Физиологическая роль немышечных миозинов в подвижности клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Ненашева, Татьяна Анатольевна

• Ненашева, Татьяна Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ненашева, Татьяна Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общий обзор

1.1.1. Миозин

1.1.2. Мышечный миозин

1.1.3. Немышечный миозин

1.1.4. Миозин

1.1.5. Миозин

1.1.6: Миозин

1.1.7. Миозин

1.2. Роль цитоскелета в поддержании клеточной формы и подвижности

1.2.1. Актин и актин-связывающие белки

1.2.2. Роль микротрубочек в поддержании формы клетки

1.3. Свойства плазматической мембраны эукариотических клеток

1.4. Методы визуализации одиночных молекул, применяемые для микроскопии живых клеток

1.4.1. Введение

1.4.2. Лазерная эпифлуоресцентная микроскопия

1.4.3 .Конфокальная микроскопия

1.4.4.Микроскопия близкого поля

1.4.5. 2-х фотонная микроскопия

1.4.6.Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (ФМПВО)

1.4.7. Детекция и трассировка флуоресцирующих молекул на поверхности клеточной мембраны

2. МЕТОДЫ

2.1. Культивирование и трансфекция клеток

2.1.1. Культивирование клеток

2.1.2. Хранение клеток

2.1.3. Трансфекция клеток фрагментами ДНК

2.2. Описание установки Флуоресцентной Микроскопии Полного Внутреннего Отражения (ФМПВО)

2.2.1. Камера для прижизненной микроскопии

2.2.2. Оптическая схема Флуоресцентной Микроскопии Полного Внутренннего Отражения (ФМПВО)

2.2.3. Описание цифровых видеокамер, применяемых для записи

2.3. Методы детекции и трассировки одиночных молекул в живых клетках

2.3.1. Метод детекции неподвижных флуоресцирующих молекул

2.3.2. Метод детекции и трассировки флуоресцирующих молекул, движущихся на клеточной мембране

2.4. Автоматическое отслеживание траекторий миграции клеток

2.5. Количественная оценка подвижности клеток на поверхности субстрата

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

3.Подвижность эндотелиальных клеток и фибробластов на поверхности субстрата

4. Динамика движения отдельных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7, 10 на мембране фибробластов и эндотелиальных клеток

4.1. Динамика движения отдельных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7, 10 на мембране фибробластов

4.1.1. Миозин-1е на мембране фибробластов

4.1.2. Миозин-2Ь в фибробластах

4.1.3. Миозин-6 на мембране фибробластов

4.1.4. Миозин-7 на мембране фибробластов

4.1.5. Миозин-10 и его субфрагменты на мембране фибробластов

Полноразмерный миозин

Безголовая форма миозина

MyTH4-FERM

Плекстрин гомологичный домен 1,2 - ПГ

Плекстрин гомологичный домен 3 - ПГЗ

Плекстрин гомологичный домен 1,2,3 - ПГ

Резюме

4.2. Динамика движения отдельных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7, 10 и на мембране эндотелиальных клеток HUVEC

4.2.1. Миозин-1е на мембране HUVEC

4.2.2. Миозин-2Ь в эндотелиальных клетках HUVEC

4.2.3. Миозин-6 в эндотелиальных клетках HUVEC

4.2.4. Миозин-7 в эндотелиальных клетках (HUVEC)

4.2.5. Полноразмерный миозин-10 в эндотелиальных клетках HUVEC

Плекстрин гомологичный домен 1,2- ПГ

Плекстрин гомологичный домен 3 - ПГЗ

Плекстрин гомологичный домен 1,2,3 - ПГ

Резюме

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физиологическая роль немышечных миозинов в подвижности клеток»

Актуальность проблемы

Клеточная подвижность является фундаментальным биологическим процессом, который необходим для миграции клеток при эмбриональном развитии, формирования иммунного ответа, заживления ран и многих других жизненно важных физиологических функций многоклеточных и одноклеточных организмов.

Подвижность клеток зависит от их способности активно перестраивать свой актиновый филаментарный цитоскелет. Важнейшую роль в этом процессе выполняют актинсвязывающие моторные белки - миозины. Вместе с тем роль миозинов в обеспечении физиологических функций и сегодня остается одной из актуальных и вместе с тем наименее исследованных проблем современной физиологии. Во многом это связано с гетерогенностью данного класса белков, очень низким содержанием их в клетках, и тем, что многие из них открыты лишь в последние годы.

Благодаря огромному количеству работ посвященных мышечному сокращению [1, 7, 9, 10] миозин, выделенный из скелетных мышц (или миозин-2) , является одним из самых хорошо изученных белков. Однако в конце восьмидесятых годов стали появляться сообщения о том, что мышечный миозин является лишь одним из классов семейства миозинов [72]. В настоящее время (2007 год) уже известно 19 классов немышечных миозинов и их число продолжает пополняться [49]. Миозины обнаружены в клетках самых разнообразных тканей животных и растений, а их функции так же разнообразны [72, 98]. Они играют важную роль в поддержании формы клеток и клеточной подвижности (миозины 1е, 2а, 2Ь, 10), внутриклеточном транспорте (миозины 5, 6, 11), слухового восприятия (миозины 1с, 7а) [72] и других процессах. Мутации генов, кодирующие специфические миозины приводят к глухоте, слепоте, онкологическим и другим заболеваниям [46, 76, 98, 147].

Главной чертой, объединяющей миозины, является наличие «головного» домена, который может циклически связываться с актиновыми филаментами, и превращать химическую энергию гидролиза АТФ в механическую работу. В то же время «хвостовые» домены немышечных миозинов обладают значительным разнообразием, что позволяет им связываться с разнообразными белками и специализированными фосфолипидами. Наличие специализированных хвостовых доменов, а также вариации в скорости гидролиза АТФ и присоединения/отсоединения от актина определяют специфические клеточные функции немышечных миозинов.

Особый интерес представляют немышечные миозины, присоединяющиеся к клеточной мембране, подвижность которых существенно влияет на физиологическое состояние последней.

Одной из главных трудностей изучения немышечных миозинов является их исключительно низкая концентрация в клетках. Так, в отличие от хорошо изученного мышечного миозина-2 (40% от всех белков в скелетных мышцах), концентрация миозина-10 составляет всего несколько сотен молекул на клетку [89]. Поэтому для исследования функций немышечных миозинов "ш vivo" используют иммуно-окраску фиксированных клеток или трансфецируют клетки ДНК исследуемого миозина, соединенного с ДНК флуоресцентного белка для последующей визуализации миозинов в живых клетках. Однако, для обнаружения флуоресцентного сигнала методами эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии необходимо поддерживать исключительно высокий уровень трансфекции, во много раз превышающий физиологический.

Очевидно, что для исследования функций миозинов необходимо изучить подвижность и распределение одиночных молекул немышечных миозинов при физиологических концентрациях в живых клетках. Одним из методов, подходящих для визуализации отдельных молекул немышечных миозинов, помеченных флуоресцентным белком GFP и сравнения подвижности немышечных миозинов на поверхности мембраны эукариотических клеток с разным уровнем подвижности, является использование флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (ФМПВО) [150].

Цели и задачи

Цель исследования: Цель данной работы - изучить динамику перемещения одиночных молекул немышечных миозинов на поверхности клеточной мембраны, влияние их подвижности на клеточные функции, связанные с перестроением цитоскелета и установить взаимосвязь между подвижностью индивидуальных молекул немышечных миозинов и подвижностью клеток.

Задачи исследования:

1. Изучить различия в подвижности фибробластов и эндотелиальных клеток с использованием темнопольной микроскопии низкого увеличения и замедленной видеосъемки, комбинированной с автоматической трассировкой отдельных клеток.

2. Используя два типа клеток, фибробласты мыши и эндотелиальные клетки, исследовать влияние температуры на свойства клеточной мембраны и на динамику подвижности немышечных миозинов.

3. Исследовать присоединение одиночных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7а и 10 к базальной мембране клеток с различной подвижностью и изучить их специфическое распределение в зависимости от класса миозина.

4. Исследовать латеральную подвижность молекул с использованием методов автоматической детекции и определения пространственных координат одиночных молекул немышечных миозинов 1е, 2Ь, 6, 7а и 10 на последовательностях изображений базальной мембраны живых клеток.

5. Изучить отдельные функциональные домены миозина-10 (плекстрин гомологичные домены - ПГ12, ПГ123 и My TH4-FERM-домен) для исследования деталей связывания миозина-10 с клеточной мембраной и его последующего перераспределения в филоподии.

Научная новизна

Разработан новый метод автоматической трассировки отдельных клеток,перемещающихся по поверхности субстрата, используя темнопольную микроскопию с замедленной съемкой, для изучения подвижности клеток.

Впервые в мировой практике исследованы одиночные молекулы нескольких классов немышечных миозинов, которые могут прикрепляться к мембране живых клеток. Получена детальная информация о пространственно-временной динамике мембаносвязывающихся миозинов 1е, 6, 7а и 10, а также миозина-2Ь, который связывается не с плазматической мембраной, а со стрессовыми актиновыми волокнами.

Доказано, что подвижность миозинов зависит от класса миозина, от типа клеток, и в некоторых случаях, от температуры. Обнаружено, что в эндотелиальных клетках существует две популяции молекул миозина-1е и ПГ12, ПГ123 доменов миозина-10, а именно - подвижная и неподвижная фракции. Впервые показано, что молекулы миозина-6 могут связываться с плазматической мембраной, а не только с мембраной везикул в цитоплазме клетки. Доказано, что абсолютное большинство молекул миозина-7а практически неподвижны на мембране, поскольку прикрепляются к трансмембранным белкам, прочно связанным с внеклеточным субстратом, однако небольшая часть молекул может «плавать» на поверхности мембраны, следуя законам неограниченной диффузии в двухмерном пространстве. Показано, что перераспределение молекул на плазматической мембране может быть достигнуто как за счет перемещения молекул, прикрепленных к мембране, так и за счет динамического связывания молекул с клеточной мембраной, когда распределение молекул обусловлено их отсоединением и прикреплением на новом участке мембраны, а не только, и часто не столько, латеральной подвижностью.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые сведения о роли немышечных миозинов в изменении цитоскелета клетки, раскрывающие ранее не исследованные механизмы клеточной подвижности.

Установлено, что температура оказывает существенное влияние на зависимую от немышечных миозинов перестройку цитоскелета.

Теоретически обоснована методология исследования отдельных молекул на клеточной мембране (визуализация + автоматическая детекция), что позволяет изучать многочисленные физиологические и патологические процессы, развивающиеся в непосредственной близости от мембраны или в самой мембране.

Разработан новый метод исследования подвижности клеток, который может быть применен для широкого круга физиологических исследований разных клеток, позволяющий изучать характер движения индивидуальных клеток.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клеточная подвижность зависит от скорости перестроения цитоскелета у разных типов клеток, подвижность фибробластов при 37°С в 5 раз ниже подвижности эндотелиальных клеток.

2. Метод ФМПВО позволяет визуализовать одиночные молекулы миозинов-1е, 6, 7а, 10 присоединяющиеся к базальной мембране живой клетки.

3. Латеральная подвижность немышечных миозинов, прикрепляющихся к плазматической мембране, зависит не только от класса миозина, но и от свойств плазматической мембраны (типа клеток) а также, в некоторых случаях, от температуры.

4. Каждый из миозинов (1е, 6, 7а, 10) имеет свое специфическое место локализации и функционирования в клетке.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были апробированы на конференции «European Muscle Conference» (о. Эльба, Италия) 12-15 сентября 2004 г.; на конференции «Biological motility: Basic research and practice» (г. Пущино) 11-15 мая 2006 г; на ежегодной конференции биофизического общества в Балтиморе (США) (51 Biophysical Society Annual Meeting, Baltimore) 6-10 марта 2007 г. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК - 1 работа.

Внедрение результатов исследования Результаты диссертационной работы могут быть использованы для исследования различных процессов в иммунологии и патологической физиологии. В настоящее время результаты диссертации используются в отделе физической биохимии национального института медицинских исследований (Лондон, Великобритания) для анализа подвижности изолированных клеток, мигрирующих на поверхности субстрата, и для оценки подвижности одиночных флуоресцирующих молекул, присоединенных к базальной мембране исследуемых клеток.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и двух экспериментальных глав, обсуждения результатов, заключения и списка литературы из 161 наименования. Диссертация изложена на 155 страницах, включая 45 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Ненашева, Татьяна Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Для изучения подвижности клеток разработан метод темнопольной микроскопии низкого увеличения с замедленной съемкой в сочетании савтоматической трассировкой.

2. Клеточная подвижность зависит от типа исследуемых клеток, структуры цитоскелета и от скорости его перестроения. Подвижность фибробластов при 37°С в 5 раз ниже подвижности эндотелиальных клеток.

3. Метод ФМПВО позволяет визуализовать одиночные молекулы миозинов-1е, 6, 7а, 10 на базальной мембране клетки, что впервые подтверждает динамическое прикрепление миозинов 1е, 6, 7а, 10 к плазматической мембране живых клеток. Каждый из вышеперечисленных миозинов имеет свое специфическое место локализации и функционирования в клетке.

4. Латеральная подвижность немышечных миозинов, прикрепляющихся к плазматической мембране, зависит не только от класса миозина, но и от свойств плазматической мембраны (типа клеток) а также, в некоторых случаях, от температуры.

5. Миозин 1-е сосредоточен в ламеллоподиях клетки и активно участвует в ее выдвижении. Отдельные молекулы миозина-1е на мембране имеют высокую латеральную подвижность, близкую к подвижности ПГ-доменов миозина-10.

6. Миозин-2Ь присоединяется к стрессовым актиновым волокнам, где отдельные молекулы визуализованы как цепочки пятен, расположенные с правильными интервалами 0,5рм. Молекулы миозина-2Ь неподвижны или двигаются вместе с актиновыми волокнами при перестроении цитоскелета клетки.

7. .Миозин-6, ответственный за внутриклеточный транспорт везикул, также присоединяется и к плазматической мембране. Латеральная подвижность миозина-6 очень низка и близка к подвижности миозина-7.

8. Миозин-7а, содержащий две пары MyoTH4-FERM доменов, как и изолированные MyoTH4-FERM домены миозина-10 неподвижен на клеточной мембране, поскольку присоединяется к трансмембранным якорным белкам, связанным с субстратом и выполняет функции связывающего звена между цитоскелетом и трансмембранными белками.

9. Молекулы миозина-10, прикрепившиеся к специфическим фосфоиноцитолам мембраны ПГ123 доменами, способны быстро двигаться на мембране до момента, когда они прикрепятся к неподвижным трансмембранным якорным белкам, через MyoTH4-FERM домен, или к актиновому филаменту цитоскелета через головную часть молекулы. После присоединения миозина-10 к актиновому цитоскелету происходит объединение молекул миозина-10 в комплексы и концентрование миозина-10 в кончиках филоподий. Образование филоподий имеет важное физиологическое значение для последующего образования ламеллоподий и перемещения клеток.

10. Миозины 1е, 6, 7, 10, имеют значимый коэффициент диссоциации от мембраны. Молекулы могут перераспределяться на клеточной мембране в результате латеральной диффузии и в результате процесса «открепления — свободного плавания в цитоплазме - прикрепления на новом участке». Такой способ перемещения имеет преимущества в клетках с ограниченной подвижностью молекул на мембране, поскольку скорость диффузии белков в цитоплазме в десятки раз выше скорости латеральной диффузии на поверхности мембраны.

140

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ненашева, Татьяна Анатольевна, 2008 год

1. Бэгшоу К. Мышечное сокращение. / К. Бэгшоу М.: Мир, 1985. - 128 С.

2. Воробьев И. А. Динамика микротрубочек в культивируемых клетках / И. А. Воробьев, И С. Григорьев, Г. Г. Бориси // Онтогенез, 2000. Т. 31, №6. - С. 420-428.

3. Воробьев И.А. Динамика и жизненный цикл микротрубочек в клетке / И.А. Воробьев, И.С. Григорьев // Цитология и генетика, 2003. №2. - С. 22-39.

4. Де Дюв К. Путешествие в мир живой клетки / Москва. «Мир». 1987. 255с.

5. Культура животных клеток. Методы: Пер с англ. под ред. Р. Фрешни. / Д. Конки, Э. Эрба, Р. Фрешни, Б. Гриффите, Р. Хей, И. Ласнитски, Г. Маурер, JI. Мораска, Э. Вилсон // М. «Мир», 1989. 333 с.

6. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза / Б.П. Копнин // Биохимия. 2000. Т65. В.1.С. 5-33.

7. Ненашева Т.А. Визуализация одиночных флуоресцирующих молекул в живых клетках / Т.А. Ненашева, Г.И. Машанов // Биофизика, 2006. -Том 51, Вып. 3. С. 454-465.

8. Поглазов Б. Ф. Миозин и биологическая подвижность. / Б.Ф. Поглазов, Д.И. Левицкий М.: Наука, 1982. - 160 С.

9. A brilliant monomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictiostelium / M. Fischer, I. Haase, E. Simmeth, G. Gerischb, A. Muller-Taubenberger // FEBS Letters, 2004. V.577. - P.227-232.

10. A microtubule-binding myosin required for nuclear anchoring and spindle assembly. / K.R. Weber, A.M. Sokac, J.S. Berg, R.E. Cheney and W.M. Bement // Nature, 2004. V. 431. - P.325-329.

11. A novel plant calmodulin-binding protein with a kinesin heavy chain motor domain / A.S. Reddy, S.B. Narasimhulu, F. Safadi, M. Golovkin, X. Hu // J. Biol. Chem., 1996. V.271. - P.7052-7060.

12. A role for myosin VII in dynamic cell adhesion / R.I. Tuxworth, I. Weber, D. Wessels, G.C. Addicks, D. Soil, G. Gerisch and M. A. Titus // Current Biology. 2001.-V.11.-P.318-329

13. Auto fluorescent proteins in single-molecule research: applications to cell imaging microscopy / G.S. Harms, L. Cognet, P.H.M. Lommerse, G.A. Blab, T. Schmidt // Biophys. J., 2001. V. 80. - P. 1296-2408.

14. Axelrod D. Total internal reflection fluorescence microscopy / D. Axelrod // Methods Cell Biol., 1989. V.30. - P. 245-70.

15. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence. In Topics in Fluorescent Spectroscopy / D. Axelrod (Lakowicz J. R., Ed.) // Plenum Pres. New York, 1992. V.3. - P. 289-342.

16. Axial rotation of sliding actin filaments revealed by single-fluorophore imaging / I. Sase, H. Miyata, S. Ishiwata, K. Kinosita // PNAS USA, 1997. V. 94. - P. 5646-5650.

17. Berg J.S. Myosin-X is unconventional myosin that undergoes intrafilopodial motility / J.S Berg., R.E. Cheney // Nature cell biology, 2002. V.4. - P.

18. Betzig E. Single molecules observed by near-field scanning optical microscopy / E. Betzig, R.J. Chichester // Science, 1993. V. 262. - P. 1422-1425.

19. Blanchoin L. Interactions of ADF/cofilin, Arp2/3 complex, capping protein and profilin in remodeling of branched actin filament networks / L. Blanchoin, T.D. Pollard, R.D. Mullins // Current Biology, 2000. V. 10. - P. 1273-1282. 19.

20. Bray D. Cell movements. From molecules to motility / Bray D. Garland New York, 2001.-372 p.

21. Campbell I.D. The talin-tail interaction places integrin activation on FERM ground / I.D. Campbell and M.H. Ginsberg, // Trends Biochem. Science, 2004. -V.29. P. 429-435.

22. Cantley L.C. The phosphoinositide 3-kinase pathway / L.C. Cantley // Science, 2002. V.296. - P. 1655-1657.

23. Cell biochemistry studied by single-molecule imaging / G.I. Mashanov, T.A. Nenasheva, M. Peckham, J.E. Molloy // Biochemical Society Transactions, 2006. Y. 34. Part 5. - P. 983-988.

24. Cell movement patterns during gastrulation in the chick are controlled by positive and negative chemotaxis mediated by FGF4 and FGF8. / X. Yang, D. Dormann, A.E. Mu'nsterberg and C.J. Weijer // Developmental Cell, 2002. Vol. 3. - P. 425-437.

25. Cheezum M.K. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles / M.K. Cheezum, W.F. Walker, W.H. Guilford // Biophys. J., 2001. V.81.-P. 2378-2388.

26. Chishti. A.H. The FERM domain: a unique module involved in the linkage of cytoplasmic proteins to the membrane / A.H. Chishti, A.C. Kim, S.M. Marfatia, M. Lutchman, M. Hanspal // Trends Biochem. Sci., 1998. V.23. - P. 281-282.

27. Cholesterol dictates the freedom of EGF receptors and HER2 in the plane of the membrane / G. Orr, D. Hu, S. Ozcelik, L.K. Opersko, H.S. Wiley, S.D. Colson // Biophys. J., 2005. V. 89. - P. 1362-1373.

28. Comer F.I. PI 3-kinases and PTEN: how opposites chemoattract / F.I. Comer and C.A. Parent // Cell, 2002. V.109. - P.541-544.

29. Creating new fluorescent probes for cell biology / J. Zhang, R.E. Campbell, A.Y. Ting, R.Y. Tsien // Nature reviews / molecular cell biology, 2002. V. 3. - P. 906918.

30. Denk W. 2-photon laser scanning fluorescence microscopy / W. Denk, J.H. Strickler, W.W. Webb // Science, 1990. V. 248. - P.73-76.

31. Dictiostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis / S. Bozzaro, P.R. Fisher, W. Loomis, P. Satir and J.E. Segal and Guenther Gerisch // Trends in Cell Biology, 2004. Vol.14. №10. - P.585-588.

32. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase: myosins in photoreceptor cells. / J.A. Porter, J.L. Hicks, D.S. Williams and C. Montel // J. Cell Biol., 1992. V.l 16. - P. 683-693

33. Differential roles for actin polymerization and a myosin II motor in assembly of the apical epithelial junctional complex / A.I. Ivanov, D. Hunt, M. Utech, A. Nusrat, C.A. Parcos // Manuscript E 05-01-0043, Revision 1.

34. Epstein, H.F. Molecular analysis of protein assembly in muscle development / H. F. Epstein, D.A. Fischman // Science, 1991. V. 251. - P. 1039-1044.

35. Finer J.T. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps / J.T. Finer, R.M. Simmons, J.A. Spudich // Nature, 1994. V. 368. - P. 113119.

36. Fluorescence localization after photobleaching (FLAP): a new method for studying protein dynamics in living cells / G.A. Dunn, I.M. Dobbie, J. Monypenny, M.R. Holt and D. Zicha // Journal of Microscopy, 2002. V. 205. -P. 109-112.

37. Forces developed by Drosophila wild-type and mutant actin interacting with rabbit heavy meromyosin measured by an optical tweezers transducer / J.E Molloy., J. E. Burns, J. C. Sparrow, D. C. S. White // Biophys. J., 1995. V. 68. -P. 238s.

38. Ford L. E. Tension responses to sudden length changes in stimulated frog muscle fibres / L.E. Ford, A.F. Huxley, R.M. Simmons // J. Physiology, 1977. V. 269. -P. 441-515.

39. Frank D.J. Myosin VI: a structural role in actin organization important for protein and organelle localization and trafficking / D.J. Frank, T. Noguchi, K.G. Miller // Curr. Opin. Cell Biol., 2004. V.16. - P. 189-194.

40. Geisbrecht E.R. Myosin VI is required for E-cadherin mediated border cell migration / E.R. Geisbrecht, D.J. Montell // Nat. Cell. Biol., 2002. V.4. - P.616-620.

41. Goulian M. Tracking single proteins within cells. / M. Goulian, S.M. Simon // Biophys. J., 2000. V. 79. - P. 2188-2198.

42. Hodge T A myosin family tree / T. Hodge, M.J.T.V. Cope // Journal of Cell Science, 2000. V. 113. - P. 3353-3354.

43. Hotulainen P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells / P. Hotulainen, P. Lappalainen // The Journal of Cell Biology, 2006. V. 173. - P. 383-394.

44. Howard J. Mechanics of motor proteins and the cytoskeleton / J. Howard Sinauer Associates, Inc. - 2001. - 367 P.

45. Huxley A.F. Muscle structure and theories of contraction / A.F. Huxley // Prog. Biophys. Biophys. Chem., 1957. V. 7. - P. 255-318.

46. Huxley A.F. Proposed mechanism of force generation in striated muscle / A.F. Huxley, R.M. Simmons // Nature, 1971. V. 233. - P. 533-538.

47. Karp G. Cell and molecular biology. Concepts and experiments. / G. Karp. John Wiley&Sons Inc., - 2002. - 780 p.

48. Kellerman K.A. An unconventional myosin heavy chain gene from Drosophila melanogaster / K.A. Kellerman, K.G. Miller // J. Cell Biol., 1992. V.119. -P.823-834.

49. Kendal J.M. Aequorea Victoria bioluminescence moves into exiting new era / J.M. Kendal, M.N. Badminton // Trends in Biotech., 1998. V. 16. - P. 216-224.

50. Kinesin walks hand-over-hand / A. Yildiz, M. Tomishige, R.D. Vale, P.R. Selvin // Science, 2004. V. 303. - P. 676-678.

51. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling / D.M. Chudakov, V.V. Belousov, A.G. Zaraisky, V.V. Novoselov, D.B. Staroverov, D.B. Zorov, S. Lukyanov, K.A. Lukyanov //Nature Biotech., 2003. V. 21. - P. 191-194.

52. Kolega J. Cytoplasmic dynamics of myosin IIA and IIB: spatial 'sorting' of isoforms in locomoting cells / J. Kolega // Journal of Cell Science, 1998. V. 111. - P. 2085-2095.

53. Konig K. Multiphoton microscopy in life science / K. Konig // J. Microscopy, 2000. V.200. - P. 83-104.

54. Kovacs M. Mechanism of action of myosin X, a membrane-associated molecular motor / M. Kovacs, F. Wang, J.R. Sellers // J. Biol. Chem., 2005. V.280. -P.15071-15083.

55. Krendel M. Myosin IE interacts with synaptojanin-1 and dynamin and is involved in endocytosis / M. Krendel, E.K. Osterweil, M.S. Mooseker // FEBS Letters, 2007.-V. 581.-P. 644-650.

56. Kurzchalia T.V. Membrane microdomains and caveolae. / T.V. Kurzchalia, R.G. Parton // Cur. Opin. Cell Biol., 1999. V. 11(4). - P.424-431.

57. Low mobility of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate underlies receptor specificity of Gq-mediated ion channel regulation in atrial myocytes. / H. Cho,

58. Y.A. Kim, J-Y. Yoon, D. Lee, J.H. Kim, S.H. Lee, W-K. Ho // PNAS, 2005. V. 102. - P. 15241-15246.

59. Margosian S. S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle / S. S. Margosian, S. Lowey // Methods in Enzymology, 1982. V. 85. - P. 55-71.

60. Mashanov G. I. Automatic Detection of Single Fluorophores in Live Cells / G.I. Mashanov and J.E. Molloy // Biophysical Journal, 2007. V. 92. - P. 2199-2211.

61. MAX-1, a novel PH/MyTH4/FERM domain cytoplasmic protein implicated in netrin-mediated axon repulsion / X. Huang, H.J. Cheng, M. Tessier-Lavigne, Y. Jin // Neuron, 2002. V.34 (4). - P. 563-576.

62. Mogliner A. Polymer motors: Pushing out and pulling up the back. Review / A. Mogliner, G. Oster // Current Biology. V.13. - P.721-733.

63. Montell C. The Drosophila ninaC locus encodes two photoreceptor cell specific proteins with domains homologous to protein kinases and the myosin heavy chain head / C. Montell and G. M. Rubin // Cell, 1988. V.52. - P.757-772.

64. Mooseker M.S. Unconventional myosins. / M.S. Mooseker, R. Cheney // Annual Review in Cell Developmental Biology, 1995. V. 11. - P. 633-675.

65. Motor function and regulation of myosin X / K. Homma, J. Saito, R. Ikebe,'M. Ikebe // The Journal of Biological Chemistry, 2001. V. 276. №36. - P. 3434834354.

66. Mutations of MY06 are associated with recessive deafness, DFNB37 / Z.M. Ahmed, R.J. Morell, S. Riazuddin, A. Gropman, S. Shaukat, M.M. Ahmad, S.A. Mohiddin, L. Fananapazir, R.C. Caruso, T. Husnain et al. // Am J. Hum. Genet., 2003.-V. 72.-P.1315-1322.

67. Myosin lc and myosin IIB serve opposing roles in lamellipodial dynamic of the neuronal growth cone / TJ. Diefenbach, V.M. Latham, D. Yimlamai, C.A. Liu, I.M. Herman and D.G. Jay // The Journal of Cell Biology, 2002. V. 158. N. 7. -P. 1207-1217.

68. Myosin V is a left handed spiral motor on the right-handed actin helix / АН M. Yusuf, S. Uemura, K. Adachi, H. Itoh, K. Kinosita, S. Ischiwata // Nature Structural Biology, 2002. V. 9. - P. 464-467.

69. Myosin VI is an actin-based motor that moves backwards / A.L Wells ., A.W. Lin , L.Q. Chen, D. Safer , S.M. Cain, T. Hasson, B.O. Carragher, R.A. Milligan, H.L. Sweeney //Nature, 1999. V. 401(6752). - P.505-508.

70. Myosin VI isoform localaised to clatrin-coated vesicles with a role in clatrin-mediated endocytosis / F. Buss, S. Arden, M. Lindsay, P. J. Luzia, Kendric-Jons // EMBO J., 2001. V20. N.14. - P. 3676-3584.

71. Myosin VI is a processive motor with a large step size. / R.S. Rock, S.E. Rice, A.L. Wells, T.J. Purcell, J.A. Spudich, H.L. Sweeny // PHAS, 2001. V. 98. №.24. - P.13655-13659.

72. Myosin VI plays a role in cell-cell adhesion during epithelial morphogenesis / H. Millo, K. Leaper, V. Lazou, M. Bownes // Mech. Dev., 2004. V. - 121. P. 13351351.

73. Myosin Vllb, a novel unconventional myosin, is a constituent of microvilli in transporting epithelia / Z.Y. Chen, T. Hasson, D.S. Zhang, B.J. Swender, B.H. Defler, M.S. Moosecer, D.P. Corey // Genomics, 2001. V.72. - P. 285-296.

74. Myosin-X, a novel myosin with pleckstrin homology domains, associates with regions of dynamic actin / Berg J.S., Derfler B.H., Pennisi C.M., Corey D.P., Cheney R.E. //Journal of Cell Science, 2000. V.l 13. - P. 3439-3451.

75. Myosin X is a downstream effector of PI(3)K during phagocitosis / D. Cox, J.S. Berg, M. Cammer, J. Chinegwundoh, B. Dale, R.E. Cheney and S. Greenberg // Nature Cell Biology Advance Online Publication/ http://cellbio.nature.com, P.l-10.

76. Myosin X provides a motor-based link between integrins and cytosceleton / H. Zhang, J.S. Berg, Z. Li, Y. Wang, P. Land, A.D. Sousa, A. Bhaskar, R. Cheney, S. Stromblad // Nature Cell Biology, 2004. V. 6. - P.523-531.

77. MyolO in brain: developemental regulation, identification of a headless isoform and dynamics in neurons / A.D. Sousa, J.E. Berg, B. Robertson, R. Meeker, R. Cheney // Journal of Cell Science, 2006. V.l 19. - P. 184-194.

78. Myosin-Specific Adaptations of the Motility Assay / J.R. Sellers, G. Cuda, F. Wang, E. Homsher // Methods in Cell Biology, 1993. V.39. - P. 23-49. 121.

79. Nanometre resolution tracing of myosin-lb motility / M.I. Wallance, C. Batters, L.M. Coluccio, J.E. Molloj // IEE Proc.-Nanobiotechnol., 2004 V. 150. P. 134140.

80. Nuclear myosin VI enhances RNA polymerase II-dependent transcription / S. Vreugdle, C. Ferrai, A. Miluzio, E. Hauben, P.C. Marchisio, M.P. Crippa, M. Bussi, S. Biffo // Mol. Cell, 2006. V. 23. - P.749-755.

81. Oliver T.N. Tails of unconvencial myosins. Multi-author review article / T.N. Oliver, J.C. Berg and R.E. Cheney // CLMS. Cellular and Molecular Life Science, 1999.-V. 56.-P. 243-257.

82. Pardee J.D. Purification of muscle actin / J.D. Pardee, J.A. Spudich // Methods in Cell Biology, 1982. V. 24. - P. 271-289.

83. Parker P.J. The ubiquitous phosphoinositides / P.J. Parker // Biochemical Society Transactions, 2004. V. 32. Part 6. - P. 893-898.

84. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane / T. Fujiwara, K. Ritchie, H. Murakoshi, K. Jakobson, A. Kusumi // J. Cell Biol., 2002. -V. 157.-P. 1071-1081.

85. Pierce, D.W. Imaging individual green fluorescent proteins / D.W. Pierce, N. Hom-Booher, R.D. Vale // Nature, 1997. V.388. - P. 338.

86. Pierce D.W. Single-molecule detection of green fluorescent protein and application to single-protein dynamics / D.W. Pierce, R.D. Vale // In Methods in Cell Biol. (ed. Sullivan, K.F. & Kay, A.A.). Academic Press. San Diego, 1999. -V.58. P. 49-73.

87. Photochemical mapping of active site of myosin / R.G. Yount, C.R. Cremo, J.C. Grammer, B.A. Kerwin // Phil. Trans. Roy, Soc. London. В., 1992. V. 336. № 1276. - P. 55-60.

88. Pollack G.H. Muscles and molecules. Uncovering the principles biological motion / G. H.Pollack Seattle: Ebner & Sons Publishers - 1990. - 300 p.

89. Pollard T.D. Acanthamoeba myosin. I. Isolation from Acanthamoeba castellanii of an enzyme similar to muscle myosin / T.D. Pollard, E.D. Corn // Journal of Biological Chemistry, 1973. V.248, - P. 4682-4690.

90. Pollard T.D. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments / T.D. Pollard, G.G. Borisy // Cell, 2003. V. 112. - P.453-465.

91. Presley J.F. ER-to-Golgi transport visualized in living cells / J.F. Presley et al. //Nature, 1997. V. 389. - P. 81-86.

92. Properties of lipid microdomains in a muscle cells membrane visualized by single molecule microscopy / GJ. Schutz, G. Kada, V.Ph. Pastushenko, H. Schindler // EMBO J., 2000. V. 19. - P. 892-901.

93. Qian H. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems / H. Qian, M.P. Sheetz, E.L. Elson // Biophysical J., 1991 -V. 60(4). -P.910-921.

94. Quantum dots for life cells, in vivo imaging and diagnostics / X. Michalet, F.F. Pinaud, L.A. Bentolita, J.M. Tsay, S. Doose, J.J. Li, G. Sundaresan, A.M. Wu, S.S. Gambhir, S. Weiss // Science, 2005. V. 307. - P.538-544.

95. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope / I. Sase, H. Miyata, J.E.T. Corrie, J.S. Craik, K. Kinosita // Biophysical J., 1995. V.69. - P.323-328.

96. Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules / M.F. Garcia-Parajo, G.M.J. Segers-Nolten, J.A. Veerman, J. Greve, van N.F. Hulst // PNAS, 2000. V. 97. - P.7237-7242.

97. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus / G. Seisenberger, M.U. Ried, Th. Endre|3, H: Buning, M. Hallek, Ch. Brauchle // Science, 2001. V. 294. - P. 1929-1932.

98. Rechsteiner M. PEST sequences and regulation by proteolysis / M. Rechsteiner and Rogers S.W. // Trends Biochem. Sci., 1996 V.21. - P.267-271. ' •

99. Role of myosin VI in the differentiation of cochlear hair cells / T. Self, T. Sobe, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, K.B. Avraham, K.P. Steel // Dev. Biol., 1999. -V. 214. -P.331-341.

100. Ruegg J. C. Calcium in muscle activation (a comparative approach) / J.C. Ruegg Berlin: Springer-Verlag, 1988'. - P. 12-150.

101. Sako Y. Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells / Y. Sako, Sh. Minoguchi, T. Yanagida // Nature Cell Biol., 2000. V. 2. -P.168-172.

102. Sako, Y. Total internal reflection fluorescence microscopy for single-molecule imaging in living cells / Y. Sako, T. Uyemura // Cell structure and function, 2001. V. 27. - P.357-365.

103. Saxton M.J. Single-particle tracking: the distribution of diffusion coefficients. M.J. Saxton // Biophysical Journal, 1997. V. 72. - P. 1744-1753. 116.

104. Sellers J.R. Myosins: a diverse superfamily / J.R. Sellers // Biochim. Biophys. Acta., 2000. V. 1496(1). - P.3-22.

105. Simons K. Functional rafts in cell membranes. / K. Simons, E. Ikonen // Nature, 1997. V.387(6633). - P.569-72.

106. Single-molecule analysis of chemotactic signaling in Dictiostelium cells / M Ueda, Y. Sako, T. Tanaka, P. Devreotes, T. Yanagida // Science, 2001. V. 294. -P.864-867.

107. Single-molecule imaging of signaling molecules in living cells / Y. Sako, K. Hibino, T. Miyauchi, Y. Miyamoto, M. Ueda, T. Yanagida // Single mol. 2000. V. 1. P. 151-155.

108. Single-molecule mechanics of heavy meromyosin and SI interacting with rabbit or drosophila actins using optical tweezers / J.E. Molloy, J.E. Burns, J.C.

109. Sparrow, R.T. Tregear, J. Kendrick-Jones, D.C.S. White // Biophys. J., 1995. V. 68. - P.298s-305s.

110. Sousa A.D. Myosin-X: a molecular motor at the cell's fingertips / A.D. Sousa, R.E. Cheney // Review. Trends in Cell Biology, 2005. V. 15. № 10. - P.533-539.

111. Spatial Sensing in Fibroblasts Mediated by 3' Phosphoinocitides / J.M. Haugh, F. Codazzi, M. Teruel and T. Meyer // The Journal of Cell Biology, 2000. V. 151. №6. - P.1269-1279.

112. Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of P-actin. / M. Peckham, G. Miller, C. Wells, D. Zicha and G. Dunn // Journal of Cell Science, 2001. V.l 14. - P.1367-1377.

113. Sprong H. How proteins move lipids and lipids move proteins / H. Sprong, P. van der Sluijs, G. van Meer // Nature, 2001. V.2. - P.504-513.

114. Structural basis of the membrane-targeting and unmasking mechanisms of the radixin FERM domain / K. Hamada, T. Shimizu, T. Matzui, S. Tsukita, T. Hakoshima // EMBO J., 2000. V.19. - P.4449-4462.

115. Structural studies of myosin : nucleotide complexes: A revised model for the molecular basis-of muscle contraction / A.J. Fisher, C.A. Smith, J. Thoden, R. Smith, K. Sutoh, H. M. Holden, I. Rayment // Biophys. J., 1995. V. 68. - P:19s-28s.

116. Structure of the ERM protein moesin reveals the FERM domain fold1 masked by an extended* actin binding tail domain / M.A. Pearson, D: Reczek, A. Bretsher, P.A. Karplus // Cell, 2000. V. 101. - P.259-270.

117. Svitkina T.M. Progress in protrusion: the tell-tale scar / T.M. Svitkina, G.G. Borisy // TIBS, 1999. V. 24. - P.432-436.

118. Sweeney H L. What can myosin VI do in cells? / H L. Sweeney and A. Houdusse // Current Opinion in Cell Biology, 2007. V.19. - P.57-66.

119. Takon D. Imaging myosin 10 in cells. / D. Takon, P.J. Knight and M. Peckham // Biochemical Society transactions, 2004. Vol. 32, part 5. - P.689-693.

120. Taylor M.V. Muscle differentiation: How two cells become one. Review /M.V. Taylor // Current Biology, 2002. V. 12. - P.224-228.

121. The lamellipodium: where the motility begin. Review / J.V. Small, T. Stradal, I. Vignal and K. Rottner // Trends in Cell Biology, 2002. Vol. 12. N 3. - P.l12-120.

122. The motor domain determines the large step of myosin-V. / H. Tanaka, K. Homma, A.H. Iwane, E. Katayama, R. Ikebe, J. Saito, T. Yanagida, N. Ikebe // Nature. V.415. - P. 192-195.

123. Thompson R.E. Precise nanometer localisation analysis for individual fluorescent probes / R.E.Thompson, D.R. Larson, W.W. Webb // Biophysical J., 2002.-V. 82. P.2775-2783.

124. The SH3 domain of a M7 interacts with its C-terminal proline-rich region / Q. Wang, M.A. Deloia, Y. Kang, C. Litchke, N. Zhang, M.A. Titus and K.J. Walters //Protein Sci., 2007. V.16. - P.189-196.

125. The spatial and temporal dynamics of pleckstrin homology domain binding at the plasma membrane measured by imaging single molecules in live mouse myoblasts. / G.I. Mashanov, D. Tacon, M. Peckham, J. Molloy // The Journal of

126. Biological Chemistiy. 2004. V.279. № 15. P.l5274-15280.

127. Titus M. Cytoskeleton: Getting to the point with myosin VI / M. Titus // Current Biology, 2000. V.10. - R294-R297.

128. Токио Н Myosin X transports Mena/VASP to the tip of fiopodia. / H. Токио, M. Ikebe // Biochemical and Biophysical Research Communication, 2004. -V. 319. -P.214-220.

129. Uyeda T.Q.P. Enzymatic activities correlate with chimaeric substitutions at the actin-binding face of myosin / T.Q.P. Uyeda, K.M. Ruppel, J.A. Spudich // Nature, 1994. V. 368. - P.567-569.

130. Visualizing single molecules inside living cells using total internal reflection fluorescence microscopy. / G.I. Mashanov, D. Tacon, A.E. Knight, M. Peckham, J.E. Molloy // Methods, Elsevier, 2003. V.29. - p. 142-152.

131. Visualization of the actin cytoskeleton by cryoelectron microscopy / G.P. Resch, K.N. Goldie, A. Krebs, A. Hotnger and V. Small // Journal of Cell Science, 2002. V.l 15.-P. 1877-1882.

132. Watanabe N. Single-Molecule spekle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. / N. Watanabe, T.J. Mitchison // Science, 2002. V.295. - P. 10831086.

133. Weber M. A. Dynamics of single dye molecules observed by confocal imaging and spectroscopy. / M.A. Weber, F. Stracke, A.J. Meixner // Cytometry, 1999. -V.36.-P.217-223.

134. Wei Q. Conditional expression of a truncated fragment of non-muscle myosin II-A alters cell shape but not cytokines in HeLa cell's / Q. Wei, R.S. Adelstein // Molecular Biology of the Cell, 2000. V. 11. - P.3617-3627.

135. Woledge R. C. Energetic aspects of muscle contraction. / R.C. Woledge, N.A. Curtin, E. Homsher London: Academic Press. - 1985. - P.8-212.

136. Yanagida Т. Stochastic processes in nano-biomachines revealed by single molecule detection / T. Yanagida, Y. Ishii // BioSystems, 2003. V.71. - P.233-244.

137. Yan K.S. PTB or not PTB-that is the question / K.S. Yan, M. Kuti, M.M. Zhou // FEBS Letters, 2002. V.513 (1). - P.67-70.

138. Yeast actin filaments display ATP-dependent sliding movement over surfaces coated with rabbit muscle myosin / S.J. Kron, D.J. Drubin, D. Botstein, J.A. Spudich // Biochem. Med. and Metab. Biol., 1991. V. 45. № 2. - P.171-180.

139. Yildiz A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localisation / A. Yildiz, J.N. Forkey, S.A. McKinney, T. Ha, Y.E. Goldman, P.R. Selvin // Science, 2003. V.300. - P. 2061-2065.

140. Zot H.G. Motility of Myosin I on Planar Lipid Surfaces / H.G. Zot, T.D. Pollard // Methods in Cell Biology. 1993. V. 39. - P. 51-63.