разные организмы неодинаково, в чем проявляется индивидуальная специфичность, зависящая от стабильности и реактивности функциональных систем каждого.

Стресс представляет собой неспецифический компонент адаптации, который играет мобилизующую роль и обусловливает привлечение энергетических и пластических ресурсов для специфической адаптивной пе рестройки различных систем организма [11].

Меерсон Ф.З. [12] предлагает рассматривать протекание адаптаци онных реакций в два зтапа: начальный этап срочной, но несовершенной адаптации и последующий этап совершенной, долговременной адаптации. Реализация срочного этапа адаптации возможно только благодаря тем резервам организма, которые обусловлены генетически, за счет ранее сформированных физиолого-биохимических механизмов. Продолжительность этапа полностью зависит от запаса пластических и энергетических ресурсов в организме. Проявляется сразу в ответ на действие фактора, но, однако, ограничено тем, что деятельность организма протекает на пределе его функциональных возможностей и не всегда может быть совершенной.

Долговременный этап адаптации развивается на основе многократной реализации срочной адаптации. При этом организм вырабатывает устойчивый комплекс адаптационно приспособительных механизмов, которые позволяют ему противодействовать более разрушительным факторам и выдерживать нагрузки, действие которых ранее было несовместимо с жизнью.

- 15

Таким образом каждый живой организм имеет адаптационный (жизненный) потенциал, который обеспечивает возможность его выживания в экстремальных или меняющихся условиях. Однако величина потенциала у разных организмов индивидуальна. Благодаря своим функциональным резервам растения и животные способны выдерживать значительные воздействия со стороны различных факторов окружающей среды, а в случае необходимости повышать потенциал толерантности системы, увеличивая свои адаптационные возможности.

РАЗДЕЛ 2. РАЗВИТИЕ ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ У ВЫСШИХ ОРГАНИЗМОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ Для получения высоких урожаев сельскохозяйственных культур необходимы сорта, способные эффективно использовать ресурсы внешней среды (свет, тепло, влагу, удобрения и пр.) и переносить стрес совые нагрузки, связанные с критическими проявлениями этих факторов и усилением деятельности вредоносных организмов. Особое место здесь занимает познание адаптивных реакций, их биохимических, физиологических и морфологических механизмов, включающихся в зависимости от продолжительности действия и величины супероптимального фактора, а также природы индуктора. Так, например, кратковременное действие температуры вызывает конформационные изменения ферментативных молекул и их каталитической активности, приводя к образованию шоковых белков, изменяя характер метаболизма растений, что и обусловливает некоторое повышение его устойчивости. При длительном действии повышенной температуры значительный рост устойчивости обеспечивается вновь синтезируемыми ферментами, отличающимися физико-химическими свойствами [13].

Существуют различные точки зрения на характер адаптации к повреждающему фактору. По мнению одних исследователей, этот процесс

- 16 сопровождается повышением устойчивости прежде всего к супероптимальному воздействию, то есть имеет специфический характер [14]. Другие считают, что Физиологическая реакция растений на различные абиотические стрессы однотипна [153. Столь противоречивые суждения подчеркивают чрезвычайную сложность изучаемого явления и недостаточность знаний в этой области [133.

Одним из механизмов, обеспечивающим формирование адаптационных изменений является гормонально-рецепторная система активное участие в которой принимает фермент аденилатциклаза.

Система аденилатциклаза - цАМФ - фосфодиэстераза является общим для прокариот и эукариот механизмом передачи, переработки и реализации внешней информации в клетке [15 3. Аденилатциклаза - фер мент, катализирующий перевод АТФ в цАМФ и пирофосфат, выступает в роли дискриминатора многочисленных сигналов окружающей среды и генератора внутриклеточного сигнала. Аденилатциклаза является состав ной частью мембраны клетки и представляет собой липопротеид. Эффек торами для аденилатциклазы могут служить различные химические аген ты - гормоны, кознзимы, метаболиты. Циклические нуклеотиды, в частности цАМФ, регулируют метаболические процессы внутри клетки посредством взаимодействия с ферментами (фосфогидролазы, фосфотранс-феразы, протеинкиназы) и цАМФ-связывающимися белками. Макроэрги-ческие свойства и необратимость превращений цАМФ обеспечивают однонаправленность хода информации в клетке.

Общая схема регуляции внутриклеточного уровня цАМФ и формирования ответной реакции клетки при действии различных внешних факто ров включает следующие основные этапы: взаимодействие внешнего фактора с аденилатциклазами мембраны, образование цАМФ, влияние цАМФ на метаболические процессы внутри клетки посредством аллостеричес-кого взаимодействия с белками, в том числе с шоковыми. Гидролиз

- i? цййФ до 5'-АМФ, осуществляется фосфодиэстеразой, прекращает биологическое действие этого нуклеотида.

Тепловой шок является внезапным, сложным, но временным изменением программы клеточной активности, которая направлена на обеспечение выживания в период стресса и на восстановление нормы (высокоэффективная адаптация). За критерий теплового шока взят синтез белков при температуре 33 - 40°С. Составлена классификация белков теплового шока (БТШ) по молекулярным массам. В настоящее время определены гены, контролирующие синтез БТШ [16].

Следует отметить, что БТШ образуются и при действии других индукторов стресса. Синтез белков теплового шока в качестве обшей реакции на стрессовые факторы в эукариотных клетках усиливается постоянно растущим числом таких факторов, действующих в качестве стимуляторов С163.

Экспериментами на клеточных культурах томатов было установлено, что предварительная тепловая обработка (25°С) оказывает защитное действие в последующий после теплового шока период.

Как показали исследования БТШ способствуют стабилизации мембран [1?]. Важным фактором в нарушении репликации ДНК могут быть дефекты мембран, приводящие к высвобождению полиаминов во внеклеточную среду. Быстрота и сложность реакции теплового шока, ее ре-гуляторное воздействие и количество вновь образованных белков имеют большое значение не только для защиты клетки от разрушения теплом, но также и для быстрого и полного восстановления нормальной клеточной активности после стресса [13 3.

Гормоны осуществляют свои физиологические эффекты, активируя транскрипцию генов, программирующих синтез ферментов и иных белков ответственных за их действие. Гормоны или гормоноподобные вещества выступающие в роли индукторов, оказывают влияние на экспрессию

- 18 гена путем воздействия на разные стадии биосинтеза РНК и белка [133

В основе регуляции биосинтеза ферментов при адаптации лежит включение или усиление транскрипции участка генома, контролирующего синтез адаптивных белков, что и составляет основу генетической индукции. Зто явление было впервые открыто и подробно исследовано у микроорганизмов С18]. Их клетки легко приспосабливаются к изменениям питательной среды благодаря адаптивному синтезу ферментов. При появлении в среде нового субстрата в клетках микроорганизмов начинается или ускоряется синтез ферментов, переводящего данный субстрат в форму, более доступную для использования в качестве источника углерода, азота или энергии С133.

В геноме высших организмов экспрессия гена и совокупность ре-гуляторных связей носит качественно более сложный характер, который обусловлен особой организацией генетического материала, наличием такого комплекса, как хроматин [193. Очевидно, что в связи с дифференцировкой в составе генетического аппарата появляются такие регуляторные белки, как гистоны и кислые белки хроматина, которые участвуют в регуляции транскрипции [13 3.

Генетическая индукция биологически активными веществами может осуществляться и на уровне изоферментов, то есть в этом случае под действием гормонов увеличивается скорость синтеза не всех множественных форм данного фермента, а только определенных, индуцибельных. Предполагается, что изоформы представляют собой отдельные модификации молекулы фермента, возникающие в процессе фосфорилирования, метилирования или лимитированного протеолиза [203. Высказано предположение, что может происходить и регулируемое взаимопревращение этих Форм - интерконверсия, интенсивность которой зависит от рН и температуры среды [133.

Факты свидетельствуют не только об универсальности принципа

- 19 избирательной индукции изоферментов, но и о его большом эволюционном возрасте [20]. Широкое распространение этой формы ферментативной индукции среди живых организмов обусловлено, по-видимому, какими-то серьезными биологическими преимуществами, которые может обеспечить данный принцип регуляции [13].

Ряд ответных реакций растительного организма носит защитный характер. Известно, что большое количество пестицидов, полициклических углеводородов и иные чужеродные химические соединения, обладающие гидрофобными свойствами, являются индукторами микросомаль ных ферментов - оксигеназ смешанных функций. Индукция таких фермен тов происходит главным образом в тканях, контактирующих с внешней средой. Эти ферменты гидроксилируют чужеродные вещества, что обеспечивает их ферментативную коньюгацию с глюкуроновой кислотой, глю козой, глицином и другими гидрофильными соединениями. Становясь в результате этого более водорастворимыми, чужеродные вещества выводятся из организма [21].

Известно, что растения для защиты от проникновения в свой организм чужеродных агентов синтезируют разнообразные токсические ве щества (так называемые фитотоксины) - терпены, фенолы, хиноны, алкалоиды и т.п., являющиеся вторичными метаболитами или ксенобиотиками [22]. Существенную роль в защите растений играют белки и пептиды, в частности гликопротеины, участвующие в распознавании чужеродного белка [23].

Установлено, что отсечение корней от интактного проростка вызывает нарушение физиологического состояния клеток, выражающееся в снижении мембранного потенциала, уровня АТФ, функционально-метаболической активности и др. В течение нескольких часов в клетках отсеченных корней происходят процессы, связанные с восстановлением клеточного гомеостаза и адаптацией к новым условиям существования.

Через 5-10 час инкубации (в зависимости от видовых и индивидуальных особенностей растения, возраста, степени интактности, условий инкубирования и др.) клетки корней переходят в новое стационарное состояние, которое характеризуется стабилизацией метаболизма и Функций, гиперполяризацией мембран, возрастанием уровня восстановленных пиридиннуклеотидов [241. Известно, что запасание восстановителя, а также генерирование и поддержание ионных градиентов - одна из стадий внутриклеточных энергетических преобразований и форма (наряду с АТФ) аккумуляции энергии в клетке, которая может расходоваться на разнообразные клеточные процессы С25—27 3. Выделяют два совершенно различных состояний клеток - дезэнергизованное - клетки с энергетическим потенциалом свежеотсеченнх корней и энергизован-ное состояние - клетки после адаптационных изменений [28].

Таким образом, за несколько часов эксперимента выделяют два практически противоположных физиологических состояния клеток корней: клетки корней пшеницы находятся в дезэнергизованном состоянии в течение 1 - 2 час после отсечения и через 5 -б час инкубации переходят в энергизованное состояние [243.

В дезэнергизованном состоянии клетки корней не поглощают ионы калия из экзогенной соли, характеризуются низкой устойчивостью и не противостоят действию альтерирующих агентов. В энергизованном состоянии наблюдается усиленное поглощение экзогенных ионов калия и активное противодействие клеток на повреждение, обусловленное возрастанием и активизацией, защитных систем [28].

На образцах пшеницы [29], обработанных химическими веществами, способных вызывать различные мутации было показано, что каждый индуцированный мутант представляет собой новую форму с присущими ей своими особенностями. Изменения в морфологии колоса (или всего растения) сопровождаются и другими качественными и количественны

- 21 ми изменениями его признаков и свойств, касающимися метаболизма, а следовательно, и физиолого-биохимических особенностей, продуктивности и жизнеспособности растения. Все это свидетельствует о множественности наследственных нарушений, происходящих при воздействии стрессирующих факторов, затрагивающих все жизненно важные для организма системы, в том числе и ферментативные. При этом выживаемость организмов зависит от возможности реализации заложенных в нем компенсаторных механизмов.

РАЗДЕЛ 3. АДАПТАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ К УСЛОВИЯМ СРЕДЫ

В настоящее время изучение физиолого-биохимических механизмов стресса и адаптации - одна из наиболее важных проблем в растение водстве [303.

Длительное воздействие высокой температуры, низкой относитель ной влажности воздуха, засоление, осмотический шок и др. сущест венно снижает содержание в растениях индольных ауксинов и стимуля торов роста фенольной природы [31-331.

Снижение уровня ауксинов обьясняют уменьшением синтеза трипто фана или увеличением скорости окисления ауксинов С323 .

При длительном стрессовом воздействии низкими и высокими тем пературами, обезвоживании, засолении и др. в различных органах растений могут накапливаться ингибиторы роста и АБК наблюдаются значительные изменения в содержании фитогормонов и в ряде случаев показана адаптивная роль этих изменений [31,323. Предполагается возможность образования и предачи в пределах растения "сигнала" индуцирующего адаптивный ответ [343. При кратковременном действии стрессора на одни части растения наблюдаются изменения содержания свободной и связанной форм ИУК [353. Так, например, кратковременное воздействие низкотемпературного стресса на побеги интактных

-224-дневных проростков кукурузы приводит к некоторому уменьшению содержания свободной ИНК в дистальной части корня этого проростка через 90 мин после стресса. Одновременно в этой же части корня наблюдается почти 3-кратное увеличение концентрации АБК по срав нению с контролем. Следовательно, при кратковременном действии стресса наблюдается тенденция снижения содержания ЙУК, повышение количества АБК и увеличение отношения АБК:ИУН СЗОЗ.

Схожие данные, только за более длинные промежутки времени, по лучены в работах [31-33].

Кроме того, удалось зарегистрировать изменения в содержании ИУК и АБК в частях растений, удаленных из органов, воспринемающих стрессовые воздействия [30].

Предполагается, что неблагоприятное воздействие на надземную часть растения вызывает образование и передачу в другие органы "сигнала", индуцирующего изменение в балансе фитогормонов [30,35]

Таковым выступает потенциал действия - электрическая волна возбуждения, которая с большой скоростью (до 36 м/ч) распространяется от очага возбуждения в другие органы, вызывая в них различные Функциональные изменения [343.

Таким образом одним из механизмов проявления адаптационного ответа на действие стрессирующего фактора является изменение концентрации свободных, т.е. активных гормонов путем высвобождения их из связанных форм или, наоборот, коньюгирования свободных форм Причем носителем сигнала может выступать лишь быстро распространяющийся потенциал действия. Генерирование электрического сигнала происходит при изменении гормонального статуса какой-либо части растения. Возникшее резкое изменение функционального состояния данного органа может изменить всю систему донорно-акцепторных отношений между этим органом и остальным растением. Распространяю

07 - L. J — щийся электрический сигнал может нести информационную нагрузку [351. Возникшие в системе изменения могут инициировать адаптивные метаболические процессы, повышая жизнеспособность растительного организма.

3.1. Влияние температуры на адаптационный потенциал растений.

Выживаемость организмов в естественных условиях непрерывно изменяющейся внешней среды невозможна без адаптации к теплу и холоду. Для пойкилотермных организмов процесс адаптации заключается в изменениях обмена веществ в соответствии с изменениями температуры их органов, которая приближается к температуре окружающей среды. Для гомотермных организмов процесс адаптации направлен, напротив, на сохранение температуры тела, относительно независимой от температуры окружающей среды [36].

Водоросли относятся к пойкилотермным организмам, у которых все протекающие в клетке процессы, в том числе и фотосинтез, испытывают постоянное влияние температуры окружающей среды [3?]. С понижением температуры уменьшается скорость транспорта электронов между ФС II и ФС I, замедляются биохимические реакции, в том числе реакции фиксации СО» [38]. При этом скорости быстропротекающих процесL сов поглощения света фотосинтетическими пигментами, миграции энергии возбуждения и разделения зарядов в реакционных центрах остаются практически неизменными. Зти различия определяют необходимость согласования скоростей фотохимических и биохимических процессов, т.к. замедление оттока электронов от ФС I и ФС II может стимулировать образование молекул водорода в возбужденном состоянии и инициировать деструктивные свободнорадикальные реакции [39,40].

Адаптация водоросли Chlorella vulgaris к пониженной температуре сопровождается уменьшением содержания в клетках хлорофиллов

- 24 а и Ь и количества активных реакционных центров фотосистем I и II. Активность ФС II уменьшается после снижения температуры культивирования и восстанавливается по мере адаптации хлореллы к новым условиям. Снижение температуры культивирования вызывает структурно-функциональную перестройку фотосинтетического аппарата у хлореллы. Перестроечные процессы завершались через 1 - 2 сут после изменения температурных условий и имели одинаковую направленность при температуре 15 и 20°С. За зтот период плотность культуры возрастала всего в 2 - 3 раза (при 15°С), следовательно указанные эффекты были обусловлены фенотипической, а не генотипической адаптацией водо рослей к новым условиям роста С413.

Под воздействием низких температур у фотосинтезирующих организмов снижается устойчивость к фотоингибированию [42], при котором усиливается тепловая диссипация поглощенной энергии света в ФС II [43]. Предполагают, что первичным актом повреждения ФС II при фотоингибировании является образование дважды восстановленного хинона [443, который покидает свое место связывания в ФС II. В дальнейшем происходит протеолитическое расщепление Б1-белка, входящего в состав ФС II [453. Для реактивации ФС II необходим ре-синтез Б1-белка и его встраивание в ФС II [463, а при сильном фотоингибировании и В2-белка ФС II [433. Адаптация хлореллы к пониженной температуре или яркому свету свидетельствует в пользу существования регуляторного механизма, управляющего скоростью синтеза хлоропластных белков в соответствии со скоростью их фотоповреждения для поддержания высокой эффективности работы ФС II [413.

На основании экспериментов с листьями высших растений была предложена модель, согласно которой процессы фотоингибирования и реактивации на свету протекают одновременно, а общая активность ФС П определяется соотношением констант прямой и обратной реак

- 25 ций первого порядка [4?3.

Высказывались предположения, что фотоингибирование может играть защитную функцию, препятствуя перевосстановлению ФС I [403 при резком увеличении интенсивности освещения, либо при понижении температуры. Вместе с тем, при длительном воздействии новых условий подобная стратегия защиты от избыточного освещения не является оптимальной, поскольку при этом велики энергетические затраты клетки на поддержание балластных (неактивных) Фотосинтетических структур [41].

Растения и цианобактерии способны десатурировать жирные кислоты мембранных липидов в ответ на изменение температуры окружающей среды. При понижении температуры подвижность мембранных липидов уменьшается. Однако при низких температурах активируется процесс денатурации жирных кислот, что в конечном итоге приводит к восстановлению физического состояния мембраны и компенсации уменьшения подвижности мембранных липидов [48-503. Ген desA, отвечающий за десатурацию жирных кислот в цианобактерии Synechocystis [513, непосредственно участвует в поддержании "нормального" состояния мембран, их текучести. Продукт гена desA, а12 десатураза, образует двойные связи в цепях жирных кислот и, таким образом, ре гулирует степень ненасыщенности жирных кислот в мембранных липидах Снижение температуры с 36°до 22°С приводит к 10-кратному увеличению уровня транскрипта desA в Synechocystis [523. Индукция экспрессии desA-гена определялась разницей температур, превышающей определенный уровень (б°С), но не абсолютной температурой. Так, увеличение количества транскрипта гена desA в клетках Synechocystis, адаптированных к 36°С, наблюдалось при 28°С, в то время как в клетках, адаптированных к 32°С, накопление транскрипта было заметно только при 2б-24°С [523. Накопление мРНИ desA-гена в циано

- 26 бактерии ЗупесЬосузиэ при низких температурах является результатом не только активации транскрипции, но и увеличением времени жизни мРНК этого гена [481.

Резкие перепады температур оказывают влияние на содержание гиб береллиноподобных веществ (ГПВ) в листьях ржи, что сказывается на росте растений. Предполагается, что одной из причин торможения рос та надземной части растений в условиях зимней вегетации является задержка не только синтеза, но и транспорта фитогормонов из корней [53,541. Этим, вероятно, обьясняется низкое содержание или отсутст вие активности гиббереллиноподобных веществ в узлах кущения. Если понижение температуры наблюдается в конце зимы (в конце февраля -начале марта), то содержание ГПВ не снижается, а в отдельные годы даже повышается. Возможно, что возрастание активности ГПВ ранней весной, даже при возобновлении холодов, связано с расщеплением их комплексов с другими веществами [55]. Такое явление часто наблюдается у многих растений при выходе их из состояния покоя, когда резкое повышение активности ГПВ происходит за счет перехода этих веществ из связанной формы в свободную [56]. При благоприятных условиях окружающей среды, в теплый осенний период и особенно ранней весной, в марте, когда происходит интенсивный рост растений, отмечается увеличение содержания ГПВ. Во время цветения ржи активность ГПВ резко снижается в листьях и в узлах кущения. Низкая температура (весенние заморозки) оказывает неоднозначное влияние на содержание ГПВ: чаще всего после ее действия в узлах кущения ГПВ не обнаруживаются, а в листьях они содержатся в незначительном количестве. Вероятно, запасные формы гиббереллоподобных веществ при неблагоприятных условиях транспортируются из узлов кущения в листья, низкая температура почвы и воздуха задерживает отток синтезируемых в листьях ГПВ в узлы кущения [571.

- 2?

Таким образом изменение температуры окружающей среды оказыва ет влияние на синтез функционально активных веществ, которые на капливаясь в клетках способны регулировать скорость протекания ме таболических процессов в растениях. Устойчивость растений к пере падам температур во многом определяется генотипическими, фенотипи ческим особенностями их строения, лабильностью белков и содержа нием биологически активных соединений.

3.2. Адаптационные механизмы холодоустойчивых растений.

Под холодоустойчивостью целесообразно понимать способность растений длительное время без вреда для последующего роста и развития переносить низкие положительные температуры, которые не вызывают заметного повреждения и гибели растений, но приводят к значительным отклонениям в направленности физиологических процессов, что оказывает заметное влияние на последующий рост, развитие и продуктивность растений [58,59].

Молекулярно-генетический подход к терморезистентности с анализом механизмов реакций растений предложен в работе [60], в которой к ведущим механизмам термоадаптации относят системы внутриклеточной регуляции, прежде всего генетическая и энзимологическая, функциональная лабильность которых обусловлена их полиморфизмом. При фоновых температурах, обеспечивающих активный рост растений, осуществляются основные биологические функции растения, и изменения температуры в пределах этого диапазона не вызывают функциональных перестроек генома. Тогда как переход в зону адаптационных температур высоких и низких индуцирует температурно-зависимую перестройку генома, что ведет к закаливанию растений. Последнее обеспечивает реализацию максимально возможной потенциальной устойчивости растительного организма. При повреждающих температурах генетичес

- 28 ки контролируемые перестройки метаболизма затруднены, метаболические превращения выходят из под контроля генома, обратимые изменения переходят в необратимые, происходят структурные и функциональные нарушения. Так, например, понижение температуры сказывается на структуре биологических мембран, что приводит к нарушению фотосинтеза и моментально отражается на характеристиках флуоресценции и замедленного послесвечения листьев интактных растений [61,621.

Низкие температуры способствуют уменьшению проницаемости корневых мембран, а также плазмалеммы и тонопласта замыкающих клеток устьиц, вызывающие нарушения водного обмена, приводящие к сильному обезвоживанию тканей и завяданию [633.

При понижении температуры меняется спектр белков, синтезируемых данным видом растений, в частности, повышается содержание растворимых белков [643. В листьях кукурузы при 10СС ингибирование ИАОР-малатдегидрогеназы и пируватфосфатазы зависит от освещения. Повреждение фотосинтезирующих тканей на свету при низких температурах может быть обусловлено потерей активности супероксиддисмута-зы. По-видимому, при понижении температуры некоторые их ферменты инактивируются за счет ослабления и разрушения гидрофобных взаимодействий в их многомерной структуре. Инактивация рибулозодифосфат-карбоксилазы при температуре ниже 10°С связана с конформационными изменениями сульфгидрильных групп в молекуле фермента. Предполагается, что адаптация к низким температурам обусловлена стабилизацией $-5-связей. Показано, что среди ферментов фотосинтетического метаболизма углерода особой чувствительностью к температуре отличается фосфоенолпируваткарбоксилаза.

Постепенная адаптация к низким температурам сопровождается ускорением синтеза РНК, растворимых и связанных с мембранами белков, рибулозодифосфаткарбоксилазы и повышением количества ненасыщенных

- 29 жирных кислот [64]. Отмечают появление различий в изоферментных спектрах пероксидазы листьев кукурузы Е65], наличием чувствитель ной к пониженным температурам фракции кислых легкорастворимых бел ков цитоплазмы, к которым относят различные ферменты, тесно свя занные с клеточным метаболизмом и активно участвующих в адаптации растений к неблагоприятным факторам среды [66].

В настоящее время общепризнано, что потенциальная морозоустой чивость сорта обусловлена генетически [б?]. Относительность в диф Ференциации сортов по этому признаку можно, по-видимому, обьяс нить существованием зависимости степени проявления морозоустойчи вости сорта от климатических условий формирования материнских се мян, выявленой в ряде исследований [68,69].

Синтез ЛИК в первом клеточном цикле меристематических клеток зародышевого корня семян озимой пшеницы, прорастающих при низкой положительной температуре, затормаживается в тем большей степени (по сравнению с оптимальной температурой прорастания), чем больше потенциальная морозоустойчивость сорта [703.

На основе анализа роста разных органов проростков (корень, ко леоптиль, лист) было показано, что у морозостойких сортов озимой пшеницы при низкой температуре в большей степени уменьшается ско рость роста по сравнению с оптимальной температурой, чем у неморо зоустойчивых сортов. Однако эта закономерность была выявлена толь ко для контрастных по устойчивости сортов [71-73].

Климатические условия, обусловливающие невысокую морозоустой чивость растений, в наибольшей степени дифференцируют сорта по их устойчивости к морозу, в то время как условия, способствующие раз витию максимальной потенциальной морозоустойчивости, дифференциру ют сорта в значительно меньшей степени [б?].

Следовательно при определении морозоустойчивости сортов необхо

- 30 димо учитывать условия формирования семян и неоднотипность реакции сорта на них. В связи с этим рекомендуется при оценке сортов по исследуемому признаку предварительно выращивать семена в разных условиях [673.

Проблема повышения устойчивости озимых злаков к действию отрицательных температур решается в настоящее время как традиционными селекционно-генетическими методами, так и разработкой новых технологий возделывания, включающих применение экологически безопасных физиологически активных соединений антистрессорного действия. К числу последних относится биосинтетический регулятор роста растений терпенойдной природы - фузикокцин, характеризующийся широким спектром физиологической активности [74,753. Способный свя зываться с мембранами растительных клеток, увеличивать энергозависимый направленный наружу поток Н+ и направленный внутрь поток К+, а также потенциал клеточной мембраны [763.Не влияет ни на пассивный транспорт растворимых веществ, ни на электропроводность в искусственных фосфолипидных мембранах. Фузикокцин вызывает такие изменения, как частичное обезвоживание клеток и аккумуляцию Сахаров, являющихся основными криопротекторами клетки, которые могут положительно влиять на формирование морозоустойчивости озимых злаков. Особый интерес представляют данные о том, что фузикокцин активирует синтез как цитоплазматических, так и хлоропластных белков [773. Известно, что в процессе адаптации растений к морозу в клетках накапливаются растворимые и мембранные полипептиды, а торможение их синтеза с помощью антибиотиков приводит к снижению устойчивости [783. Фузикокцин способен повышать морозоустойчивость растений озимой пшеницы. Степень устойчивости зависит от испытуемых доз и приемов обработки. Существенным достоинством Фузикок-цина является его регенерационное действие после промораживания.

- 31

Под влиянием закаливания у обработанных фузикокцином растений наблюдается тенденция к увеличению общего количества гранальных ти-лакойдов, что, очевидно, отражается на функциональной активности хлоропластов. Зто в свою очередь способствует усилению фотосинтетической ассимиляции углекислоты, продукты которой депонируются как в форме Сахаров, так и в виде липидов, пластоглобул. Возможно, интенсификация фотосинтетической активности является ключевым механизмом, посредством которого индуцируется морозоустойчивость озимых растений [?9].

Показано, что формирование адаптационных механизмов у злаковых культур к низким температурам протекает только на свету и в основе его лежат такие индуцированные светом процессы, как накопление сахар ов-криопротекторов [801, повышение содержания ненасыщенных жирных кислот, снижающих температуру фазового перехода, липидов [811 и высоковосстановленных веществ и АТФ [82].

3.3. Адаптационные механизмы солеустойчивых растений.

Семейство рясковых (Leinaceae) и в особенности род Wolffia являются результатом эволюционного упрощения [83]. Вольфия характеризуется переходом к миксотрофному (фотогетеротрофному) питанию и существенной дедифференциацией растения (отсутствие корней, проводящей системы, очень редкое цветение). Скорость роста вольфии на среде, содержащей органическое вещество (сахарозу) в несколько раз выше в сравнении с карбонатным источником углерода [84].

Условия миксотрофного роста на свету можно рассматривать как соответствующие модели переполнения (overflow) [85], согласно которой быстрое окисление избытка углеводов необходимо для устойчивого функционирования метаболических циклов. Светозависимый рост у вольфии на сахарозе связан с протеканием гликолиза и ЦТК на свету,

- 32 минуя аденилатный контроль [831. Окислительный метаболизм вольфии существенно зависит от типа углеродного питания. Изменения концентрации С0;> и присутствие органического источника углерода приводит к изменению потока через цианидрезистентную оксидазу, через гликолатный путь и другие пути, связанные с дыханием.

Засоление ведет к значительным перестройкам окислительного метаболизма вольфии, являющейся пресноводным растением. Сахароза при росте на ИаС1 служит не только как источник углерода, но и как осмопротектор. Фотодыхательный путь в условиях засоления выполняет ряд функций. С ним связана аккумуляция пролина и других аминокислот, играющих важную роль в адаптации к высокому содержанию НаС1 [863. Фотогетеротрофно растущая вольфия менее чувствительна к засоленности. Это коррелирует с более высокой интенсивностью ци-анидрезистентного окисления дыхательных субстратов и интенсивностью дыхательных процессов в целом.

Стратегия биохимической адаптации вольфии к различным условиям внешней среды (углеродное питание, свет, засоление) включает существенные перестройки окислительного метаболизма. Они состоят в изменениях потока электронов через цианидрезистентную оксидазу, в изменениях соотношения между интенсивностями гликолиза и пенто-зофосфатного пути, в интенсификации метаболических путей, сопрягающие конструктивные и энергетические процессы [833.

Многие морские и пресноводные цианобактерии способны переносить концентрации солей, равные или превышающие их содержание в морской воде С8?,881. Такие высокие концентрации соли, намного пре вышающие обычную внутриклеточную концентрацию йа+, ведут к увеличению осматического давления и созданию направленного внутрь клетки градиента На+. Два главных процесса участвуют в поддержании условий, обеспечивающих выживание и даже клеточное деление. Первый

- 33 процесс, по-видимому, не требует синтеза белков de novo [89] и представляет собой повышение концентрации осмотиков, в основном гликозилглицерина и сахарозы [87,89-91]. Однако при повышении критической концентрации соли в среде у обоих изученных видов до сих пор штаммов (морского Synechococcus sp. [923 и пресноводного Synechocystis PCC68G3 [933 аккумулированных осматиков достаточно для уравновешивания лишь 25-5QX внешнего осматического потенциала. Следовательно, требуется включение дополнительного механизма. При высоких концентрациях соли, возможно, Na+ пассивно диффундирует в клетку по градиенту концентрации, в то время как только энергозависимые процессы способны удалять его внутренний избыток. Доказательства существования Na+/H+ антипортной активности, возможно ассоциированной с Н+-АТФазой, отвечающей за создание и/или поддержание протонного градиента на цитоплазматической мембране, были получены для трех штаммов: Synechococcus РСС6301 [94,953, РСС6311 [96-983 и Synechocystis РСС6714 [993.

Энергия, необходимая для выброса натрия, создается в ходе слож ного процесса. Перенос пресноводных и морских клеток с низких на высокие концентрации соли приводит к усилению поглощения кислорода [95,97,100-1023, что коррелирует с активацией цитохром-с-оксидазы. Известно, что цитохром-с-оксидаза, входящая в состав одной из двух дыхательных цепей цианобактерий, локализована преимущественно в тилакойдной мембране - у двух факультативных фототро-фов Synechocystis РСС6?14 [1033 и РСС6803, или в плазматической мембране - у Anacystis nidulans и Spirulina subsala [1023. При преносе с низкой на высокую концентрацию соли [97,1013 фотосинтетическая активность, измеренная по выделению кислорода целыми клет ками, остается на прежнем уровне, однако происходят более тонкие изменения. Измерения Флуоресцентной эмиссии в клетках Synechocys

- 34

РСС6803 после преноса с 0,05 на 0,684 М ИаС1 показало снижение соотношения активностей ФС II и ФС I [1003, что соответствует активации циклического транспорта электронов по ФС I [1013. В этих условиях никакие другие мембрано-связанные (дыхательные или фотосинтетические) переносчики электронов, помимо цитохрома аа и ФС I, не повышают свою активность.

Показано, что синтез мРНК и белков в некоторых штаммах изменяется в условиях солевого стресса [89,1043. Идентифицирован один белок (53,4 кДа), узнаваемый антителами против цитохром-с-оксидазы который индуцировался в плазматической мембране $р1ги11па зиЬза1а [1023, выращенной при 1 М ИаС1. Весь спектр таких белков показывает некоторое сходство с картиной, наблюдаемой при других стрессах, в частности при тепловом шоке [1053.

Поскольку синтез осмотиков и увеличение электронно-транспортной активности, контролируемые метаболически независимыми путями, определяются состоянием аллели stpA, то наболее вероятной кажется гипотеза о вовлечености эЪрй в адаптационный процесс на раннем этапе. Возможно, функция аллели как регулятора различных метаболических процессов, подверженных влиянию солевого стресса, проявляется через разветвленную сеть реакций. Такое каскадное действие, при котором накопление осмопротекторов, контролируемое зЪрЙ, является ранним событием и необходимо для дальнейшего установления полностью адаптированного состояния, что включает в себя усиление энергетической активности [1063.

Хлорелла, являющаяся белокнакапливающим организмом, в ответ на голодание по азоту начинает синтезировать безазотистые соединения (углеводы и/или липиды) и претерпевает серьезные изменения в ультраструктуре клеток [107-1093.

При засолении клетки хлореллы переходят к накоплению свобод

- 35 ного пролина, содержание которого может достигать 10 - 20% сухой биомассы [863. Процесс накопления свободного пролина сопровождается одновременным снижением пула углеводов и других свободных аминокислот [110-112], что может служить наглядным примером изменения направленности метаболизма хлореллы при действии высоких концентра ций НаС1.

Повышенный синтез пролина тесно связан с углеродным и азотным метаболизмом [113,1143. Известно, что углеродные скелеты на синтез пролина поступают из углеводов при окислении их в цикле Кребса [1153, а аммиак является донором - групп для глутамата [116], основного предшественника пролина [11?]. Ассимиляция аммиака протекает при участии глутаминсинтетазы/глутаматсинтазы (ГС/ГТС) и/или глутаматдегидрогеназы (ГДГ) [118,119] в зависимости от источника азота и его концентрации в окружающей среде [1203.

При засолении основная роль в ассимиляции аммиака в клетках морской хлореллы принадлежит ГДГ [1143. Кроме того, функционирование этого фермента в условиях засоления являлось необходимым условием и в синтезе пролина, поскольку ингибирование активности ГДГ резко снижало синтез пролина и одновременно увеличивало пул неас-симилированного аммиака [1143. Обратную зависимость между накоплением пролина и пулами аммиака и углеводов прослежено в работах [111,1123. Пролин, синтезированный в клетках хлореллы в ответ на засоление и свидетельствующий об изменении направленности метаболизма клетки, является в данных условиях стабилизирующей основой и связующим звеном азотного и углеводного обменов [1213. Нарушение синтеза пролина в условиях засоления, вызванное подавлением ассимиляционного процесса, приводит к серьезным нарушениям не только азотного обмена (накопление аммиака), но и углеродного (накопление крахмала).

- 36

Взаимосвязь между синтезом пролина и накоплением крахмала показана рядом авторов. Так, у Enteromorpha intestinalis солевой стресс сопровождался синтезом пролина, когда клетки обогащали крахмалом (16 ч непрервного освещения) [122 3. В другой работе, напротив, показано, что накопление крахмала наблюдали в солеустой-чивых клетках Nicotiana sylvestris на среде с NaCl, в которой вместо сахарозы использовали пролин [123 3.

Появление осмиофильных глобул в клетках хлореллы при длительном ингибировании ГДГ свидетельствует, по-видимому, о более глубоких нарушениях в метаболизме хлореллы и о переходе клеток в этих условиях к синтезу липидов.

Некоторые авторы считают, что образование осмиофильных глобул в клетках хлореллы в ответ на голодание по азоту является приспособительной обратимой реакцией для переживания клеткой неблагоприятных условий [10?3. йнгибирование активности ГДГ показало [1213, что в условиях засоления биосинтез пролина тесно связан с пулом аммиака и углеводов. Подавление ННз-ассимиляции приводило к снижению синтеза пролина и накоплению крахмала и аммиака, что свидетельствовало в пользу обратимости реакций, ведущих к образованию пролина из углеводов и аммиака.

При засолении основным фактором повреждения культурных растений является избыточное накопление ими ионов солей П243 , в результате которого нарушается обмен веществ [1253. Поэтому решающее значение в условиях засоления для сохранения нормального функционирования растений приобретает регуляция транспорта ионов. Таким образом, солеустойчивость растений в значительной степени обусловлена их способностью поддерживать ионный гомеостаз [126,127 3. Существует несколько способов поддержания гомостаза: 1 - полное исключение поглощения Na+, 2 - частичное ограничение его поглощения; 3 - де

- 3? понирование Иа+ в вакуолях; 4 - активное перемещение Иа+ из корней в побег и далее эвакуирование его из листьев с помощью железистых клеток, что характерно для солянковых [1243.

На организменном уровне солеустойчивость может формироваться за счет концентрирования солей в тканях и частях клетки, не несущих большой метаболической нагрузки [1283. Так, например, большая солеустойчивость растений проса и пшеницы по сравнению с сорго обусловлена наличием у них механизма, контролирующего транспорт На+ из среды в надземные органы. Тогда ка^, у наиболее устойчивых к избытку солей гликофитов засоляющие ионы локализуются преимущественно в корнях, представляющих для них своеобразный барьер, а у неустойчивых - в надземных органах. Кроме того, солеустойчивые виды способны накапливать в вакуолях Иа+ из ксилемы и затем транспортировать его в среду. Предполагается, что они обладают высокоэффективным механизмом для откачивания ионов йа+ [1293.

Способность ограничивать транспорт ионов к растущим листьям путем их аккумуляции в базальной части побега характерна для зерновых культур [1303, однако при этом солеустойчивость к хлоридно-му засолению у них различна. Так, у кукурузы она ниже, чем у пшеницы [131,132 3. Более высокая устойчивость к засолению обусловлена наличием у пшеницы барьерного механизма, препятствующего потоку засоляющих ионов из корней в надземные органы.

Следует разграничивать эффективность действия на растений внезапного и постепенного засоления [1333. Внезапное засоление, вызывая более сильный солевой стресс, способствует выраженному проявлению индивидуальных свойств растений [1253.

Виды и сорта растений, характеризующиеся большей относительной скоростью роста, менее устойчивы к засолению. Потверждается общебиологическая закономерность об обратной зависимости между скорос

- 38 тыо роста организма и его устойчивостью к засолению [1291.

При избыточном содержании солей в почве у растений развивается солевой стресс. Показано, что у форм подсолнечника, обладающих солеустойчивостью, активность СОД в корешках проростков семян при выращивании в условиях засоления повышается, а у неусточивых -снижается [1343. Повышение активности СОД является защитным механизмом, предотвращающим отрицательный эффект избыточного накопления свободных радикалов в клетке.

Засоление оказывает ингибирующее влияние на рост гликофитов [135-13?]. Это обусловлено, в частости, снижением интенсивности фотосинтеза [138], которое, в свою очередь, связано с уменьшением открытости устьиц даже в условиях нормального тургорного давления и функционирования основных фотосинтетических механизмов [138]. Однако наряду с этим существуют данные как о кратковременном, так и длительном стимулирующем воздействии засоления на фотосинтез [135], что, возможно, может быть обусловлено различными видовыми и возрастными особенностями растений, а также противоположностью действия стрессового фактора [1393.

Засоление отрицательно влияет на дыхание гликофитов. Подобная реакция связана с адаптацией растений к снижению количества доступ ного субстрата дыхания, вызванного уменьшением интенсивности фотосинтеза. У некоторых видов растений при засолении интенсивность дыхания повышается [139 3.

В условиях засоления продуктивность культурных растений резко снижается вследствие подавления ростовых процессов [1403. Особенно сильно страдают при засолении корни [141,142,1433.

До настоящего времени вопрос о причинах замедления роста растений при засолении остается дискуссионным [13?, 1443. Широко распространено обьяснение ингибирования роста гликофитов нарушением

- 39 водного баланса, повышением осмотического потенциала клеток [140, 1451. Фактором подавления роста, несомненно, является и токсическое действие солей, прежде всего ионов натрия [140,145].

Изучение формирования корневой системы в условиях прогрессирующего засоления показало заметное угнетение роста придаточных корней, уменьшении их числа и суммарной длины. При этом биомасса корней снижалась в основном за счет сокращения общей длины придаточных корней и в меньшей степени за счет редукции их числа.

Ослабление повреждающего эффекта при совместном действии некоторых токсических агентов (стресс-факторов) на живые огранизмы описано в ряде исследований [146-149]. Классическим примером такого явления служит антагонизм ионов [150]. Наряду с этим имеется немало примеров ослабления повреждающего эффекта при одновременном действии на клетки стресс-факторов совершенно различной природы, что нельзя объяснить известным химическим антагонизмом [1513. Так, при воздействии на животные ткани получены эффекты снижения повреждений в условиях совместного действия солей и этанола, ЫаС1 и новокаина, йаС1 и растяжения [148,1493. В экспериментах на животных и бактериальных клетках получены сведения о снижении повреждающего влияния радиации при сочетании агентов, угнетающих физиологическую активность: охлаждение, голодание [152 3, антибиотики [1533. На растительных обьектах зарегистрировано явление антагонизма при одновременном действии стрессовых доз токсических газообразных веществ [1543.

Однако причины повышения устойчивости организмов (снижение пов реждающего эффекта) при совместном действии двух или нескольких агентов остаются неясными [14?]. Хотя этот эффект широко распро странен и весьма неспецифичен (наблюдается при совместном действии агентов различной природы). В основе антагонизма действия стресс

- 40 факторов различной природы могут быть общие причины [1513. В связи с этим представляет интерес сформулированная Мелеховым [155 3 гипотеза о том, что реализация нанесенного клетке повреждения осуществляется за счет изменения метаболизма. При замедлении метаболизма растений относительно мягкими физиологическими воздействиям (обработка естественными ингибиторами роста) повышалась их устойчивость к потенциально летальным повреждениям [1563, что связано, по мнению авторов, с замедлением метаболизма. Мягкие физиологические воздействия фитогормонами эндогенного происхождения не могут быть отнесены к стрессовым [1513. Действие ингибиторов роста на устойчивость растительных клеток может быть опосредовано не только реакцией защитного торможения метаболизма [1553, но и активацией некоторых процессов (стимуляция синтеза отдельных фракций белков [1483, стабилизация мембран [1573 и др.). Тем не менее, на основании данных о защитном эффекте ингибиторов роста при потенциально летальных стрессах, можно предположить, что уменьшение повреждающего эффекта при совместном действии двух или более стресс-факторов может быть связано с ингибированием метаболического самоповреждения клеток. Такого рода явления, по-видимому, возможны в том случае, если два повреждающих агента имеют разные мишени первичного действия или один из агентов представляет собой малоспецифический ингибитор метаболизма в целом [1513.

РАЗДЕЛ 4. ФИЗИ0Л0Г0-БИ0ХИМИЧЕСКЙЕ ОСОБЕННОСТИ ПОКОЯ СЕМЯН.

Покой семян можно рассматривать как необходимое физиологически обусловленное состояние, при котором максимально сохраняется их жизнеспособность и обеспечивается возможность переносить неблагоприятное для функционирования растений время года [158 3. В состоянии вынужденного покоя в семенах растений протекают преимуществен

- 41 - но анаэробные катаболические процессы. Об интенсивности которых судят по количеству образующихся в клетках NADH и FADH [1593. NADH образуется в реакциях катализируемых дегидрогеназами, среди которых следует отметить лактатдегидрогеназу, изоцитратдегидрогеназу, алкогольдегидрогеназу и т.д. Интенсивность оксидазных процессов поддерживается за счет высокой активности пероксидазы. При прорастании семян соотношение процессов смешается в сторону активации оксидазных аэробных метаболических реакций, величина которых зависит от работы гормональных систем.

Показано [1603, что при прорастании семян ячменя образующиеся в скуттеле свободные гиббереллины транспортируются из зародыша в эндосперм и алейроновый слой. Гиббереллины индуцируют процесс гидролиза клеточных стенок эндосперма посредством активирования специфических ферментов, которыми являются, в частности, эндо - ман-наза у томатов [160 3 и целлюлаза у Datura ferox L. [1613. Кроме этого, гиббереллины вызывают новообразование в алейроновом слое cí- амилазы - фермента, расщепляющего крахмал эндосперма до растворимых Сахаров, служащих энергетическим и строительным материалом для растущего зародыша. Однако наличие лаг-фазы в действии d- амилазы, синтез этого фермента не входит в число первичных реакций [1623.

В семенах многих растений, в том числе и кукурузы, ИНК находится в связанной форме, в виде коньюгатов. У кукурузы при созревании семян в эндосперме зерновки накапливаются гликозиды - конью-гаты 2-о-индол-З-ацетил-мио-инозитола (ИУК-ноз). При прорастании семян гликозиды превращаются в ИУК-ноз, который транспортируется в зародыш, где происходит его гидролиз. Установлено, что в эндосперме зерновок кукурузы мало свободной ИУК, но много ее эфиров. Таким образом, ИУК-ноз является главным источником свободной ИУК

- 42 для растущего проростка [163,1643. Превращение ЙНК-ноз в И9К происходит преимущественно в стеблевой части проростка [1653. Tillberg, определив содержание ЙУК в сухих и прорастающих семенах кукурузы, обнаружил, что наиболее высокий ее уровень характерен для периода, когда зародышевый корешок прорывает семенную кожуру [166 3 В работе [16?3 выявлена наибольшая ИУК-активность в зародыше через 24 ч набухания; в это время практически у всех семян появляется зародышевый корешок. Аналогичные результаты были получены как в колеоптильном тесте, так и в биотесте с листовыми черешками фасоли. В экстракте эндосперма набухающих семян помимо ИНК присутствовали и другие индольные соединения. В это время эндосперм по массе почти в четыре раза превосходил зародыш.

В семенах кукурузы в отличие от других растений обнаружены значительные количества цитокининов - зеатина и его производных, причем, как показано в ряде работ, в сухих семенах содержание цитокининов ниже, чем в прорастающих [168,1693. Smith и van Staden полагают, что у кукурузы эндогенные цитокинины играют важную роль при запуске прорастания [1693.

При набухании семян кукурузы содержание ауксинов в них возрастает (особенно в зародыше), при прорастании - снижается (в зародыше - до следовых количеств). Содержание цитокининов, напротив, при набухании семян снижается, при прорастании возрастает. Активность абсцизовой кислоты в прорастающих семенах снижается до минимума. Гибберелины обнаружены лишь в эндосперме набухших и прорастающих семян [16?3.

В зависимости от вида растений содержание фитогормонов в по коящихся семенах может сильно варьировать. Прерывание покоя, cor ласно существующим представлениям [1?0,1?1-1?63, осуществляется посредством смещения стимуляторно-ингибиторного соотношения в сто

- 43 рону стимуляторов: в семенах активируется биосинтез гормонов, пре вращение связанных форм в свободные, происходит перераспределение регуляторов между отдельными частями семени в зависимости от функ ционального назначения [1673. Так, гиббереллины в зародыше прини мают участие в инициировании процесса прорастания, а в эндосперме регулируют мобилизацию резервов, тогда как при совместном действии с ауксинами могут регулировать рост проростка [1??3. Цитокинины, с одной стороны, являются инициаторами ростазародышевого корешка с другой - могут участвовать в мобилизации питательных веществ в процессе прорастания и роста проростка [178,179]. Ауксины играют важную роль в процессе поступления воды в растущие клетки: на ста дии набухания семени, характеризующейся более интенсивным поглоще ние воды, содержание ИНН значительно выше.

Семена многих видов не имеют ярко выраженного покоя, но энергия прорастания их низка в силу их неоднородности, прежде всего по степени зрелости. У дикорастущих растений растянутость периода прорастания выражена особенно сильно. Наблюдается она и у ряда культурных, в частности огородных растений. Для повышения энергии прорастания семян используют осмотически активные вещества [158, 174]. Изучено влияние ретарданта 2,3-дихлоризобутирата натрия (ДХИБ) на активность ферментов и содержание свободных аминокислот при 4 и 20-часовом замачивании семян маша в 0,01 М растворе [180]. Показано, что при длительной обработке семян ДХИБ тормозится процесс распада белка, уменьшается активность протеаз, а в первые дни прорастания семян - активность аланинаминотрансферазы. При действии ДХИБ растения реагируют подобно реакции на водный стресс: увеличивается количество аминокислот (аланина, пролина и фенилала-нина), играющих важную роль в адаптационных процессах, снижается интенсивность транспирации [1823.

- 44

В работах [181, 182] показано, что предпосевная обработка семян в экологическом аспекте предпочтительнее сплошной обработки растений. При этом может быть достигнуто обогащение посевного материала жизненно важными химическими веществами, ускоряющими прорастание семян, влияющих положительно на развитие проростков и способных защищать растения от неблагоприятных воздействий.

РАЗДЕЛ 5. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ.

Изучение проблемы устойчивости растений к экстремальным уело виям привело к представлениям о том, что не только разные виды ус тойчивости обусловливаются неодинаковыми причинами, но даже борьба растений по-разному. Оказалось, что растущие в природной обстанов ке рядом растения противостоят засухе различными средствами. Иными словами, их адаптация к одним и тем же факторам окружающей среды шла различными путями и в этом отношении нельзя говорить об адек ватности приспособления растений к среде обитания [183,184].

Одним из механизмов устойчивости растений и животных к воздействию неспецифических факторов является механизм индукции повыше-ной сопративляемости организмов, которые стимулируются с помощью биологически активных веществ. Указанные соединения способны инициировать механизмы активной защиты растения-хозяина, результатом этого является повышение устойчивости последнего [1853.

Индуцированная устойчивость растений проявляется в способности организмов вырабатывать специализированные Ь-белки, которые играют определенную роль в механизме защиты растений от вирусной инфекции [186-189 3 и могут индуцироваться не только зарожением, но и обработкой растений определенными химическими веществами. Так, например, обработка растений табака полиакриловой кислотой приводила к возникновению устойчивости к ВТМ на третьи сутки после зароже

- 45 ния: защита была полной или почти полной у сверхчувствительных и частичной у восприимчивых растений-хозяев [190]. Причем устойчивость, индуцированная полиакриловой кислотой, преодолевалась при 31°С, когда реакция на зарожение ВТМ становилась системной. В этот же период исчезали и новообразованные белки [191]. Тогда как у животных актиномицин Б также ингибировал устойчивость к ВТМ, индуцированную полиакриловой кислотой. На основании этого был сделан вывод о возможности существования механизма белковой защиты у растений, аналогичного выработке антител у животных, который может стимулироваться индукторами интерферона, и в частности полианионами [19П.

В работах по изучению механизма действия было показано, что полиакриловая кислота способна подавлять размножение вирусов в системно зараженных растениях-хозяевах или листовых дисках, однако подобный эффект наблюдается преимущественно на ранних этапах заражения. Обработка полиакриловой кислотой, проведенная на сутки раньше или позже момента заражения, не оказывает влияния на размножение вирусов [192,193].

Способность индуцировать устойчивость к инфицированию установлена и у других полиаминов, среди которых наиболее эффективными являются малеиновый ангидрид, малеиновая кислота, полиметакриловая кислота, стеаринмалеиновый ангидрид [1943 и поливинилпирролидон [195].

Критериями формирования устойсивости растений к ВТМ могут служить повышение активности терминальных оксидаз, особенно перокси-дазы [1963, появлением специфичных белков (Ь-белков), повышением активности фитогормонов и других физиологически активных веществ [197-202]. Устойчивость организмов проявляется в усилении энергообмена, сопровождающимся активацией синтетических процессов, имею

- 46 щих защитные Функции. Тогда как у восприимчивых растений при заражении, наоборот, резко снижается уровень знергообмена, что напоминает процессы ускоренного старения организма. При зарожении происходит смещение конкурентного соотношения ферментативного и свобод-норадикального окисления в клетке в сторону свободнорадикального, сопровождающегося образованием большого количества свободных пере-кисных радикалов, которые способствуют дестабилизации мембранной организации клетки. В связи с этим большое значение приобретают идеи об использовании ингибиторов свободнорадикальных реакций (ан-тиоксидантов) для повышения сопротивляемости организма к неспецифическим воздействиям [1853.

Устойчивость различных сельскохозяйственных культур к вредным организмам может быть сопряжена с наличием эндогенных факторов, повышающих резистентность клеток [2033. К таким факторам относятся различные природные соединения, обладающие антибиотическими и ре-гуляторными свойствами, способствующими активации процессов регенерации и репарации поврежденных органов. Природные регуляторы роста растений - фитогормоны способствуют формированию защитных функций клеток, органов и тканей в ответ на повреждение. Наряду с абсцизовой кислотой, которая хорошо известна как своеобразный неспецифический индуктор устойчивости растений к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, защитными свойствами обладают и ци-токинины [170,2043. Природные цитокинины (зеатин, зеатин рибозид, изопентиладенин и др.), как известно, активируют процессы синтеза белков и нуклеиновых кислот, препятствуя деструкции клеток, способствуют в целом предотвращению старения растительного организма [2053. Известно также, что цитокинины обладают, подобно индолил-3-уксусной кислоте, аттрагирующими свойствами, которые выражаются в способности одних тканей и органов растений, обработанных этими

- 4? фитогормонами, акцептировать ассимиляты из других [206,20?]. Имеются сведения о том, что восприимчатые к нематодам сорта томатов содержат больше цитокининов по сравнению с устойчивыми формами [208]. В работах [203,209] показано, что у устойчивых к злаковой тлеформ кукурузы при повреждении этим видом вредителя резко возрастал, а у неустойчивых - снижался синтез зеатина и зеатина рибозида в активно растущих органах.

Таким образом, цитокинины могут служить индукторами устойчивости растений к вредным насекомым. Однако один и тот же генотип может иметь различную степень устойчивости к различным видам вредителей. Например, форма, устойчивая к злаковой тле, может быть неустойчивой к шведской мухе, и наоборот. Учитывая этот факт, можно предположить, что наблюдаемые нарушения в образовании цитокининов в поврежденных вредителями органах растений отражают не только свойства генотипа в той или иной степени накапливать фито-гормоны в тканях, но и служить критерием оценки физиологического состояния растения, находящегося в состоянии стресса. Вероятно, ответная реакция на повреждающее воздействие у различных генотипов не только различаются, но и зависит от характера повреждения и численности вредителя. Вероятно, цитокинины так же, как и АБН, обладают защитными функциями, выражающимися в способности этих соединений активизировать метаболические процессы в клетках, направленные на сопротивляемость вредителям. Можно предположить, что неспецифическая устойчивость растений к неблагоприятным факторам биотической природы определяется неадекватной реакцией различных по устойчивости растений, которая выражается в неодинаковой способности клеток к образованию фитогормонов [203].

Устойчивость к засухе у различных сортов озимой мягкой пшеницы обусловлена разными генетически детерминированными механизмами.

- 48

Вероятно, существует несколько таких механизмов, которые сформировались в процессе эволюционной дивергенции и обеспечивают наиболее эффективную защиту растений к засухе в определенных экологических условиях. Сорта озимой пшеницы по системам засухоустойчивости делят на три группы: 1 - система защиты от потери воды (фаза налива зерна); 2 - система снабжения водой (корневая система); 3 - система устойчивости к обезвоживанию. Причем, в одном сорте устойчивость к засухе может обеспечиваться одним или несколькими механизмами. Каждая из выделенных систем состоит из более мелких подситем определяющих в конечном итоге количественное выражение и специфичность системы устойчивости к засухе. Например, система снабжения водой зависит от скорости роста и отмирания корней, их физиологической активности и т.д. Система защиты от потери воды (водоудер-живающая способность) определяется силой набухания клеточных коллоидов, осмотического давления клеток, силой упругого противодействия клеточных стенок и др. [210 3. В растительном организме все системы находятся в единстве и их действие проявляется в определенной последовательности, что количественно можно определить в следующем виде: при степени обезвоживания 0% система устойчивости обусловлена корневой системой, 25-30% - водоудерживающей способностью, 42Х - устойчивостью к обезвоживанию, при ?0 - 80 X обезвоживания растение теряет воду и гибнет [2213.

При нехватке почвенной влаги корневая система не в силах поддерживать водный баланс, в результате чего возникает остаточный водный дефицит, вызывающий завядание. Защиту растений от засухи в этот период обеспечивают водоудерживающие механизмы клеток. После потери 40-42 % воды резко возрастает выход электролитов, свидетельствующий об усилении процессов распада [2213. При этом включаются механизмы системы устойчивости к обезвоживанию.

- 49

Между силой и длительностью стрессовой нагрузки, с одной стороны, и количеством включенных механизмов защиты, с другой, существует взамосвязь: при слабой и непродолжительной засухе растение может нормально функционировать только за счет мощной корневой системы, при средней - необходимо наличие и включение системы во-доудерживания и при сильной - кроме первых двух чрезвычайно важно иметь хорошо развитую и активно работающую систему устойчивости к обезвоживанию.

Первичная реакция устойчивых к гербицидным препаратам культурных растений на послевсходовые гербициды схожа с их реакцией на природные сресс-воздействия (высокую и низкую температуру, засоленность и т.д.). Однако степень влияния последних нарастает, как правило, постепенно, тогда как первые вызывают слишком быстрые изменения физиолого-биохимического состояния, с которым репарационная система растений часто не справляется, что и сказывается в од-ном-двух последующих поколениях [2123.

Известно, что развитие растений определяется генетической программой и средой [2123. Химические вещества могут вызывать наследственные и ненаследственные перемены.

Исходя из общих представлений о неспецифичности действия защитных механизмов у растений [2133, а также из положения о том, что адаптация к химической среде по механизму своего возникновения в сущности ничем не отличается от адаптаций к другим абиотическим Факторам [212,2143, предложено, что процессы адаптации к действию гербицидов у устойчивых к ним растений схожи с процессами адаптации к различным неблагоприятным факторам среды (стрессам) - высоким и низким температурам, засолению, засухи и т.п.

Зти процессы состоят из нескольких основных фаз, которые могут повториться во времени в виде затухающих волнообразных колеба

- 50 ний, что обусловлено системой саморегуляции растительного организма [215,216]. Так, например, у обработанных гербицидом растений уже в первые часы после воздействия отмечались изменения биоэлектрического потенциала, через несколько суток обнаруживались изменения в обмене веществ, угнетение роста и накопления сухой биомассы, а через ?-10 дней начиналось усиление синтетических процессов, ускорение роста. Однако обработка гербицидами не всегда приводит к увеличению урожайности: если в период репарации преобладают благоприятные условия, она повышается, если неблагоприятные - понижается. Значит, в зависимости от условий вегетации культурные растения по-разному реагируют на воздействие гербицидов [212].

Любой стрессор у устойчивых к нему растений действует не на направленность отдельных процессов или звеньев обмена веществ, не на характер признаков, а на их выраженность, степень их реализации и в целом на отзывчивость организма к различным воздействиям. Он не изменяет качественно норму реакции растений, определяемую генотипом, а регулирует ее количествено, увеличивая или уменьшая размах фенотипической изменчивости. Меняется изменчивость, а не структура генетического аппарата, и это проявляется в ряду поколений [212].

При первичном воздействии химического вещества в результате процессов адаптации происходит перестройка в обмене веществ, мобилизация всех сил организма на восстановление постоянства внутренней среды, что сопровождается усилением активности метаболических процессов [212].

Повысить продуктивность культур можно, создавая благоприятные условия для роста и развития растений и воздействуя на них веществами, вызывающими первоначально угнетение, а затем стимуляцию роста и развития. Наблюдаемое усиление обмена веществ приводит

- 51 к временному увеличению размаха фенотипической изменчивости, к повышению отзывчивости растений на действие различных факторов [21?]

При отклонениях от нормального состояния, вызванных постепенными изменениями среды, механизмы приспособления, обеспечивающие гомеостаз клеток и организма в целом, возвращают систему к стабильному состоянию, характерному для данного этапа онтогенеза.

При слишком быстрых отклонениях в метаболизме растений, вызванных такого рода веществами, репарационная система не может полностью восстановить нормальное функционирование организма в одном поколении и указанные изменения продолжают проявляться в 2-3 последующих поколения [212].

Полевые опыты показали, что одинаковое снижение засоренности пшеницы и ячменя под влиянием 2,4-Д при первичном и многолетнем воздействии препарата на сорт в первом случае сопровождалось получением значительных прибавок урожая, а в последнем - существенным их снижением, по-видимому, из-за уменьшения отзывчивости растений на улучшение условий произрастания (уничтожение сорняков). Развитие растений здесь детерминировано не только геномом и средой, но и последствием (в поколениях) гербицидной обработки. Таким образом применение в 2-3 поколениях культуры гербицидов как бы ограничивает фенотипическую изменчивость последующих поколений. И подобно всякой детерминации она, обеспечивая реализацию фенотипа в определенном направлении, ограничивает онтогенетическое развитие в других возможных направлениях, что приводит к уменьшению размаха изменчивости. Причем влияние гербицида на фенотипическую изменчивость при однолетних и многолетних обработках различно: однолетние приводят к увеличению размаха изменчивости, а многолетние - к его снижению [212 3.

Установлено, что по мере старения растений их устойчивость к

- 52 действию гербецида 2,4-Д повышается, поскольку величина коэффициента ингибирования уменьшается в 20-30 раз при переходе от стадии проростков к взрослой стадии [2183.

Начиная с концентрации 2,4-Д 1 г/л происходило изменение в сос таве аминокислот после обработки. Количество аминокислот и их со держание в растении увеличивалось под действием 2,4-Д в 1-ю неделю тогда как к 14-му дню наблюдался спад в содержании свободных амино кислот в 2 раза. Сахара и липиды к 14-му^дню снижались во взрослых растениях в 12 и 16 раз, соответственно. Сильнейшие нарушения в ме таболизме растения вызваны высокой токсичностью 2,4-Д.

Применение 2,4-Д на II-III этапах органогенеза, как правило заметно увеличивало количество побегов подгона при уменьшении продуктивной кустистости. Зто способствовало возрастанию вегетатив ной массы снопа в ущерб массе генеративных органов. При более позд них сроках обработки ячменя значение указанных показателей прибли жалось к контрольным [2193.

Устойчивость древесных пород к насекомым определяется содержанием в растениях защитных веществ, которые оказывают на насекомых токсическое или репеллентное воздействие. Естественная устойчивость насаждений к листо-хвоегрызущим вредителям, так же как и к стволовым, зависит от содержания в растениях определенных защитных веществ, которые при нормальных условиях роста даже в основном кор мовом растении дают возможность выжить только ограниченному количеству вредителей, а в некоторых наиболее оптимальных условиях соз дают растению полный иммунитет. В случае ухудшения состояния растений ослабевает и защитная система, в частности, содержание защитных веществ в растениях уменьшается, вследствие чего увеличивается выживаемость вредителей [2203.

Поведение организма на действующий фактор проявляется мобили

- 53 зацией своих адаптационных возможностей, обусловленных генерацией своих физиолого-биохимических механизмов неспецифической направлен ности. Резистентность растений и животных, в основном, проявляется в активизации перекисного окисления липидов, индукции системы ан тиоксидантной защиты, направленных на повышение реативности орга низма, причем проявление неспецифической устойчивости мало зависит от природы повреждающего агента или фактора.

РАЗДЕЛ 6. ПЕРЕПИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ.

Растения и животные могут существовать только в атмосфере, со держащей кислород, который обеспечивает протекание аэробных мета болических процессов в клетках, а также образование в них свобод ых радикалов и перекисных соединений органической и неорганичес кой природы [221-2233. При действии неблагоприятных факторов интенсивность этих процессов возрастает [224-2283. В клетке существует несколько специальных механизмов противоокислительной системы, включающих глутатион, аскорбат, каротинойды и Ферменты Ссупероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, глутатионредуктаза) [22?,2283. За счет наличия баланса антиоксидантов и прооксидантов в тканях поддерживается нормальный гомеостаз живых организмов, в которых физиологически обусловлена генерация свободных радикалов т.е. активных форм кислорода, 0^ , Н^О^, НО* [229 3 . Генерация супероксидного радикала может происходить в результате актив ности НА0ФН-цитохром-Ь5-редуктазы, митохондриальной НАОН-дегидро геназы, ксантиноксидазы [230,2313 и пероксидазы [2323, а также фотодинамического действия света на хлорофилл, приводящего к образованию синглетного кислорода или супероксид радикала [2293

Процесс начинается стадией инициирования, причем в роли инициато

54 ров в основном выступают супероксидный или гидроксильный радикалы. Это наиболее реакционноспособные промежуточное соединения кислорода, обладающие большим сродством к электрону, способные модифицировать молекулы белков, нуклеиновых кислот, разрушать липидные компоненты мембран клеток и т.д.[2333: г + Щ Н0£ + 1Ш ^ + нго2.

Образовавшиеся радикалы ненасыщенных жирных кислот (К*) далее взаимодействуют с кислородом, образуя перекисные радикалы ), а те в свою очередь вступают в реакцию с новой молекулой жирной кислоты с образованием ^ и накоплением гидроперекисей липидов ШОН). О

КО: г М м иоон.

Процесс подавляется антиоксидантами, которые способны реагировать со свободными радикалами, образуя малоактивные радикалы, не способные вступать в реакцию с новыми молекулами ненасыщенных жирных кислот. ЬпН — ШН + 1лг.

Свободнорадикальные процессы и перекисное окисление липидов, необходимо для регулирования липидного состава и проницаемости мембран, а также синтетических и регуляторных процессов в растительных и животных тканях, нормальный уровень которых поддерживается за счет функционирования системы ингибиторов свободноради-кального окисления [2333. Срыв в функционировании защитных систем может приводить к развитию окислительного повреждения тканей, развитию окислительного стресса. Накопление активных форм кислорода приводит к инициации перекисного окисления липидов биологических мембран, следствием чего является частичная их дезинтеграция и

- 55 увеличение проницаемости для ионов [2343, изменение степени гидро-Фильности и микровязкости мембранных липидов С235], а также степени олигомеризации мембранных белков и их взаимодействия с липидами [236]. Следствием этих процессов может быть изменение условий функ ционирования рецепторных комплексов, ответственных за связь с гормональными веществами и нарушение регулирования метаболических про цессов. Для избежания существенного повреждения функциональных систем в организме существует система ограничивающая действие свободных радикалов, ответственная за поддержание их концентрации на достаточно низком уровне. Составной частью этой системы защиты являются в тканях растений естественные антиоксиданты [23?].

Активные формы кислорода являются вторичными посредниками клеточной активации и пролиферации и служат компонентами свободно-радикального механизма в регуляции размножения клеток [238,2393. В случаях инфекционных заболеваний появление активных форм кислорода может служить фактором фитоиммунитета [240,2413.

Для различных стрессов, возникающих под действием неблагоприятных факторов среды (инфекции, различные ксенобиотики, гербициды, тяжелые металлы, ультрафиолетовое излучение, рентгеновское облучение и др.), является характерным повышение в тканях содержания супероксидных радикалов и других активных форм кислорода, активизации ПОЛ [237,242-2463. Разнообразие факторов и неспецифичность проявляется в общем их механизме действия.

К наиболее широко распространенным факторам физического воздей ствия на семена и вегетирующие растения в научных исследованиях и в производственной практике относится ионизирующее излучение [247] Показана неоднозначность реакции семян и растений на ионизирую щее излучение, относящихся к различным классам, семействам, родам, видам и сортам. Рядом авторов [248-2513 выдвинута концепция видо

- 56 вой дифференциации по уровню радиорезистентности высших растений в рамках крупных ботанических кариотаксонов, объясняя зто явление с позиции структурных параметров клеточного ядра, высказывая предположение, что в основе внутривидового полиморфизма дифференциации по радиорезистентности лежат факторы структурной природы, связанные с особенностями тонкой структурной организации генома [252 3.

В опытах на многих культурах, где применялись разного рода сильные воздействия, экспериментаторы ошечали разную степень ин гибирования разных растений, особенно в диапазоне сублетальных доз когда на фоне общего сильнейшего поражения отдельные растения, или их группы нормально росли и развивались, незначительно отличаясь от контроля [247,2533. УФ излучение вызывает повреждения в ДНК: нарушаются процессы транскрипции и репликации, вследствие образования свободных радикалов и гидроперекисей азотистых оснований, приводящие к сшивкам, с формированием пиримидиновых димеров [254,2553. УФ-облучение вызывает нарушение проницаемости мембран эритроцитов и дрожжей [256,25?3, изменение физико-химических характеристик липидного бислоя и вследствие этого потере связывающей активности мембранного опиоидного рецептора [258 3. Выявлена положительная корреляция между скоростью УФ-индуцированного гемолиза эритроцитов и перекисным фотоокислением липидов в мембране [2593. Показано [2603, что фотоокисление лежит в основе обнаруженного ранее [2613 нарушения функционирования различных ферментов и их ансамблей, связанных с мембраной. Причем окисление липидов под действием УФ-облучения протекает по цепному механизму и аналогично автоокислению, где роль облучения сводится к генерации свободных радикалов, инициирующих цепи окисления [262 3. Супероксидный ионрадикал, образующийся в УФ-облученной клетке [263 3, способен вызывать мутации как прокариотов, так и эукариотических клеток

- 5?

263,2643. Аналогичным действием могут обладать и другие активные формы кислорода, регулирование активности которых осуществляется с помощью функционально активных веществ, относящихся к группе ан-тиоксидантов. Возникающие свободные радикалы инициируют перекисное окисление липидов - процесс, который в значительной мере определяет их токсичность. Степень его развития будет зависеть от уровня антиокислителей и их активности [23?3. Например, появление свободных радикалов при старении растений обьясняется снижением активности антиокислительного комплекса, в котором взаимодействуют витамины Е и С [265 3. Типичная картина может наблюдаться и при дефиците железа и цинка [234,2663. Неспецифичность реакции активных форм кислорода на воздействующий фактор или проявление дефицита может свидетельсвовать их об участии в активации регуляторных сил биологических систем, с целью компенсировать возникшие изменения. Реализация их деятельности проявляется в активизации ПОЛ, изменения количества антиоксидантов и т.д. Так, например, показано [223,26?], что ответная реакция биологических мембран на усиление ПОЛ молекулярным кислородом выражается в активации каталазы, супероксиддис-мутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), в уменьшении окислительного индекса и накоплении МДА. Наиболее эффективными регуляторами ПОЛ являются (в порядке убывания эффективности) каталаза, СОД, ГП. Истинная пероксидаза обладает прооксидантны-ми свойствами, переводя на более высокий уровень регуляции систему Ферментативных антиоксидантов за счет образования в процессе перок-сидазного катализа свободно-радикальных форм фермента. Опосредованное действие ПОЛ показана на регулировании активности протеинкина-зы С (ПК-С) - Са2+ и фосфолипидзависимого фермента, который играет ключевую роль в регуляции многих клеточных процессов. ПК-С рассматривается как важнейшее звено в системе трансмембракной переда

- 58 че сигнала при многих кратковременных и долговременных клеточных ответах, включая пролиферацию и трансформацию С268,2691 . Известно, что данные процессы наряду со специфическими регуляторами контроли руются работой системы ПОЛ в биологических мембранах, компонентами которой являются продукты ПОЛ и природные антиоксиданты [2?0 3. В работе [238] предложена гипотеза о роли свободнорадикальных процес сов (в частности, соотношения перекисей липидов и природных антиок сидантов) в регуляции размноженя^нормальных и опухолевых клеток. Причем система регуляции ПОЛ, основными параметрами которой являют ся: концентрация перекисей липидов, содержание природных антиокси-дантов, состав липидов и структура мембраны, тесно связана с функционированием ПК-С, продукты ПОЛ в зависимости от концентрации могут как активировать, так и ингибировать ПК-С [2?1,2?2].

Роль свободнорадикального окисления в липидной фазе биологических мембран показано для патологических состояний - лучевая болезнь, злокачественный рост, токсикозы, Е-авитаминоз, гипер- и гиповитаминоз Д, ишемические и реоксигенационные повреждения, гемоли тическая анемия, стрессорные растройства и т.д. Во всех патологических процессах активацию ПОЛ можно предупреждать или ограничивать с помощью антиоксидантов - ингибиторов свободнорадикального окисления, в отсутствии которых наблюдается повреждение мембранных структур клеток. ПОЛ может приводить к разборке мембранных структур и обновлению мембранных фосфолипидов £2733. Согласно идеи Эмануэля и Тарусова ПОЛ является универсальным механизмом повреждения мембранных структур клетки при различных патологических состояниях действии экстремальных факторов, а также при старении [2?43.

В развитии свободнорадикальных процессов при кардиомиопатии выделяется несколько Фаз. В начале заболевания активация ПОЛ связана с увеличением первичных продуктов пероксидации [2?5-2??]. В

- 59 этот период начинается повышение активности и ферментов антиокси-дантной защиты [27?]. При дальнейшем развитии патологии наблюдается резкое уменьшение содержания сиаловых кислот в сарколемме, выраженные субсарколеммальные изменения кардиомиоцетов, набухание митохондрий, расплавление миофибрилл [26?].

При гипоксии и гипербарической оксигенации (ГБО) наблюдается активация ПОЛ. Причем при гипоксии это происходит за счет накопления восстановителей [278], а при ГБО - за счет возрастания кислоро да в тканях [279]. Интенсификация ПОЛ способствует увеличению вязкости мембран, появлению отрицательного заряда на поверхности мембран, увеличению количества гидрофильных зон, снижению доли липи-дов, находящихся в жидком состоянии [280 3. На начальных этапах ПОЛ способствует "разрыхлению" мембран, вследствии окисления ненасыщенных двойных связей и выталкиванием молекул, содержащих гидрофильные кислородсодержащие перекисные группы из гидрофобного окружения.

Светозависимое перекисное окисление липидов, имеющее характер свободнорадикальной цепной реакции, является причиной повреждения мембран хлоропластов у растений. Окислительный процесс предотвращается каротинойдами, ^-токоферолом. Действие антиоксидантов связано с обрывом цепной реакции, в результате чего образуются гидро-пероксид субстрата и обладающий низкой реакционной способностью свободный радикал ингибитора [278 3. Антиоксидантный эффект ^-токоферола в мембранах усиливается аскорбатом. В присутствии аскорбата oC-токоферол может восстанавливать перекись липида до его исходной формы [2813. Таким образом, уровень ПОЛ в клетке находится под кон тролем высоко активной системы антиоксидантной защиты, куда входят низко- и высокомолекулярные соединения, роль которых в повышении резистентности живых организмов будет подробно рассмотрена ниже.

- 60

РАЗДЕЛ ?. АНТИОКСИДАНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ

Важным аспектом в исследовании регуляции клеточного метаболизма является выяснение роли природных компонентов клетки в процессах перекисного окисления липидов. Уровень ПОЛ в нормальных тканях зависит от многих факторов, в частности от содержания анти-оксидантов в липидах биологических мембран и свойств самих липидов как субстратов окисления [282,2833. В ПОЛ участвуют преимущественно высоконенасыщенные жирнокислотные остатки арахидоновой, до-козагексаеновой, линоленовой кислот, находящиеся в Д -положении глицерольного остатка молекулы фосфолипидов [2843. Способность к окислению различных мембранных фосфолипидов не одинаково. Легко окисляются фракции фосфотидилэтаноламина (ФЗ), фосфатидилинозита, ФосфЬтидилсерина и кардиолипида [2853.

Антиоксиданты регулируют процессы свободнорадикального окисления, создают оптимальные условия для нормального метаболизма и функционирования клеток и тканей [282 3, их основной функцией в растительных и животных клетках является торможение развития сво-боднорадикальных процессов окисления.

В основном антиоксиданты по механизму действия можно разделить на две группы [2863: 1) высокомолекулярные соединения - ферменты антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза и др.), а также белки, способные связывать ионы Ре и Си, являющиеся катализаторами свободнорадикальных процессов (альбумин, транс-Феррин, ферритин и т.д.); 2) низкомолекулярные соединения, к которым относятся стероиды, убихиноны, фосфолипиды, некоторые аминокислоты, полиамины, мочевина, мочевая кислота, глутатион, аскорбат, билирубин, токоферолы и др.

Общая антиокислительная активность липидов зависит как от ко

- 61 личества биоантиоксидантов и их взаимовлияния, так и от присутствия веществ, которые сами не оказывают антиоксидантного или проок-сидантного действия, но способны усилить или ослабить действие биоантиоксидантов [28?].

Антиоксиданты, ингибирующие окислительные процессы в организмах, в последнее время приобретают все большую известность как регуляторы роста растений [288], деления клеток, активаторы проницаемости мембран. Аналогичным ^дейсвием обладают стероидные гликози-ды и амбиол - препарат с высокой рострегулирующей активностью, испытанный на кукурузе, пшенище, ячмене, овсе, декоративных и других культурах, а также препарат Ф, изученный на сельскохозяйственных растениях и животных [П. Показано, что зти антиоксиданты в зависимости от их концентрации в питательной среде дифференцированно стимулируют рост, развитие, побего- и корнеобразование у регене-рантов.

Известно, что витамины-антиоксиданты оказывают синергическое действие. Аскорбиновая кислота восстанавливает продукт окисления токоферола и -токофероксид в и -токоферол, витамины С и Р также взаимно обратимо восстанавливаются. Аскорбиновая кислота более стабильна в присутствии метилметионина, так как сульфгидрильные группы способны восстанавливать дегидроаскорбиновую кислоту в аскорбиновую. Метилметионин, поставляющий БН-группы, обеспечивает Функционирование глутатионного звена - одного из основных механизмов антиокислительной системы. При этом, он участвует в выведении из организма как активных радикалов, так и избытка радикалов-биоокислителей [289]. Липоевая кислота, которая участвует в процессе биологического окисления в липидном и углеводном обмене, ко-энзим А также обладают выраженными антиоксидантными свойствами. Под их влиянием увеличивается фонд МАОН, что способствует восста

- 62 новлению окисленного глутатиона [2213.

В последнее время в основе патогенеза различных заболеваний проявляются механизмы повреждения растений индуцированных патогеном за счет активации свободнорадикальных процессов [290-2943, сопровождающиеся селективным повреждением полиненасыщенных жирных кислот [295 3. Развитие поражения тканей сопровождается изменениями относительного содержания полиненасыщенных жирных кислот и, в основном, снижается содержание линолевой и линоленовой кислот с увеличением доли пальмитиновой кислоты [2963. Выявленные изменения в составе липидов листьев проявляются уже на ранных, досимпто-мных этапах патогенеза и сохраняются в процессе развития болезни. Снижение доли полиненасыщенных жирных кислот отражает деструктивные повреждения, обусловленные действием патогена на мембранные структуры клеток растений. Зтапы повреждающего действия возбудителей заболеваний можно представить следующим образом. Патоген вначале активирует в растительных клетках генерацию свободных радикалов кислорода. Последние, непосредственно или через цепь реакций, инициируют процессы перекисного окисления мембранных липидов, приводя к необратимым десруктивным повреждениям мембран, включая и плазмалемму. В результате нарушаются их барьерные Функции, что обычно сопровождается увеличением скорости выхода внутриклеточных электролитов [296 3. Следствием повреждения мембран является деком-партметация клеток и выход токсичных соединений, в том числе и фе-нольной природы, а также солюбилизацией пероксидазы из клеточных стенок [29?,298 3 . В результате создаются благоприятные условия для активации системы пероксидаза-фенолы в диффузатах, приводящей к генерации активных форм кислорода [2993, для подавления образования которых используются антиоксиданты.

Эффективность действия антиоксиданта обусловлена предотвраще

- 83 нием окисления 5Н-групп белков, сохранением состава мембран, био логически активных веществ, информативных молекул и т.д., повреж дение которых возникает в результате активации процесса перекисно го окисления липидов.

- 64

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основе действия механизмов покоя заложено функционирование различных физиолого-биохимических процессов. Контроль за этими процессами осуществляется комплексом биологически активных ве ществ, которые регулируют рост и развитие растительного организма обеспечивая сохранение его жизнеспособности. Вхождение в сос тояние покоя сопровождается понижением активности биосинтетичес ких процессов и дыханиямитохондрий, последнее вызывается разобщением окислительного фосфорилирования, переключением аэроб ных метаболических процессов на анаэробные. При этом активность анаэробных метаболических систем начинает преобладать над активностью аэробных процессов. Показателями анаэробных метаболи ческих процессов могут служить ферменты глюкозо-6-фосфатде гидрогеназа и алкогольдегидрогеназа, а аэробных - пероксидаза. Глю козо-6-фосфатдегидрогеназа является ключевым ферментом пентозофос фатного пути превращения углеводов, катализирует реакции окисления глюкозо-6-фосфата в присутсвии NADP, который необходим для метабо лизма липидов (жирных кислот и стероидов). При этом известно, что стероидные гликозиды могут в организме выполнять роль антиоксидан тов, регулировать проницаемость мембран и активировать процессы де ления и роста клеток. Алкогольдегидрогеназа катализирует обратимые реакции окисления алифатических спиртов с участием NAD (рис. 1) Отношение концентраций альдегида к спирту отражает уровень протека ния анаэробных биоэнергетических процессов. Снижение этого соотно шения должно сопровождаться активацией катаболических процессов, а повышение - углублением гипобиотического состояния. Однако этот регуляторный механизм в семенах куоьтурных и дикорастущих растений недостаточно изучен.

Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по актив

- 65 ноети пероксидазы, которая совместно с СОД и каталазой входит в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов, предотвращающих разрушительное действие активных форм кислорода. Фермент способен катализировать реакции окисления различных биологически активных соединений СНАОН, И9К, аскорбиновая кислота, флавоноиды и др.), среди которых следует выделить антиоксиданты, соединения способные подавлять образование свободных радикалов, ингибировать ПОЛ (рис. 1). Таким образом между пероксидазой и антиоксидантами должна наблюдаться взаимная зависимость, которая, к сожалению, недостаточно изучена.

Семена культурных растений в отсутствие воды и при низкой температуре находятся в состоянии вынужденного покоя. Однако с возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические I процессы и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие С174Э. Период прорастания делиться на три этапа [721: 1) активация метаболизма (этап физического набухания); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка. Известно, что для нормального прорастания в воздушно-сухих семенах должны присутствовать все компоненты белок-синтезирующей системы: рибосомы, тРНК, факторы инициации и элонгации, аминокислоты и аминоацил-тРНК-синтетазы, все ферменты метаболизма, белки теплового шока и их мРНК. Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей. В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода (ЙФК): 0^-, Н^О^, НО», Н0С1 и др. [2331. Накопление ЙФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидные радикалы модифицируют белки, наруша

- 67 ют структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества С 196 3 . Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран, и ряда биосинтетических процессов [2383. Контроль за содержанием АФК в семенах осуществляют антиоксиданты. В генерировании свободных радикалов может принимать участие и пероксидаза. Однако инициирующая роль фермента в процессах прорастания семян практически не изучена. Набухание и прорастание семян всегда сопровождается активированием оксидазных процессов. УФ-облучение семян может инициировать возрастание ПОЛ, регулируемое в живых организмах компонентами антиоксидантной системы. Однако взаимодействие их основных метаболитов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний у живых организмов, обитающих в экстремальных условиях мало исследована. Поэтому актуальньсть и значимость изучения биохимических механизмов формирования гипобиотических состояний позволили нам сформулировать цель и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов заложенных в структуре основных маркерных ферментов катаболических и анаболических процессов, и их метаболитов, и проявляемых у организмов в ответ на действие стрессирующего фактора; исследование взаимосвязи между компонентами системы антиоксидантной защиты и биологически активными веществами в процессе прорастания семян, а также определение их функциональной роли в адаптационных механизмах растений, выявление закономерностей протекания метаболических процессов при формировании гипобиотических состояний организмов, обитающих в экстремальных условиях.

- 68

В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить Физико-химические свойства пероксидазы, алкоголь- и глю-козо-6-фосфатдегидрогеназ растений: выявить особенности структурной организации каталитических центров этих ферментов и способы реализации заложенных в них адаптационных возможностей, которые могут быть реализованы при формировании гипобиотических состояний.

2. Провести сравнительный анализ кинетических свойств ферментов в зависимости от функционального состояния и видовой принадлежности растительного организма.

3. Изучить участие пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидро-геназ и их метаболитов в обеспечении устойчивости и поддержании высокой жизнеспособности семян дикорастущих и культурных растений.

4. Исследовать влияние высоких положительных температур на резистентность и всхожесть семян растений, выявить отличительные особенности в проявлении Ферментативной активности у семян культурных и дикорастущих растений при действии стрессирующих факторов.

5. Исследовать влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы, а также роль малых доз ультрафиолетового излучения на динамику активности ферментов зерна пшеницы.

6. Изучить роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в онтогенезе растений. Изучть закономрности взаимного влияния компонентов антиоксидант-ной системы в механизмах прорастания семян.

8. Установить роль аскорбиновой кислоты в механизмах формирования гипобиотических состояний.

9. Изучить возможности регулирования механизмов гипобиоза с помощью варьирования концентраций антиоксидантов.

-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Исходные вещества. Семена пшеницы (Tritiui aestivue L.) местной селекции сорта Скороспелка улучшенная (вегетационный период 66-83 дня, сорт скороспелый, масса 1000 зерен - 21 - 23 г.), сорт Якутянка 224 (вегетационный период 85-98 дней, сорт среднепоздний, масса 1000 зерен 36-40 г) и инорайонные сорта Ладе, Омская 12 и Приленская 19, сорта среднеранние, масса 1000 зерен - 32 - 39 г.

Пероксидаза хрена (Reanal, Венгрия), с RZ=i,0, которую очищали до электрофоретически гомогенного препарата (RZ=fl403/fl28Q=3.2) по методике, описанной в работе [300]. без дополнительной очистки использовали п-толуолсульфонат 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимид, тринитробензолсуль-фокислоту, 6-фосфоглюконовую кислоту, дитионит натрия, кверцетин (Sigma, США), 1-этил-З (3-диметиламинопропил) карбодиимид, п-гид-роксимеркурибензоат-Иа, хлормеркурибензоат, о-фенантролин, аскорбиновую кислоту (Serva, ФРГ), иодметилат М-п-фенилазофенил-N'(N,N-диметиламинопропил) карбодиимид (предоставлен проф. В. М. Степановым), пропилендиамин и гексаметилендиамин (KochLíght, Англия). Ди-нитрофенилпропилендиамин, динитрофенилгексаметилендиамин, динитро-Фенилдодекандиамин получали динитрофенилированием соответствующих диаминов с последующей перекристаллизацией из 6 М HCl; солянокислый гидроксиламин дважды перекристаллизовывали. HAD, NADH, NADP, АМФ, АДФ, АТФ, глюкозо-6-фосфат (Reanal, Венгрия), тритон К—100 (Ferak Berlin, Германия), тиобарбитуровая кислота - ос.ч, пикриновая кислота - чда, НаОН - ос.ч, трилон Б - чда, хлорид железа (III) - чда, МУК - ос.ч, натрий фтористый - хч, гексацианоферрат калия - чда. (Химреактив, Россия), дигоксин (Ланикор, Югославия), строфантин £ (йенафарм), этанол - очищали перегонкой, о-дианизидин марки ч. очи

- 70 щали возгонкой в вакууме, перекись водорода - ЗОХ-ный водный рас твор, ос.ч.

В работе использовали соли ос.ч. или дважды перекристаллизованные из бидистиллированной воды.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Рогожин, Василий Васильевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении хотелось бы подвести итог проведенным исследовани ям. Формирование гипобиотического состояния есть приспособительный признак, присущий растениям и животным, реализация которого обус ловлена наличием в живом организме специализированных систем, способных обеспечивать выживание организма, попавшего в экстремальные условия, существование в которых может привести к его гибели. Уело вия создаются понижением и повышением температуры окружащей среды за пределы физиологически допустимых норм.

По своему территориальному расположению Республику Саха (Яку тия) можно отнести к районам с рискованным земледелием. Огромное значение на формирование гидротермического режима почв республики т.е. на создание почвенного климата и почвообразование в целом, а также на развитие микро- и нанорельефа и растительного покрова ока зывает влияние многолетняя мерзлота повсеместно распространенная в Якутии. Мощность многолетнемерзлотных пород колеблется от 500 до 700 м с температурой от минус 5-? , в долинах крупных рек до -10°С и ниже. При этом мощность деятельного слоя почв колеблется от 0,2 м в арктической тундре и до 1,5-2,0 м в равнинной части (Еловская 19?9). Климат Якутии резко-континентальный, засушливый. Период с температурой воздуха 10сС продолжается 90-100 дней, безморозный пе риод - 60-100 дней (Гаврилова, 1973).

Для продуктивного выращивания зерновых культур в экстремальных условиях необходимо разработать единую эколого-биологическую стра

- 3?6 тегию, основанную на использовании современных достижений в области молекулярной биологии и биотехнологии. Прежде всего необходимо использовать в сельскохозяйственном производстве высопродуктивные, акклиматизированные сорта зерновых, усиливая их посевные свойства путем направленной зкзогенной обработки биологически активными веществами (БАБ), способными повышать резистентность растений к неблагоприятным факторам среды. За счет использования обработки зерша БАБ снимать э$фекты^егатив«ого влияния токсических веществ, содержащихся в почве. Предварительная обработка зерен БАБ должна быть направлена на активирование механизмов прорастания семян на конечных этапах эмбриогенеза. Кроме этого БАБ во время активной вегетации должны повышать устойчивость растений к перепадам температур. Направленное использование различных по строению и функциональной активности веществ позволит повысить посевные качества семян и увеличить урожайность зерновых. Усилить действие БАБ можно путем использования различных физических приемов, повышающих общую резистентность растений к факторам среды, используя низкие дозы УФ-облучения и малые закаливающие температуры.

Предполагается, что ведущими звеньями в механизме термоадаптации являются системы внутриклеточной регуляции, прежде всего генетическая и энзиматическая, функциональная лабильность которых обусловлена их полиморфизмом (Титов, 1978). Реакция организма на воздействие низкой температуры зависит от силы и продолжительности действия стрессирующего фактора. Величины адаптационных температур могут индуцировать температурнозависимую перестройку генома, приводящую к закаливанию растений, обеспечивающую реализацию максимально возможной потенциальной устойчивости растительного организма. При повреждающих температурах генетически контролируемые перестройки метаболизма затруднены, метаболические превращения выходят из под

- 377 контроля генома, обратимые изменения переходят в необратимые, при этом происходят структурные и функциональные нарушения.

Покой является физиологически обусловленным состоянием в онтогенезе растений, за счет которого обеспечивается выживание вида в неблагоприятных условиях. В основе Формирования механизмов покоя заложено Функционирование различных физиолого-биохимических процессов. Контроль за этими процессами осуществляется комплексом Функционально активных вещеетв, которые регулируют рост и развитие растительного организма, обеспечивая таким образом сохранение его жизнеспособности. Одним из компонентов механизмов покоя является антиок-сидантная система (АОС), поддерживающая жизнеспособность организма, при проявлении его минимальной функциональной активности. При этом компоненты АОС, могут не только обеспечивать продолжительность состояния покоя, но и при создании благоприятных условий, активировать выход из состояния гипобиоза. Ведущим звеном этой системы являются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), запускающие у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности. Доказательствами этого утверждения служат следующие факты. При создании благоприятных условий (температура, влажность, кислород) семена могут прорастать. Однако предварительно у них должно активироваться дыхание. В покоящихся семенах дыхание крайне ослаблено, отмечаются изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохондриальной системы, за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования. Однако, поступивший кислород активирует пусковые механизмы процессов ПОЛ. Контроль за этими процессами осуществляет антиоксидантная система, в составе низкомолекулярных (аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мочевина, глутатион и др.) и высокомолекулярных (супер оксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза) соединений. Причем между

- 3?8 компонентами системы просматривается взаимная зависимость. Среди ферментов следует выделить пероксидазу, которая обладает широкой субстратной специфичностью, способна катализировать реакции окисления различных органических соединений. Причем особенностью механизма действия пероксидазы является способность фермента катализировать окисление органических субстратов с участием кислорода, т.е. Фермент может выполнять роль оксидазы. Окисдазными субстратами фермента служат индолил-3-уксусная кислота, диоксифумаровая кислота и др. Причем продуктом оксиления в оксидазных рекциях является супероксид анион-радикал (0£ ) и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола. Радикалы скатола могут регировать в дальнейшем с молекулярным кислородом, образуя перокси-радикалы и далее перекись скатола (Савицкий и др.,1998). Поэтому генерация свободных радикалов пероксидазой в оксидазных реакциях фермента может быть условием для его участия в процессах свободнорадикального окисления в семенах пшеницы, а фермент может выполнять роль инициатора образования свободных радикалов в семенах.

В круг пероксидазных субстратов фермента входят различные функционально активные вещества, в том числе и антиоксиданты. В реакциях индивидуального окисления эти соединения чаще всего являются медленно окисляемыми субстратами, однако при совместном окислении с быстро окисляемым субстратом, скорость их пероксидазного окисления может возрастать в 100 и более раз. Пероксидаза способна, осуществлять контроль за уровнем перекиси, восстанавливая ее до воды и при этом окислять низкомолекулярные антиоксиданты. В процессе каталитического процесса могут образовываться свободные радикалы, которые в начальный момент прорастания семян, способны инициировать реакции свободнорадикального окисления, активируя при этом протека

- 3?9 ние процессов переписного окисления липидов. Высокие концентрации антиоксидантов ингибируют пероксидазу как в реакциях индивидуально го, так и совместного окисления, осуществляя таким образом регуля-торную функцию. Следует выделить ряд особенностей в проявлении активности пероксидазы в покоящихся и прорастающих семенах. Так, например, в сухих семенах выявляется высокая пероксидазная активность, коррелирующая с уровнем их жизнеспособности. Тогда как низкая„.активность> ферменха свидетельствует о понижении- жизнеспособное ти и всхожести семян.

В условиях искусственного гипобиоза, вызванного длительным затоплением семян в воде, у них так же отмечается увеличение содержа ния антиоксидантов, сопроводающееся уменьшением уровня ПОЛ. Тогда как использование низких конценраций перекиси водорода, при набуха нии семян, в них повышается пероксидазная активность, коррелирую щая с возрастанием их всхожести.

Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в составе антиоксидантов и повышением активности пероксидазы в десятки и более раз. У непроросших семян отмечается повышение содержания антиоксидантов, при пониженом уровне ПОЛ и пероксидазной активности. В прорастающих семенах происходит переключение дегирогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ. Актив ность АДГ может регулироваться различными концентрациями АТФ, а пероксидазы - ИУК. Избирательность типов ингибирования пероксидазы ЙУК обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. При этом ЙУК может изменять направленность ре акций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фер мента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высо коспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необхо

- 380 димость в которых может возникать у растений в процессе развития Таким образом ИНК может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Действие ауксина проявляется например, при выходе семян пшеницы из состояния вынужденного покоя

Алкогольдегидрогеназа семян при физиологических рН преимущественно способна катализировать реакцию накопления этанола, который в покоящихся семенах может выполнять роль основного энергетическо го субстрата метаболических процессов. За счет генерации этанола в семенах поддерживается их высокая жизнеспособность и длительная сохранность. При этом реакция восстановления ацетальдегида находится под контролем эндогенных нуклеозидфосфатов (АТФ и АДФ), избыток которых, по-видимому, может ингибировать фермент, регулируя таким образом уровень эндогенных этанола и ацетальдегида в семенах, находящихся в состоянии вынужденного покоя. Тогда как при прорастании семян активизируются метаболические процессы, увеличивающие концентрацию АТФ в проростке, в результате содержание нуклеозидфосфатов начинает накапливаться в системе. Избыточное содержание АТФ в проростках приводит к ингибированию АДГ, что и проявляется в виде понижения активности Фермента при прорастании проростков пшеницы. Таким образом АТФ может выполнять роль регулятора алко-гольдегидрогеназной активности, осуществляя направленное переключение процессов с анаэробных на аэробные, при повышении функциональной активности митохондрий.

Воздействие высокой температуры на семена пшеницы приводит к резкому снижению активности пероксидазы, коррелирующей с понижением их всхожести и жизнеспособности. Таким образом пероксидаза может служить критерием оценки посевных качеств семян, тогда как понижение активности фермента характеризует снижение общего уровня метаболических процессов в семенах, понижение активности антиокис

- 381 лительной системы и ослабление работы активационных механизмов, отвественных за прорастание семян.

Предварительное УФ-облучение семян проявляется в резком увеличением активности пероксидазы, повышением уровня ПОЛ, с проявлением компенсаторного выбраса высоких конценраций антиоксидантов в период проклевывания. Причем наиболее активно возрастание антиоксидантов и ПОЛ отмечается в зародыше семян пшеницы, тогда как в щитке увеличение ПОЛ сопровождается понижением антиоксидантной активности. Возможно, в этом проявляется регуляторный механизм, обеспечивающий нарушение избирательного транспорта Функционално активных веществ через щиток. При этом из эндосперма в зародыш начинают активно поступать регуляторы роста, обеспечивающие прорастание зерен пшеницы.

Субстратами пероксидазы могут быть и фитогормоны (абсцизовая кислота, гибберелловая кислота, ауксины и др.), поэтому фермент имеет важное значение в регуляции состава функционально активных веществ. Причем окисление этих функционально активных веществ ферментом способствует генерации свободных радикалов в семенах, а как следствие этого процесса является активизация ПОЛ. Причем вслед за этими процессами в семенах активизируется дыхание, повышается общий уровень метаболических процессов, что проявляется в ускоренном про-растани семян, активно выходящих из состояния покоя.

Для повышения всхожести семян можно предложить разработанный нами метод использования УФ-облучения и низких концентраций антиоксидантов, в предпосевной обработке семян пшеницы. При этом всхожесть семян пшеницы может повышаться на 20-30%. При обработке семян высокими концентрациями антиоксидантов наблюдается понижение всхожести семян, за счет, вероятно, ингибирования перекисного окисления липидов, проявляемое в углублении их покоя. Тогда как при действии малых доз УФ-излучения и низких концентраций антиоксидантов мы

- 382 наблюдали эффекты активирования процессов свободнорадикального окисления в прорастающих семенах, что позволяет высказать предположение об участии ПОЯ в активировании пусковых механизмов прорастания семян. Возможно, эти же методы могут быть использованы для активизации прорастания семян дикорастущих видов растений.

- 383