Физиологически совместимые антиоксиданты: Молекулярно-механистический аспект биологической активности и повышение защитной эффективности природных антиоксидантов в результате химической модификации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор химических наук в форме науч. докл. Парфенов, Эдгар Андреевич

• Парфенов, Эдгар Андреевич
• доктор химических наук в форме науч. докл.
• 2000

Оглавление диссертации доктор химических наук в форме науч. докл. Парфенов, Эдгар Андреевич

Развитие методов тонкого органического синтеза и анализа сложных химических структур, особенно интенсивное в эпоху НТР, дало мощный импульс для внедрения в хемотерапию быстро- и сильнодействующих агентов. Уже синтезировано и подвергнуто биологическим испытаниям очень много соединений этого типа, сотни тысяч их запатентованы, а десятки тысяч вышли на орбиту медицинской практики. Возможности химического синтеза еще далеко не исчерпаны, но, наряду с полезными свойствами, медицинская практика со всей очевидностью выявила и негативные характеристики этого типа лекарств. Они вытекают из объединяющей их принадлежности к категории чужеродных для живого организма соединений. И в этом качестве их селективность по отношению к ткани (органу) - мишени не сопоставима с лекарственным действием физиологически совместимого агента. Как следствие, токсичность - органический, неискоренимый признак лекарств-ксенобиотиков и других чужеродных соединений. Особенно наглядно это прослеживается на примере всех эффективных противоопухолевых лекарств. Неудивительно, что "лекарственная болезнь", не исключающая летальный исход, стала серьёзной проблемой современной медицины. Но главная опасность заключается в том, что лекарства - чужеродные соединения, подменяяя собственные защитные системы организма, угнетают последние, тем самым понижают его собственный защитный потенциал и шансы на автономное существование.

Угрожающее ухудшение экологической ситуации (производства и употребления лекарств-ксенобиотиков как части ее) и малая эффективность лекарств-чужеродных соединений при хронических заболеваниях выдвигают задачу развития методов альтернативной ортомолекулярной медицины в качестве актуальной. О результатах этой работы свидетельствует появление новых направлений экспериментальной медицины, таких как оксидантная терапия, антиоксидантная терапия и терапия, направленная на системы сигнальной трансдукции клетки или контроль генной экспрессии. Само развитие этих новых направлений в медицине стало возможным благодаря выбору средств хемотера-пии, главные признаки которых - редокс-активность и физиологическая совместимость.

Основанием для выбора соединений этого типа как перспективной области поиска новых лекарств послужили два типа наблюдений: 1) эпидемиологические исследования, согласно которым выбор диеты с высоким содержанием овощей и фруктов способствует успешному курсу лечения при многих заболеваниях, 2) аналитические данные, показавшие, что многие вещества, входящие в состав активного начала лекарственных растений, овощей и фруктов и обнаруживающие защитные свойства по отношению к разнообразным патологиям, обладают антиоксидантными свойствами. Одновременно стало известным, что процессы старения и аутоимунные заболевания или заболевания воспалительной этиологии, представляющие наиболее значительные проблемы современной медицины (сердечно-сосудистые заболевания, нарушения центральной и периферической нервной системы, рак, СПИД и другие инфекции, артриты и другие воспалительные заболевания, диабет и др.), вызываются или сопровгоедаются окислительным стрессом, недостаточностью или дефектами физиологической антиоксидантной защитной системы, находящейся в состоянии неделимого единства с другими защитными системами человека от чужеродных одно- и многоклеточных организмов и соединений (хемопротектор-ной и иммунной).

Другое важное открытие последних лет заключается в установлении того, что активные частицы кислорода, азота и серы - участники окислительного стресса - в достаточно низкой концентрации выполняют функции физиологических вторичных посредников. Была также обнаружена тесная взаимосвязь между активными частицами-окислителями и вторичными посредниками других типов (окислительными метаболитами высших поли-еновых жирных кислот, циклонукпеотидами и др.).

Эти обстоятельства объясняют предпочтительность выбора физиологически совместимых антиоксидантов (ФСАО) и лрооксидантов перед синтетическими.Таким образом, молекулярными мишенями ФСАО/прооксидантов должны быть структуры, входящие в состав систем сигнальной трансдукции клетки, и вообще - любые ферменты, способные прямо или косвенно подвергаться редокс-регуляции. Наиболее общим молекулярным механизмом воздействия редокс-активного лекарства нового типа на функционально-активный элемент клет-ки в таком случае является индуцированный им сдвиг (положительный или отрицательный) редокс-потенциала клетки.

Можно констатировать, что имеются основательные научные предпосылки для сознательного планирования и разработки безопасных лекарств нового типа на основе ФСАО, которые можно также назвать антиоксидантами биотического типа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физиологически совместимые антиоксиданты: Молекулярно-механистический аспект биологической активности и повышение защитной эффективности природных антиоксидантов в результате химической модификации»

Способность ингибиторов радикально-цепного процесса окисления, антиоксидантов, защищать от окислительного повреждения функционально важные биомолекулы непосредственно в биологических системах при важности окислительного стресса в механизмах индукции и развития патологических процессов явилась основой для стихийного внедрения антиоксидантов в медицину. Накопленные к настоящему времени знания позволяют организовать этот процесс в строго научных рамках и на основании анализа различий в механизмах проявления биологической активности лекарств-чужеродных соединений и природных антиоксидантов предложить методологию разработки средств хемотерапии альтернативной медицины, ориентированную на предпочтительное использование безопасных лекарств. Нет сомнения, что поиск и разработка антиоксидантов лекарственного действия позволит значительно расширить ассортимент ингибиторов окислительных процессов, предназначенных для использования и в других сферах народного хозяйства (пищевые добавки, стабилизаторы различных химических изделий, средства, повышающие сроки годности готовых лекарственных форм и т.д.).

Настоящая работа выполнена в соответствии с плановыми исследованиями Опыт-но-наработочной лаборатории НИИ ЭД и ТО ОНЦ РАМН им.Н.Н.Блохина по госбюджетной теме "Создание новых противоопухолевых и иммуномодулирующих препаратов на основе природных соединений и разработка технологии их получения" (N госрегистрации 01. 9.40009602), а также в рамках международного сотрудничества с Национальным раковым институтом (NCI, USA) при поддержке Европейской организации по исследованию и лечению рака (EORTC, Amsterdam).

Цепь, задачи работы и исследовательский метод. Цепь работы - теоретическое и экспериментальное обоснование принципов сознательного поиска эффективных физиологически совместимых редокс-агентов (антиоксидантов/прооксидантов), пригодных для продвижения в медицинскую практику, т.е. вооружить разработчика точными знаниями. В данном случае точное знание складывается из трех составляющих:

1) представления о молекупярно-кпеточных механизмах патологии, т.е. о деталях функционирования молекул и их комплексов, ответственных за поддержание процессов жизнедеятельности, о нарушениях их работы и о причинах этих нарушений;

2) представления о молекулярных основах вмешательства лекарственного агента в механизмы патологии и способах восстановления нормальной функции на молекулярно-клеточном уровне;

3) эффективной методологии выбора наиболее подходящего типа АО и отбора внутри него подходящих объектов исследования.

В соответствии с изложенным в работе поставлены задачи: 1) изучить принцип кобальт-зависимого редокс-катализа полифункциональных субстратов, 2) изучить роль двухвалентной серы в редокс-зависимых каталитических процессах жизнедеятельности и патологии, 3) теоретически и экспериментально обосновать выбор металла и лиганда для планирования и последующей разработки безопасного лекарства.

Для успешного разрешения поставленных задач в работе широко использован метод химического моделирования как наиболее эффективный и оперативный при минимальных материальных вложениях из всех известных.

Научная новизна. Впервые на основании анализа обширного литературного материала (обработано свыше 5000 литературных источников) и, в определенной мере, собственных экспериментальных данных обоснована концепция физиологически совместимых антиоксидантов как база для поиска и разработки лекарств новой генерации, безопасных.

В результате сравнения известных механизмов действия лекарств-чужеродных соединений и ФСАО выявлены характерные признаки ФСАО. Впервые признак физиологической совместимости обоснован как краеугольный для разработки лекарства. Соответственно новым является предложенный в работе метод оценки лекарственной перспективы ФСАО с точки зрения его способности синхронизировать редокс-сдвиги с биологическими процессами. В работе такой подход экспериментально обоснован на примерах участия кобальта и соединений двухвалентной серы в процессах каталитического сопряженного редокс-переноса химических групп в норме и патологии. В ней можно выделить еще один уровень исследования - синтетический - и специфические для этого уровня оригинальные разработки и находки, как-то:

1 Методом химического моделирования экспериментально продемонстрирована способность ФСАО синхронизировать два уровня биологической организации, молекулярный и субмопекулярный, а именно:

1.1 показано редокс-участие кобальта в каталитической трансформации этиленгли-коля,

1.2 показано редокс-участие серы(Н) в каталитическом переносе злектрофильных остатков на нуклеофильный центр.

2 Обнаружена высокая склонность к сольволитическим превращениям у р-гидрокси-зтилкобалоксима, а именно:

2.1 выделен и изучен интермедиат сольволитических превращений, соответствующий кобальторганический ион карбония (в виде гексахлорантимоната),

2.2 на препаративном уровне получены соответствующие простые и сложные ко-бальторганические эфиры.

3 Найдено, что с сольволитическим превращением замещенных алшлкобалоксимов всегда конкурирует реакция их деградации с выделением олефинов и что эффективность сольволиза определяется нуклеофильностью сопряженного основания кислоты-катализатора.

4 На примерах оксикобальтирования простых и сложных виниловых эфиров и ш-О-замещенных пентенов-1 (разработано три способа) и переалкилирования способных к сольволизу органокобалоксимов показано, что реакция распада органокобалоксимов с образованием олефинов имеет обратимый характер.

5 Показано, что обработка кобалоксимаэ 1,3-дибромпропеном или его предшественником, тетрабромпропаном, в среде водных спиртов

5.1 сопровождается стереоспецифической перегруппировкой аллильного типа продукта алкилирования, 3-бромаллилкобалоксима, с участием гидроксилсодержащего растворителя, воды или спирта,

5.2 а в присутствии этиленглмколя на эту реакцию накладывается еще один процесс, внешнесферное окислительно-восстановительное каталитическое превращение этилен-гликоля.

6 Установлено, что сера(Н) является сопрягающим агентом при каталитическом ре-докс-переносе злектрофильных групп на нуклеофильный центр.

7 Обнаружено, что соединения трехвалентного фосфора могут служить катализатором не только реакции сопряженного ацилирования N-сульфенильных производных, но и в ходе синтеза хлорангидридов ароматических сульфеновых кислот. В последнем случае каталитическая активность установлена и у простейших амидов карбоновых кислот.

8 Показано, что простые кумарины и их аналоги могут служить превосходным синто-ном для получения разнообразных антмоксидантов: фенолов, каптодативных олефинов, полифенолов, алифатических и ароматических редукгонов, стабилизированных тиоля-тов, алифатических и ароматических эффективных хелаторов (а- и р-дикарбонильного типа, поликарбоксилатов, а-нитрозоенолов /а-изонитрозокетонов/), комплексных соединений с переходными биометаллами - моделей супероксиддисмутазы и других защитных металлоферментов и металлопротеинов.

9 В ходе синтеза кумариновых АО впервые было установлено:

9.1 что итог восстановления 4-замещенных 3-нитрокумаринов дитионитом натрия определяется характером заместителя в положении 4,

9.2 что при взаимодействии З-нитро-4-хлоркумарина с бензилмеркаптаном могут быть получены два ряда S-производных в зависимости от стехиометрии реагентов,

9.3 что восстановление нитрогруппы в 3-нитро-4-(2-карбоксифенилтио)кумарине дитионитом натрия до аминогруппы конкурирует с ее замещением на водород или меркап-тогруппу,

9.4 что З-нитро-4-кумаринилтиолят очень легко гидролизуется в присутствии ионов щелочных металлов в качестве противоиона, но может быть стабилизирован замещенными аммонийными ионами.

10 Последнее наблюдение, истолкованное с позиций теории ЖМКО, может служить импульсом для развития теории ионных реакций.

11 Впервые показано, что активным интермедиатом реакции сопряжённого ацилиро-вания может служить солеобразный ацилаль.

12 Данные по реакционной способности З-нитро-4-замещенных кумаринов обобщены сточки зрения отличия от соответствующих ароматических соединений.

Однако по отношению к основной цели диссертации эти материалы являются сопутствующими.

Практическая ценность. Главная ценность проведенного исследования заключается в создании научного фундамента для поиска и разработки принципиально новых средств хемотерапии, представленных модифицированными природными антиоксидан-тами. Сформулированные рекомендации адресованы ко всем разработчикам новых лекарств, независимо от профиля организации, в которой они работают. В диссертации рекомендации по химической трансфоромации биодобавок (нутрицевтиков) в лекарства, вытекающие как следствия из концепции ФСАО, были апробированы на следующих примерах.

1 По результатам биоиспытаний на модели алкогольной язвы желудка отобраны комплексные соединения меди(П) и цинка(Н) с кумариновыми лигандами с активностью выше сукралфата.

2 Синтезированы комплексные соединения Cu(ll), Zn(l(), Fe(ll), Fe(lll), Co(lll), Mn(lll), Mn(IV), VO(II), TiO(ll) и Ti(IV) с лигандами на основе кумарина и родственных гетероцик-лов, показавшие противовоспалительную активность. Перечисленные соединения обнаруживают также активность эффективных бронходиляторов (антиастматических агентов), с активностью более высокой, чем у интала и теофиллина на тех же моделях патологии in vivo.

3 На стрептозотоциновой модели диабета П-готипа отобраны пероральные эквиваленты инсулина среди эффективных хелаторов, модификаций аскорбата и моделей СОД с ванадилом в качестве центрального иона металла.

4 По результатам испытаний in vitro и in vivo показана перспективность поиска противоопухолевых агентов среди кумариновых редукгонов, эффективных хелаторов и моделей СОД, особенно ванадил-содержащих.

5 Среди кумариновых антиоксидантов 9 типов отобраны высокоэффективные анти-гипоксанты и актопротекгоры.

Плодотворность концепции ФСАО для разработки лекарств принципиально нового типа подтверждает также её прогностическая способность в отношении обоснования дизайна:

1)гипоксия-селективных кобальт-содержащих противоопухолевых агентов улучшенного типа на основе уже синтезированных сольволитически активных органокобалокси-мов,

2)лротивоопухолевых агентов на основе кумарина и его аналогов, селективных по отношению к гормон-зависимым и метастазирующим опухолям.

На сугубо химическом уровне исследования обогащены методы тонкого органического синтеза, как-то:

1)разработан каталитический способ окислительно-восстановительного превращения этиленгликоля до ацетона, углекислого газа и фракции насыщенных углеводородов,

2)разработан каталитический способ получения хлорангидридов ароматических сульфеновых кислот,

3)разработан каталитический окислительно-восстановительный способ замещения сульфенильного остатка на другой электрофильный на примерах препаративного получения N-аципированных аминов в реакциях N-сульфенированных производных с ангидридами, хлорангидридами и тиоэфирами карбоновых кислот,

4)разработан экономичный способ сопряженного ацилирования с использованием солей карбоновых кислот и З-нитро-4-хлоркумарина на примерах препаративного получения N-аципированных производных, ангидридов, эфиров и тиоэфиров карбоновых кислот.

Предложенные в диссертации экспериментальные разработки являются готовыми технологическими решениями. Большинство выполненных разработок ФСАО имеет патентоспособный характер, на некоторые химические разработки получены авторские свидетельства СССР.

Синтезированные диссертантом образцы соединений и разработанные методики апробированы в ШТХТ им.М.В. Ломоносова, ВНЙВИ, Отделении экспериментальной патологии НИИ по БИКС, Институте фармакологии РАМН, ВНЦ по безопасности БАВ, Институте экспериментальной эндокринологии ЭНЦ РАМН, 2-м ММИ им.Н.И.Пирогова, Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, ГПА (г.Брянск), NCI-EORTC (Amsterdam).

В качестве замечаний обобщающего характера можно отметить:

1 Получен экспериментальный материал, полезный для развития теории сольво-литических реакций и ионных процессов.

2 Представленные в диссертации материалы могут служить основой учебного курса "Безопасные лекарства. Молекулярно-механистические основы биологической активности, принципы химии и технологии", предназначенного для студентов и аспирантов в центрах подготовки кадров разработчиков новых лекарств.

Личный вклад автора. Личной заслугой автора является постановка проблемы и разработка концепции ФСАО в развитие теории "Антиоксидант в биологии" ("Биоантиок-сидант"), созданной отечественными учеными (Н.М.Эмануэль, Б.Н.Тарусов, Е.Б.Бурлако-ва). Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в выработке общей концепции, постановке задач, разработке путей их решения, непосредственном участии в осуществлении большей части химического эксперимента и интерпретации полученных результатов в виде написания статей, обзоров и монографий.

На защиту вь/носятся следующие положения: концепция ФСАО, ее теоретическое и экспериментальное обоснование в части синхронизации антиоксидантом биологических процессов на субмолекулярном и молекулярном уровне в норме и патологии (на модельных примерах участия кобальта и сульфенильной серы) и примеры приложения концепции ФСАО для разработки фармакологически активных АО (разные типы АО на основе кумаринов и их моноциклических аналогов, модификации аскорбата).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на международных и отечественных научных собраниях, включая XII Научную сессию по химии и технологии органических соединений серы и сернистых нефтей (Рига, 1971), V и VIII Международные конгрессы по металлорганической химии (Москва, 1971; Kyoto, 1977), 3-е Всесоюзное совещание по химии координационных соединений кобальта, никеля и марганца (Тбилиси, 1974), XII Всесоюзное Чугаевское совещание по химии комплексных соединений (Новосибирск, 1975), Сессию по бионеорганической химии (Донецк, 1976), V Всесоюзный симпозиум по органическому синтезу (Москва, 1988), Международную конференцию по регуляции свободнорадикальных реакций (Биомедицинские аспекты) (Varna, 1989), IV и V конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1993,1998), 1-й Европейский конгресс по фармакологии (Milano, 1995), 2-, 5- и 6-й Российские национальные конгрессы

Человек и лекарство" (Москва, 1995,1998,1999), 6-ой Национальный конгресс по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), 11-й международный конгресс по органическому синтезу (IC0S-11) (Amsterdam, 1996), 4-ю и 5-ю Научно-практические конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств (Москва, 1997 и 1998), 6-й Международный симпозиум по молекулярным аспектам хемотерапии (Gdansk, 1997), 1-й Всероссийский диабетологический конгресс (Москва, 1998) и 2-ю Всероссийскую конференцию "Гипоксия. Механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1999).

Результаты работы доложены на межлабораторном коллоквиуме во Всесоюзном научно-исследовательском витаминном институте (Москва), на Научно-практической конференции Отделения экспериментальной патологии Научно-исследовательского института по биологическим испытаниям химических соединений (Москва), научном семинаре Института фармакологии РАМН (Москва), Научной конференции НИИ ЭД и ТО ОНЦ РАМН им.Н.Н.Блохина и на межлабораторном заседании МГАТХТ.

Публикации. На основании материалов диссертации опубликованы обзорные статьи: "Фармакологический потенциал антиоксидантов на основе кумарина" (Парфенов Э.А., Смирнов Л.Д. Химико-фармацевтический журнал, 1988, том 22, N 12, с. 1438-1448), "Успехи и перспективы создания лекарственных препаратов на основе аскорбиновой кислоты" (Парфенов Э.А., Смирнов Л.Д. Химико-фармацевтический журнал, 1993, том 26, N 9-10, с. 4-17), а также монографии: "Biometals and Ligands for Anticancer Drug Design" in two Parts (Parfenov E.A., Zaikov G.E. Nova Science Publishers, New York, 1998, in press), "Biotic Type Antioxidants: The Perspective Search Area of Novel Chemical Drugs" (Parfenov E.A., Zaikov G.E. PSV, Zeist, in press).

Результаты работы отражены в 43 оригинальных статьях, помещенных в отечественных и зарубежных научных журналах, 31 тезисах докладов на научных собраниях и двух авторских свидетельствах.

Структура работы. Теоретический раздел диссертации представлен в двух обзорах и трех монографиях, экспериментальная часть исследования, распыленная в статьях и тезисах докладов, просуммирована в настоящем реферате. основное содержание работы

I выбор метода и объектов исследования

Настоящая работа является развитием теоретических представлений ЛА.Блюмен-фельда и Д.Грина на биохимическую реакцию как результирующую взаимодействия трёх биологических потоков, химического, энергетического и информационного с приоритетом информационной составляющей.

1 Выбор исследовательского метода. В работе предпочтение отдано исследовательскому методу, основанному на анализе данных о молекулярных и клеточных механизмах процессов жизнедеятельности, их нарушениях, приводящих к патологическим осложнениям, и данных о возможных механизмах вмешательства лекарства, исправляющих нарушения нормального хода процессов жизнедеятельности. Успешному развитию этого подхода мешает совершенно очевидное обстоятельство - неполнота информации о молекулярных и клеточных механизмах жизнедеятельности и их отклонениях от нормы. Можно все-таки считать, что объем накопленных первоначальных знаний уже сейчас вполне достаточен, чтобы вполне успешно развивать второй подход, восполняя неполноту знаний научной интуицией и выбором эффективной методологии научного исследования.

Можно уверенно утверждать, что при анализе сложного биохимического явления, содержащего много неисследованных параметров, на сегодняшний день вполне оправдал себя научный подход, названный методом химического моделирования. Он заключается в том, что вместо самого явления анализу подвергается его подобие, сохраняющее лишь самые существенные для разрешения поставленной проблемы черты оригинала. Остальные, какими бы важными для постороннего глаза они не казались, опускаются. Легко понять, что применение метода химического моделирования требует от исполнителя не только высокого профессионализма, но и хорошо развитой интуиции.

В работе метод химического моделирования использован в различных аспектах: для изучения кобамид-зависимого катализа, для изучения роли двухвалентной серы в процессах транспорта злектрофильных частиц в норме и патологии, при разработке ФСАО класса моделей защитных металлоферментов.

Как перевести биодобавку (нутрицевтик) в разряд лекарственных агентов? Ответ подсказывает сама природа. Ясно, что повышение концентрации ФСАО сверх физиологической нельзя считать приемлемым решением. Такой приём может быть полезен в рамках оксидантной или антиоксидантной терапии, когда ФСАО выступает в качестве неспецифического лекарства, но проблемы такой подход не решает. Многочисленные наблюдения подсказывают, что организм решает эту проблему в результате метаболической модификации физиологически активных соединений. В нормальных условиях ФСАО поддерживают процессы жизнедеятельности и в составе физиологической АО защитной системы обеспечивают физиологический уровень активных частиц кислорода, азота и серы (ROS, RNS and RSS). Однако ликвидация патологии (и её последствий) требует иной организации биологических процессов. В этом случае более активная роль, чем конститутивному ФСАО, может принадлежать метаболиту, участнику новых путей сигнальной трансдукции и новых способов регуляции генной экспрессии. Т.е., по-видимому, следует говорить о реализации организмом всё того же защитного приёма, хорошо известного на примере защитных ферментов, когда конститутивная форма фермента усиливается в патологических условиях индуктивной его формой. Можно указать, по крайней мере три способа химической модификации эндогенных физиологически активных соединений, способствующей раскрытию их защитного потенциала: ^модификация нуклеофильной функциональной группы ФСАО электрофипьным агентом (алкилиро-вание, ацилирование), 2)окислительно-восстановительная модификация и 3)хелатирова-ние. Примеры соединений 1-го типа: мелатонин, М-ацетил-Ьцистеин и необлигатные составляющие физиологических систем, О-алкилированные производные и гликозиды кумаринов и флавоноидов. К этой же группе соединений можно отнести витамин Е, который можно рассматривать как внутримолекулярно алкилированную форму аналогов ди-гидровитамина К или убихинолов , адаптированную к специальной задаче защиты биологических мембранных структур. Примеры ФСАО 2-го типа: метаболиты триптофана и тирозина, таурин, гипотаурин, мочевая кислота, биливердин и билирубин. К 3-му типу агентов принадлежат хелаты железа, меди и других переходных биометаллов со специфическими хелатирующими белками (апоферритин, апотрансферрин, апометалло-тионеины).

2 Выбор объектов исследования. Свойством физиологической совместимости обладают только те экзогенные химические соединения, которые в ходе эволюции жизни на Земле были в результате естественного отбора использованы для поддержания процессов жизнедеятельности. Анализ составных элементов пищи обнаруживает в ней минорные компоненты, обладающие свойством защитных агентов (иммуномодуляторов, хемопротекторов, антимутагенов, антиканцерогенов). Как правило, удается связать защитные свойства элементов пищи с их групповой принадлежностью к АО. Но какие из них выбрать для изучения"?

Все минорные составляющие пищи можно разделить на две группы. В первую входят облигатные компоненты, без поступления которых извне организм существовать не может (витамины, микроэлементы). Вторая представлена главным образом фенольными АО. Дефицит витаминов и микроэлементов (МЭ) является предпосылкой заболевания и, как правило, ему сопутствует. Поэтому препараты поливитаминов в комбинации с МЭ (биодобавки, нутрицевтики) давно уже заняли свое место в арсенале лечащего врача как профилактическое средство и как средство поддерживающей терапии. В таких случаях обеспечивается задача соблюдения физиологической концентрации витамина или МЭ. Однако достижение специфического лечебного эффекта может потребовать использования относительно высоких доз АО. По этой причине малопригодны для изучения витамины, вызывающие явление гипервитаминоза (витамины А и Д), и неорганические соли МЭ. Физиологические концентрации МЭ очень низки, не говоря уж об их "транзитном пуле", а свободные, т.е. гидратированные, ионы переходных металлов представляют собой индукторы окислительного стресса. Поэтому переходные металлы необходимо изучать в форме комплексных соединений, достаточно стабильных в биологических средах.

Изучение физиологической АО защитной системы (ФАОЗС) обнаруживает, что она многокомпонентна. В ее состав входят как низко-, так и высокомолекулярные соединения (белки). Это наблюдение подталкивает к мысли, что в природе отсутствует универсальный АО. Вывод о безнадежности попыток поиска универсального АО следует также из рассмотрения химической схемы радикально-цепного процесса окисления, включающей более десятка констант скорости. Это рассмотрение показывает безусловно важную роль константы к7 (обрыва радикальной цепи окисления), но на общую скорость процесса можно более или менее значительно воздействовать и в других точках общей цепи превращений.

Кроме ловушек свободно-радикальных частиц, к числу активных АО относятся также эффекгитвные хелаторы - ловушки свободных ионов переходных металлов, предупреждающие саму возможность индукции свободно-радикальных реакций. Упомянем также ловушки пероксида водорода и органических гидропероксидов, которые не только фигурируют в схеме свободно-радикального цепного окисления, но и вступают в реакции двухэлектронного окисления, роль которых в биологических системах нельзя недооценивать.

Дальнейшее рассмотрение ФАОЗС обнаруживает еще два ее интересных качества. Ее состав варьирует при переходе от одного органа (ткани) к другому, равно как и при переходе от одного клеточного компартмента к другому, и определяется его функцией. И во-вторых, ее компоненты взаимодействуют меиеду собой по принципу синергизма. Отсюда будет верным считать, что продуктивность настоящей разработки должна непропорционально возрастать с числом объектов изучения, если не будут упущены из вида отношения части и целого. Одновременно приходится делать вывод о неизбежно фрагментарном характере данной работы, которую следует рассматривать лишь как начало систематической разработки проблемы.

В пользу начала изучения проблемы с исследования кобальта, серы, меди, аскорбиновой кислоты и кумаринов можно привести следующие соображения. Фармакологический потенциал кобальта сомненмй не вызывает, тем более, что он уже в определенной степени реализован. Об этом свидетельствует его введение в медицинскую практику (витамин В12, препараты коамид и кодиамид) в форме противоанемических агентов. Однако, в отличие от железа и меди защитные ферменты, имеющие в своем составе кобальт, неизвестны. Тем не менее известно, что витамин В® ведёт себя как синергист мелатонина и этот синергизм имеет отношение к его взаимодействию с оксидом азота. Кобальт - единственный металл, входящий в состав витамина, и его физиологическая функция определяется участием в механизмах кобамид-зависимого катализа. Уникальность катализа заключается в проведении реакции изомеризации разнообразных полифункциональных субстратов, в ходе которой происходит активация органического лиганда в кобамидном ксферменте. Понимание механизма этих превращений, особенно роли кобальта, может дать важный ключ к конструированию комплексных соединений кобальта медицинского назначения. Сложность химической конструкции кобамидного кофер-мента вселяет особую надежду на эффективность модельного изучения в этом случае.

Ранее G.N.Schrauzer показал, что бис(диметилглиоксиматный) лиганд весьма удачно замещает экваториальный лиганд в моделях корриноидов. Такое замещение не сказывается на характере химических превращений органического лиганда в моделях кобапа-минов. Сверх того изучение бис(диметилглиоксиматных) комплексов переходных металлов является дальнейшим развитием идей Л.А.Чугаева и его учеников. Можно, например, сослаться на работы молдавских ученых (А.В.Аблов, Н.М.Самусь, В.Н. Шафран-ский), исследующих в том числе и возможности медицинского приложения кобапоксимов.

Защитная функция меди следует из ее включения в качестве функционально-активного центра в состав защитных ферментов (Cu/Zn-содержащие супероксиддисму-тазы, церулоплазмин, цитохромоксидаза). На перспективность разработки медь-содер-жащих комплексных соединений в качестве потенциальных лекарств указывает возможность рассматривать их в качестве функционально-активной модели СОД. При правильном выборе лигандов константа скорости дисмутации супероксида таким комплексом может не только приближаться, но и превосходить константу скорости самого фермента.

Сера принадлежит к пяти основным элементам, из которых построены все биологические органические молекулы. Но сера в белках лишь в малой степени выполняет структурную нагрузку, ее главная роль - обеспечение функциональной активности белков. В этом серу можно уподобить микроэлементам (особенно показательно сравнение с селеном). По современным представлениям, именно двухвалентная сера (наряду с фосфором) наделяет органическую материю свойством жизни. Глутатион занимает исключительно важное место в механизмах энзиматической и неэнзиматической детоксикации электрофильных агентов и выведения их из организма, а низкомолекулярные тиолы (глутатион, цистеамин и его производные, липоевая кислота, зрготионеин) в комбинации с тиольными белками, участвуя в реакциях тиол-дисульфидного обмена, играют центральную роль в механизмах сопряжения сдвигов редокс-потенциала клетки с регуляцией систем сигнальной трансдукции и различных метаболических процессов.

Среди витаминов пока наибольшим вниманием в качестве АО пользуются витамины Е и С. Первый из них играет ключевую роль в защите гидрофобных компартментов клетки (мембранных структур), второй занимает лидирующее положение в антиоксидантной системе защиты жидких тканей организма и протоплазмы. В данной работе предпочтение отдано аскорбиновой кислоте как синтону - предшественнику модифицированных форм, включая гидрофобные, с повышенным фармакологическим потенциалом. Среди водорастворимых витаминов в этом аспекте большого внимания заслуживает также витамин Вб, антиоксидантный, а значит и защитный потенциал которого пока что остается загадкой.

Среди необязательных минорных компонент пищи выбраны кумарины. По своей распространенности они не уступают родственным фенольным АО из группы флавонои-дов, но обладают более простым строением и представляют собой превосходный синтон для конструирования практически любого типа АО.

II модельное изучение роли серы и микроэлементов (на примере кобальта) в процессах жизне деятельности и патологии С) — Or

А I

Erz-SH гаи н I

-Call)

1 исследование кобальт-зависимого редокс-катализа

Предварительные замечания. Механизмы защитного действия кобальта изучены слабо. Если исходить из наиболее простого определения физиологической совместимости как способности того или иного агента контролировать ход энзиматического катализа в составе тех или иных физиологических систем, то наиболее естественно для кобальта как АО принять, что его участие в энзиматическом катализе должно быть сопряжено с окислительно-восстановительным превращением (переносом одного или двух электронов). В качестве второй теоретической посылки должен выступать принцип поляризации-деполяризации химической связи в ходе энзиматического катализа, обоснованный Д.Грином (D.Green). Блестящим подтверждением этих теоретических постулатов служит расшифровка механизма участия кобальта в биологическом переносе метильной группы на различные субстраты. Главные черты этого —ct—с2—' —сг механизма: гетеролиз связи Со-С и изменение трехвалентного состояния кобальта на одновалентное. Вслед за Л.Ингрэмом мы считаем, что те же принципы должны быть реализованы в ходе катализа кобальтом трансформации полифункциональных субстратов. Известно, что в биологических системах кофермент В12 (аденозилкобаламин) принимает участие в реакциях изомеризации более десятка полифункциональных субстратов. Несмотря на отсутствие внешнего сходства между ними все эти реакции могут быть изображены одной общей схемой (схема 1).

Согласно этой схеме переход заместителя X к соседнему атому углерода выглядит как сопряженный разрыв и реконструкция связей С-С или С-гетероатом и связи С-Н. При этом в метилмалонилюэнзим А мутазной реакции происходит сохранение конфигурации реакционных центров, а в глутаматмутазной реакции и в диолдегидратазной (как для R-, так и для S-формы) происходит их обращение, а в этаноламин-аммиакпиазной реакции наблюдается рацемизация. Такой стереохимический результат, позволяет предполагать, что механизм перегруппировки для разных субстратов не должен совпадать во всех деталях. Интересно, что заместитель X обменивается местами с атомом водорода, гидрид-ионом или комбинацией атома водорода с электроном, но никак не с протоном. Т.е. изомеризация формально описывается как внутримолекулярное окислительно-восстановимо} t В

Со} + Prod (2) f В

R-органический лиганд,, ^-активированный органический лиганд, В-основный лиганд,

-экваториальный лиганд тельное превращение. Этот вывод заставляет с особым вниманием отнестись к существенной роли сульфгидрильной труп лы апофермента в энзиматическом катализе.

Превращение субстрата в процессе катализа комплексным соединением кобальта может происходить по одному из двух механизмов, внутрисферному или внешнесфено-му (схема 2).

В первом случае субстрат замещает один из лигандов комплекса и его превращение происходит в результате непосредственного взаимодействия с металлом. Во втором случае воздействие металла на субстрат опосредствуется лигандом. Нерасшифрованный механизм аденозилкобаламин-зависимого катализа заставляет при его моделировании учитывать обе возможности.

Приняв все известные экспериментальные факты, незамещенные алкилкобалокси-мы можно исключить из числа моделей аденозилкобаламина. Если принять, что активация 5'-дезоксиаденозильного лиганда происходит в результате протонирования атома кислорода в цикле рибофуранозильного фрагмента, то механизм активации органического лиганда в кобамидном коферменте I можно изобразить схемой 3, центральное место в которой занимает ион карбония II. н

Ad J>

Y -сн2

4 6 но он L-B

Со]

IV

- корриновый макроцикл; Nuc: ОН, OR', OCOR"; R: CH(OH)CH(OH)CH(OH)Ad. 1.2 Синтез и исследование функционально-замещенных алкил- и алкенилко-балоксимов. 1.2.1 Синтез ft-замещенных апшпкобапоксимов с применением хпоргид-ринов олефинов или их ацетатов. Для синтеза p-гидроксизамещенных алкилкобалокснгснгон (Со) = (Со1) + С1СНгСНгОН ---(Со)

11 I I

Ру Р« Ру

Ру ) экваториальный бис (диметилглиоксиматный) лиганд (планарный) симов в работе разработан метод апкилирования нукпеофильного комплекса одновалентного кобальта (супернуклеофипьного кобалоксима, кобалоксимаэ) хлоргидринами олефинов или их ацетатами. Этим способом были получены органокобалоксимы как с линейным органическим лигандом [например соединение I и 2.5-дигидроксипентил(пири-дин)кобалоксим (II)], так и кобальт-содержащий циклический эфир (соединение IV, схема 2). SSi^t (СО) *- И—*», . Щ

Ри

Можно предположить, что стабилизация последнего должна происходить в результате нукпеофильной атаки (скорее всего молекулы воды, спиртового или карбоксильного остатка эпофермента) с образованием 2-О-замещенного апкилкобаламина, либо в ре

4 3 ■ > зультате окислительно-восстановительного'образования замещенного винилкобаламина (Предварительные замечания, схема 3). Отсюда модельное изучение кобамид-эависимо-го катализа сводится к изучению взаимопревращений кобалоксимов - аналогов изображенных на той же схеме кобаламинов в окислительно-восстановительных условиях.

Анализ изложенных результатов заставляет сделать вывод, что 2-гидроксиалкилко-балоксимы в условиях кислотного катализа образуют переходное состояние с ослабленной связью Со-С и одновременно приобретается частичная двоесвязность между а- и (3-атомами углерода органического лиганда. Если главный вклад в этот эффект вносит взаимодействие d-орбиталей кобальта с органическим лигандом, то в геометрии переходного состояния оба атома органического лиганда (Са и Ср) должны занимать равноценное положение ("|3-эффект", Green), если же преобладает эффект взаимодействия органического лиганда с экваториальным, то явление описывается в терминах "вертикальной стабилизации" (Traylor).

Ослабление связи С-0 при протонировании 2-гидроксиалкилкобалоксимов свидетельствует о склонности этих соединений к сольволитическим превращениям (нуклео-фильное замещение по механизму Sni). В работе на примере 2-гидроксиэтилкобалокси

CH^HsOR СНгСНгОН GHjCHsOCOR

CO) ^L (Jo) (Со) (з)

J I 1

Ру Ру Ру ма на препаративном уровне разработан способ нуклеофильного замещения с участием О-нуклеофилов (спиртов и карбоновых киспот) (схема 3). Показано, что наилучшие результаты достигаются при катализе жесткими кислотами (Бренстеда: CF3CO2H, АсОН, HCIO4, H2SO4, HBF4 или Льюиса: BFs.EfeO, SbCis), выход понижается в присутствии кислот Льюиса промежуточного типа (ZnCfe) и падает практически до нуля при использовании мягкой кислоты Льюиса (НдСЬ)

Эти наблюдения однозначно указывают на сольволитическим характер быстрого превращения. Если сольволиз. протекает по механизму Sm, это значит, что в качестве интермедиата реакции выступает ион карбония. Для него в общем случае можно принять структуру с прочной связью Со-С (А) или ослабленной связью Со-С в результате р-эффекта (структура В) или эффекта вертикальной стабилизации (структура С, схема 4).

В работе заряженному интермедиату сольволиза приписывается структура иона карбония без + делокализа- fH*CH R сн^с

ЦИИ СВЯЗИ Со- <Со| '(Со)

С (структура Ру 1у

А). Впервые а в здесь удалось зафиксировать промежуточный катион А путем его стабилизации комплексным анионом. При обработке 2-гидроксиэтил(пиридин)кобалоксима трифенилметилгексахло-рантимонатом или двумя эквивалентами пятихлористой сурьмы был выделен ион карбония A (R=H) в виде желтого или светлокоричневого вещества. Желтая форма легко превращается в парамагнитную светлокоричневую форму при переосаждении ее раствора в хлористом метилене или хлороформе из петролейного эфира. Обе формы по элементному составу отвечают структуре V, однако не образуют метилового эфира при взаимодействии с метилатом натрия. Вместо этого наблюдается элиминирование органического лиганда. Катионный комплекс А не склонен к депротонированию с образованием а-олефинового комплекса F (схема 4). На это указывает отсутствие дейтерообмена при алкоголизе 2-ацетоксиэтил(пиридин)кобалоксима в среде дейтероуксусной кислоты-сЦ. С

CHR

CRfl Crt=CHR I f (4.

Ру Ру другой стороны, и а-олефиновый кобалоксим не склонен к присоединению протона. По данным ПМР, транс-карбоксибутен-1-(пиридин)кобалоксим (VI) в течение нескольких дней не подвергался какому-либо превращению в растворе безводной трифторуксусной кислоты, тогда как в водной трифторуксусной кислоте в течение нескольких минут происходит распад комплекса VI с высвобождением 4-пентеновой кислоты. В случае прото-нирования ненасыщенного пиганда в соединении VI следовало ожидать превращения катионного комплекса VII либо в лакгон VIII, либо в равновесную смесь транс- и цис-изомеров VI и IX (схема 8). cf;,co7h с=с! н (СН2)СОгН | | н н <8>

СН2=СН(СНг)2СОгН ■* Н2° (to) (Со) (L)W°,H

К 1> У 1>У

V1 VIII IX

Следует подчеркнуть, что во всех исследованных в работе случаях сольволитичес-кое превращение конкурировало с распадом 2-замещенных алкилкобалоксимов (как исходных соединений, так и конечных продуктов). Поэтому при увеличении продолжительности проведения реакции выходы уменьшались вплоть до нуля. Это обстоятельство не позволяет провести сольволиз с количественным выходом, несмотря на легкость протекания этих реакций. Конкурирурующий кислотный распад становится единственным наблюдаемым превращением при условии эффективного нуклеофильного содействия в духе схемы 9.

Механизм превращения |}-гидроксиалкильных комплексов кобальта(Ш) и их эфиров под действием кислотных катализаторов обсуждается здесь и в литературе в терминах гетеролитических реакций. На самом деле схема механизмов сольволитических превращений и конкурирующих с ними реакций распада может иметь более сложный характер и у-нт

Со)

Ру "roh

CH>CHj I

Со) Ру

СН2СН2 Ру й =5=s= (Со) -(Со) (9>

Ру | сн2=сн2 I

Nuc "uc включать стадии переноса электрона. Об этом свидетельствует сделанное здесь наблюдение парамагнитной формы интермедиата, иона карбония V, и литературные наблюдения по кислотному превращению 2-гидроксиалкильных комплексов кобальта.

1.2.2 Синтез fl-замещенных алкилкобалоксимов в результате гидроксикобальти-рования некоторых олефинов. В диссертации разработаны три независимых варианта использования виниловых эфиров для алкилирования электрофильных неорганических соединений кобальта. Сверх того удалось экспериментально доказать, что усилить нук-леофильность олефина можно не только в результате сопряжения двойной связи с п-электронами кислорода, но и в результате эффекта анхимерного содействия гетероато-ма в (о-О-замещенных олефинах.

1.2.3 Замещение олефином органического лиганда. Здесь впервые обнаружено, что 2-гидроксиэтил(пиридин)кобалоксим и его простые и сложные эфиры вступают в реакцию обмена органического лиганда (переалкилирование) с двумя типами обсуждавшихся олефинов (схема 18). rv-^x

СН,СНО U о/Ч х= н2, о

Реакция в отсутствие катализатора не идет. Роль катализатора могут выполнять сос°> - «*> -(fc0) (18)

Ру х=н2,о ^ х=н2,о £ ли ртути, но гораздо более удобны в этом качестве сильные кислоты: хлорная, серная, борфтористоводородная или пятихлористая сурьма.

Реакция переалкилирования связана конкурентными отношениями как с известной реакцией распада р-О-замещенных кобальторганических хелатов под действием минеральных кислот, так и с их сольволитическими превращениями (сравни со схемой 9).

СНгСНгСНгСНО х ^НгСКгОЙ (?> JL р, ■*- р<

Если принять, что в промежуточном ионе карбония имеется только один реакционный центр - в положении 2 органического лиганда,- то в таком случае присоединение этого карбкатиона к испытанным олефинам должно было бы привести к соединениям с новой связью С-С (схема 19). В действительности ни этих соединений, ни продуктов их превращения обнаружить не удалось. Хороший акцептор ионов карбония, трихлорэтилен, тоже не присоединяется к заряженному интермедиату реакции. Необычная устойчивость промежуточного первичного иона карбония (сравним с трифенилкарбонием) и его неспособность образовывать продукты С-С присоединения являются отличительным признаком этого неклассического иона карбония.

1.2.4 Нуклеофильное содействие анионом. Для дальнейшего обсуждения важно, что основный лиганд В в 1.6-органокобалоксимах под влиянием органического лиганда (транс-эффект) становится лабильным в кинетическом и термодинамическом смысле. Присутствующий в системе анион играет важную роль в контроле характера химического поведения 2-О-замещенного органического лиганда в условиях кислотного катализа. Дополнительная информация по этому поводу была получена при изучении 2-гидрокси-3-хлорпропил(пиридин)кобалоксима (XVIII) и его ацетата XIX. Синтез этих соединений проводили взаимодействием кобалоксимаз с эпихлоргидрином и последующим ацетили-рованием спиртовой группы органокобалоксима XVIII смесью уксусного ангидрида с пиридином (схема 25).

CHjCHCIfcCI IjttiCJHCHzCI Г . бНг-^НСНгС! (<роЭ 0Н (^)ОАс (25) ру Ру Ру

XVIII Х|Х

Для выделенного из реакционной смеси в качестве единственного продукта органокобалоксима и полученного из него ацетата методом ШР однозначно было установлено строение 2-гидрокси-3-хлорпролил(пиридин)кобалоксима (XVIII) и его ацетата XIX. Оба соединения оказались неактивными в реакции метанолиза при использовании в качестве катализатора кислот Бренстеда и Льюиса, мягких и жестких. В связи с наличием в коба-локсимах XVIII и XIX нескольких реакционных центров предоставилась возможность рассмотреть селективность их взаимодействия с нуклесфильными агентами. В контрольных опытах с точно рассчитанным количеством этилата натрия не удалось наблюдать образования кобальторганического эпоксида ни из ацетата XIX, ни из хлоргидирина XVIII. Во всех опытах в зависимости от количества взятого этилата наблюдалось частичное или полное разрушение исходного соединения. Аналогичный результат, показавший, что реакция с разрывом связи Со-С является единственным наблюдаемым процессом, был получен и с другими нуклеофильными агентами: цианидом или о-нитротиофенолятом натрия. Контроль с помощью ТСХ показал, что полный распад ацетата XIX происходит при воздействии одного эквивалента этилата (практически сразу после смешивания реагентов) или цианада (спустя 2 часа). Реакция с о-нитротиофенолятом протекает в 2-2.7 раза медленнее, чем с цианидом, но и в этом случае для полного распада органокобалоксима было достаточно одного эквивалента реагента. В последнем случае было также отмечено образование заметного количества дисульфида. Органический лиганд ацетата XIX в этих реакциях превращался в хлористый алпил. Это соединение было идентифицировано в виде о-нитрофенилаллилсульфида.

Образование хлористого аллила можно объяснить первоначальной атакой нуклео-фильного агента по реакционному центру на кобальте согласно схеме 26. Перенос заря

CHjj- Cf-1^ ОАс Рщ XIX + «и<Г -» (Со) CHjCI -k (Со) * СН 2=СНСН гС1 (гб) р, Ь^ч I

Nuc Nuc да на кобальт с нуклеофипа сопровождается разрывом связи Со-С и эпимини+ованием ацетата (хорошая уходящая группа).

Существенно, что разрыв связи Со-С в обоих органокобалоксимах XVIII и XIX происходит в результате замещения основного лиганда (пиридина) несущим заряд нуклеофи-лом. Поскольку это замещение должно протекать по механизму Sni, нуклеофильный агент атакует кобальт в пятикоординационном состоянии. А такой промежуточный комплекс, как это было показано в литературе, принадлежит к классу мягких кислот. Использованные нуклеофипьные агенты в порядке возрастания сродства к мягкой кислоте располагаются в порядке: ЕЮ <CN <o-N02C6H4S" Однако согласно проведенным наблюдениям о динамике накопления продуктов скорость распада ацетата XIX - наибольшая в реакции с этилатом и наименьшая - в реакции с о-нитротиофенолятом. Если считать, что образование связи кобальта с нуклеофильным агентом и разрыв связей Со-С и С-0 происходят синхронно (схема 26), то следует ожидать обратного соотношения скоростей. Отсюда изображенный на схеме анионный комплекс является промежуточным соединением. Возможность реализации анионных комплексов обсуждаемого типа должна определяться способом связывания заряженного нуклеофипа с кобальтом. Связь мягкого основания с кобальтом(Ш) определяется как сумма ст-донорного и я-акцепторного его вкладов. Этилат-анион (жесткое основание) функционирует только как сг-донор. Отсюда его присоединение к кобальту происходит либо синхронно с разрывом связи Со-С, либо с временем жизни промежуточного комплекса, меньшем, чем в случае атаки анионом-мягким основанием, тогда как цианид и о-нитротиофенолят (мягкие основания) определенно обнаруживают способность к образованию промежуточного анионного комплекса, время жизни которого зависит от природы выбранного нуклеофила.

Приведенные факты 10провергают предложенный механизм образования ацеталь-дегида из кобальторганического соединения с карбонатом этиленгликоля в качестве органического лиганда (Finke, 1983) и 2)являются модельным экспериментальным обоснованием активации кофермента в ходе реакции изомеризации попифункционапьных субстратов. Основные черты механизма активации: гетеролитический характер процесса, в ходе которого происходит разрыв связи С-0 в р-положении органического лиганда, и участие в этом процессе заряженной нуклеофильной группы апофермента, скорее всего сульфгидрильной.

1.2.5 Синтез и исследование функционально-замещенных апкенилкобалоксимов. Установление механизма участия сульфгидрильной группы в металкобаламин-зависи-мых реакциях подтверждает представление, которое Lloyd Ingraham высказал еще в 1964 г. о том, что кобамидные коферменты в энзиматических реакциях ведут себя как биологические реактивы Гриньяра. Однако эта аналогия не вполне точна. Если при активации меркаптаном метилкобаламина нуклеофильная метильная группа скорее всего переносится на тот или иной субстрат в синхронном процессе, то в случае 5 -дезокси-аденозилкобапамина более вероятен ступенчатый процесс первоначальной активации кофермента с фиксацией кобаламинаг. Последний далее может выступать как нуклео-фил или донор одного или двух электронов. В этой связи представляет интерес любая новая информация об особенностях поведения кобаламина.; и его более простых моделей.

В работе проведено сравнение кобалоксима5 с другими нуклеофилами, мягкими и жесткими основаниями. Хорошим тестом можно считать взаимодействие нукпеофилов с полигалогенидами. В зависимости от специфики нуклеофила он может принять предпочтительное участие в одной из трех реакций: элиминирования галогена, элиминирования галогенводорода или реакции замещения. Известно, что кобаламин3 вступает в реакцию с 1,2-дибромэтаном, приводящую к образованию этилена. В данной работе установлено, что взаимодействие кобалоксима5 с 1.2-дихлорэтаном приводит к образованию этилена и 1.6-хлор(пиридин)кобалоксима. Элиминирование галогена в качестве единственного направления превращения было зафиксировано и при проведении реакции между ка-лий(пиридин)бис(диметилглиоксимато)кобальтом(1) и дихлорэтаном в среде тетрагидро-фурана. Таким образом в этой тест-системе кобалоксим3 показал себя аналогом кобала-MHHas.

Более сложный характер имеет взаимодействие кобалоксимээ с 1.1,2.3-тетрабром-этаном в водно-метанольном растворе едкого натра. В согласии с предыдущим можно было ожидать, что после дебромирования продует этой реакции, 1.3-дибромпропен, проалкилирует избыток кобапоксима$ с образованием кобальторганического бромида ал-лильного типа (схема 29). Из реакционной смеси действительно был выделен 1,6-бром-(пиридин)кобалоксим, но полученный кобальторганический комплекс го анализу брома не содержал. Этот неожиданный результат побудил исследовать взаимодействие 1.1,2.3-тетрабромпрогана с другими нуклеофилами. Оказалось, что его взаимодействие с о-нитротиофенолятом (молярное соотношение реагентов 1:3) с высоким выходом приводит к образованию двух изомерных бромсульфидов, 2.2'-динитродифенилдисульфида и неорганического бромида. Как показали дополнительные опыты, по той же схеме, что и о-нитротиофенолят, реагируют с 1.1.2.3-тетрабромпропаном и другие мягкие основания: иодид и тиомочевина. Т.о. взаимодействие трех дополнительно исследованных нукпео-филов-мягких оснований с 1.1.2.3-тетрабромпропаном приводит к одному и тому же результату - образованию замещенного в положение 3 1-бромпропена-1. Нет оснований считать, что взаимодействие кобалоксима$ с тем же тетрабромидом будет протекать по принципиально иной схеме. Ведь комплексное соединение одновалентного кобальта -это тоже мягкое основание. Скорее всего, постулированный продукт реакции, кобальторганический бромид аллильного типа (схема 29), недостаточно стабилен и в условиях реакции превращается в более стабильное соединение. Для проверки этого предположения Ko6anoKCMMs ввели в реакцию с заранее приготовленной смесью цис- и трансизомерных 1.3-дибромпропенов. И в этом случае не удалось наблюдать образования кобальторганического бромида, продукт реакции по элементному составу, по всем своим спектральным характеристикам и хроматографическому поведению оказался полностью идентичным продукту реакции кобалоксима5 с 1.1.2.3-тетрабромпропаном. На основании всех полученных характеристик для этого соединения однозначно была установлена структурная формула транс-[3-метоксиметилвинил(пиридин)кобалоксима. При проведении реакции в среде водного этанола или трет.-бутанола вместо метилового спирта были выделены, соответственно, этиловый и трет.-бутиловый кобальторганические эфиры

Вг I

Со) + ВгСН=СНСН2Вг

- Г СН,СН=СНВг

С I

Со)

Br" ^ (29) в сочетании с неэтерифицированной формой кобальторганического спирта (схема 31). н сн2оп н сн 2осн з fr г в™'он ?=Н тин f"н (,,» lv°) + BrCH=CHCH —(to) » (fci) cnf Py cff5^ Py

BrCH=CHCH gBr -(Co) (Coj

• '„„и;,, з

Из спектральных особенностей синтезированных кобалоксимов винильного типа отметим сильное смещение полосы vc=c в низкочастотную область по сравнению с аналогичной полосой для ст-аллилкобалоксима и значение константы спин-спинового взаимодействия олефиновых протонов Jhh 13.5 гц, свидетельствующее об их транс-расположении и подтвержденное данными по расщеплению сигналов олефиновых протонов на 31Р. Отсюда взаимодействие 1.3-дибромпропена с кобалоксимомв в отличие от его реакций с другими испытанными нуклеофилами - мягкими основаниями - не заканчивается образованием замещенного на нуклеофил бромида аллильного типа, а включает его перегруппировку с участием еще одного нуклеофила -молекулы гидроксилсодержащего растворителя. Биполярный интермедиа! перегруппировки (как и при сольволитических превра-щениях 2-0-замещенных органокобалоксимов) может быть о' н описан двумя структурами, (G) (л-комплекс) или

Н) (а-комплекс). Этот (независимо от способа написания) катионный комплекс должен вступать в реакцию с нуклеофилами и приводить к тем же продуктам, которые и были обнаружены при проведении реакции в водно-спиртовых смесях.

1.2.6 Каталитическое окислительно-восстановительное превращение этилен-гликоля, индуцированное органокобалоксимом. При проведении взаимодействия коба-локсимаес 1.1.2.3-тетрабромпропаном или 1,3-дибромпропеном наблюдается качественно новое явление. На описанную реакцию изомеризации промежуточного 3-бромаллилн ch2or кобалоксима, приводящую к ожидаемым продуктам, спирту XXVa и моноэфиру этиленгликоля XXVb, накладывается каталитическое редокс-(Со) превращение этиленгликоля, приводящее к образованию смеси ацетона, углекислого газа и фракции насыщенных углеводородов. Аналити-r afV ческое определение ацетона указывает на прохождение не менее 3.5 cHjc'n2oH(b) каталитических циклов. Исследование плохо растворимого в воде и других растворителях остатка (шлама) не позволило обнаружить в нём предшественника мдентифицировнных продуктов типа ацетоуксусной кислоты, но из него были выделены 1.6-бромпиридинкобалоксим и диацетат диметилглиоксима. Последнее соединение служит маркёром редокс-превращения кобальтсодержащего катализатора. Поскольку в отдельно поставленных экспериментах было показано, что ни кобалоксим5, ни выделенные кобальторганические комплексы XXVa и XXVb не могут служить катализаторами редокс-превращения этиленгликоля, в качестве такого должен выступать ин-термедиат изомеризации, катионный я- или о-комплекс (G или Н).

Приведенный эксперимент подтверждает допущение о существенной роли восстановленных форм кобальта в кобамид-зависимом катализе превращения полифункциональных субстратов и иллюстрирует положение о том, что связь переходный металл-углерод не является слабой в силу своей природы и что ее разрыв определяется возможностью реализации того или иного конкретного химического механизма.

1.2.7 Заключительные замечания. Проделанный эксперимент в сочетании с литературными данными по изучению кобамид-зависимого катализа позволяет выдвинуть определенные соображения в отношении молекулярного механизма этого процесса.

А. Активация кофермента. Пока обсуждение этой проблемы сводилось к вопросу о прочности" связи Со-С, оно носило схоластический характер, что уводило дискуссию в сторону от рассмотрения сложной природы явления. Связь Со-С в коферментах и модельных соединениях безусловно носит ковалентный характер, но значительный вклад в ее резонансную стабилизацию вносят структуры с тремя степенями окисления кобальта:

CH2R ~CHiR ch2R +сн гП ft - ff ~ 'f

Это обстоятельство определяет легкую поляризуемость связи Со-С, что находит свое подтверждение в поведении метилкобаламина (при содействии SH группы) как биологического реактива Гриньяра в исследованных энзиматических механизмах. Есть основания говорить об общности механизмов метилкобаламин- и аденозилкобаламин-зависи-мых реакций. Эта аналогия стала еще более убедительной после обнаружения обмена водородом меаду коферментом и существенной сульфгидрильной группой в рибонукле-отидредуктазной реакции и распространения этого принципа и на этаноламиндезами-назную реакцию (Babior е.а., 1985). Другой убедительный аргумент в пользу подчиненности аденозилкобамид-зависимого катализа принципу Д.Грина - обнаружение активации этиладенильного аналога кофермента в виде аниона АСНгСНг", прочно связанного с ферментом [высвобождается только при денатурации (Fukui е.а., 1987)]. Эти и подобные аргументы в пользу гетеролитмческой схемы активации кофермента в ходе энзиматиче-ского катализа заставили сторонников гомолиза еще в 1979 г. признать, что "аденозил-кобамид-зависимый катализ ставит больше вопросов, чем получает ответов" (Babior). Действительно, на фоне появления все новых аргументов в пользу гетеролитической схемы активации кофермента все попытки экспериментально обосновать гемолитический катализ неизменно терпели неудачу. С химической точки зрения несостоятельным выглядит участие 5 -дезоксиаденозильного радикала в энзиматическом обмене водородом. Объяснение, согласно которому в биохимических схемах этот радикал стабилизируется в результате взаимодействия с апоферментом в белковом кармане, недоступном для кислорода, выглядит по меньшей мере странно. Вообще, сторонники гемолитического катализа слишком часто ссылаются на некие особые свойства фермента, что смахивает на обыкновенный обскурантизм. Не лишне вспомнить, что представление о гемолизе связи Со-С связи появилось по поводу необходимости обосновать внутрисферный механизм каталитической изомеризации, Но в серии блестящих экспериментов сам же Бэбьор доказал невозможность превращения субстрата, связанного с кобальтом. В рамках же гетеролитической схемы активации кофермента разрыв связи Со-С не является необходимостью. Вместо него вводится понятие о взаимопревращении а- и я-комплек-сов кобальта в разных валентных состояниях. Эта работа усиливает аргументацию в пользу гетеролитической схемы активации и служит экспериментальным обоснованием ее протекания как приэлектрофильном, так и нуклеофильном катализе.

Б. Роль основного и экваториального лигандов. Нуклеофильное содействие а ходе активации кобамидного кофермента в духе схемы 26 реализуется по механизму трансэффекта. Это означает необходимость замещения 5.6-диметилбензимидазольного ли-1 ганда в коферменте на заряженную функциональную группу апофермента. Изучение взаимодействия аденозилкобамида и его аналогов с апоферментом в различных энзиматических системах обнаружило большую предрасположенность кофермента к замещению основного лиганда. Было показано, что частично диссоциированное состояние 5.6-диметилбензимидазольного лиганда является обычным при образовании фермент-коферментного комплекса и что эта диссоциация может доходить до 100%.

Атомные радиусы железа и кобальта почти совпадают. Почему же для комплексиро-вания кобальта понадобился корриноид, если включение железа в комплекс с порфиринами было с успехом использовано природой для самых разнообразных целей? Необходимость включения в состав комплекса органического лиганда существа дела не меняет, так как кобальтпорфирины с успехом можно вводить в состав кобапьторганических соединений. По нашему мнению, главная причина заключается в необходимости обеспечить механизм активации органического лиганда в результате ориентированной фокусировки транспорта электронов, сопряженного с механизмом транс-атаки заряженным нук-леофильным агентом. Вот почему понадобилось нарушать цепь сопряжения в порфири-новом лиганде: в кобальт-зависимом катализе нет необходимости переносить электроны через плоскость экваториального лиганда, что крайне желательно при включении железа в биологические электронотранспортные цепи. Гибкость корриновых лигандов полезна для оптимальной координации кобальта в разных валентных состояниях и может иметь отношение к поляризации связи Со-С (эффект "дыбы"), но скорее всего все же имеет менее важное значение для катализа.

В. Активация субстрата. Установка исследователя на внутрисферный катализ на уровне модельного экспериментирования проявилась, пожалуй, еще более отчетливо, чем в биохимических исследованиях. Было предложено, да и сейчас продолжает появляться, немало кобапьторганических соединений в качестве моделей промежуточного г А превращения субстратов энзиматического ка-Т7 г тализа. Нельзя сомневаться, что изучение v химического превращения таких соединений р»с-1 уже внесло ценный вклад в развитие теории и практики гомогенного катализа. Однако от-сгутствуют какие-либо основания считать исследование этих соединений модельными. Напротив, трудами Coffman, Buettner, Pilbrow и других специалистов, изучавших методом ЭПР так называемые "дублетные" спектры кобамид-зависимых энзиматических систем, показано, что парамагнитная форма кобальта в коферменте находится в состоянии магнитного диполь-дипольного взаимодействия с точечным объектом, удаленным от него на расстояние не менее, чем 9.9 А0. Определены не только расстояние R, но и другие параметры взаимодействующей системы (рис. 1). Таким образом, получено прямое экспериментальное доказательство внешнесферного механизма катализа. Удивительно, но этот вывод из биохимических исследований середины и второй половины семидесятых годов ничего не изменил в методологии последующих химических разработок.

Г. Роль апофермента. Взаимодействие кофермента с апоферментом, приводящее к связыванию, - необходимое условие подготовки его к впючению в катализ. Участие функциональных групп белка во взаимодействии с коферментом, в частности в координации с кобальтом, может отражать и более непосредственное участие апофермента в катализе. В многочисленных работах (до 1980 г, не менее шестнадцати) установлено существенное значение сульфгидрильной группы в катализе. Данные спектральных исследований подтверждают, что связанный с апоферментом кобамидг находится скорее в шестикоор-динационном состоянии, чем пятикоординационном, и что в качестве шестого лиганда не исключена SH группа апофермента.

Д. Роль процессов трансдукции электронов в катализе. Парамагнитный сигнал может появиться не только вследствие гемолитического разрыва связи Со-С, но и как результат участия кобальта в окислительно-восстановительных превращениях. Этим объясняется интерес не только химиков, но и электрохимиков, к моделированию кобамид-зависимого катализа. Возможность участия комплексных соединений кобальта в реакциях трансдукции электрона надежно установлена.

Важное значение сульфгидрильной группы апофермента в кобамид-зависимом ка

4I"V ' тализе может определяться, в частности, и ее участием в процессах трансдукции электрона. Эта функция с полной определенностью установлена для рибонуклеотидредуктаз-ной реакции. В этой роли сульфгидрильные группы переносят электроны от восстановленного тиоредоксина или дигидролипоевой кислоты к акцептору электронов - нуклео-тидтрифосфату. Сравнительно недавно (Gerafen е.а., 1996) исследование кинетики появления тиильного радикала и кобаламинаг в рибонуклеотидредуктазной реакции методом ЭПР позволило установить сопряженный характер этого явления. А это позволяет говорить об экспериментальном обосновании электронного обмена между меркаптанами и кобамидным коферментом. Еще ранее возможность включения такой стадии в энзима-тический катализ была экспериментально обоснована в системе модельного изучения продуктов и кинетики окисления тиолов в растворе молекулярным кислородом при каталитическом участии кобаламинов и кобинамидов (Brown е.а., 1984). Оказалось, что органические комплексы кобальта с дезоксиаденозильным или метильным лигандом способны катализировать окисление 2-меркаптоэтанола или дитиоэритритола в темновой реакции, приводящей к образованию дисульфида и пероксида водорода. В слабощелочном растворе скорость реакции пропорциональна концентрации катализатора. На возможность координации тиола с кобальтом указывает понижение скорости окисления с увеличением стерической затрудненности достижения аксиального положения координации.

Эти данные позволяют включить стадии переноса электрона в механизм кобамид-зависимой изомеризации, в ходе которой происходит обмен водородом между Су-положением дезоксиаденозильного лиганда и субстратом или продуктом. По сумме изложенных данных кобамид-зависимые реакции выглядят как внешнесферный процесс, в ходе которого происходит активация кофермента путем превращения исходного ст-комплекса в тт-комплекс. Поскольку изучение модельных кобалоксимов и кобаламинов (раздел 1.2.1) показало значительный вклад в резонансную стабилизацию гс-комплекса иона Co(lll) граничной структуры с положительным зарядом, локализованным в р-положении органического лиганда, для простоты изображениятакая структура (К) и будет далее фигурировать в схемах. Представленный здесь эксперимент обосновывает включение в схему кобальт-зависимого превращения полифункциональных субстратов двух активированных форм катализатора, иона карбония (К) и ст-комплекса винильного типа (М). Уже была экспериментально обоснована невозможность их взаимопревращения в результате простого процесса протонирования-депротонирования. Но необходимость включения в катализ стадий переноса электрона переводит взаимопревращения К с М в разряд реальных согласно схеме 33. Схема не включает механизм превращения субстрата в виду почти полного отсутствия информации, химической и биохимической, о способах активации различных [со)сн гснп . e - (Co)CH= chr субстратов и их вош - <Г м влечении во внешнесферный катализ.

Исключением служит единственное указание (Babior е.а., 1985) на то, что перенос водорода на субстрат в механизме этаноламин-аммиакпиазы включает второй интермедиат переноса водорода в дополнение к коферменту. Обмен водородом с этим интермедиа-том, так же как и с субстратом, не сопровождается переходом метки в воду. Взаимопревращения Co(lll) с Со(1) допускают и двухэлектронные переходы. Наложение двухэлек-тронных процессов на одноэлекгронные усложняют схему 33 в результате введения в нее еще двух интермедиатов, аниона (Р) и анион-радикала (О), и семи дополнительных fcojcit aCHR * ■ (Со)СН gCHR к - е" l rfW rf II • rf (зз) путей взаимоперехода (схема 34). Как можно видеть, в схеме фигурируют три формы катализатора, несущие неспаренный электрон, который может быть локализован целиком или в большей степени на кобальте. В этой части схема теоретически обосновывает экспериментально наблюдаемую парамагнитную форму кофермента в ходе энзиматиче-ского катализа. Иными словами связывать наблюдение парамагнитного сигнала в биологической системе исключительно с гемолитическим механизмом активации кофермента

Co)CHiCHR Р было бы, по крайней мере, наивно. Сложность итоговой схемы 34 не позволяет предложить какой-то вполне конкретный вариант для реально наблюдаемого катализа. Но можно с уверенностью утверждать, что и обнаруженная в этой работе каталитическая реакция, и кобамид-зависимые превращения должны описываться фрагментами схемы 34, причем для разных случаев кобамид-зависимого катализа эти фрагменты вовсе не обязаны совпадать.

Е. Практический аспект исследования. Изучение кобамид-зависимого катализа наталкивает на мысль о важной роли кобальта в процессах биологического одноэлектрон-ного переноса. Это соображение вполне соответствует тому, что редокс-потенциал пары Со(Н1)ГСо(Н) в составе комплексов находится в пределах изменений нормального редокс-потенциапа клетки (от -200 до 400 мВ). Это свойство кобальта может найти применение (и такие попытки уже предпринимаются) для разработки комплексных соединений кобальта, имеющих медицинское значение. Такие комплексные соединения кобальта(Ш) можно рассматривать как пропекарства-предшественники металла или фармакологически активного лиганда. Нехелатирующие или спабо координирующие лекарства, в свою очередь, могут быть встроены в состав экваториального или аксиального лиганда. С этой точки зрения особенно перспективны (3-замещенные органокобалоксимы или родственные структуры типа XXVI. Функционально-замещенные фармакологически активные агенты (спирты, кислоты, амины) можно вводить в состав заместителя RX, но возможны и более сложные варианты с использованием заместителя R1. Напрашивается использовать комплексные соединения кобальта(Ш) в качестве гипоксия-селективных агентов, пригодных для лечения любых типов солидных опухолей. Проявсн2снк Юо) в xxvi x: о, im, s red red '

V / н,о

Co(lll)L6 ^ ■ Co(ll]Lj -fc- Co(ll)(H20), + 6 L (35)

02- 03 ление цитотоксической активности этими агентами основано на их нестабильности в анаэробных условиях гипоксической зоны опухоли. При этом происходит высвобождение иона металла (индуктор окислительного стресса) и специально введенного в состав комплекса цитостатика (схема 35). В качестве подходящих цитостатических лигандов предложены варианты азотистого иприта. При координации этих аминов в результате элек-тронооттягивающего эффекта иона Со(Ш) элекгрофильность этих агентов подавляется, а распад комплексного соединения означает их электрофильную активацию.

2 модельное изучение редокс-участия соединений двухвалентной серы в механизмах биологического транспорта

2.1 Предварительные замечания. Среди элементов, входящих в состав живой клетки, центральное место в процессах жизнедеятельности принадлежит сере (наряду с фосфором). Уникальность положения серы (и фосфора) среди основных биогенных элементов находит свое толкование с позиций различия в эффективных размерах валентных s- и р-орбиталей этих элементов. Ковалентный радиус серы(Н) составляет 1.04 А0, что на 30-40% превышает значения (0.66-0.77 А0) для С, N и О, основных элементов, участвующих в построении молекул живой клетки. Значительная длина ковалентных связей с участием серы(П) при высокой поляризуемости делает ее чувствительной к химическим воздействиям и позволяет понять, почему сера (наряду с фосфором) занимает центральное место среди биогенных элементов в процессах химического переноса групп. С другой стороны, среди главных биоэлементов сера выделяется низким потенциалом ионизации, а это обстоятельство уже позволяет ей играть центральную роль в процессах переноса электронов и трансформации энергии. Электроотрицательность серы(Н) в значительной мере определяется атомом, участвующим в образовании химической связи с ней. Поэтому сера в двухвалентном состоянии выступает в химических реакциях в качестве электрофильного, радикального или нуклеофильного центра, а также донора или акцептора одного или пары электронов в процессах их трансдукции.

Уже кобамид-зависимый катализ, как можно было видеть, подводит исследователя к вопросу о роли соединений двухвалентной серы в механизмах биологического транспорта электронов, в частности, в реакциях сопряжённого редокс-катализа.

В работе поставлена задача - на простой химической модели вскрыть многозначность поведения органических соединений серы в качестве электрофила, нуклеофила или участника гемолитических процессов в зависимости от редокс-потенциала окружающей среды. Это означает, что соединение RSX в зависимости от условий может быть донором нуклеофильных частиц (X ), свободных радикалов (X*) или электрофильных частиц (X*):

RS-X I гын (Ох)

RSH + Х RSSR +■ х" tRS+l + X"

Группа SH биогенного тиола в результате ее обратимого окисления согласно схеме 36 может выполнять функцию каталитического переноса электрофильного остатка на нуклеофильный центр. Ближайшим прототипом такого редокс-ацилирования могут служить варианты нерибосомального ацилирования, представленные неэнзиматическим переносом ацильного остатка на О- и N-нуклеофильные центры белков, полипептидов и ксенобиотиков. Можно указать и на другие известные примеры редокс-участия серы. Яркий пример - явление трансформации - качественного изменения каталитической активности фермента (В.З.Горкин). Ответственность за трансформацию несет окисление существенной сульфгидрильной группы фермента до сульфенильной. н е гн* • г е гн • ге

JL bs-u« . ее-он и . е-.

0-5ft»4^SR • И—N«t J н- • е

• е ы НгО

-гн . гв"

Ef-Nuc

-Н* • «,-► НгО

Nac: Н^ . OR. OCOR; Et OCOR, Alk

Другой интересный пример может иметь отношение к разрешению известного парадокса теории химического канцерогенеза. Его можно сформулировать так: как конечному (ultimate) канцерогену, образованному из попицикпического ароматического углеводорода (ПАУ), удается достичь своей биомишени, О < Nс/мр. < Парой- < S(ll)

ДНК ядра, не растратив Sni —-Sn2 (37) своего химического потенциала на колоссальной по молекулярным масштабам дистанции от места своего образования в мембранных структурах? Канцерогенные метаболиты ПАУ - это элекгро-фильные частицы бензильного типа, которые согласно теории ЖМКО относятся к категории мягких кислот. По данным разных исследовательских групп, от 94 до 98% метаболитов ПАУ, связанных с биологическими молекулами, представлены конъюгатами с белками. Все нуклеофильные центры белков условно можно разделить на четыре категории: центры на кислороде, центры на азоте в составе алифатических остатков, центры на азоте гетероциклов ароматического характера и центры на сере(И) (схема 37). Будучи мягкими кислотами электрофильные метаболиты ПАУ предпочтительно реагируют с реакционными центрами белков, представленными мягкими основаниями (в основном серой). Одновременно возникает меньшая фракция О- и N-конъюгатов, но эта фракция сопьволитически активна (процесс Sni). Поэтому в условиях термодинамического равновесия должно происходить перераспределение конъюгатов разного типа в пользу S-конъюгтов. Последние, являясь стабильными соединениями, могут транспортироваться на большие расстояния. Если существует механизм активации S-конъюгатов, тогда возможен перенос конечного канцерогена от места его образования до ДНК по эстафетному механизму, от одного белка к другому по цепочке. Таким же способом могут преодолеваться и мембранные структуры. Наиболее вероятный способ активации белковых S-конъюгатов - включение этой стадии в механизм переноса остатка канцерогена, сопряженный с трансдукцией электронов. Возможны несколько вариантов. Они могут быть реализованы либо в условиях окислительного стресса, либо при шунтировании S-конъю-гатом электронотранспортных цепей, либо в энзиматических реакциях. Из пяти вариантов лишь один - восстановительный, остальные - окислительные:

1) Процесс с анион-радикалом РгЭ'ХНгАг в качестве интермедиата.

2) Одноэлектронное окисление через катион-радикал PrS+*CH2Ar, любой вариант

Л г? распада которого рождает повреждающую частицу канцерогена.

3) Двухэлектронное окисление через сульфоксид PrS(0)CH2Ar (схема 40). о

PtSCHiAr-PiSCHiAr --—PrSOH * АгСНг (40) „

Окислительная активация может происходить и при анхимерном содействии соседней сульфгидрильной группы, более чувствительной к окислению, чем тиоэфирная. И в этом случае возможны два варианта.

4) Одноэлектронное окисление (схема 41).

PiSCHsAr-- Pi^SCHjAr -к pi—S ■ АгСНг ( ч е-*"* U- W <4,)

5) Двухэлектронное окисление (схема 42).

В двух последних случаях энзиматическая индукция весьма вероятна, поскольку можно назвать несколько ферментов, окисляющих тиолы.

PrSCHsAr -z- Рг-5СНгАг Pr-S ♦ АгСНг *

2.2 Разработка экспериментальной модели. Если на схеме 36 нуклеофильный остаток будет представлен остатком первичного или вторичного амина, а электрофиль-ный остаток - ацильным, то подлежащая изучению каталитическая система изобразится суммарным уравнением 43. На схеме 36 центральное место занимает реакция замещения сульфенильного остатка при нуклеофильном центре остатком карбоновой кислоты или алкилом. В соответствии с этим было предпринято изучение взаимодействия замещенных сульфенамидов с активированными производными карбоновых кислот: S

R'SH + red/ок u п 1.Л н + rcooh * >C0R + нг° (43; эфирами, ангидридами и хлорангидридами.

Групповой признак сульфеновых кислот и их производных - высокая лабильность, особенно при низких значениях рН. Поэтому для моделирования были выбраны наиболее стабильные сульфенамиды - производные ароматических сульфеновых кислот. В тонком органическом синтезе (особенно пептидном синтезе) сульфенирование свободной аминогруппы используют как прием ее временного блокирования. Снятие временной сульфенильной защиты достигается подкислением. Кинетически достоверный механизм активации связи S-N при подкислении включает стадию присоединения протона к основному центру молекулы сульфенамида с последующим высвобождением амина (схема

44). Согласно теории ЖМКО можно себе представить и другой способ активации - воздействие мягкого основания на другой реакционный центр молекулы, атом серы, (схема

45). По этой н+ ^ причине в ка- rs<^ -rs-m^ -v RSX + н< (44 > честве катали- и "" затора были выбраны соединения трехвалентного фосфора, а активирующий эффект этих соединений . в „ ,--,+ -, был вначале испы- -- -- [ rs-b] < (45) тан для случая в взаимодействия ароматических сульфенамидов с S-эфирами тиокарбоновых кислот.

В ходе наработки серии ароматических сульфенамидов удалось разработать улучшенный способ получения сульфенилхлоридов путем проведения синтеза в каталитическом варианте. Оказалось, что эффективными катализаторами хпоролиза ароматических дисульфидов сульфурилхлоридом могут служить трифенилфосфин, мочевина и амиды рСГ

ArSNR,R2 * R3COSR4 -» R3CONR1R2 + ArSSR4 (ад)

•SAr ~SR- 4 RCQN^ (50) карбоновых кислот.

Как показали предварительные опыты, сульфенамиды в отсутствие катализатора не реагируют с тиоэфирами. Но при внесении в реакционную систему 5-10 молярных процентов соединения трехвалентного фосфора (трифенилфосфин, трифенилфосфит, три-метилфосфит) реакция проходит до конца за 1.5-4 ч при 18-20°. Контроль методом ТСХ не обнаруживает никаких других продуктов реакции, кроме N-ацилированного амина и дисульфида (или фракции дисульфидов), при испытании 8 ароматических сульфенамидов и 7 S-эфиров тиокарбоновых кислот (схема 48). Реакция начинается атакой катализатора мягкой кислоты по центру на ато-ме серы в суфенамиде, которая завершается переносом двух электронов от фосфора на сульфенамид с образованием координационного соединения, соли фосфония, в качестве активного ин-термедиата. Т.о., катализатор увеличи- х ^ . вает поляри- ArSN., * :Р— =f== Ar|— N^ [ -PSArJ N^ (49) зацию связи р S(ll)-N вплоть xlx до ее ионизации (схема 49). Соль фосфония Далее ацилируется (схема 50). Кроме N-ацильного производного, на ^psAr этой стадии возникает новая соль фосфония, которая может либо распадаться с образованием эпектро-нейтральных продуктов, либо реагировать с другой молекулой исходного сульфенамида (схема 51).

Хотя взаимодей- г 1+ AlSt/ I it ствие моно- A,SSR' + |^sa,|sb- ^ [ >SA- ] < + ft'SSR' (si) сульфенамидов с S-эфирами тиокарбоновых кислот можно описать как гетеролитический процесс, участие в нем катализатора носит обратимый окислительно-восстановительный характер; в конечном счете электроположительный характер серы в сульфенамиде меняется на электронейтральный.

Затем в этой работе в реакции с сульфенамидами были испытаны ангидриды и хло-рангидриды карбоновых кислот. И в этих вариантах в отсутствие катализатора реакция не идет. Особенность реакции с линейными ангидридами (суммарное уравнение 52)

2 ArSN< + (RC0)2O + РХз -> ArSSAr + 0=РХз + 2 RCON< (52) заключается в том, что соединение трехвалентного фосфора, сохраняя функцию атива-тора связи S-N, одновременно выполняет дополнительную функцию акцептора кислорода из ангидрида. Именно это последнее обстоятельство позволяет в этом варианте аци-лирования использовать оба остатка карбоновой кислоты, входящей в состав ангидрида. На шести примерах реагенты расходовались полностью уже через 2-4 ч после их смешивания в подходящем растворителе при 18-20°. N-Ацилированные амины обычно удается выделить с выходом 90% и выше. а

Сочетание принципа активирующего взаимодействия мягкого основания с мягкой кислотой и акцепторной функцией катализатора по отношению к кислороду позволяет представить следующую последовательность элементарных превращений (схема 54).

О AISMC+ [x3PSAlpji^ 2)[x3PSAf] it + (ВСО) 20—"IXjPSArl OCOR + всолС

3) [XjPSAf] OCOR [ ХзРОСОвГSAl 4) [х 3POCOr] SAt-► XaP=0 + RCOSAi (54) s)[x3PSAt] H^t RCOSAi-1. RCOR(+[ X3PSAr] SAr б) [x 3PSAr] SAr s^» PX 3 t A1SSA1

Можно видеть, что соединение трехвалентного фосфора стехиометрически расходуется на стадии образования тиоэфира карбоновой кислоты (стадия 4). Этот промежуточный продукт удалось зафиксировать в реакционной смеси методом аналитической ТСХ. Согласно этим данным наблюдается нарастание содержания этого интермедиата по мере развития реакции, но после израсходования исходных соединений содержание тиоэфира в наблюдаемых продуктах падает до нуля.

Не менее успешно (на 8 гримерах выход после выделения 81-96%) протекает аци

2AfS«^ + 2RCOCI + PI13P --^ 2 RCOWl + ArSSAr + [ph»PCl] CI" feff) лирование сульфенамидов хлорангидридами карбоновых киспот (схема 55). В этом варианте ацилирования катализатор снова дополнительно выполняет акцепторную функцию. Однако, если вводить в реакционную смесь конкурирующий акцептор - олефин, ее можно вести в каталитическом режиме. Введение в реакцию еще более эффективного, чем тиоэфир и ангидрид, ацилирующего агента приводит к еще большему усложнению реакционной системы. Добавление олефина к реакционной смеси не только обнаруживает каталитический характер процесса, но и позволяет вывести из реакционной системы активный интермедиат, арилсульфенилхлорид, подавляя тем самым побочные реакции с его участием. Без применения олефинового акцептора не удается выделить N-ацильное производное с выходом выше 65-70%. В качестве акцептора удобно использовать добавку циклогексена ипи диаллилового эфира, который в избытке может служить и растворителем. Анализ выделенных адцуктов с олефином доказывает образование в реакционной смеси сульфенилхлорида.

Для подтверждения важной роли вклада основности аминокомпоненты в успех каталитического редокс-ацилирования были синтезированы сульфенированные амины с пониженной основностью из простейшего амина, аммиака. В соответствии с прогнозом производные аммиака с основностью, пониженной за счет введения двух электроноак-цепторных остатков, о-нитрофенилсульфенильного в (NPS)2NH или его комбинации с остатком никотиновой кислоты в З-PyCONHSPN, оказались неактивными в реакции с S-2-нитрофенил-3-пиридинкарботиоатом в ранее разработанных условиях в присутствии Ph3P.

В соответствии со схемой 49 мерой активации связи S-N в реакциях N-сульфе-нированных аминов с электрофильными агентами может служить потенциал двухэлек-тронного окисления основания-катализатора.

Побочное образование дисульфидов в данной работе подтверждается литературными данными о склонности сульфенамидов к участию в реакциях одноэлектронного переноса. Подчеркнем, что описанные здесь реакции проводились в отсутствие инициаторов гомопиза или облучения. Поэтому в качестве одноэлекгронных доноров и акцепторов в изученных системах наиболее вероятны амины и NPSCI. Стадия одноэлектронного переноса экспериментально подтверждена методом ЭПР при изучении взаимодействия сульфенилхлоридов с третичными аминами. Перенос электрона доказан и для взаимодействия сульфенилхлорида с сульфенамидом (Кнунянц и др., 1969). Т.о., правомерно рассматривать сульфенамиды не только в качестве участников биологических систем двухэлектронного переноса, но и в качестве доноров и акцепторов систем одно-электронного транспорта в духе схемы 62.

Система II

RSI< системен н

III синтез и исследование физиологически совместимых антиоксидантов

1 Предварительные замечания. Сырьевая база для разработки ФСАО медицинского назначения достаточна широка. Она представлена витаминами, микроэлементами и другими минорными компонентами пищи, наличие которых в диете не носит облигат-ный характер. Изучение состава активного начала лекарственных растений, как правило, позволяет идентифицировать фенольную фракцию, а среди ее главных представителей - флавоноиды и кумарины.По своему фармакологическому потенциалу эти две группы природных АО вполне сопоставимы.

При разработке АО медицинского назначения главным можно считать достижение максимальной физиологической совместимости в пределах структурной модификации, выявляющей антиоксидантный потенциал. Отсюда и отбор синтезированных соединений на биологические испытания, ориентированный только на признак АО активности, совершенно недостаточен. Универсальной системой отбора можно считать систему in vitro, основанную на комбинации двух показателей: хорошего хемопротекторного индекса по отношению к культуре нормальных клеток в сочетании с убедительным цитотоксическим показателем по отношению к культуре трансформированных клеток. Сопоставление даже в ряду фенолов только с витамином Е совершенно недостаточно, хотя бы потому, что в клетке витамин Е выполняет специализированную функцию, к тому же в комбинации с аскорбатом.

Простейший кумарин (I) в химических тест-системах АО активности не обнаруживает, но приобретает ее в биологическом окружении. Причиной этого может быть либо способность ацилировать белки, что сопровождается высвобождением фенольного гидрок-сила, либо быстрый метаболизм с участием микросомальных систем гидроксилирова-ния. Идентифицированы все 6 возможных продуктов гидроксилирования кумарина (I), среди которых преобладают 3-гидроксикумарин и 7-гидроксикумарин (умбеллиферон). По этой причине любой фармакологически активный кумарин можно рассматривать в качестве фенольного (енольного) АО или его предшественника.

2 Синтез и исследование АО в ряду кумаринов. Доступность кумаринов в сочетании с их способностью легко поддаваться химической трансформации позволяет рассматривать их в качестве превосходного синтона при разработке АО медицинского назначения. В частности, учитывая структурную близость кумаринов и витамина Е нетрудно наметить схемы химического перехода от кумаринов к аналогам витамина Е (II), включая водорастворимые формы (схема 1). С другой стороны, несложная химическая модификация может трансформировать кумарин (I) в жирорастворимые аналоги аскорбиновой л1.:: — еа « кумарин и его r2 производные " 1 "' можно рассматривать как удобный синтон для перехода к аналогам как жиро-, так и водорастворимых ви.гминов. Однако до сих пор систематических исследований в этом направлении не провожалось.

2.1 Кумаринозые iедуктоны алифатического типа. Родственные витамину С кумариновые редуктоны III известны в природе. Это - частично или полностью О-метили-рованные 3.4-дигидроксикумарины, З-амино-4-гидроксикумарин входит в качестве фрагмента в состав новобиоцина и других антибиотиков, известны и замещенные 4-меркэпто-кумарины. Эти данные заставляют предполагать хорошую физиологическую совместимость у кумариновых редуктонов-аналогов витамина С.

Если вводить комбинации трех гетероатомов (О, IM и S) в состав кумарина I в положения 3 и 4, то в общем случае возможны 9 типов алифатических кумариновых редукто-нов, из них в природных источниках обнаружены только два, 00 и N0. В данной работе разработаны методы синтеза пяти типов этих редуктонов.

2.1.1 Синтезы на основе 4-гидроксикумарина. 4-Гидроксикумарин - доступное продажное сырье, его можно также синтезировать в одну стадию из фенола и малоновой кислоты. Ключевой полупродукт в синтезе З-Ы-содержащих редуктонов - З-нитро-4-хлор-кумарин (V). Его получают с выходом более 80% из 4-гидроксикумарина обработкой последнего нитрующей смесью с последующей заменой гидроксила на хлор в З-нитро-4-гидроксикумарине (IV) при его взаимодействии с хпорокисью фосфора в среде ДМФА (схема 2). Восстановление нитрокумарина IV или его 4-хлор-аналога V дитионитом натрия приводит к простейшему представителю класса NO-алифатических кумариновых редуктонов, З-амино-4-гидроксикумарину (VI). iv v vi

Атом хлора в З-нитро-4-хлоркумарине (V) активирован сопряжением как с карбони-лом, так и нитрогруппой, поэтому кумарин V подобно хлорангидридам кислот легко вступает в реакцию нукпеофильного замещения. При использовании N-нуклеофилов (первичные алифатические и ароматические амины, линейные и циклические, аминоспирты, аминокислоты, гетероциклы) происходит гладкое замещение хлора на первичную или вторичную аминогруппу. Затем нитрогруппу восстанавливают (лучше всего дитионитом натрия). Полученные таким образом диамины VII можно дальше алкилировать или аци-лировать. Всего по этой схеме было получено несколько десятков 3.4-замещенных диа-минокумаринов (метод разработан совместно с В.Л.Савельевым).

Хлор в кумарине V можно заместить и на серу, чтобы затем перейти к кумариновым редуктонам NS-типа. Однако этот путь нельзя назвать удобным. Так, восстановление 3-нитро-4-(2-карбоксифенилтио)кумарина, полученного из тиосалициловой кислоты и кумарина V, дитионитом натрия происходит с образованием трех продуктов: ожидаемого 3-амино-4-(2-карбоксифенилтио)кумарина в смеси с 4-(2-карбоксифенилтио)кумарином и 3-меркапто-4-(2-карбоксифенилтио)кумарином. Полученный результат был истолкован с точки зрения направляющего влияния гетерозамесгителя в четвертом положении 3-нитрокумарина. Для этого следует сравнить результаты восстановления 3-нитрокумари

Y:N,O.S| 1Н) ын2

Y: О | И оа

XII

Y: CI. S j |H]IH5

5) нов, содержащих в положении 4 различные гетероатомы. Такое сравнение показывает, что аномальный результат возникает, когда положение 4 занимает сера, кислород или хлор, но не азот. А именно, при восстановлении 4-метокси-З-нитрокумарина наряду с 3-амино-4-метоксикумарином наблюдается образование 4-метоксикумарина. Аналогично, при восстановлении З-нитро-4-бензилтиокумарина согласно схеме 5 возникает смесь ожидаемого амино- и дезаминокумарина. В растворах дианион дитионита находится в равновесии с мощным одноэлектронным переносчиком, анион-радикалом диоксида серы. В растворах дитионита натрия происходит также накопление сероводорода по более сложной цепи превращений. Нитрогруппа в органических соединениях ведет себя как эффективный одноэлекгронный акцептор. Поэтому на первой стадии взаимодействия 3-нитро-4-гетерозамещенных кумаринов VIII с анион-радикалом диоксида серы должен возникать относительно стабильный анион-радикал нитрокумарина VIII (IX), который либо восстанавливается до 3-аминопроизводнога X, либо теряет остаток азотистой кислоты с образованием свободнорадикальной частицы XI. Согласно схеме 5 результат восстановления определяется относительной стабильностью двух интермедиатов реакции, анион-радикала IX и свободного радикала XI. Сравнение азота и кислорода в качестве заместителя в положении 4 исходного нитрокумарина VIII позволяет утверждать, что более электроотрицательный кислород должен в большей степени поляризовать связь C-NO? и тем самым содействовать ее разрыву, чем азот. Это и наблюдается в эксперименте, когда положение 4 занимает метокси-группа. 4-Гидроксикумарин в условиях эксперимента (слабощелочная среда) ионизируется, а заместитель О" вызывает уже электроположительный эффект и превращение по типу 4-аминозамещенных кумаринов. В отличие от азота и кислорода хлор и сера способны расширять свои валентные оболочки, поэтому они могут стабилизировать свободнорадикальную частицу XI в виде мосги-кового интермедиата XII. Поскольку раскрытие трехчленного цикла в нем при атаке водородом происходит с образованием только 4-замещенных кумаринов (4-гидроксикума-рин из З-нитро-4-хлоркумарина, а также только 4-бензилтиокумарин из соответствующего 3-нитропроизводного), то предпочтительным местом присоединения меркаптогруппы можно считать положение 3.

З-Нитро-4-хлоркумарин (V) по своей реакционной способности (высокая склонность к реакциям нукпеофильного замещения) напоминает 2-нитро-1-галогенбензолы. Однако различие обнаруживается при синтезе меркаптанов. Как известно, галогены, особенно фтор и хлор, в 2-нитро-1-галогенбензолах легко обмениваются на меркаптогруппу. В данной работе не удалось наблюдать образования меркаптокумарина при взаимодействии З-нитро-4-хлоркумарина (V) с разнообразными донорами серы: сульфидом и гидросульфидом натрия и калия, тиоцианатом калия, тиосульфатом натрия, дисульфидом натрия, тиоуксусной и тиобензойной кислотами. Во всех случаях наблюдалось одинаковое превращение, приводящее к трем наблюдаемым продуктам: З-нитро-4-гидроксикума-рину (XIII), бис(3-нитро-4-кумаринил)сульфиду (XIV) и фракции окрашенных продуктов дат- са5г— ocfb окрашенные продукты (б) xiv v xiii сложного состава (схема 6). Варьирование условий проведения реакции позволяет смещать ее направление в сторону предпочтитетельного образования одного из продуктов.

•Образование З-нитро-4-гидроксикумарина нельзя объяснить конкурентным по отношению к тиолированию гидролизом. Соединение V в нейтральных водных растворах не изменяется, а добавка воды в условиях реакции тиолирования вообще подавляет образование гидроксикумарина XIII. В то же время образование двух продуктов, кетона (енола) и симметричного сульфида, как известно, - характерный признак гидролитического распада тиокетонов (ентиолов), который протекает в кислых средах. В щелочных растворах меркаптаны образуют тиоляты (меркаптиды) в качестве устойчивой к гидролизу формы. Принимая во внимание, что со всеми донорами серы в одинаковых условиях соблюдается одинаковый состав продуктов, можно считать, что во всех случаях введение серы происходит нор-sR f мально, но затем связь S-R (R:

0ГТ — (STY (7) S03Na,SNa,CN,Ac,C0Ph,3о нитро-4-тиокумарин) в промеxv xvi жуточном продукте XV подвергается быстрому гидролизу с образованием нестабильного З-нитро-4-кумаринилтиопята (XVI) (схема 7). Ясно, что тот же нитротиолят - сопряженное основание сильной кислоты, З-нитро-4-меркаптокумарина, образуется и в реакции с NazS или NaHS.

•Для кумаринового тиолята XVI способ стабилизации по образцу пикрилтиолята невозможен, поскольку резонансная стабилизация аналогичной ароматической структуры А в отличие от пикрилтиолята не включает ароматических граничных структур (схема 10). no 2 ^-A-v no2 щтг — огс-ecc-wr <«> A

Для сопряженного основания нитроновой кислоты ароматическая граничная структура тоже невозможна (схема 11), но отрицательный заряд может распределяться в диеновой fi О* Г* » О, о=с-с=м-о —■- -0c=&-N=0

1 ч- 1 1 iсистеме сопряжения, содержащей атом серы или кислорода на другом конце цепи (схема 12). Отсюда можно заключить, что первоначально возникающая ионная пара, XVII или XVIII, должна обладать способностью к металлотропии (схема13). Поскольку в качестве

XVIII противоиона фигурирует жесткая кислота (Н4, Ма+, К+), то согласно теории ЖМКО равновесие должно сдвинуться в сторону формы XIX. При этом сера выводится из системы делокализации отрицательного заряда, и кумарин приобретает свойства тиокетона, т.е. проявляет склонность к гидролизу. Если этот вывод справедлив, то резонансно стабилизированную систему 3-нитрокумаринилтиолята XVI (схема 10) должен защищать от гидролиза противоион, представленный мягкой кислотой.

•Действительно, проведение тиолирования любым донором серы в присутствии соли аммония состава R1R2R3R4N+X" позволяет выделить З-нитро-4-кумаринилтиолят из реакционной смеси. В качестве противоиона можно использовать соединения на основе аммиака, первичных и вторичных алифатических и ароматических аминов, третичных аминов, алифатических и ароматических азотистых гетероциклов, что показано на 4-5 десятках примеров. Стабильность соединений возрастает с повышением гидрофобности противоиона. Функцинально-замещенные амины тоже можно вводить в состав противоиона. но стабильность тиолята в этом случае падает даже в твердом состоянии. Спектральные данные подтверждают предложенное строение З-нитро-4-кумаринилтиолятов XVI.

•Химическое поведение тиолятов XVI не вполне подтверждает предложенную структуру. Так, аммонийная соль XVI при взаимодействии с хлористым бензилом с трудом образует S-бензильное производное, идентичное с известным З-нитро-4-бензиптиокума-рином, а при восстановлении гипофосфитом натрия в присутствии скелетного никелевого катализатора образует до того недоступный З-амино-4-меркаптокумарин. Примечательно, что восстановление протекает в более жестких условиях, чем восстановление иных З-нитро-4-замещенных кумаринов. Эти данные позволяют предполагать, что выделенные тиоляты XVI существуют в форме заряженной трициклической системы кумарина, конденсированного с N-оксидом тиаоксазола (уравнение 14, форма В). ^

В тех случаях, когда связь S-R в 3-нит- Х¥| —" рокумаринах XV устойчива к гидролизу, син- в тез этих соединений не вызывает затруднений. В работе вопреки литературным данным (Praill е.а., 1983) показано, что меркаптаны при стехиометрическом соотношении реагентов реагируют с З-нитро-4-хлоркумарином (V) исключительно с замещением хлора. При введении в реакцию избытка бензилмеркаптана единственным продуктом реакции является редуктон SS-типа, 3.4-дибензилтиокумарин. В то же время при взаимодействии эквимолекулярных количеств З-нитро-4-метоксикумарина и бензилмеркаптана наблюдает

ОССлг

Г S4 о й I есс ©5»'

R .SR

НО г ! sn

0CC

RS Sf) бОГ I

RS SB

IfOOr1

15> ся образование смеси моно- и ди-8-замещенных кумаринов. Полученные данные интерпретированы на основании кинетических особенностей схемы 15. Возможны три пути

N02

N02 ш

XXI

XXII

XXIII превращения первоначального аддукта: распад на исходные реагенты с константой скорости ki, распад с выбросом заместителя R (путь а) и распад с выбросом нитрогруппы (путь Ь). При высокой нукпеофугальности R' предпочтителен второй вариант, при его пониженной нуклеофугальности замедленный распад первоначального аддукта создает предпосылки для одновременного существования в реакционной среде двух интерме-диатов, содержащих тетраэдрический атом углерода в положении 4. Процесс р-замеще-ния включает неклассическую мостиковую структуру, в которой мостиковый атом расширяет свою электронную оболочку сверх секстета. На это способны только мягкие основания.

Дополнительное подтверждение существенного различия между З-нитро-4-заме-щенными кумаринами и соответствующими ароматическими системами получено при изучении хлоролиза З-нитро-4-бензилтио-кумарина Как известно, нитротиофенолы образуют стабильные сульфенилхло-риды, которые удобно получать хлоролизом соответствующих S-бензильных производных. Взаимодействие же З-нитро-4-бензилтиокумарина с хлористым сульфурилом приводит к продукту, который нельзя выделить из реакционной смеси и очистить без разложения. Это исключает стабильный З-нитро-4-хлоркумарин (V) из числа возможных продуктов хлоролиза. В качестве последнего можно было бы предположить соль сульфония XXI, сульфенилхлорид XXII или бензилхлорид XXIII по аналогии с обычным результатом хлоролиза алифатических бензилсульфидов. Однако какой-либо индивидуальный хлорсодержащий продукт идентифицировать не удалось. Обработка реакционной смеси после проведения хлоролиза п-толуидином приводит к образованию 4-п-толипамино-Знитрокумарина с выходом 70%. То же соединение получено встречным синтезом из 3-нитро-4-хлоркумарина (V) и п-толуидина (схема 16). Т.о., продукт хлоролиза 3-нитробен-зил-4-тиокумарина ведет себя не как сульфенирующий агент, чего можно было бы ожидать по аналогии с соотвтетствующими ароматическими системами, а как алкенилирую-щий агент, что подчеркивает неароматический характер замещенных в гетероциклическом фрагменте кумаринов.

Склонность к гидролизу 4-3-производных З-нитро-4-меркаптокумарина - результат повышенной чувствительности этих соединений к нуклеофильным агентам в результате совместного активирующего влияния карбонильной и нитрогруппы. В таком случае и 4-0-производные З-нитро-4-гидроксикумарина должны проявлять повышенную чувствитель

1 SO2CL2 г-gs-H» хх осе is) rcoct + О ность к нуклеофильным агентам.Из этого следует, что З-нитро-4-хлоркумарин можно рассматривать в качестве удобного сопрягающего агента для ацилирования нуклеофильно-го центра солями карбоновых кислот (схема 19). Экспериментальная проверка полностью подтвердила это предположение. Оказалось, что в присутствии З-нитро-4-хпокума-рина (V) соли карбоновых кислот, приготовленные специально или in situ, очень легко (уже при 18-20° за 15-30 мин.) ацилируют спирты, амины, меркаптаны или тиофенолы с выходом 70-95%. Если же в реакционную систему не вводить конкурирующий нуклео-фил, то из двух молярных эквивалентов соли карбоновой кислоты образуется ангидрид (при температуре 40-60°). Несмотря на то, что синтез ангидридов протекает с количественным выходом, нельзя считать, что в общем случае именно ангидрид выступает в качестве ацилирующего агента. При проведении взаимодействия солей карбоновых кислот с сопрягающим агентом V в более мягких условиях (18-20°) впервые удалось выделить солеобразные ацилали XXVII (схема 20), которые и следует считать истинным ацили-рующим агентом. Такой характер протекания сопряженного ацилирования следует объяснять тем, что движущей силой реакции является образование резонансно-стабилизи ~ - об^ - -м рованной системы аниона З-нитро-4-гидроксикумарина (XXVI) (схема 21).

2.1.2 Синтезы на основе 3-гидроксикумарина. Возможны и другие способы синтеза кумариновых редуктонов. Например, в работе испытана схема с использованием 3-гидроксикумарина (схема 23). Реакция нукпеофильного замещения промежуточного 3

Hal SR еог есс -tSt ы гидрокси-4-галогенкумарина протекает при нагревании только с мощными нукпеофилами (тиолами).

2.1.3 Исследование синтезированных кумариновых редуктонов. Некоторые из синтезированных кумариновых редуктонов алифатического типа были испытаны на антиок-сидантную активность и некоторые виды фармакологической активности.Исследование в лаборатории проф. Ю.А.Владимирова (II ММИ им.Н.И.Пирогова) проводили по двум тестам: по уровню тушения железо-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) и по уровню подавления накопления продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Результаты испытаний представлены в табл. 1.

Как можно видеть, кумариновые редустоны NN-типа не уступают при химическом тестировании по своей АО активности промышленному АО ионолу и значительно превосходят при таком определении активность аскорбиновой кислоты. Эти же кумарины в биохимической системе тестирования АО активности (тушение XJ1, индуцированной взаимодействием 3-гидроксипиридина с пероксидазой из хрена, эксперимент проведен Н.Н.Золотовым) подтвердили свою высокую АО эффективность и обнаружили в этой тест-системе зависимость АО активности от коэффициента гидрофобное™

Т.М.Зайцева).

При испытании на мышах BDF1 и СБА (Н.М.Перетолчина) кумариновые редукто-ны вызвали 64-75% ингибирование роста опухоли LLC и 85-86% ингибирование роста опухоли шейки матки (РШМ-5), а при испытании на культуре клеток СаО (О.С.Жукова) алифатические кумариновые редуктоны показали высокую ци-тотоксичность.

2.2 Каптода-тивные олефины.

Сочетание элекгронооттягивающего и электронодонорного эффектов на радикальный центр, как в структурах XXVIII, XXIX, приводящее к стабилизации свободнорадикальных частиц, принято называть каптодативным эффектом. Опефины, обладающие каптода-тивным эффектом, привлекли к себе внимание в

Косовом.

XXVIII XXIX AD-5 XXX качестве АО нового типа, у некоторых из них (препарат AD-5) был обнаружен значительный фармакологический потенциал.

З-Гетерозамещенные кумарины XXX, будучи циклическими аналогами катехолами-нов, одновременно представляют собой разновидность каптодативных олефинов. Известно, что 3-гидроксикумарин реагирует с супероксидом, а 3-аминокумарины и их аце-тилированные и ацилированные формы обнаруживают антибактериальную, антиаллергическую и гипотензивную активность.

В работе каптодативные формы кумарина были синтезированы по схеме 24 из легкодоступного сырья по удобной технологии. На всех стадиях схемы достигается выход ос - ocf - юг- юг- осе <»> xxxi xxxii xxxiii

80-90% и выше.

Переход от N-ацетилированной формы XXXI к амину XXXII и енолу XXXIII осущев-ляется контролируемым кислотным гидролизом. По данным лаборатории проф. Ю.А. Владимирова, АО активность 3-замещенных кумаринов невысока (табл. 2). Слабое проявление каптодативного эффекта следует объяснять сопряжением двойной связи фрагмента дидегидроаланина с бензольным циклом кумарина. Сравнение этих соединений с кумарин-3-карбоновой кислотой, не обладащей каптодативным эффектом, но слабым

Таблица 1

Соединение

1 2 3 4 5 6

X X

NHi ОН

NH; NHe

NHi NHMc

NHi MHCHjPh

NH; N(n>r)l

NH; SCHjPI,

Концентрация АО в моль/л, снижающая в 2 раза

Интенсивность ХЛ в Количество продуктов, максимуме (3.4+0.1)х10е (4.0+0.3)х107 (3.8+0.4)х1&7 (1.0+0.1)х10-7 (7.5+0.6)х10-6 (2.2+0.1 )х10-5 реагирующих с ТБК (7.0+0.2)х10-6 (3.5+0.2)х10-6 (8.0+0.4)х107 (1.8+0.1)х10-6 (9.2±0.4)х10-6 (1.5+0.1)х10"4

Ионол Аскорбат

6.0+0.4)х107 (1.8+0.1 )х104

7.4+0.2)х10-7 хелатором, показывает, что АО свойства исследованных соединений складываются из каптодативного эффекта и их способности связывать ионы железа.

Таблица 2

2.3 Эффективные хе-паторы среди кумаринов и родственных гетероцик-лое. В работе предпринят синтез нескольких типов эффективных хелаторов на основе кумаринов.

2.3.1 р -Дикарбонипьные соединения. Эксперименталь

АО свойства 3-замещенных кумаринов, определенные по накоплению ТБК-активных продуктов

Соединение Сво%, моль/л

XXXI (1.2+0.1)х10-з

XXXII (4.0+0.2)х10-5

XXXIII (5.0±0.4)х10-5

З-Карбокси кумарин (0.8+0.1)х10"3

Ионол (7.4±0.3)х1(И но обоснован синтез двух типов р-дикарбонильных хелаторов в кумариновом ряду.

1) Хелаторы алифатического ряда удобно получать взаимодействием 4-гидроксику-маринов с ангидридами или хлорангидридами карбоновых кислот при нагревании в присутствии пиридина (схема 25). В общем случае в реакцию можно вводить карбоновую кислоту (или ее соль) в комбинации с хлорошсью фосфора (или другим галсидирующим агентом).

2) Хелаторы ароматического ряда. В этом случае удобнее выделять промежуточный сложный эфир, а затем проводить перегруппировку Фриса в присутствии хлористого

СА —.J9U А J°' 1 ""

Ас алюминия (схема 26 на примере 4-метилумбеллиферона). Кумариновые фенолы удобно нарабатывать в одну стадию с хорошим выходом по реакции Пехмана (схема 27).

3) Кумариновые аналоги.

Оба синтетических подхода без каких-либо изменений сохраняют свое значение и при привлечении гредшественников-гетероаналогов кумарина XXXIV и XXXV с атомом азота (карбостирилы) или серы вместо кислорода.

Из практических соображений еще более привлекательными выглядят моноциклические аналоги кумаринов, точнее их изомеров, хроменонов-4, XXXVI и XXVII. Простейший из них, мальтол (XXXVIII), - природное соединение (особенно богаты им хвойные)

-sc6. 6°" Фс fc

X: MR', S R' xxxiv xxxv xxxvi xxxvii xxxviii xxxl> уже имеет разнообразные самостоятельные сферы применения. Интерес к мальтолу m первоначально был продиктован как к ценной пищевкусовой добавке (мальтол обладает привлекательным вкусом и запахом). В качестве отдушки, фиксатора запаха, консерванта и другим качествам модификатора пищевых продуктов мальтол получил широкое распростанение. По этой линии его использования в национальном хозяйстве в США, например, промышленное производство мальтола и его гомолога, этилмальтола, достигает десятков тысяч тонн в год. С обнаружением АО активности мапьтола и его гетероа-налогов открылись новые сферы его применения уже как стабилизатора пищевых продуктов, готовых лекарственных форм и самостоятельного использования в качестве медицинских препаратов. В частности, препарат Li (деферипрон) (XXXIX), внедряется в качестве перорального хелатора железа вместо дорогого и неудобного в обращении дес-фераля. До сих пор десфераль был единственным хелатором медицинского назначения, особенно незаменимого в гематологической клинике для лечения таких заболеваний, грозящих летальным исходом, как гемохроматозы и гемосидерозы.

2.3.2 Поликарбоксилаты. Как в алифатическом, так и в ароматическом ряду кума

ПИ ОН

СН20 ♦ Н»,СН 2СООН, 0^NtCH2COOH,2 ы ринов эти хелаторы легко доступны по реакции Манниха (схема 28). В ароматическом ряду возможно образование бис-оснований Манниха, например, из эскулетина (схема 29).

Ы(СН -СООН) 1 наАг гсн2о * г нщсн 2coohj 2 —- [ОТ

Н(Гу

ЩСН 2СООН) 2

2.3.3 Нитрозофенолы (нитрозоенолы). Поликарбоксилаты - достаточно хорошо изученный, особенно в аналитических целях, класс хелаторов. Нитрозокумарины легко доступны, это - перспективный класс хелаторов. Их тоже можно синтезировать в двух кумариновых рядах. 4-Гидроксикумарин легко получить путём взаимодействия с нитритом натрия при простом смешивании в воде при 18-20° и выделении из синего раствора при подкислении. Не возникает затруднений и при нитрозировании 4-метилумбеллифе-рона и других кумаринов, несущих фенольный гидроксип.

Часть из синтезированных хелаторов прошла биотестирование. Было показано (Н.М.Перетолчина), что хелатор железа деферипрон в комплексе с ионом Mg(ll) нетоксичен в дозах 300-500 мг/кг (пятикратная инъекция). Это соединение ингибировало рост опухоли LLC (самцы мышей DDF1) на 48-67% и рак шейки матки РШМ-5 (самки мышей СБА) - на 55-77% (при пятикратном внутрибрюшинном введении). В экспериментах на стрептозотоциновой модели сахарного диабета это же соединение показало себя эффективным пероральным заменителем инсулина.

2.4 Модели супероксиддисмутазы (СОД). АО активность кумариновых хелаторов определяется главным образом их способностью связывать ионы железа и других переходных металлов-индукторов окислительного стресса и выводить их из патологической зоны в связанном состоянии. Собственная активность в качестве ловушки свободно-радикальных частиц тоже дает некоторый вклад в суммарную АО активность. Но и комплексные соединения эффективных хелаторов с ионами переходных металлов могут иметь собственную АО активность в качестве моделей защитных металлоферментов. В этом отношении внимание в первую очередь заслуживают комплексные соединения с ионом меди(Н) как модели Cu/Zn-супероксиддисмутаз. По литературным данным, сали-цилатные модели СОД по своей каталитической активности приближаются к своему про-тотипу-нативному ферменту. Известны также железо- и марганецсодержащие разновидности фермента. Способность дисмутировать супероксид можно считать общим свойством комплексных соединений переходных металлов. Но было бы неправильно относить биологические эффекты комплексного соединения переходного металла только к его ходных металлов-индукторов окислительного стресса и выводить их из патологической зоны в связанном состоянии. Собственная активность в качестве ловушки свободно-радикальных частиц тоже дает некоторый вклад в суммарную АО активность. Но и комплексные соединения эффективных хелаторов с ионами переходных металлов могут иметь собственную АО активность в качестве моделей защитных металлоферментов. В этом отношении внимание в первую очередь заслуживают комплексные соединения с ионом меди(Н) как модели Cu/Zn-супероксиддисмутаз. По литературным данным, сали-цилатные модели СОД по своей каталитической активности приближаются к своему про-тотипу-нативному ферменту. Известны также железо- и марганецсодержащие разновидности фермента. Способность дисмутировать супероксид можно считать общим свойством комплексных соединений переходных металлов. Но было бы неправильно относить биологические эффекты комплексного соединения переходного металла только к его способности имитировать активность СОД. Только для медных моделей СОД можно уверенно прогнозировать возможность проявления ими эффектов, подобных активности каталазы, пероксидаз, оксидаз (аскорбатоксидаза, аминооксидазы, сульфгидрилоксида-за). Можно также уподобить их активность действию оксигеназ и диоксигеназ (схема 32). Для моделей СОД с другими биометаллами эти дополнительные активности вообще могут выйти на первый план. Нельзя не учитывать и возможную транспортную функцию моделей СОД. Воздействие на редокс-потенциал клетки они могут оказывать в качестве переносчиков не только самого металла, но также и электрона, а в некоторых случаях и молекулярного кислорода. Для синтеза моделей СОД медицинского назначения необходимо использовать хелаторы, способные конкурировать с очень мощными хелаторами -белками - за ион переходного металла. По последним оценкам логарифм констатны устойчивости комплекса металла медицинского назначения должен быть не менее 19. Менее прочные комплексы можно рассматривать как удобные пролекарства по отношению как к металлу, так и лиганду.

В работе на основе кумариновых и родственных лигандов были синтезированы комплексные соединения меди и других переходных биометаллов (всего около двухсот) и произведена оценка их АО и фармакологической активности. Все использованные для синтезов лиганды принадлежат к ацидо-типу. Поэтому синтезы проводились по стандартной методике в присутствии (или титрованием) рассчетного количества сильного основания. Таким образом были получены и нейтральные, и заряженные (растворимые в воде) комплексные соединения.

Оценка их антирадикальной активности проведена в лаборатории проф.Ю.А.Влади-мирова (II ММИ им.Н.И.Пирогова). Для исследования были выбраны 4 кумариновые модели СОД, а для сравнения использованы известные по литературе салицилатные модели СОД: бис(салицилато)ди(акво)медь(П) дигидрат (XL), салицилато-трис(акво)мар-га-нец(П) семигидрат (XLI), а также промышленный АО, ионол, и Cu/Zn-содержащая СОД. АО активность определяли по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Результаты испытаний приведены в табл. 3. Можно видеть, что антирадикальная активность моделей СОД находится на уровне ионола или выше и не уступает эффективности описанным в литературе салицилатным моделям СОД, обладающих широким спектром фармакологической активности.

Таблица 3

Сравнительная АО активность медных моделей СОД на основе кумаринов, салицилатных хелатов меди и марганца, ионола и СОД

Соедине- Концентрация АО (моль/л), снижающая в 2 раза ние интенсивность ХП в количество ТБК-активных максимуме продуктов яО 93 (1.5±0.1)х1(И (9.0+0.5)х107 лО 83-3 (7.0+0.3)х108 (7.0+0.4)х10-в л(Э 153-3 (3.5+0.2)х10» (9.0+0.5)х10"8 tiQ 101 (3.5+0.2)х10-6 (8.0+0.4)х10-б

XL (8.0+0.4)х10'7 (6.0+0.4)х10-'

XLI (1.6+0.2)х103 (2.2+0.3)х10-3

Ионол (6.0+0.4)хЮ-7 (7.4+0.2)х10-7

СОД 125+20 ед./мл 130+15 ед./мл

При испытаниях in vitro на культуре клеток СаО (О.С.Жукова) цмтотоксическую активность обнаружили многие медные модели СОД, но из девяти отобранных соединений в опытах in vivo (Н.М.Перетолчина) ни один не показал удовлетворительных результатов. В отличие от них хелат деферипрона с ионом ванадила дал LD«o 700 мг/кг (мыши СВА), а в тесте торможения роста опухолей обнаружил следующие показатели: на опухоли LLC (самцы мышей BDF1) - 53-60%, на раке шейки матки РШМ-5 (самки мышей СВА) - 70-83% (везде 5х внутрибрюшинное введение).

Хелат ванадила показал себя также как перспективный пероральный эквивалент инсулина.

В литературе обосновывается точка зрения, согласно которой нестероидные противовоспалительные средства проявляют свою фармакологическую активность в качестве участников метаболизма меди. С другой стороны, комплексные соединения меди в качестве моделей СОД могут воздействовать на воспаление, подавляя окислительный стресс. Общей чертой биологического поведения всех хелатов переходных металлов является также их способность связывать меркаптогруппы биологических тиолов, воздействуя таким образом на тиол-дисульфидное равновесие. А сдвиг тиол-дисульфидно-го равновесия - главный показатель сдвига редокс-потенциала клетки. Это может объяснить, почему синтезированные в работе хелаты меди и цинка показали себя в качестве эффективных гастропротекторов, которые на алкогольной модели язвы желудка крысы по своей активности на 30% превысили эффект сукралфата (В.А.Трапков).

В соответствии с этими результатами хелаты меди, цинка, кобальта, железа, марганца, ванадия и титана с кумариновыми и родственными лигандами на карагениновой модели отека лапки крысы обнаружили противовоспалительную активность (В.Л.Ковалева). По значению антианафилактической активности EDso Ю'9М комплексное соединение железа(Ш) сопоставимо с кортикостероидом будесонидом, а хелаты титана(1У) снижают антиген-индуцированную дегрануляцию в 2 раза, что сопоставимо с активностью гидрокортизона. Синтезированные хелаты переходных биометаллов зарекомендовали себя как перспективные антиастматические агенты. На экспериментальных моделях in vitro и in vivo они по своим показателям значительно превзошли эффекты интапа и теофилли-на. Как следует из результатов биохимических исследований (Л.В.Татьяненко), эти хелаты металлов можно считать бронходиляторами нового типа, фармакологическая активность которых имеет отношение к ингибированию фосфодиэстеразы IV типа.

3 Модифицированные формы аскорбиновой кислоты

Еще в работах Я.Д.Фридмана (70-80-е годы) было показано, что АО активность, а, следовательно, и фармакологический потенциал аскорбата можно значительно усилить в результате комплексообразования. Однако, моноанион аскорбиновой кислоты - довольно плохой комплексообразователь (логарифм константы устойчивости большинства хелатов находятся в интервале 3-9), поэтому указанный прием до сих пор носил абстрактный характер. В работе для синтеза комплексных соединений аскорбиновой кислоты использованы ионы Ti(IV), TiO(ll) и VO(II) (lg kycT 27 и выше). Аскорбат - водорастворимый АО. Но его фармакологический потенциал можно значительно усилить за счет введения в молекулу витамина гидрофобных заместителей. В работе были получены производные аскорбата (в порядке повышения гидрофобности) с ацетоном (кеталь XLII), бензальдеги-дом (ацеталь XLIII) и пальмитиновой кислотой (эфир XLIV), На основе этих лигандов были получены комплексные соединения.

ОСО)СН гЫСНз нПЬн xlii

Уже первые результаты определения фармакологической активности синтезированных модификаций аскорбата подтвердили, что выбранный подход позволяет раскрыть фармакологический потенциал аскорбиновой кислоты. Об этом свидетельствуют данные по определению противовоспалительной и антиастматической активности производных аскорбата (В.Л.Ковалева), их инсулиноподобный эффект при пероральном приеме (В.П. Федотов) и результаты определения их антигипоксической и актопротекгорной активности (Н.Н.Самойлов). * *

В заключение приводим сводную таблицу определения фармакологической активности синтезированных ФСАО (табл. 4). Приведенные в ней данные убеждают в том, что

1) химическая модификация повышает фармакологический потенциал как биометалла, так и биолиганда и

2) фармакологический эффект ФСАО есть функция его воздействия на редокс-потенциал клетки (ср. данные по определению 6 видов фармакологической активности у меди и обнаружение антигипоксической активности в 9 классах ФСАО).

4 Разработки в области технологии витамина Е

4.1 Привлечение ароматического сырья. Согласно предложению проф. М.Я. Крафта ароматическое ядро витамина Е, триметилгидрохинон, можно синтезировать из мезитилена по схеме 33, ключевая стадия которой - перегруппировка Бамбергера. Уже

Tacriuyti 4

Фармакологическая активность ФСАО

Класс АО Модель язвы воспаления астмы рака in vitro рака in vivo диабета гипоксии

Алиф. кумариновые редуктоны + + +

Модифицированный аскорбат + + + +

Эффективные хелато-ры - + + +

Си(П)] + + +■ + + +

Zn(ll)] + + + +

Mn(lll)] +

Mn(IV)]

VO(II)) + - + +

TiO(ll)] •Н + +

Ti(IV)] + ■1-

Fe(lll)] +

Co(lll)] + +

Модифицированный никотинат +

Кумариновые полифенолы +

Стабилизированные тиоляты + на стадии лабораторной проработки схемы опасение вызывали стадии восстановления нитромезитилена порошком цинка в слабокислой среде и чувствительность мези-тилгидроксиламина и промежуточного хинола к окислению кислородом воздуха. При масштабировании разработки в металлической аппаратуре (МЭВЗ) эти опасения подтвердились: выход на стадии восстановления оказался нестабильным (колебания в пределах 20-30%), а полученный триметилгидрохинон оказался загрязненным продуктами окисления. На основании исследования сделаны рекомендации по изысканию более удобного способа восстановления (гидрирование на катализаторе Адамса с контролем расхода водорода) и оформлению заключительной стадии процесса в условиях изоляции от кислорода воздуха и металлических деталей аппаратуры.

4.2 Привлечение алифатического сырья. Альтернативой получению триметил-гидрохинона на основе ароматического сырья (крезопы, ксиленопы, псевдокумол, мези-тилен) служат способы, целиком опирающиеся на сырье алифатическое (насыщенные и ненасыщенные альдегиды и кетоны, ацетилацетон, нитрометан и др.). По способу, который апробировал ВНИВИ, синтез проводят по схеме 34. Синтез начинается (ключевая стадия) с проведения циклоконденсации кротонового альдегида с диэтилкетоном. Конденсацию проводят в присутствии катализатора - порошка гидроокиси калия. В работе методом ГЖХ проведена оптимизация процесса и показано, что максимальный выход

Л • Г- Л X £ - £ - 4 "" достигается в узком интервале температур и молярных соотношений катализатора и диэтилкетона (последний одновременно служит растворителем) и примеси влаги. Применение в процессе порошкообразного едкого кали затрудняет его масштабирование и исключает его проведение в паровой фазе или в непрерывном режиме. Сам выбор сырья тоже нельзя назвать удачным: диэтилкетон на момент разработки схемы в СССР не производился а кротоновый альдегид высокотоксичен и обладает чрезвычайно раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки (сильнейший лакриматор).

Более удачным для разработки крупнотоннажного производства витамина Е выглядит выбор такого сырья как метилэтилкетон, уксусный альдегид и нитрометан, например, в духе схемы 35. В этом случае открывается возможность проведения процесса в о с;

- геи>сио - CHjNOJ —>■ | . ^ | —- -КЗ' паровой фазе на контактных катализаторах (цеолиты, модифицированные фторид-ионами, палладиевый или платиновй катализатор), сокращается число стадий, которые можно проводить в непрерывном режиме. выводы

1 Выдвинуто и обосновано представление о безопасных лекарствах с характеристикой физиологически совместимых АО (ФСАО).

2 С использованием метода химического моделирования на примерах кобальта и серы экспериментально показана синхронизация посредством ФСАО явлений на двух уровнях биологической организании, молекулярном и субмолекулярном.

3 Правомерность концепции ФСАО подтверждается её прогностической способностью (объяснение парадокса теории химического канцерогенеза, редокс-механизм коба-мид-зависимого катализа, прогноз не зависимых от фермента защитных эффектов витамина Вб).

4 Сформулированы, вытекающие из концепции ФСАО, практические рекомендации по разработке безопасных лекарств.

5 На основании концепции ФСАО и вытекающих из неё практических рекомендаций разработаны синтезы и исследованы свойства синтезированных соединений в рядах: а)эффективных хелаторов алифатического и ароматического типов, б)моделей СОД и других защитных металлоферментов, в)алифатических и ароматических кумариновых редуктонов, комплексных соединений аскорбата и его гидрофобных вариаций, д)стабилизированных кумариновых тиолятов.

6 Правильность практических рекомендаций, вытекающих из концепции ФСАО, подтверждена патентоспособными разработками: а)эффекгивных гастропротекторов, б)противовоспалительных агентов, в)бронходиляторов (показано на 9 типах моделей СОД, г)пероральных моделей инсулина (показано на 3 классах ФСАО), д)антигипоксантов и актопротекторов (показано на 9 типах ФСАО).

7 Показана перспективность поиска противоопухоленвых агентов в рядах эффективных хелаторов, кумариновых редуктонов и моделей СОД

8 Большинство выполненных разработок ФСАО медицинского назначения представляют собой готовые технологические решения.

9 Показано редокс-участие кобальта в каталитической трансформации полифункционального субстрата, этиленгликоля.

10 Показано редокс-участие серы(Н) в каталитическом переносе злектрофильных остатков на нуклеофильный центр,

11 На примере синтеза простых и сложных эфиров обнаружена высокая склонность к сольволитическим превращениям у 2-гидроксиалкилкобалоксимов.

12 Выделен и изучен неклассический интермедиат сольволитических превращений, первичный кобальторганический ион карбония.

13 Показано, что эффективность сольволиза 2-О-замещенных алкилкобалоксимов определяется нуклеофильностью сопряженного основания кислоты-катализатора,

14 На примерах оксикобальтирования двух классов олефинов и открытой здесь реакции переалкилирования показано, что реакция кислотного распада органокобалоксимов имеет обратимый характер;

15 Открыта стереоспецифическая перегруппировка органокобалоксимов аллильного типа, в которую вовлекается гидроксилсодержащий растворитель.

16 Открыта зависимая от кобальторганического соединения каталитическая реакция внешнесферного окислительно-восстановительного превращения этиленгликоля,

17 На примере изучения реакционной способности 2-гидрокси-3-хлор(пиридин)коба-локсима и его ацетата установлено, что аксиальная транс-атака заряженной нуклео-фильной группы апофермента может составлять важную часть кобамид-зависимого катализа;

18 На препаративном уровне разработана каталитическая 3(И)-зависимая реакция редокс-переноса ацильных остатков из ангидридов, хлорангидридов и тиоэфиров карбо-новых кислот на азот,

19 Обнаружено, что соединения трехвалентного фосфора могут служить катализатором не только реакции сопряженного ацилирования замещенных N-сульфенильных соединений, но и для синтеза хлорангидридов ароматических сульфеновых кислот. В последнем случае каталитическая активность установлена и у амидов карбоновых кислот.

20 На препаративном уровне разработан удобный метод ацилирования нуклео-фильных агентов солями карбоновых кислот с образованием N-ацильных производных, сложных эфиров, тиоэфиров или ангидридов карбоновых кислот.

21 Впервые показано, что активным интермедиатом зависимого от гетероциклического медиатора сопряжённого ацилирования выступают заряженные ацилали.

22 Концепция ФСАО является теоретическим ядром новой научной дисциплины, учения о безопасных лекарствах.

23 Данное исследование представляет собой попытку предложить научное толкование стихийной практике внедрения АО в медицину.

Основные результаты диссертации представлены в следующих публикациях:

1.М.Е.Маурит, Г.В.Смирнова, Э.А.Парфенов, И.К.Сарычева, Н.А.Преображенский. Полный синтез 2.5.7.8-тетраметил-2-(4 .8 .12-триметилтридецил)-6-оксихромана (витамина Е, а-токоферола) и его производных//ДАН СССР.-1961.-Т.140.-С. 1330-1333.

2. М.Е.Маурит, Г.В.Смирнова, Э.А.Парфенов, Т.М.Винковская, Н.А.Преображенский.

Полный синтез 3.7.11.15-тетраметилгексадецен-1-ола-3, изофитола//ЖОХ.-1962.-Т. 32,-С. 2483-2487.

3. Э.А.Парфенов, А.М.Юркевич. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. 1 .Синтез 5-бром-4-пентеновой кислоты и некоторых ее производных//ЖОрХ.-1971.-Т. 7.-С. 2471-2476.

4. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин, А.М.Юркевич. О регуляции химической активности аминов соединениями двухвалентной серы//Тезисы докладов XII научной сессии по химии и технологии органических соединений серы и сернистых нефтей. "Зинатне". Рига.-1971-С. 262-263.

5. E.A.Parfenov, A.M.Yurkevich. Synthesis and properties of alkenylcobaloximes//V International Conference on Organometallic Chemistry. Abstracts. Moscow.-1971.-Vol. 2.-P. 395-398.

6. Э.А.Парфенов, А.М.Юркевич. О получении 1-алкенилкобалоксимов.// ЖОХ.-1972.-Т. 42.-С.- 474475.

7. Э.А.Парфенов, А.М.Юркевич. Циклизация диольного лиганда в 2.5-диоксипентил-(пиридин)кобалоксиме на кремневой кислоте//ЖОХ.-1972.-Т. 42.-С. 2350.

8. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, А.М.Юркевич. Сольволиз р-оксиэтил(пиридин)коба-локсима//ЖОХ.-1972.-Т. 42.-С. 2584-2585.

9. Э.А.Парфенов, А.Р.Беккер, М.Г.Еделев, АМЮркевич. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. 2.Взаимодействие кобалоксима.; и некоторых других нуклеофилов с 1.1.2.3-тетрабромпропаном//ЖОХ.-1972.-Т. 42.-С. 2790-2796.

10. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин, А.М.Юркевич. О каталитической замене сульфенильно-го остатка в сульфенамидах ацильным//ЖОХ.-1973.-Т. 43.-С. 1202-1203.

11. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, А.М.Юркевич. О катализируемом органическим комплексом кобальта окислительно-восстановительном превращении этиленглико-ЛЯ//ЖОХ.1973.-Т. 43.-С. 1858-1859.

12. Э.А.Парфенов, М.Г.Еделев, В.В.Мищенко, И.М.Кустанович, А.М.Юркевич. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. З.Синтез р-окси- и р-алкоксиме-тилвинилкобалоксимов//ЖОХ.-1973.-Т. 43.-С. 2770-2777.

13. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев, И.М.Кустанович, А.М.Юркевич. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. 4.Апкоголиз и ацидолиз р-оксиал-кил(пиридин)кобалоксима.//ЖОХ,- 1973.-Т.43.-С. 2777-2785.

14. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев, АМЮркевич. О реакции замещения о-связанного лиганда на другой органический лиганд//ЖОХ.-1974.-Т.44.-С. 466.

15. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев, М.Г.Шмырев, А.М.Юркевич. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. 5.Взаимодействие 2-окси-З-хлор-пропил(пиридин)кобалоксима и его ацетата с некоторыми нуклеофильными агентами. О возможном механизме активации кобамидного кофермента//ЖОХ.-1974.-Т. 44.-С. 18131825.

16. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев, А.М.Юркевич. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. 6.Каталитическое окиспительно-восстановитель-ное превращение эгиленгликоля. О некоторых особенностях химического поведения органокобалоксимов//ЖОХ.-1974.-Т. 44.-С. 1825-1832.

17. ЭАПарфенов, ВАФомин, А.М.Юркевич. Способ получения хлорангидридов ароматических сульфеновых кислот//Авт. свид. СССР N427929.-Ony6n. 15.05.1974,-Бюлл. N18.

18. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев, А.М.Юркевич. Об алкилировании элек-трофильного бис(диметилглиоксиматного) комплекса кобальта винилэтиловым эфиром //ЖОХ.-1974.-Т. 44.-С. 2362-2363.

19. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев. 06 алкилировании электрофильного бис(диметилглиоксиматного) комплекса кобальта некоторыми олефинами//3-е Всесоюзное совещание по химии координационных соединений Со, Ni и Мл. Тезисы докладов. "Мецниероба". Тбилиси.-1974.-С. 15.

20. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин, А.М.Юркевич. Способ ацилирования аминов//Авт. свид. СССР М56804.-0публ. 15.01.1975.-Бюлл. N2.

21. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин. Участие электрофильных органических соединений двухвалентной серы в каталитических превращениях. 1.Удобный способ хлоролиза ароматических дисульфидов/ШЭХ.-1975.-Т. 45.-С. 1129-1131.

22. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев. Вовлечение воды и спиртов в реакцию пропенилирования нуклеофильного бис(диметилглиоксиматного) хелата кобальта. Каталитическое окислительно-восстановительное превращение этиленгликоля//ХП Всесоюзное Чугаевское совещание по химии комплексных соединений. Тезисы докладов. Ч.З. Новосибирск.-1975.-С. 454-455.

23. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова. Алкилирование неорганических бис(диме-тилглиок-симатных) хелатов кобальта некоторыми олефинами//ЖОХ.-1975.-Т. 45.-С. 1200.

24. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова, М.Г.Еделев. Поиски простой химической модели ко-бамидного кофермента. 7. Замещение с-связанного с кобальтом органического лиганда в реакциях с олефинами//ЖОХ.-1977.-Т. 47.-С. 914-923.

25. Э.А.Парфенов, Т.Г.Червякова. Поиски простой химической модели кобамидного кофермента. 8.0ксикобальтирование некоторых олефинов бис(диметилглиоксиматным) хелатом кобальта//ЖОХ.-1977.-Т. 47.-С. 923-932.

26. E.A.Parfenov, T.G.Chervyakova. The role of an anion in some transformations of 2-0-substituted alkyl bis(dimethylglyoximato)coball(lll) complexes (alcohols, ethers, and esters) //VIII International Conference on Organometallic Chemistry. Abstracts.-Tokyo.-1977.-P. 97.

27. Э.А.Парфенов, А.Р.Беккер, Г.Ф.Костерева. О необычном превращении кротонового альдегида в условиях реакции Штеттера//ЖОрХ.-1981.-Т. 17.-С. 885-886.

28. Э.А.Парфенов, А.Р.Беккер, Г.Ф.Костерева. 1.4-Присоединение нитрометана к а,р-непредельным альдегидам и кетонам в присутствии катализатора межфазного перено-са//Ж0рХ.-1981 .-Т. 17.-С. 1591 -1594.

29. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин. Участие электрофильных органических соединений двухвалентной серы в каталитических превращениях. 2.Каталитическая обменная реакция N-моносульфенированных аминов с эфирами тиокарбоновых кислот//ЖОХ.-1981.-Т. 51.-С. 1129-1137.

30. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин, А.А.Максимова. Участие электрофильных органических соединений двухвалентной серы в каталитических превращениях. 3.0 некоторых особенностях синтеза и химического поведения М-ацильных производных амида о-нитро-бензолсульфеновой кислоты//ЖОХ.-1981.-Т.51.-С. 1137-1144.

31. Э.А.Парфенов, В.А.Фомин. Участие электрофильных органических соединений двухвалентной серы в каталитических превращениях. 4.Каталитическая обменная реакция N-моносульфенированных аминов с ангидридами и хлорангидридами карбоновых кислот//ЖОХ.-1981.-Т. 51.-С. 1144-1153.

32. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Фармакологический потенциал антиоксидантов на основе кумарина. Обзор//Хим.-фарм. журнал.-1988.-Т. 22.-С. 1438-1448.

33. Э.А.Парфенов, О.Л.Самсонова, В.Л.Савельев, Л.Д.Смирнов. Удобный способ получения 3.4-диаминокумаринов/А/ Всесоюзный симпозиум го органическому синтезу. Тезисы докладов. Москва.-1988.-С. 131-132.

34. Э.А.Парфенов, В.Л.Савельев, Л.Д.Смирнов. О направляющем влиянии заместителя на результат восстановления 4-замещенных 3-нитрокумаринов гидросульфитом нат-рия//ХГС.-1989.-N З.-С. 423.

35. E.A.Parfenov, N.NZolotov, K.Yu.Zalilov, V.L.Savelyev, L.D.Smirnov. Antiradical efficacy of reductons on the base of coumarins//lnternational Conference on Regulation of Free Radical Reactions. (Biomedical Aspects). Abstracts. Varna.-1989.-Abstr. N192.

36. Э.А.Парфенов, ЛД.Смирнов. Случай прямого замещения нитрогруппы у ненасыщенного центра кумарина на меркаптогруппу//ХГС.-1990.-1^8.-С. 1135-1136.

37. ЭАПарфенов, Л.Д.Смирнов. Зависимое от З-нитро-4-хлоркумарина сопряженное ацилирование//ХГС.-1991 .-N7.-C. 995-996.

38. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Гетероциклические биоантиоксиданты. 1. Взаимодействие З-нитро-4-хлоркумарина с тиолирующими агентами//ХГС.-1991.-М8.-С. 10321037.

39. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Гетероциклические биоантиоксиданты. 2. Взаимодействие З-нитро-4-замещенных кумаринов с меркаптанами//ХГС.-1991.-М1.-С. 14761479.

40. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Зависимый от З-нитро-4-хлоркумарина синтез ангидридов карбоновых кислот//ХГС.-1991 .-N11.-С. 1562-1563.

41. Ю.А.Владимиров, Э.А.Парфенов, О.М.Епанчинцева, ЛДСмирнов. Антирадикальная активность 3-замещенных кумаринов и их влияние на железо-зависимую хемилюми-несценцию//Бюлл. экспер. биол. мед.-1991.-Т. 112.-С. 358-360.

42. Ю.А.Владимиров, Э.А.Парфенов, О.М.Епанчинцева, ЛДСмирнов. Антирадикальная активность кумариновых редуктонов//Бюлл. экспер. биол. мед.-1991.-Т. 112.-С. 472475.

43. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Гетероциклические биоантиоксиданты. 3.0 влиянии заместителя на результат восстановления З-нитро-4-замещенных кумаринов гидросульфитом натрия//ХГС.-1992.-1\13.-С. 329-334.

44. Ю.А.Владимиров, Э.А.Парфенов, О.М.Епанчинцева, В.С.Шаров, Е.С.Дремина, Л.Д.Смирнов. Антирадикальная активность комплексных соединений меди(П) на основе кумариновых лигандов//Бюлл. экспер. биол. мед.-1992.-Т. 113.-С. 479481.

45. Э.А.Парфенов, ЛД.Смирнов. Гетероциклические биоантиоксиданты. 4.0 хлороли-зе 3-нитро4-5-бензилкумарина//ХГС.-1992.-Ы7.-С. 888-889.

46. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Гетероциклические биоантиоксиданты. 5. Стабилизация 3-нитро4-кумаринилтиолята аммониевым противоионом//ХГС.-1993.-1М4.-С. 459462.

47. Э.А.Парфенов, О.С.Жукова, НАОбидняк, Г.К.Герасимова. Цитотоксическая активность медь-содержащих моделей супероксидцисмутазы на основе кумариновых лиган-дов//1У конференция "Биоантиоксидант". Тезисы докладов.-1993.-Т. 1.-С. 69-70.

48. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Каптодативные олефины в кумариновом ряду//Там же.-С. 211-212.

49. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. О синтезе кумариновых редукгонов/Дам же.-С. 212213.

50. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов, Т.М.Зайцева. Относительная гидрофобность в ряду кумариновых редуктонов//Там же.-С. 213-214.

51. Э.А.Парфенов, Л.Д.Смирнов. Успехи и перспективы создания лекарственных препаратов на основе аскорбиновой кислоты. Обзор//Хим.-фарм. журнал.-1993.-Т. 26.-N9-10.-С. 4-17.

52. E.A.Parfenov, V.ATrapkov, L.D.Smirnov. Synthesis and gastroprotective activity of Zn(ll) and Cu(ll) coumarin complexes//Pharinacol. Res.-1995.-Suppl. 31 .-P. 222.

53. В.Л.Ковалева, Л.В.Татьяненко, Э.А.Парфенов, В.М.Павлова, Т.П.Муфазалова. Новый ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ как потенциальное антиастматическое средст-во//6-ой Российский национальный конгресс по болезням органов дыхания. Тезисы докладов. Новосибирск.-1996.-Реф. N1379.

54. E.A.Parfenov, V.N.Tolkachev. Convenient route of coupled acylation with carboxylic acid salts//11th International Conference on Organic Synthesis (ICOS-11). Book of Abstracts. Amsterdam.-1996.-Abstr. PO-315.-P. 455.

55. Э.А.Парфенов, В.А.Трапков, Л.Д.Смирнов. Синтез и противоязвенная активность медь- и цинк-содержащих кумариновых антиоксидантов//Хим.-фарм. журнал.-1996.-Т. 30.-N7.-C. 20-26.

56. В.Л.Ковалева, Л.В.Татьяненко, Э.А.Парфенов, В.М.Павлова. Перспективы разработки новых бронхолитических средств на основе производных кумарина//Лекарства -человеку. Международный сборник научных трудов 4-й научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств. Москва.-1997.-Т. 4.-С. 222232.

57. E.A.Parfenov, N.M.Peretolchina, V.N.Tolkachev. Pharmacological potential of reductones//6th International Symposium on Molecular Aspects of Chemotherapy. Abstracts. Gdansk.-1997.-Poster 89.-P. 166.

58. E.A.Parfenov, N.M.Peretolchina, V.N.Tolkachev. Pharmacological potential of the effective chelators//lbidem.-Poster 90.-P. 167.

59. E.A.Parfenov, V.L.Kovaleva, V.N.Tolkachev. Pharmacological potential of the coumarin superoxide dismutase (SOD) models//lbidem.-Poster 91 .-P. 168.

60. В.Л.Ковалева, Э.А.Парфенов, В.А.Трапков, Л.Д.Смирнов. Фармакологическая активность комплексных соединений переходных металлов на основе кумариновых анти-оксидантов//Лекарства - человеку. Международный сборник научных трудов 5-й научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств. Мо-сква.-1998.-Т. 5.-С. 196-200.

61. Э.А.Парфенов, В.Л.Ковалева, Н.И.Веселова, В.Н.Толкачев. Кумариновые модели супероксиддисмутазы для разработки противовоспалительных средств //5-й Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. Москва.-С. 601-602.

62. Э.А.Парфенов, Н.М.Перетолчина, В.Н.Толкачев. Биометаллы и энтиоксидантные лиганды для дизайна противоопухолевых средств//Там же.-С. 602.

63. В.П.Федотов, Э.А.Парфенов, Н.В.Садовникова, Г.Н.Плужникова, В.Н.Толкачев. Синтез комплексных соединений биометаллов на основе антиоксидантных лигандоа и применение их при экспериментальном сахарном диабете//1-й Всероссийский диабето-логический конгресс. Тезисы докладов. 1Иосква.-1998.-С. 27.

64. Э.А.Парфенов, В.Л.Ковалева, В.А.Трапков, Л.В.Татьяненко, В.Н.Толкачев. Физиологически совместимые антиоксиданты для разработки противовоспалительных средств //5-я международная конференция "Биоантиоксидант". Тезисы докладов. Москва.-1998.-С. 161-162.

65. Э.А.Парфенов, Н.М.Перетолчина, В.Н.Толкачев. Физиологически совместимые антиоксиданты как перспективные нетоксичные противоопухолевые средства//Там же.-С. 162.

66. E.A.Parfenov, G.E.Zaikov. Biometals and Ligands for Anticancer Drug Design: Molecular Mechanisms of Superoxide Dismutase Models Antitumor Effects// Nova Science Publishers.- New York.-1998.-PP. 380.

67. В.Л.Ковалева, И.Ю.Ильницкая, Э.А.Парфенов, Г.А.Базанов, Л.Н.Сернов. Исследование антиаллергических свойств новых комплексных производных кумаринов//6-й Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. Москва.-1999,-С. 37.

68. Э.А.Парфёнов, А.И.Володин, Е.Н.Стратиенко, Н.В.Протасова, М.М.Должанский, Н.Н.Самойлов. Изучение антигипоксических свойств новых антиоксидантов//Гипоксия: Механизмы, адаптация, коррекция. Материалы Второй Всероссийской конференции. БЭБиМ.-Москва.-1999.-С. 56.

69. E.A.Parfenov, G.E.Zaikov. Biometals and Ligands for Anticancer Drug Design: Superoxide Dismutase Models for Combined Tumor Therapy//Nova Science Publishers.-New York.-2000.-ln press.

70. EAParfenov, V.A.Trapkov, V.N.Tolkachev. A gastroprotector search in the coumarin superoxide dismutase models// Acta Biochimica Polonica- In press.

71. E.A.Parfenov, G.E.Zaikov. BioticType Antioxidants: The Perspective Search Area of Novel Chemical Drugs//PSV.-Zeist.-2000.-ln press.

Участок множительной техники ОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН

Подп. к печати 14.03„2000г. Заказ 50 Тираж 10