Физические методы адресации биологически активных веществ в живых системах с использованием полимерных микроносителей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Курочкин Максим Андреевич

• Курочкин Максим Андреевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Курочкин Максим Андреевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Последовательная полиионная адсорбция

1.2 Полимерные микрокапсулы

1.3 Инкапсуляция биологически активных веществ

1.4 Визуализация и контроль распределения полимерных носителей в живых системах

1.5 Методы визуализации движения форменных элементов крови

Глава 2. PIV анализ сосудистых микропотоков крови

2.1 Введение

2.2 Материалы и методы

2.2.1 Экспериментальная установка

2.2.2 Объект исследований

2.2.3 Измерение скорости крови

2.3 Результаты и обсуждение

2.4 Выводы

Глава 3. In vitro и in vivo адресация магнитных микрокапсул

при помощи магнитного пинцета

3.1 Введение

3.2 Материалы и методы

3.2.1 Протокол синтеза наночастиц Fe304

3.2.2 Получение RITC-конъюгированного BSA

3.2.3 Приготовление микрокапсул

3.2.4 Конфокальная микроскопия

3.2.5 Сканирующая электронная микроскопия (SEM)

3.2.6 Флуоресцентная визуализация микрокапсул

3.2.7 Системы магнитной адресации микрокапсул

3.2.8 Эксперименты in vitro

3.2.9 Эксперименты in vivo

3.2.10 Гистологический анализ

3.3 Результаты и обсуждение

3.4 Синтез микрокапсул

3.5 In vitro магнитный захват микрокапсул

3.6 In vivo магнитная адресация магнитных микрокапсул в брыжейке крысы

3.7 Анализ динамики кровотока до и после введения микрокапсул методами PIV

3.8 Выводы

Глава 4. Формирование клеточной колонии в потоке жидкости

под действие внешнего магнитного поля

4.1 Введение

4.2 Материалы и методы

4.2.1 Клеточная линия

4.2.2 Колориметрическая оценка метаболической активности клеток

4.2.3 Визуализация динамики микропотоков клеточной суспензии

4.3 Результаты и обсуждение

4.3.1 Интернализация магнитных микрокапсул

4.3.2 In vitro магнитная адресация клеток в стеклянном

канале

4.3.3 Выводы к главе

Глава 5. Оптоптоволоконная активация полимерной

•• и и •• О /"

трехмерной микроструктурированной пленки

5.1 Введение

5.2 Материалы и методы

5.2.1 Микропечать полимерных трёхмерных микроносителей

5.2.2 ^стема лазерной ИК активации полимерных контейнеров оптическим волокном

5.3 Результаты и обсуждение

5.3.1 Лазерная ИК активация полимерных трёхмерных

микро структурированных плёнок при помощи оптического волокна

5.4 Выводы

Глава 6. In situ опосредованная ИК-лазерная адресация

биологически активных веществ для экспрессии зелёного флуоресцентного белка у единичных клеток на основе биосовместимых полимерных трёхмерных микроструктурированных плёнок

6.1 Введение

6.2 Материалы и методы

6.2.1 Изготовление полимерной трёхмерной

микро структурированной плёнки

6.2.2 Клеточная линия миобластов С2С12

6.2.3 Культивация миобластов С2С12 на внешней поверхности полимерной тёхмерной

микро структурированной плёнки

6.2.4 Окрашивание клеток С2С12

6.2.5 Хорактеризация полимерной тёхмерной

микро структурированной плёнки

6.2.6 Визуализация

6.3 Результаты и обсуждение

6.3.1 Фототермическая активация

6.3.2 Лазерная адресация

6.4 Выводы

Заключение

Список литературы

Список рисунков

Список сокращений

PDADMAC - Полидиаллилдиметиламмониум хлорид

(Poly(diallyldimethylammonium chloride)) solution

PAH - Полиаллиламин гидрохлорид (Polyallylamine hydrochloride)

PSS - Полистирол сульфонат (Polystyrene sulfonates)

PMA - Полиметакриловая кислота (Poly(methacrylic acid))

BSA - Бычий сывороточный альбумин (Bovine serum albumin)

TRIT - Тетраметилродамин изоционат (Tetramethylrhodamine isothiocyanate)

FITC - Флуоресцеин изоционат (Fluorescein isothiocyanate)

RITC - Родамин B изотиоцианат (Rhodamine B isothiocyanate)

AuNPs - Золотые наночастицы (Gold nanoparticle)

CaCO3 - Карбонат кальция

SiO2 - Диоксид кремния

EDTA - Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

(Ethylenediaminetetraacetic acid)

NaCl - Хлорид натрия

CaCl2 - Хлорид кальция

Na2CO3 - Карбонат натрия

Fe3O4 - Оксид железа(ПДП)

ПДМС - Полидиметилсилоксан (Polydimethylsiloxane) PLA - Полимолочная кислота (Polylactic acid ) PEI - Полиэтиленимин (Polyethylenimine)

ЗФБ - Зелёный флуоресцентный белок (Green fluorescent protein)

СЭМ - Сканирующая электронная микроскопия (Scanning electron

microscopy)

ТЭМ - Трансмиссионный (просвечивающая) электронный микроскоп (Transmission electron microscopy)

ПТМП - Полимерная трёхмерная микроструктуррированная плёнка МК - Микроконтейнеры

ПА - Последовательная адсорбция (Layer-by-Layer deposition)

PIV - Анемометрия по изображению частиц (Particle Image Velocimetry)

ИК - Инфракрасный

RhB - Родамин B (Rhodamine B)

DOX - Доксициклин (Doxycyclin)

DMEM - Клеточная среда (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

PBS - Натрий-фосфатный буфер (Phosphate-Buffered Saline)

КМОП - Комплементарный металл-оксид-полупроводник (complementary

metal-oxide-semiconductor)

LASCA - Анализ контраста лазерных спеклов (laser speckle contrast analysis)

ДОКТ - Доплеровская оптическая когерентная томография

ЛДФ - Лазерная допплеровская флуометрия

МРА - Магнитная резонансная ангиография

РКА - Рентгеноконтрастная ангиография

РО - Расчётная область

ЗНЧ - Золотые наночастицы

DS - Декстран сульфат

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физические методы адресации биологически активных веществ в живых системах с использованием полимерных микроносителей»

Актуальность темы

Одной из актуальных задач современной медицины XXI века является развитие персонализированных методов профилактики, диагностики и лечения паталогических состояний. Задачи персонализированной медицины неразрывно связаны с развитием различных полимерных адресуемых систем доставки биологически активных веществ [1-7]. В настоящее время полимерные носители широко используются в биомедицинских приложениях, таких как адресная доставка лекарственных средств [3], репродуктивная [8] и регенеративная медицина [9; 10] антибактериальная [11] и противораковая [12; 13] терапия, тканевая инженерия [14; 15], а также для задач контроля экспрессии генов клеточных культур [16]. Существует широкий спектр целевых систем доставки биологически активных веществ таких, как визикулы гидрогеля [17], полимерные [18] или липосомальные микрокапсулы [19], для адресации действующих агентов в проблемные зоны биологических тканей (зоны воспаления, злокачественные новообразования и т.д.), позволяющие не только контролируемо высвобождать инкапсулированные агенты посредствам лазерного, электрического, магнитного, ультрозвуково-го или биохимического воздействия, но и визуализировать целевые участки биологических тканей.

Метод последовательной адсорбции (ПА) альтернативно заряженных полиэлектролитных слоёв [20] широко применяется для синтеза полимерных функциональных самоорганизующихся систем, таких, как иногослой-ные плёнки и многослойные микрокапсулы [21; 22]. Метод последовательной адсорбции позволяет варьировать в широком диапазоне толщину (жёсткость и проницаемость) и состав стенки полимерных носителей, а также функционализировать многослойные системы металлическими наночасти-цами (золото, серебро, магнетит Бе3О4), флуоресцентными красителями и флуоресцентными частицами (квантовые и карбоновые точки). В результате, достигается возможность управлять физико-химическими свойствами

полимерных многослойных систем по средствам внешних электромагнитных полей [23-29].

Суспензионные микроносители имеют ряд ограничений, связанных с проблемами контроля распределение микроносителей в живых системах. Однако, применение магнитных наночастиц, для функционализации оболочки микрокапсул, позволяет неинвазивно концентрировать магнитные микрокапсулы в целевой области биологической ткани in vivo, под действием внешнего градиентного магнитного поля [30]. Клетки способны интер-нализировать полимерные микрокапсулы посредствам эндоцитоза [31], что открывает возможность для контроля перемещения клеточных носителей функционализированных магнитными микрокапсулыми, при помощи градиентного магнитного поля [32-34].

В работе [35], была продемонстрирована возможность контролировать перемещение металлической сферы, диаметром 1,5 мм, в пределах сегмента сонной артерии свиньи in vivo, при помощи градиентных катушек МРТ системы. В 2014 году, Pouponneau и др. продемонстрировал адресацию крупных (50 мкм) биополимерных магнитных микрокапсул в печени кролика, при помощи градиентных катушек МРТ системы, для задач трансартериальной химиоэмболизации (инкапсулированный доксирубицин) [33]. Капсулы вводились через катетер в печёночную артерию, после чего при помощи градиентного магнитного поля задавалось направление потока магнитных биополимерных капсул в левую или правую ветвь печёночной артерии, в результате чего капсулы возможно было локализовать либо в левой, либо в правой печёночной доле. Тем не менее, пространственная разрешающая способность градиентных МРТ катушек не позволяет концентрировать магнитные микрокапсулы локально, в пределах сосудистого сегмента, а подобные размеры микрокапсул не позволяют их вводить в системный кровоток, так как это может привести к закупорке сосудов (эмболия).

Микроциркуляторное русло является транспортной системой, отвечающей за своевременную доставку питательных вещества и кислорода к тканям через кровь, с последующим удаление побочных продуктов метаболизма [36; 37]. Анормальный кровоток и модификация гемореологических характеристик крови в соответствии с конфигурацией кровеносных сосудов

имеют критическое значение для диагностике сосудистых паталогических состояний, на их ранних стадиях [38]. На сегодняшний день существует запрос не только на качественную визуализацию полимерных микроносителей в сосудистых сетях, но и на количественную оценку реакции кровеносных сосудов на введение инородных тел (микроносителей) [7]. Метод анемометрии по изображению частиц (PIV от англ. particle image velocimetry ) заключается в пространственной визуализации распределения мгновенной скорости потока жидкости путем анализа двух и более последовательно зарегистрированных изображений перемещающихся частиц-трассеров [39]. Трассеры, как правило, не различимы между собой, поэтому для оценки локальной скорости потока используется среднее смещение группы трассеров в пределах некоторой области конечного размера, именуемой «расчетная область» (РО). Наиболее распространенным способом при этом является оценка взаимной корреляционной функции изображений одной и той же расчетной области, зарегистрированных в два последовательных момента времени. Смещение максимума корреляционной функции соответствует среднему по расчетной области перемещению частиц в плоскости изображения, и, следовательно, средней скорости потока [40].

В контексте задач модификации таких крупных объектов, как клеточные подложки, поверхности медицинских имплантов и т.д., наиболее подходящими носителями биологически активных веществ, являются биополимерные наноплёнки [21; 22]. Полимерные трёхмерные микроструктурированные плёнки (ПТМП), с массивом микроконтейнеров на их внешней поверхности, являются новым типом полимерных носителей, которые представляют собой полимерную наноплёнку, c массивом трёхмерных уединённых полых микроконтейнеров на её поверхности. ПТМП могут изготовляться как методами последовательной адсорбции, так и методами микролитографии, что позволяет варьировать физикохимические свойство стенок микроконтейнеров ПТМП [21; 22]. Также ПТМП плёнка позволяют герметично инкапсулировать как низкомолекулярные так и высокомолекулярные водорастворимые биологически активные вещества в уединённых микроконтейнеров на поверхности ПТМП плёнки. В результате достигается возможность равномерно распределять биологически активные вещества по

поверхности плёнки в виде небольших одинаковых кластеров, которые возможно активировать как по одиночке так и целыми группами посредствам лазерного излучения, ульитразвукового воздействия, механического воздействия или электромагнитными полями.

Наиболее перспективным методом активации процессов высвобождения инкапсулированных биологически активных компонентов, являются лазерные фототермические методы воздействия. Основными достоинствами лазерных оптических методов активации полимерных микроносителей является возможность селективно воздействовать на целевой полимерные микроноситель в пределах биологического окна прозрачности биоткани. С появлением биоразлогаемых оптических волокон [41], становится актуальными задачи не только по активации единичных полимерные микроносителей, посредствам сфокусированного лазерного излучения, но и задачи связанные с активацией групп кластеров полимерных микроносителей глубоко в биологических тканях, при помощи лазерного излучения подведённого через оптическое волокно.

Целью данной работы является разработка и апробация методов неин-вазивной адресации, и активации полимерных микроносителей в живых системах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка и апробация физических методов визуализации и магнитного захвата полимерных многослойных флуоресцентных микрокапсул, функционализированных магнитными наночастицами, в разветвлённых сетях кровеносных сосудов брыжейки крысы.

2. Разработка и апробация методов магнитного захвата модельных клеток MA-104, поглотивших магнитные флуоресцентные многослойные микрокапсулы, для формирования жизнеспособной клеточной колонии в стеклянном фантоме кровеносного сосуда.

3. Разработка неинвазивных оптических методов визуализации динамики микропотоков крови разветвлённой сети сосудов методами адаптивного корреляционного PIV анализа (Particle Image

Velocimetry) для визуализации и контроля движения полимерных/клеточных носителей.

4. Разработка метода фототермической лазерной активации полимерной трёхмерных микроструктурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её внешней поверхности, в фантоме мягких тканей, на основе агарозного геля, при помощи оптического многомо-дового волокна.

5. In situ лазерная инфракрасная активация клеточной подложки, на основе полимерной трёхмерных микроструктурированных плёнки, с массивом микроконтейнеров на её внешней поверхности, для доксициулин-индуцированной активации экспрессии зелёного флуоресцентного белка (Green Fluorescence Protein) у единичных клеток.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. In vivo адресация магнитных многослойных микрокапсул, под действием градиентного магнитного поля, происходит в зонах изгибов и ветвлений васкулатурной сети.

2. Клетки способны поглощать магнитные флуоресцентные многослойные микрокапсулы и формировать жизнеспособную клеточную колонию по действием градиентного магнитного поля.

3. Использование полимерных трёхмерных микро структурированных плёнок с массивами полых контейнеров, в качестве клеточной подложки, позволяет активировать, посредствам фототермического лазерного воздействия, как единичные микроконтейнеры, для доксициклин-индуцированной активации экспресии зелёного флуоресцентного белка единичных клеток, так и группы микроконтейнеров полимерной трёхмерной микроструктурированной плёнки, для задач управляемого релиза инкапсулированного вещества внутри мягких тканей.

4. Установлено, что единичный микроконтейнер полимерной трёхмерной микроструктурированной клеточной подложки способен выступать в качестве носителя доксициклина, высвобождение

которого способно стимулировать экспрессию зелёного флуоресцентного белка, по меньшей мере, в одной клетке.

Научная новизна:

1. В данной диссертационной работе впервые была реализована методика адресации флуоресцентных многослойных микрокапсул в потоке крови in vivo при помощи электромагнитного пинцета в пределах выбранного сосудистого сегмента васкулатурной сети.

2. Впервые была реализована методика магнитного захвата модельных клеток МА-104, поглотивших магнитные флуоресцентные многослойные микрокапсулы, в стеклянном фантоме кровеносного сосуда. В результате была сформирована жизнеспособная клеточная колония в месте неразрушающего магнитного воздействия.

3. Разработана безмаркерная методика визуализации сосудистых сетей на основе кросс-корреляционных алгоритмов для построения карт скоростей крови в сосудистых сетях. Разработана методика маскирования границ сосудов на основе методов локальной бинаризации яркостных картин кровеносных сосудов.

4. Разработана методика фототермической активации полимерной трёхмерных микроструктурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её поверхности, при помощи инфракрасного лазерного воздействия через многомодовое оптическое волокно. Лазерная фототермическая активация микроструктурированной полимерной плёнки производилась внутри фантома мягких тканей.

5. Впервые была продемонстрированна система лазерной инфракрасной фототермической активации единичных микроконтейнеров трёхмерных микроструктурированной плёнки, с последующим высвобождением инкапсулированного доксициклина. Разработана методика доксициклин-индуцированной активации экспрессии зелёного флуоресцентного белка у единичных клеток, на клеточной подложки, на основе полимерной трёхмерных микроструктурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её поверхности.

Научная и практическая значимость

Полимерные микроносители находят своё применения для целого спектра биофизических задач, связанных с адресной доставкой биологически активных веществ. Флуоресцентные полимерные микрокапсулы, функ-ционализированные магнитными наночастицами способны контролируемо накапливаться в целевом участке биологимческой ткани, под действием внешнего градиентного магнитного поля. В перспективе данный подход позволит локально вводить полимерные носители в проблемную зону биологической ткани и локализовывать их распределения в данной области по-средствам магнитного поля, снижая цитотоксическое воздействие применяемых лекарственных средств за счёт уменьшения их дозировки. В частности, магнитные микрокапсулы способны выступать в качестве носителей опухолевых супрессоров в рамках задач по лечению онкологических заболеваний.

Полимерные микроструктурированные плёнки, с массивом микроконтейнеров на своей внешней поверхности, обеспечивают контролируемую инкапсуляцию химически активных компонентов в виде небольших кластеров, равномерно распределённых по поверхности полимерной плёнки. Подобные полимерные плёнки могут найти своё применение не только для контролируемой доставки лекарственных средств, но и в качестве антикоррозионных покрытий, для задач микроэлектроники, тканевой инженерии и сохранения продуктов питания.

Диссертационная работа выполнена при поддержке следующих научных фондов:

1. Грант Правительства Российской Федерации №14^50.31.0004 для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах Российской Федерации (исполнитель);

2. Грант РНФ № 16-15-10252 «Разработка технологии мониторинга проницаемости васкулярных барьеров на основе мульти-масштабного анализа переходных процессов по данным оптических методов визуализации»

(2016-2018, исполнитель)

3. Проектная часть госзадания в сфере научной деятельности № 3.1586.2017/ПЧ при поддержке Минобрнауки РФ «Квантификация физических закономерностей регуляции кровотока в микроциркуляторной сети методами оптического мониторинга и численного моделирования» (2017-2019, исполнитель)

Степень достоверности полученных результатов обеспечивается применением современных методов исследования таких, как оптическая флуоресцентная микроскопия, оптическая конфокальная флуоресцентная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Основные результаты диссертационной работы были опубликованы в высокорейтенговых научных журналах, пройдя независимую экспертную оценку (ACS applied materials & interfaces - IF - 7.504; Journal of Controlled Release IF - 7.786). Представленные результаты находятся в соответствии с результатами, полученными другими авторами, работающих в области нано- и биомедицинских технологий.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на следующих конференциях:

1. Kurochkin M.A., Timoshina P.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.," Study of thermal source light spatial coherence" SFM 2011, Saratov State University, Saratov, Russia.

2. Kurochkin M.A., Timoshina P.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.,"Particle Image Velocimetry for blood micro circulate studies" SFM 2012, Saratov State University, Saratov, Russia.

3. Kurochkin M.A, " Система для прижизненной цифровой визуализации и микроанемометрии капиллярного кровотока"УМНИК, Устный доклад, SSU, Russia, 2013

4. Kurochkin M.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.," Real time Particle Image Velocimetry for blood microcirculation studies" SFM 2013, Saratov State University, Saratov, Russia.

5. Kurochkin M.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.," Advanced digital image processing for in vivo capillaries network flux analysis" SFM 2014, Saratov

State University, Saratov, Russia.

6. Kurochkin M.A., Timoshina P.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.," Advanced digital image processing for in vivo analysis of blood flow in capillary network," Asia Communications and Photonics Conference (ACP), China, Shanghai, 2014.

7. Курочкин М.А., Тимошина П.А., Федосов И.В., Тучин В.В.," Прижизненная цифровая микроскопия для анализа динамики кровотока в сети капилляров," VII Съезд Российского фотобиологического общества, Россия, пос. Шепси, 2014.

8. Е.С. Стюхина, М.А. Курочкин, И.В. Федосов, В.В. Тучин, Д.Э. Постнов, «Оценка динамических характеристик капиллярного кровотока методами окклюзионной фотоплетизмографии и капилляроскопии», материалы VII съезда Российского фотобиологического общества, Пущино, 92 (2014)

9. Kurochkin M.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V., "Computational side of microcirculation assessment by PIV," Saratov Fall Meeting - SFM'14 Microscopic and Low-Coherence Methods in Biomedical and Non-Biomedical Applications VII, Russia, Saratov, 2015.

Личный вклад. Большая часть экспериментальных результатов была получена лично соискателем, а также совместно с коллегами научных групп в рамках сотрудничества при выполнении совместных проектов. Вклад соискателя заключается в разработке и апробации методов магнитной адресации полимерных магнитных микрокапсул in vitro и in vivo, при помощи магнитного пинцета. Разработка и апробация методов магнитного захвата клеток, поглотивших магнитные микрокапсулы, в стеклянном капилляре. Разработка методов морфологического анализа васкулаторных сетей на основе корреляционных алгоритмов PIV анализа. Изготовление полимерной трёхмерной микро структурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её поверхности и оптической системы лазерного ИК воздействия через многомодовое оптическое волокно, для задач фототермической активации групп микроконтейнеров в толще фантома мягких тканей. Разработка и апробация методов фототермической адресации биологически активных веществ к единичным клетка, на полимерной микроструктурированной клеточной положке.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 12 печатных изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения и двух приложений. Полный объём диссертации составляет 152 страницы с 59 рисунками Список литературы содержит 155 наименований.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Последовательная полиионная адсорбция

В 1991 году Decher и др. [42] представили метод послойного синтеза, молекулярно упорядоченных тонких плёнок, который основывался на последовательной адсорбции (полиионная сборка) пар противоположно заряженных полианионов и поликатионов на подложке. Для этого матрица (твёрдая подложка, коллоидный частицы и т.д.), имеющую заряд на своей поверхности, опускается в раствор полиэлектролитов с противоположным зарядом. Осаждение макромолекул полиэлектролитов на поверхности подложки происходит, за счёт электростатических сил и как следствие наблюдается перезарядка поверхности подложки. Происходит насыщение адсорбции, что приводит к формированию молекулярного слоя.

* промывка

поверхностный заряд поликатионы

Рисунок 1.1 — Схематическое представление синтеза молекулярно

упорядоченной полимерной плёнки при помощи метода последовательной

полиионной адсорбции [42].

Погружая матрицу поочерёдно в противоположно заряженные растворы полиэлектролитов, формируются связи между противоположно заряженными ионными группами, что в результате приводит к формированию бис-лоёв полимерной плёнки толщиной в несколько нанометров. Таким образом возможно контролировать толщину полимерной плёнки с высокой точностью, за счёт варьирования количества полимерных бислоёв.

После каждого этапа адсорбции полиэлектролитного слоя, подложка промывается в растворителе (деионизированная вода и т.д.) для удаления не адсорбированных макромолекул полиэлектролитов, чтобы избежать образования комплексов в исходном растворе.

Number of Bilayers

Рисунок 1.2 — График зависимости коэффициента поглощения (ось ординат) плёнки (PSS/PDADMAC)n от количества полиэлектролитных бислоёв (ось абсцисс), в зависимости от концентрации солей NaCl в растворах данных полиэлектролитов. Коэффициент поглощения измерялся на длине волны 226 нм, поскольку спектр поглащения PSS, в водном растворе, имеет пик на данной длине волны. [43]

Увеличение коэффициента поглощения полиэлектролитной оболочки, в зависимости от количества полиэлектролитных слоёв, может происходить как линейно, так и экспоненциально, в зависимости от количества соли в растворах полиэлектролитов и морфологических особенностей матрицы, на которые наносятся данные полиэлектролитные слои [44]. Предполагается, что линейный рост коэффициента поглощения полимерной плёнки обуславливается одинаковым количеством адсорбирующихся полиэлектролитов, на однородной поверхности матрицы. При низких концентрациях солей, полимерная плёнка равномерно формируется на поверхности матрицы, в то время как увеличение концентрации солей в растворах полиэлектролитов приводит к увеличению толщины единичного адсорбированного слоя на

матрице, а также может приводить к формированию неровности на поверхности полимерной плёнки (Рисунок 1.3). Нелинейный рост коэффициента поглощения полимерной плёнки может объяснятся наличием неровностей на поверхности матрицы, которые будут увеличиваться с каждой итерацией синтеза полимерной плёнки [43]. Соответственно данный эффект проявляется с ростом концентрации соли в растворах полиэлектролитов, как показано на рисунке 1.2.

Рисунок 1.3 — Атомная силовая микроскопия поверхности (PSS/PDADMAC)lo плёнки с 10 бислоями полиэлектролитов при

концентрации 0.1М (а), 0.3М (б) и 1.0М (в) ШО в растворах полиэлектролитов. Размер каждого изображения - 5х5 мкм [43].

Полимерную плёнку, из-за пластичности и малой толщины, возможно равномерно формировать на неоднородной матрице с различными неровностями, выпуклыми и вогнутыми элементами. Также полимерная плёнка может быть перенесена с одной поверхности на другую посредствам структурированной микропечати, что позволяет формировать полые микроконтейнеры в толще полимерной плёнки, как показано на рисунке 1.4.

Рисунок 1.4 — СЭМ изображения полимерных микроструктурированных плёнок с массивами полых контейнеров на их поверхности, которые были сформированы посредствам микропечати (PSS/PDADMAC). Для микропечати использовалась кремниевая подложка с круглыми, квадратными и коническими паттернами [21].

1.2 Полимерные микрокапсулы

В 1998 году, Сухоруков Г.Б. и др., применили метод последовательной полиионной адсорбции для формирования полимерной оболочки на коллоидных частицах (ядрах) [18]. В результате была достигнута возможность формирования сферических полимерных микроносителей микрометрового размера, вида «ядро-оболочка», которые на сегодняшний день широко применяются для разработки систем целевой доставки биологически активных веществ.

Рисунок 1.5 — Схематическое представление синтеза полых многослойных микрокапсул методом последовательной адсорбции разнозаряженных

полиэлектролитных слоёв [45].

Как правило, полимерная полиэлектролитная оболочка является герметичной для высокомолекулярных соединений (молярная масса более 5 кДа), однако для низкомолекулярных соединений полиэлектролитная оболочка остаётся проницаемой. Поэтому ядра, покрытые полимерной полиэлектролитной плёнкой, могут быть растворены для получение полых микрокапсул (Рисунок 1.5). Для биомедицинских приложений рекомендуется использовать неорганические растворители, чтобы избежать образования токсичных продуктов распада. Проницаемость полимерной оболочки во многом зависит от её химического состава, толщины, матрицы а также от химического состава, температуры и кислотности среды, в которой находятся данные полимерные носители. Так при температуре выше 35 С0 модуль упругости плёнки PDADMAC/PSS уменьшается на 2 порядка [46; 47], что видимо связано с началом перехода вещества в аморфное состояние [48].

Полиэлектролиты делятся на слабые и сильные. Сильные полиэлектролиты в водных растворах полностью ионизованы и соответственно заряды их функциональных групп не меняются при изменении концентрации ионов Н + и ОН-. У слабых полиэлектролитов степень диссоциации полярных групп (заряд) зависит от pH, а значит варьируя соотношением сильных

и слабых полиэлектролитов в оболочке полиэлектролитной капсулы, возможно контролировать её проницаемость [49]. У подобных капсул, регулируя рН, возможно обратимо переключать состояние открыто-закрыто, для задач инкапсуляции биологически активных веществ и их целевого высвобождения [50]. Также немаловажным фактором при синтезе микрокапсулы является тип используемых ядер, на которых будет сформирована оболочка. Размер ядра и его морфология определяют конечный размер и морфологию микрокапсулы, а также толщину и проницаемость её оболочки. В качестве ядра могут быть использованы как органические так и неорганические коллоидные частицы, белки, живые клетки и т.д. К наиболее распространённым неорганическим ядрам относятся МпСо3, СаСо3 и СёСо3 [45;51;52]. К наиболее распространённым органическим ядрам относятся латексные сферы, меламин формальдегид и $Ю2 [53-55].

Как правило, капсулы на основе органических ядер, отличаются хорошей монодисперсностью. Также их полости, после растворения ядер, могут быть заполнены различными биологически активными веществами, путём изменения проницаемости многослойной полиэлектролитной оболочки по-средствам изменения рН [49; 56], полярности растворителя [57], ионных сил раствора [58; 59] или температуры [46;47].

В свою очередь, капсулы на основе пористых неорганических ядер, могут быть непосредственно заполнены путём как адсорбции инкапсулируемого вещества на пористой матрице (ядро), так и добавления инкапсулируемого вещества в состав самих ядер на этапе их синтеза. Далее модифицированные ядра покрываются полиэлектролитной оболочкой (метод предварительной загрузки), формируя систему «ядро-оболочка», с возможностью последующего растворения ядра [51; 60]. В процессе растворения ядра, некоторые олигомеры могут не полностью растворяться, что приводит к их частичной адсорбции на внутренней поверхности микрокапсулы [58]. Поэтому для биологического применения могут быть предпочтительнее микрокапсулы на основе биосовместимых ядер, таких как пористый карбонат кальция СаСо3 [51], мезопористый диоксид кремния ^Ю2) [60] или различные полилактиды (РЬвА, РЬА) [61]. В свою очередь, ядра на основе карбоната кальция, также могут быть растворены.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Курочкин Максим Андреевич, 2019 год

источник

белого

света

конденсор

объектив

fi флуоресцентный куб

/у^дихроичное ' зеркало

тубусная линза

И К фильтр

КМОП камера

перископ

Рисунок 6.2 — Схематическое изображение фототермической активации микроконтейнеров ПТМП, сфокусированным лазерным ИК пучком, на длине волны 830 нм, для локального высвобождения инкапсулированного доксициклина возле тетрациклин-зависимой клетки-мишени с последующей экспрессии ЗФБ.

па FUC LUN Plan FLX 60х/0,7 Ph2 (Olympus, Токио, Япония) на поверхности ПТМП в пятно диаметром 1 мкм.

Возбуждение флуоресценции ЗФБ производилось при помощи галогенной лампы (Lumen 200, Prior Scientic, Inc., США) и стандартного набора светофильтров (куба U-MNIB) для регистрации флуоресценции ЗФБ (Фильтр возбуждения флуоресценции 470-490 нм, дихроичное зеркало 505 нм и барьерный фильтр эмиссии 515 нм, Olympus, Токио, Япония). Флуоресценция ЗФБ регистрировалась при помощи того же объектива FUC LUN Plan FLX 60х/0,7 Ph2 и затем изображалась тубусной линзой (f=180 мм) на монохромный датчик КМОП камеры (DCC3260M, Thorlabs inc., США). Перед КПОМ датчиком изображений помещался ИК фильтр. Оптическая

мощность лазерного пучка составляла 12,5 мВт. Размер пятна фокусировки лазерного пучка составлял порядка 1 мкм. Время воздействия лазерного ИК пучка на единичный микроконтейнер ПТМП, контролировалось механическим оптическим затвором и составляла порядка 0,5 с. В течение всего эксперимента чашка петри с клетками С2С12 находилась в термостатическом инкубаторе, закреплённом на предметном столике инвертированного микроскопа, при температуре 37 0С и 5%

6.3 Результаты и обсуждение

6.3.1 Фототермическая активация

После синтеза ПТМП, проверялась возможность фототермической активации микроконтейнеров ПТМП посредствам сфокусированного ИК лазерного пучка (830 нм). Обычно полислойные полиэлектролитные системы функционализируются ЗНЧ при помощи полиионной сакмосборки, однако биополимер PLA заряжен нейтрально. Поэтому ЗНЧ напылялись на поверхность PLA ПТМП в вакууме. Времени напыления ЗНЧ ниже 30 с, приводит к образованию слоя изолированных наночастиц (режим одиночной наночастицы). Увеличении времени напыления ЗНЧ до 45-60 секунд, формирует плёнку ЗНЧ, с размерами наночастиц 3-25 нм. Кумулятивные свойства ЗНЧ плёнки значительно выше, так как если расстояние между наночастицами меньше чем их диаметры, то фототермический нагрев усиливается [142; 148].

Для экспериментов по высвобождению инкапсулированного вещества из ячеек ПТМП 6.3, механический лазерный затвор открывался вручную, от одной до нескольких секунд, в зависимость от используемой мощности ИК лазера. Микроконтейнеры ПТМП, изготовленные при помощи 1% PLA, легко открывались с использованием TEM00 лазера 830 нм, 55 мВт при времени воздействия порядка 1 секунды. Для ПТМП микроконтейнеров на

основе 2-3% PLA, выходная мощность лазерного пучка увеличивалась до 99 мВт. Вплоть до вскрытия биополимерной ячейки, преципитат остаётся в микроконтейнере, окружённый пузырьком воздуха, что является дополнительным гидрофобным слоем, препятствующий растворению преципитата. После активации микроконтейнера, преципитат растворяется в течении 1517 секунд в воде и распространяется в окружающей среде, как показано на рисунке 6.3. Угасание флуоресценции RhB в зоне воздействия 6.3д обуславливается растворением RhB, так как на данной длине волны лазерного модуля (830 нм), RhB краситель не поглощает [152]. При лазерном воздействии на ПТМП с RhB без ЗНЧ, тушения флуоресценции RhB не обнаружилось. RhB является термостабильным красителем, который не теряет своих флуоресцентных свойств при 20 часовом автоклавировании при темпира-туре 150-180°, поэтому термическое повреждение флуоресцентного карго, вблизи температуры стеклования или температуры плавления полимера, не ожидается [153].

6.3.2 Лазерная адресация

PLA может быть использован в качестве клеточного субстрата клеток C2C12 на своей поверхности, что коррелирует с более ранними исследованиями о развитии хондроцитов на PLA системы и его использованием в качестве имплантационного материала (рисунок 6.1г,д) [154]. Было обнаружено, что клетки распространяются так же, как и на стандартных клеточных ]подложках, и предпочтительно располагаются в областях между микроконтейнерами ПТМП, на плоской поверхности ПТМП (рисунок 6.1). Было обнаружено, что некоторые клетки растягиваются через микроконтейнеры ПТМП МС без существенной деформации, из-за того, что клетки значительно больше ПТМП микроконтейнеров и пространства между ними, соответственно. Данные наблюдения согласуются работами по анализу поведения клетки на подложке [155]. Важно отметить, что случайная миграция клеток C2C12 на ПТМП за 24 часа достигала 15 мкм. Эта скорость

Рисунок 6.3 — Фототермическая активация 2% РЬЛ микроконтейнера ПТМП, посредствам сфокусированного лазерного ИК пучка.

Светлопольное изображение ПТМП, до лазерного воздействия (а), Светлопольное изображение ПТМП, после 0,35 с лазерного воздействия

(б), Светлопольное изображение ПТМП, после 1,35 с лазерного воздействия (в), Флуоресцентное (ЯИБ) изображение ПТМП, до лазерного

воздействия (г), Флуоресцентное изображение ПТМП, после лазерного воздействия (д), СЭМ изображение единичного микроконтейнера ПТМП,

после лазерного воздействия (е).

движения достаточно мала, что позволяет напрямую соотносить положение клетки с ЗФБ и положение активированного ПТМП микроконтейнера. Как и ЯИБ, БОХ может был преципитирован в микроконтейнеры ПТМП и в дальнейшем был использован в качестве модели биологически активного вещества.

Рисунок 6.4 — Дизайн эксперимента по фототермической активации экспрессии ЗФБ единичных генетически модифицированных клеток на ПТМП клеточном субстрате (а), 10х светлопольное изображение ПТМП с

клеточной колонией, до лазерного воздействия (б), зона лазерного воздействия на единичный микроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, до фототермической активации (в), зона лазерного воздействия на единичный

микроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, после фототермической активации (г), конфокальные флуоресцентные изображения прокрашеных ядер и цитоскелета клеточной колонии в зоне фототермической активации микроконтейнера ПТМП (д), конфокальные флуоресцентные изображения ЗФБ клеточной колонии в зоне фототермической активации микроконтейнера ПТМП (е), наложение флуоресцентных каналов (ж)

При активации ПТМП микроконтейнера DOX воздействует на тетрациклин-зависимые рецепторы генетически модифицированных клеток C2C12, запуская ЗФБ экспрессию. Подобные клетки обладают высокой чувствительностью к DOX [151]. Подобная восприимчивость делает эти клет-

ки надёжным инструментом оценки количество высвобожденных веществ и эффективности направленного воздействия биологически активных компонентов ПТМП. Известно, что подобная система контроля экспрессии генов чувствительна менее чем к 10 пг/мл БОХ [151]. Таким образом высвобождение порядка 10 пг БОХ из единичного микроконтейнера ПТМП является достаточным для экспрессии ЗФБ единичных клеток (рисунок 6.4 и рисунок 6.5). Клетки, демонстрирующие экспрессию ЗФБ вблизи (расстояние длины клетки) активированного микроконтейнера ПТМП, считаются «положительными», клетки без ЗФБ (на том же расстоянии от МК) считались «отрицательными». Клетки, экспрессирующие ЗФБ, в отдалении от активированных МК, сфитались «ложноположительными» (рисунок 6.5). Из-за высокой чувствительности клеток к БОХ, внашем эксперименте не наблюдалось «отрицательных» клеток. 22% клеток были идентифицированы как «ложноположительные», которые, возможно, были привнесены на ПТМП дочерними клетками, содержащими ЗФБ, в их цитоплазме после деления. Клеточный отклик на БОХ и, следовательно, разница между ложноположи-тельными и положительными клетками значительна (1-тест р <0,05). Крутой градиент концентрации БОХ, который убывает согласно формуле 6.1, отвечает за высокую чувствительность клеток к БОХ.

^ 0,5пг3 ^ (6. )

где С - локальная концентрация, С0 - концентрация источника в МК, а г - расстояние от МК. В пределах одного клеточного диаметра (от 10 до 30 мкм в зависимости от диаметра ячейки) концентрация уменьшается в пределах от 2 до 10 относительных единиц. Была проведена оценена ЗФБ флуоресценции клеток ЗФБ на различных концентрации БОХ (рисунок 6.5е), а также была проведена оценка относительно ожидаемого высвобождаемого объёма БОХ из ПТМП микроконтейнера. Определенная минимальная концентрация БОХ для экспрессии ЗФБ соответствует литературе [16; 151], в которой была определена концентрация БОХ для максимального ответа ЗФБ, после чего жизнеспособность клеток и, следовательно, экспрессия ЗФБ и плотность клеток уменьшались. Было отмечено, что активация МК

между двумя клетками способен стимулировать экспрессию гена в обеих клетках.

Установлено, что единичный ПТМП микроконтейнер способен экс-прессировать ЗФБ по меньшей мере в одной клетке. Чтобы избежать высвобождения избыточного количества доксициклина, следует избегать активации нескольких бизлежащих микроконтейнеров и сохранять минимальное расстояние по меньшей мере двух МК друг от друга. В экспериментах активации нескольких соседних МК ПТМП приводило к экспрессии ЗФБ в нескольких не целевых клетках, в поле зрения микроскопа. Этот эффект объясняется тем, что из нескольких МК высвобождается значительное количество БОХ. Другие расхождения между позицией флюоресцентных клеток и открытым МК объясняются миграцией клеток, которая может составлять до 15 мкм. Поэтому для определения концентрации экспозиции биологически активного вещества важно учитывать начальную позицию клетки, а не её текущее положение на клеточной подложке.

0 модель диффузии доксициклина

Рисунок 6.5 — Подковообразная область свечения ЗФБ клеток созданная

посредствам локальной активации серии микроконтейнеров ПТМП. Красными стрелками обозначены вскрытые микроконтейнеры лазерным воздействием (а), Белыми стрелками указаны клетки, возле активированны микроконтейнеров, которые начали экспрессировать ЗФБ (б), наложение каналов флуоресценции ЗФБ и канала визуализации клеток С2С12 (в), процентное соотношение клеток, возле вскрытых микроконтейнеров ПТМП, которые запустили экспрессию ЗФБ (г), численная модель распределения относительной концентрации высвобожденного доксициклина из единичного микроконтейнера ПТМП, диаметром 5 мкм (д), зависимость интенсивности свечения клеток (ЗФБ экспрессия) от количества БОХ в мгл/мл. Концентрация доксициклина была той же, что и

в контрольном образце

6.4 Выводы

Была продемонстрирована методика изготавления гидрофобных биосовместимых и биоразлагаемых ПТМП, усеянных массивом полых микроконтейнеров. Данные ПТМП позволяют герметично инкапсулировать низкомолекулярные гидрофильные молекулы методом ко-преципитации из жидкой фазы. В водной среде, герметичность микроконтейнеров сохраняется 21 день. Золотые наночастицы, встроенные в оболочку полимерных микроконтейнеров, позволяют эффективно конвертировать поглощённое лазерное ИК излучение в темпло, что приводит к локальным фототермическим повреждениям оболочки полимерных микроконтейнеров и как следствие релиз инкапсулированного доксициклина. Количество инкапсулированного доксицикоина определялось методами флуоресцентной спектроскопии. Выход вещества из активированного микроконтейнера составлял 80% от инкапсулированной массы.

Методика поштучной фототермической активации микроконтейнеров полимерной PLA 3D плёнки позволяет управляемо адресовать инкапсулированный агент к единичной клетке. Работоспособность метода была апробирована на ЗФБ модифицированной клеточной линии С2С12. Высвобожденный, из микроконтейнеров, доксициклин поглощался клетками С2С12, в результате чего экспресировался ЗФБ протеин. Данная методика может применяться для прикладных биофизических задач нейрональной имплантации (направленный рост нейронов), биоаналитики (определение необходимой эффективной концентрации биологически активных веществ), анализа миграции клеток (привлечение иммунных клеток к раковым клеткам), задач умной трансплантологии с активными покрытиями (доставка тромбина в случае псевдоаневризмы).

Заключение

Основные результаты диссертационной работы заключаются в следующем.

1. Разработана и апробирована методика адресации флуоресцентных многослойных микрокапсул в потоке крови in vivo при помощи электромагнитного пинцета в пределах выбранного сосудистого сегмента сети сосудов. Было показано, что многослойные микрокапсулы могут быть захвачены магнитным пинцетом в сосудистых сетях брыжейки крысы, в зонах с наличиями изгибов и ветвлений сосудистых сегментов. Было показано, что в зоне воздействия магнитного поля, после введения полимерных капсул в кровоток, закупорки сосудов не наблюдалось.

2. Реализована методика магнитного захвата модельных клеток МА-104, поглотивших магнитные флуоресцентные многослойные микрокапсулы, в стеклянном фантоме кровеносного сосуда. В результате была сформирована жизнеспособная клеточная колония в стеклянном канале, в месте неразрушающего магнитного воздействия.

3. Разработана безмаркерная методика визуализации сосудистых сетей на основе кросс-корреляционных алгоритмов для построения карт скоростей крови в сосудистых сетях. Разработана методика маскирования границ сосудов на основе методов локальной бинаризации яркостных картин кровеносных сосудов.

4. Разработана методика фототермической активации полимерной трёхмерной микро структурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её поверхности, при помощи ИК лазерного воздействия через многомодовое оптическое волокно внутри фантома мягких тканей.

5. Разработана система лазерного ИК фототермической активации единичных микроконтейнеров полимерной трёхмерной микроструктурированной плёнки с последующим высвобождением инкапсулированного доксициклина. Разработана методика

доксициулин-индуцированной активации ЗФБ экспрессии единичных клеток на клеточной подложке, на основе полимерной трёхмерной микроструктурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её поверхности.

Автор выражает благодарность сотрудникам кафедры оптики и биофо-тоники за предоставленные возможности и всестороннюю поддержку. Автор выражает благодарность в частности своему научному руководителю, доценту кафеды оптики и биофотоники к.ф.-м.н. Федосову Ивану Владленовичу, заведующему кафедры оптики и биофотоники д.ф.-м.н. Тучину Валерию Викторовичу, д.ф.-м.н. Постнову Дмитрию Энгелевичу, д.ф.-м.н. Симо-ненко Георгию Валентиновичу, Стюхиной Елене Сергеевне а также сотрудникам лаборатории дистанционно управляемых систем для тераностики: к.ф.-м.ню Сухорукову Глебу Борисовичу, д.х.н. Горину Дмитрию Александровичу, к.х.н. Иноземцевой Ольге Александровне, к.б.н. Синдеевой Ольге Александровне и к.ф.-м.н. Воронину Денису Викторовичу. Также, автор выражает благодарность Хлебцову Николаю Григорьевичу и Хлебцову Борису Николаевичу.

Список литературы

1. Alvarez-Lorenzo, Carmen. Smart drug delivery systems: from fundamentals to the clinic / Carmen Alvarez-Lorenzo, Angel Concheiro // Chemical Communications. — 2014. — Vol. 50, no. 58. — Pp. 7743-7765.

2. Electronic MEMS for triggered delivery / Amy C Richards Grayson, Rebecca Scheidt Shawgo, Yawen Li, Michael J Cima // Advanced drug delivery reviews. — 2004. — Vol. 56, no. 2. — Pp. 173-184.

3. Degradable controlled-release polymers and polymeric nanoparticles: mechanisms of controlling drug release / Nazila Kamaly, Basit Yameen, Jun Wu, Omid C Farokhzad // Chemical reviews. — 2016. — Vol. 116, no. 4. — Pp. 2602-2663.

4. The smart drug delivery system and its clinical potential / Dong Liu, Fang Yang, Fei Xiong, Ning Gu // Theranostics. — 2016. — Vol. 6, no. 9.

— P. 1306.

5. Integrated microsystems for controlled drug delivery / S Zafar Razzacki, Prasanna K Thwar, Ming Yang et al. // Advanced drug delivery reviews. — 2004. — Vol. 56, no. 2. — Pp. 185-198.

6. Safari, Javad. Advanced drug delivery systems: Nanotechnology of health design A review / Javad Safari, Zohre Zarnegar // Journal of Saudi Chemical Society. — 2014. — Vol. 18, no. 2. — Pp. 85-99.

7. In vitro and in vivo visualization and trapping of fluorescent magnetic microcapsules in a bloodstream / Denis V Voronin, Olga A Sindeeva, Maxim A Kurochkin et al. // ACS applied materials & interfaces. — 2017. — Vol. 9, no. 8. — Pp. 6885-6893.

8. Nanotechnology in reproductive medicine: emerging applications of nanomaterials / Natalia Barkalina, Charis Charalambous, Celine Jones, Kevin Coward // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.

— 2014. — Vol. 10, no. 5. — Pp. e921-e938.

9. Furth, Mark E. Smart biomaterials design for tissue engineering and regenerative medicine / Mark E Furth, Anthony Atala, Mark E Van Dyke // Biomaterials. — 2007. - Vol. 28, no. 34. - Pp. 5068-5073.

10. Studies on thermoresponsive polymers: Phase behaviour, drug delivery and biomedical applications / Arijit Gandhi, Abhijit Paul, Suma Oommen Sen, Kalyan Kumar Sen // asian journal of pharmaceutical sciences. — 2015. — Vol. 10, no. 2. — Pp. 99-107.

11. A fully functional drug-eluting joint implant / VJ Suhardi, DA Bichara, SJJ Kwok et al. // Nature biomedical engineering. — 2017. — Vol. 1, no. 6. — P. 0080.

12. Masood, Farha. Polymeric nanoparticles for targeted drug delivery system for cancer therapy / Farha Masood // Materials Science and Engineering: C. — 2016. — Vol. 60. — Pp. 569-578.

13. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies / Karel Ul-brich, Katerina Hola, Vladimir Subr et al. // Chemical reviews. — 2016. — Vol. 116, no. 9. — Pp. 5338-5431.

14. Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices / Ku-maresh S Soppimath, Tejraj M Aminabhavi, Anandrao R Kulkarni, Walter E Rudzinski // Journal of controlled release. — 2001. — Vol. 70, no. 1-2. — Pp. 1-20.

15. Bacterial-derived biopolymers: Advanced natural nanomaterials for drug delivery and tissue engineering / Ahad Mokhtarzadeh, Abbas Alibakhshi, Maryam Hejazi et al. // TrAC Trends in Analytical Chemistry. — 2016. — Vol. 82. — Pp. 367-384.

16. Luo, Dong. Local and sustained activity of doxycycline delivered with layer-by-layer microcapsules / Dong Luo, David J Gould, Gleb B Sukho-rukov // Biomacromolecules. — 2016. — Vol. 17, no. 4. — Pp. 1466-1476.

17. Photo-and thermo-responsive multicompartment hydrogels for synergistic delivery of gemcitabine and doxorubicin / Cheng Wang, Guoying Zhang, Guhuan Liu et al. // Journal of Controlled Release. — 2017. — Vol. 259. — Pp. 149-159.

18. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles / Gleb B Sukhorukov, Edwin Donath, Heinz Lichtenfeld et al. // Colloids and Surfaces A: physicochemical and engineering aspects. — 1998. — Vol. 137, no. 1-3. — Pp. 253-266.

19. Dhoot, Nikhil O. Microencapsulated liposomes in controlled drug delivery: strategies to modulate drug release and eliminate the burst effect / Nikhil O Dhoot, Margaret A Wheatley // Journal of pharmaceutical sciences. — 2003. — Vol. 92, no. 3. — Pp. 679-689.

20. Decher, Gero. Fuzzy nanoassemblies: toward layered polymeric multicom-posites / Gero Decher // science. — 1997. — Vol. 277, no. 5330. — Pp. 12321237.

21. Patterned microstructure fabrication: polyelectrolyte complexes vs poly-electrolyte multilayers / Meiyu Gai, Johannes Frueh, Valeriya L Kudryavt-seva et al. // Scientific reports. — 2016. — Vol. 6. — P. 37000.

22. Polylactic acid nano-and microchamber arrays for encapsulation of small hydrophilic molecules featuring drug release via high intensity focused ultrasound / Meiyu Gai, Johannes Frueh, Tianyi Tao et al. // Nanoscale. — 2017. — Vol. 9, no. 21. — Pp. 7063-7070.

23. The role of metal nanoparticles in remote release of encapsulated materials / Andre G Skirtach, Christophe Dejugnat, Dieter Braun et al. // Nano letters.

— 2005. — Vol. 5, no. 7. — Pp. 1371-1377.

24. Magnetic microcapsules with low permeable polypyrrole skin layer / Daria V Andreeva, Dmitry A Gorin, Dmitry G Shchukin, Gleb B Sukhorukov // Macromolecular rapid communications. — 2006. — Vol. 27, no. 12.

— Pp. 931-936.

25. Nanocomposite microcontainers with high ultrasound sensitivity / Ta-tiana A Kolesnikova, Dmitry A Gorin, Paulo Fernandes et al. // Advanced Functional Materials. — 2010. - Vol. 20, no. 7. - Pp. 1189-1195.

26. Impact of high-frequency ultrasound on nanocomposite microcapsules: in silico and in situ visualization / VF Korolovych, OA Grishina, OA Inozemt-seva et al. // Physical Chemistry Chemical Physics. — 2016. — Vol. 18, no. 4. — Pp. 2389-2397.

27. Nondestructive light-initiated tuning of layer-by-layer microcapsule permeability / Weinan Xu, Ikjun Choi, Felix A Plamper et al. // ACS nano. — 2012. — Vol. 7, no. 1. — Pp. 598-613.

28. Multicompartmental Microcapsules with Orthogonal Programmable Two-Way Sequencing of Hydrophobic and Hydrophilic Cargo Release / Weinan Xu, Petr A Ledin, Zacharoula Iatridi et al. // Angewandte Chemie International Edition. — 2016. — Vol. 55, no. 16. — Pp. 4908-4913.

29. Delcea, Mihaela. Stimuli-responsive LbL capsules and nanoshells for drug delivery / Mihaela Delcea, Helmuth Mohwald, Andre G Skirtach // Advanced drug delivery reviews. — 2011. — Vol. 63, no. 9. — Pp. 730-747.

30. Magnetically engineered microcapsules as intracellular anchors for remote control over cellular mobility / Anton M Pavlov, Bruno G De Geest, Benoit Louage et al. // Advanced materials. — 2013. — Vol. 25, no. 48. — Pp. 6945-6950.

31. Intracellularly degradable polyelectrolyte microcapsules / Bruno G De Geest, Roosmarijn E Vandenbroucke, Anja M Guenther et al. // Advanced materials. — 2006. — Vol. 18, no. 8. — Pp. 1005-1009.

32. Improved and targeted delivery of bioactive molecules to cells with magnetic layer-by-layer assembled microcapsules / Anton M Pavlov, Saman-tha A Gabriel, Gleb B Sukhorukov, David J Gould // Nanoscale. — 2015. — Vol. 7, no. 21. — Pp. 9686-9693.

33. Pouponneau, Pierre. Therapeutic magnetic microcarriers guided by magnetic resonance navigation for enhanced liver chemoembilization: a design review / Pierre Pouponneau, Gael Bringout, Sylvain Martel // Annals of biomedical engineering. — 2014. — Vol. 42, no. 5. — Pp. 929-939.

34. Kollmannsberger, Philip. BaHigh-force magnetic tweezers with force feedback for biological applications / Philip Kollmannsberger, Ben Fabry // Review of Scientific Instruments. — 2007. — Vol. 78, no. 11. — P. 114301.

35. Automatic navigation of an untethered device in the artery of a living animal using a conventional clinical magnetic resonance imaging system / Sylvain Martel, Jean-Baptiste Mathieu, Ouajdi Felfoul et al. // Applied physics letters. — 2007. — Vol. 90, no. 11. — P. 114105.

36. 2014 ESC/EACTS guidelines on myocardial revascularization: the Task Force on Myocardial Revascularization of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Association for Cardio-Thoracic Surgery (EACTS) developed with the special contribution of the European Association of Percutaneous Cardiovascular Interventions (EAPCI) / Authors/Task Force members, Stephan Windecker, Philippe Kolh et al. // European heart journal. — 2014. — Vol. 35, no. 37. — Pp. 2541-2619.

37. Pittman, Roland N. Oxygen transport in the microcirculation and its regulation / Roland N Pittman // Microcirculation. — 2013. — Vol. 20, no. 2. — Pp. 117-137.

38. Diagnosis and treatment of chronic arterial insufficiency of the lower extremities: a critical review / Jeffrey I Weitz, John Byrne, G Patrick Clagett et al. // Circulation. — 1996. — Vol. 94, no. 11. — Pp. 3026-3049.

39. Blood flow velocity measurements in chicken embryo vascular network via PIV approach / Maxim A Kurochkin, Elena S Stiukhina, Ivan V Fedosov, Valery V Tuchin // Saratov Fall Meeting 2017: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XIX / International Society for Optics and Photonics. — Vol. 10716. — 2018. — P. 107160H.

40. In vivo micro PIV in the embryonic avian heart / Peter Vennemann, Kenneth T Kiger, NTC Ursem et al. // 6th international symposium on particle image velocimetry. Pasadena, CA, USA. — 2005.

41. Flexible biodegradable citrate-based polymeric step-index optical fiber / Dingying Shan, Chenji Zhang, Surge Kalaba et al. // Biomaterials. — 2017.

— Vol. 143. — Pp. 142-148.

42. Decher, Gero. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process, 1 consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles on charged surfaces / Gero Decher, Jong-Dal Hong // Makromolekulare Chemie. Macromolecular Symposia / Wiley Online Library. — Vol. 46. — 1991. — Pp. 321-327.

43. Atomic force microscopy studies of salt effects on polyelectrolyte multilayer film morphology / Richard A McAloney, Mark Sinyor, Vyacheslav Dud-nik, M Cynthia Goh // Langmuir. — 2001. — Vol. 17, no. 21. — Pp. 66556663.

44. Guyomard, Aurelie. Buildup of multilayers based on amphiphilic polyelec-trolytes / Aurelie Guyomard, Guy Muller, Karine Glinel // Macromolecules.

— 2005. — Vol. 38, no. 13. — Pp. 5737-5742.

45. Porous calcium carbonate microparticles as templates for encapsulation of bioactive compounds / Gleb B Sukhorukov, Dmitry V Volodkin, Anja M Gunther et al. // Journal of Materials Chemistry. — 2004. — Vol. 14, no. 14. — Pp. 2073-2081.

46. Drastic morphological modification of polyelectrolyte microcapsules induced by high temperature / Karen Köhler, Dmitry G Shchukin, Gleb B Sukhorukov, Helmuth Mohwald // Macromolecules. — 2004. — Vol. 37, no. 25. — Pp. 9546-9550.

47. Thermal behavior of polyelectrolyte multilayer microcapsules. 1. The effect of odd and even layer number / Karen Kohler, Dmitry G Shchukin, Helmuth Mohwald, Gleb B Sukhorukov // The Journal of Physical Chemistry B. — 2005. — Vol. 109, no. 39. — Pp. 18250-18259.

48. Melting of PDADMAC/PSS capsules investigated with AFM force spectroscopy / Renate Mueller, Karen Kohler, Richard Weinkamer et al. // Macromolecules. — 2005. - Vol. 38, no. 23. - Pp. 9766-9771.

49. pH-controlled macromolecule encapsulation in and release from polyelec-trolyte multilayer nanocapsules / Gleb B Sukhorukov, Alexei A Antipov, Andreas Voigt et al. // Macromolecular Rapid Communications. — 2001. — Vol. 22, no. 1. — Pp. 44-46.

50. pH-dependent release of insulin from layer-by-layer-deposited polyelec-trolyte microcapsules / Kentaro Yoshida, Tetsuya Ono, Yoshitomo Kashi-wagi et al. // Polymers. — 2015. — Vol. 7, no. 7. — Pp. 1269-1278.

51. Matrix polyelectrolyte microcapsules: new system for macromolecule encapsulation / Dmitry V Volodkin, Alexander I Petrov, Michelle Prevot, Gleb B Sukhorukov // Langmuir. — 2004. — Vol. 20, no. 8. — Pp. 33983406.

52. Polyelectrolyte multilayer capsule permeability control / Alexei A Antipov, Gleb B Sukhorukov, Stefano Leporatti et al. // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. — 2002. — Vol. 198. — Pp. 535541.

53. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelec-trolytes / Edwin Donath, Gleb B Sukhorukov, Frank Caruso et al. // Angewandte Chemie International Edition. — 1998. — Vol. 37, no. 16. — Pp. 2201-2205.

54. Peyratout, Claire S. Tailor-made polyelectrolyte microcapsules: from multilayers to smart containers / Claire S Peyratout, Lars Daehne // Angewandte Chemie International Edition. — 2004. — Vol. 43, no. 29. — Pp. 3762-3783.

55. Caruso, Frank. Hollow capsule processing through colloidal templating and self-assembly / Frank Caruso // Chemistry-A European Journal. — 2000. — Vol. 6, no. 3. — Pp. 413-419.

56. An, Zhihua. pH controlled permeability of lipid/protein biomimetic microcapsules / Zhihua An, Helmuth Mohwald, Junbai Li // Biomacromolecules. - 2006. - Vol. 7, no. 2. - Pp. 580-585.

57. Urease encapsulation in nanoorganized microshells / Yuri Lvov, Alex-ei A Antipov, Arif Mamedov et al. // Nano Letters. — 2001. — Vol. 1, no. 3. — Pp. 125-128.

58. Antipov, Alexei A. Influence of the ionic strength on the polyelectrolyte multilayers' permeability / Alexei A Antipov, Gleb B Sukhorukov, H Mohwald // Langmuir. — 2003. — Vol. 19, no. 6. — Pp. 2444-2448.

59. Swelling and shrinking of polyelectrolyte microcapsules in response to changes in temperature and ionic strength / Changyou Gao, Stefano Lep-oratti, Sergio Moya et al. // Chemistry-A European Journal. — 2003. — Vol. 9, no. 4. — Pp. 915-920.

60. Mesoporous silica particles as templates for preparing enzyme-loaded biocompatible microcapsules / AIMIN Yu, YAJUN Wang, Elizabeth Barlow, Frank Caruso // Advanced Materials. — 2005. — Vol. 17, no. 14. — Pp. 1737-1741.

61. Layer-by-layer engineering of biocompatible, decomposable core- shell structures / Dinesh B Shenoy, Alexei A Antipov, Gleb B Sukhorukov, Helmuth Mohwald // Biomacromolecules. — 2003. — Vol. 4, no. 2. — Pp. 265-272.

62. One-Step Formulation of Protein Microparticles with Tailored Properties: Hard Templating at Soft Conditions / Dmitry V Volodkin, Stephan Schmidt, Paulo Fernandes et al. // Advanced Functional Materials. — 2012. — Vol. 22, no. 9. — Pp. 1914-1922.

63. Encapsulation performance of layer-by-layer microcapsules for proteins / Marie-Luce De Temmerman, Jo Demeester, Filip De Vos, Ste-faan C De Smedt // Biomacromolecules. — 2011. — Vol. 12, no. 4. — Pp. 1283-1289.

64. Angelatos, Alexandra S. Light-responsive polyelectrolyte/gold nanoparticle microcapsules / Alexandra S Angelatos, Benno Radt, Frank Caruso // The Journal of Physical Chemistry B. — 2005. — Vol. 109, no. 7. — Pp. 3071— 3076.

65. LbL multilayer capsules: recent progress and future outlook for their use in life sciences / L Loretta, Pilar Rivera-Gil, Azhar Z Abbasi et al. // Nanoscale. — 2010. — Vol. 2, no. 4. — Pp. 458-467.

66. Intracellular processing of proteins mediated by biodegradable polyelectrolyte capsules / Pilar Rivera-Gil, Stefaan De Koker, Bruno G De Geest, Wolfgang J Parak // Nano letters. — 2009. — Vol. 9, no. 12. — Pp. 43984402.

67. Neuron cells uptake of polymeric microcapsules and subsequent intracellular release / Anton M Pavlov, Andrei V Sapelkin, Xinyue Huang et al. // Macromolecular bioscience. — 2011. — Vol. 11, no. 6. — Pp. 848-854.

68. Layer-by-layer assembled fluorescent probes in the second near-infrared window for systemic delivery and detection of ovarian cancer / Xiang-nan Dang, Li Gu, Jifa Qi et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2016. — Vol. 113, no. 19. — Pp. 5179-5184.

69. Bimodal tumor-targeting from microenvironment responsive hyaluronan layer-by-layer (LbL) nanoparticles / Erik C Dreaden, Stephen W Morton, Kevin E Shopsowitz et al. // ACS nano. — 2014. — Vol. 8, no. 8. — Pp. 8374-8382.

70. Hydrophobic IR-780 dye encapsulated in cRGD-conjugated solid lipid nanoparticles for NIR imaging-guided photothermal therapy / Ye Kuang, Kunchi Zhang, Yi Cao et al. // ACS applied materials & interfaces. — 2017. — Vol. 9, no. 14. — Pp. 12217-12226.

71. Transfer of cells with uptaken nanocomposite, magnetite-nanoparticle func-tionalized capsules with electromagnetic tweezers / Irina V Vidiasheva, Anatolii A Abalymov, Maxim A Kurochkin et al. // Biomaterials science. — 2018. — Vol. 6, no. 8. — Pp. 2219-2229.

72. Singh, Abhalaxmi. Magnetic nanoparticles: a novel platform for cancer ther-anostics / Abhalaxmi Singh, Sanjeeb K Sahoo // Drug discovery today. — 2014. — Vol. 19, no. 4. — Pp. 474-481.

73. Smart multifunctional magnetic nanoparticle-based drug delivery system for cancer thermo-chemotherapy and intracellular imaging / Beibei Shen, Yuan Ma, Shiyong Yu, Chenhui Ji // ACS applied materials & interfaces.

— 2016. — Vol. 8, no. 37. — Pp. 24502-24508.

74. Co-encapsulation of magnetic nanoparticles and doxorubicin into biodegradable microcarriers for deep tissue targeting by vascular MRI navigation / Pierre Pouponneau, Jean-Christophe Leroux, Gilles Soulez et al. // Biomaterials. — 2011. — Vol. 32, no. 13. — Pp. 3481-3486.

75. Secomb, TW. Motion of red blood cells in a capillary with an endothelial surface layer: effect of flow velocity / TW Secomb, R Hsu, AR Pries // American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. — 2001. — Vol. 281, no. 2. — Pp. H629-H636.

76. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis / Jay R Hove, Reinhard W Koster, Arian S Forouhar et al. // Nature. — 2003. — Vol. 421, no. 6919. — P. 172.

77. Nowak-Sliwinska, Patrycja. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering / Patrycja Nowak-Sliwinska, Ta-tiana Segura, M Luisa Iruela-Arispe // Angiogenesis. — 2014. — Vol. 17, no. 4. — Pp. 779-804.

78. Evaluation of the circle of Willis with three-dimensional CT angiography in patients with suspected intracranial aneurysms. / Ronald A Alberico, Mahendra Patel, Sean Casey et al. // American journal of neuroradiology.

— 1995. — Vol. 16, no. 8. — Pp. 1571-1578.

79. Hartung, Michael P. Magnetic resonance angiography: current status and future directions / Michael P Hartung, Thomas M Grist, Christopher J Francois // Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. — 2011.

— Vol. 13, no. 1. — P. 19.

80. Briers, J David. Capillary blood flow monitoring using laser speckle contrast analysis (LASCA) / J David Briers, Glenn J Richards, Xiao-Wei He // Journal of biomedical optics. — 1999. — Vol. 4, no. 1. — Pp. 164-176.

81. Davis, Anjul. Quantitative measurement of blood flow dynamics in embryonic vasculature using spectral Doppler velocimetry / Anjul Davis, Joseph Izatt, Florence Rothenberg // The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. — 2009. — Vol. 292, no. 3. — Pp. 311319.

82. Riva, Charles. Laser Doppler measurements of blood flow in capillary tubes and retinal arteries / Charles Riva, Benjamin Ross, George B Benedek // Investigative Ophthalmology & Visual Science. — 1972. — Vol. 11, no. 11.

— Pp. 936-944.

83. Micro-particle image velocimetry (^PIV): recent developments, applications, and guidelines / Ralph Lindken, Massimiliano Rossi, Sebastian Große, Jerry Westerweel // Lab on a Chip. — 2009. — Vol. 9, no. 17.

— Pp. 2551-2567.

84. Advanced digital methods for blood flow flux analysis using ^PIV approach / Maxim A Kurochkin, Polina A Timoshina, Ivan V Fedosov, Valery V Tuchin // Saratov Fall Meeting 2014: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVI; Laser Physics and Photonics XVI; and Computational Biophysics / International Society for Optics and Photonics. — Vol. 9448. — 2015. — P. 94481A.

85. Micro-PIV quantification of capillary blood flow redistribution caused by laser-assisted vascular occlusion / Maxim A Kurochkin, Elena S Stiukhina, Ivan V Fedosov et al. // Saratov Fall Meeting 2015: Third International Symposium on Optics and Biophotonics and Seventh Finnish-Russian Photonics and Laser Symposium (PALS) / International Society for Optics and Photonics. — Vol. 9917. — 2016. — P. 99171T.

86. Adaptive ^PIV for visualization of capillary network microcirculation using Niblack local binarization / Maxim A Kurochkin, Elena S Stiukhina, Ivan V Fedosov, Valery V Tuchin // Saratov Fall Meeting 2016: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVIII / International Society for Optics and Photonics. - Vol. 10336. - 2017. - P. 103360W.

87. Adrian, Ronald J. Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics / Ronald J Adrian // Annual review of fluid mechanics. — 1991. — Vol. 23, no. 1. — Pp. 261-304.

88. Chien, Aichi. Analyzing Circle of Willis blood flow in ischemic stroke patients through 3D Stroke Arterial Flow Estimation / Aichi Chien, Fernando Vinuela // Interventional Neuroradiology. — 2017. — Vol. 23, no. 4. — Pp. 427-432.

89. Spect measurements of regional cerebral perfusion and carbondioxide reactivity: correlation with cerebral collaterals in internal carotid artery occlusive disease / Michiel J de Boorder, Jeroen van der Grond, Alice J van Dongen et al. // Journal of neurology. — 2006. — Vol. 253, no. 10. — Pp. 12851291.

90. Dynamic 3D-CT angiography / M Matsumoto, N Kodama, Y Endo et al. // American journal of neuroradiology. — 2007. — Vol. 28, no. 2. — Pp. 299304.

91. Evaluation of CT perfusion in the setting of cerebral ischemia: patterns and pitfalls / YW Lui, ER Tang, AM Allmendinger, V Spektor // American Journal of Neuroradiology. — 2010. — Vol. 31, no. 9. — Pp. 1552-1563.

92. Segmentation of the pulmonary vascular trees in 3D CT images using variational region-growing / Maciej Orkisz, M Hernandez Hoyos, V Perez Ro-manello et al. // IRBM. — 2014. — Vol. 35, no. 1. — Pp. 11-19.

93. Postcatheterization pseudoaneurysms and arteriovenous fistulas: repair with percutaneous implantation of endovascular covered stents / Christoph Thalhammer, Anja S Kirchherr, Frank Uhlich et al. // Radiology. — 2000. — Vol. 214, no. 1. — Pp. 127-131.

94. Noninvasive fractional flow on MRA predicts stroke risk of intracranial stenosis / David S Liebeskind, Andrzej S Kosinski, Michael J Lynn et al. // Journal of neuroimaging. — 2015. — Vol. 25, no. 1. — Pp. 87-91.

95. Optimization of MR parameters of 3D TOF-MRA for various intracranial stents at 3.0 T MRI / Jin Woo Choi, Hong Gee Roh, Won-Jin Moon et al. // Neurointervention. — 2011. — Vol. 6, no. 2. — Pp. 71-77.

96. High-Resolution In vivo Three-Dimensional Mapping of Blood Flow and Blood Vessels Using Advanced Multipoint Laser Doppler Velocimeter / Tsugunobu Andoh, Hiroki Ishida, Shunsuke Akiguchi et al. // Japanese Journal of Applied Physics. — 2009. — Vol. 48, no. 1R. — P. 017002.

97. Briers, J David. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging / J David Briers // Physiological measurement. — 2001. — Vol. 22, no. 4. — P. R35.

98. Tuchin, Valerii. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis / Valerii Tuchin.

99. Roustit, Matthieu. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation / Matthieu Roustit, Jean-Luc Cracowski // Trends in pharmacological sciences. — 2013. — Vol. 34, no. 7. — Pp. 373384.

100. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation / Surya C Gnyawali, Kevin Blum, Durba Pal et al. // Scientific reports. — 2017. — Vol. 7. — P. 41048.

101. Postnov, Dmitry D. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images / Dmitry D Postnov, Valery V Tuchin, Olga Sosnovtseva // Biomedical optics express. — 2016. — Vol. 7, no. 7. — Pp. 2759-2768.

102. Fully distributed absolute blood flow velocity measurement for middle cerebral arteries using Doppler optical coherence tomography / Li Qi,

Jiang Zhu, Aneeka M Hancock et al. // Biomedical optics express. — 2016.

— Vol. 7, no. 2. — Pp. 601-615.

103. Accurate blood flow measurements: are artificial tracers necessary? / Christian Poelma, Astrid Kloosterman, Beerend P Hierck, Jerry Westerweel // PloS one. — 2012. — Vol. 7, no. 9. — P. e45247.

104. Shear-induced diffusion of red blood cells measured with dynamic light scattering-optical coherence tomography / Jianbo Tang, Sefik Evren Erdener, Baoqiang Li et al. // Journal of biophotonics. — 2018. — Vol. 11, no. 2.

— P. e201700070.

105. Particle image velocimetry: a practical guide / Markus Raffel, Christian E Willert, Fulvio Scarano et al. — Springer, 2018.

106. Niblack, Wayne. An introduction to digital image processing / Wayne Niblack. — Prentice-Hall Englewood Cliffs, 1986. — Vol. 34.

107. Sharan, Maithili. A two-phase model for flow of blood in narrow tubes with increased effective viscosity near the wall / Maithili Sharan, Alek-sander S Popel // Biorheology. — 2001. — Vol. 38, no. 5, 6. — Pp. 415-428.

108. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods / KL Pitts, R Mehri, C Mavriplis, M Fenech // Measurement Science and Technology.

— 2012. — Vol. 23, no. 10. — P. 105302.

109. Massart, Rene. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media / Rene Massart // IEEE transactions on magnetics. — 1981. — Vol. 17, no. 2. — Pp. 1247-1248.

110. Synthesis of magnetite hydrosols in inert atmosphere / SV German, OA In-ozemtseva, AV Markin et al. // Colloid Journal. — 2013. — Vol. 75, no. 4.

— Pp. 483-486.

111. Council, National Research. Guide for the care and use of laboratory animals / National Research Council et al. — National Academies Press, 2010.

112. Bovine serum albumin adsorption onto immobilized organotrichlorosilane surface: influence of the phase separation on protein adsorption patterns / Shouren Ge, Ken Kojio, Atsushi Takahara, Tisato Kajiyama // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. — 1998. — Vol. 9, no. 2. — Pp. 131— 150.

113. Magnetic nanoparticles: design and characterization, toxicity and biocom-patibility, pharmaceutical and biomedical applications / L Harivardhan Red-dy, Jose L Arias, Julien Nicolas, Patrick Couvreur // Chemical reviews. — 2012. — Vol. 112, no. 11. — Pp. 5818-5878.

114. Preparation and fluorescence properties of fluorophore-labeled avidin-biotin system immobilized on Fe3O4 nanoparticles through functional in-dolequinone linker / Nao Hirata, Kazuhito Tanabe, Asako Narita et al. // Bioorganic & medicinal chemistry. — 2009. — Vol. 17, no. 11. — Pp. 37753781.

115. Emulsion-based synthesis of reversibly swellable, magnetic nanoparticle-embedded polymer microcapsules / Hye Young Koo, Suk Tai Chang, Won San Choi et al. // Chemistry of materials. — 2006. — Vol. 18, no. 14.

— Pp. 3308-3313.

116. Magnetic/gold nanoparticle functionalized biocompatible microcapsules with sensitivity to laser irradiation / Dmitry A Gorin, Sergey A Portnov, Olga A Inozemtseva et al. // Physical Chemistry Chemical Physics. — 2008.

— Vol. 10, no. 45. — Pp. 6899-6905.

117. Fabrication of uniform "smart" magnetic microcapsules and their controlled release of sodium salicylate / Sai Zhang, Yifeng Zhou, Wangyan Nie et al. // Journal of Materials Chemistry B. — 2013. — Vol. 1, no. 34. — Pp. 43314337.

118. Magnetic targeting and cellular uptake of polymer microcapsules simultaneously functionalized with magnetic and luminescent nanocrystals / Bernd Zebli, Andrei S Susha, Gleb B Sukhorukov et al. // Langmuir. — 2005. — Vol. 21, no. 10. — Pp. 4262-4265.

119. Galanzha, Ekaterina I. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening / Ekaterina I Galanzha, Valery V Tuchin, Vladimir P Zharov // World Journal of Gastroenterology: WJG. — 2007. - Vol. 13, no. 2. - P. 192.

120. Rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis / Ming Yang, Peter C Stapor, Shayn M Peirce et al. // Journal of visualized experiments: JoVE. — 2012. — no. 63.

121. Observation of mesenteric microcirculatory disturbance in rat by laser oblique scanning optical microscopy / Yichen Ding, Yu Zhang, Tong Peng et al. // Scientific reports. — 2013. — Vol. 3. — P. 1762.

122. Fass, Joseph N. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-^ 1 in-tegrin antibody-coated magnetic beads / Joseph N Fass, David J Odde // Biophysical journal. — 2003. — Vol. 85, no. 1. — Pp. 623-636.

123. Huang, Hayden. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology / Hayden Huang, Roger D Kamm, Richard T Lee // American Journal of Physiology-Cell Physiology. — 2004. — Vol. 287, no. 1. — Pp. C1-C11.

124. Yang, Jiho. Predicting bifurcation angle effect on blood flow in the mi-crovasculature / Jiho Yang, Y Eugene Pak, Tae-Rin Lee // Microvascular research. — 2016. — Vol. 108. — Pp. 22-28.

125. Treatment of renal adenocarcinoma by embolic occlusion of the renal circulation / Lars Erik Almgard, Ingmar Fernstrom, Mats Haverling, ARNE LJUNGQVIST // British journal of urology. — 1973. — Vol. 45, no. 5. — Pp. 474-479.

126. Mathieu, Jean-Baptiste. Steering of aggregating magnetic microparticles using propulsion gradients coils in an MRI scanner / Jean-Baptiste Mathieu, Sylvain Martel // Magnetic Resonance in Medicine. — 2010. — Vol. 63, no. 5. — Pp. 1336-1345.

127. Multiple internalization pathways of polyelectrolyte multilayer capsules into mammalian cells / Lena Kastl, Daniel Sasse, Verena Wulf et al. // ACS nano. — 2013. — Vol. 7, no. 8. — Pp. 6605-6618.

128. Targeting cancer cells: controlling the binding and internalization of antibody-functionalized capsules / Angus PR Johnston, Marloes MJ Kam-phuis, Georgina K Such et al. // ACS nano. — 2012. — Vol. 6, no. 8. — Pp. 6667-6674.

129. The role of capsule stiffness on cellular processing / Huanli Sun, Edgar HH Wong, Yan Yan et al. // Chemical science. — 2015. — Vol. 6, no. 6. — Pp. 3505-3514.

130. Mesenchymal stem cell magnetization: magnetic multilayer microcapsule uptake, toxicity, impact on functional properties, and perspectives for magnetic delivery / Kirill V Lepik, Albert R Muslimov, Alexander S Timin et al. // Advanced healthcare materials. — 2016. — Vol. 5, no. 24. — Pp. 3182-3190.

131. Becker, Alisa L. Layer-by-layer-assembled capsules and films for therapeutic delivery / Alisa L Becker, Angus PR Johnston, Frank Caruso // Small. — 2010. — Vol. 6, no. 17.

132. Biocompatibility of Fe3O4 nanoparticles evaluated by in vitro cytotoxicity assays using normal, glia and breast cancer cells / Balaprasad Ankamwar, Tsung-Ching Lai, Jing-Hong Huang et al. // Nanotechnology. — 2010. — Vol. 21, no. 7. — P. 075102.

133. Manipulating nanoparticle transport within blood flow through external forces: an exemplar of mechanics in nanomedicine / Huilin Ye, Zhiqiang Shen, Le Yu et al. // Proc. R. Soc. A. — 2018. — Vol. 474, no. 2211. — P. 20170845.

134. Beyond 100 nm resolution in 3D laser lithography—Post processing solutions / G Seniutinas, Andreas Weber, Celestino Padeste et al. // Microelectronic Engineering. — 2018. — Vol. 191. — Pp. 25-31.

135. Nanocomposite microcontainers / Christine M Andres, Inigo Larraza, Teresa Corrales, Nicholas A Kotov // Advanced Materials. — 2012. — Vol. 24, no. 34. — Pp. 4597-4600.

136. Deuschle, Ulrich. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. / Ulrich Deuschle, WK Meyer, Hans-Jurgen Thiesen // Molecular and cellular biology. — 1995. — Vol. 15, no. 4. — Pp. 1907-1914.

137. Influence of extracellular matrix proteins on human keratinocyte attachment, proliferation and transfer to a dermal wound model / RA Dawson, NJ Goberdhan, E Freedlander, S MacNeil // Burns. — 1996. — Vol. 22, no. 2. — Pp. 93-100.

138. Kitajima, Y. Protein metabolism during the stratum corneum formation: Molecular aspects of keratinization, cell adhesions and cytoskelet ons / Y Kitajima. — 1998.

139. Bioactive coronary stent coating based on layer-by-layer technology for siRNA release / S Hossfeld, A Nolte, H Hartmann et al. // Acta biomateri-alia. — 2013. — Vol. 9, no. 5. — Pp. 6741-6752.

140. Magnetically triggered reversible controlled drug delivery from microfabricated polymeric multireservoir devices / Kaiyong Cai, Zhong Luo, Yan Hu et al. // Advanced Materials. — 2009. — Vol. 21, no. 40. — Pp. 4045-4049.

141. Development of Nanoparticle Stabilized Polymer Nanocontainers with High Content of the Encapsulated Active Agent and Their Application in Water-Borne Anticorrosive Coatings / Martin F Haase, Dmitry O Grigoriev, Helmuth Mohwald, Dmitry G Shchukin // Advanced Materials. — 2012. — Vol. 24, no. 18. — Pp. 2429-2435.

142. Near-Infrared-Activated Nanocalorifiers in Microcapsules: Vapor Bubble Generation for In Vivo Enhanced Cancer Therapy / Jingxin Shao, Mingjun Xuan, Luru Dai et al. // Angewandte Chemie International Edition. — 2015. — Vol. 54, no. 43. — Pp. 12782-12787.

143. Biodegradable protein-based rockets for drug transportation and light-triggered release / Zhiguang Wu, Xiankun Lin, Xian Zou et al. // ACS applied materials & interfaces. — 2014. — Vol. 7, no. 1. — Pp. 250-255.

144. NIR-Laser-Switched In Vivo Smart Nanocapsules for Synergic Photothermal and Chemotherapy of Tumors / Zhouqi Meng, Fang Wei, Ronghua Wang et al. // Advanced Materials. — 2016. — Vol. 28, no. 2. — Pp. 245-253.

145. Layer-by-Layer Coated Gold Nanoparticles: Size-Dependent Delivery of DNA into Cells / Asmaa Elbakry, Eva-Christina Wurster, Alaa Zaky et al. // Small. — 2012. — Vol. 8, no. 24. — Pp. 3847-3856.

146. Link, Stephan. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles / Stephan Link, Mostafa A El-Sayed // The Journal of Physical Chemistry B. — 1999. — Vol. 103, no. 21. — Pp. 42124217.

147. Pattnaik, Priyabrata. Surface plasmon resonance / Priyabrata Pattnaik // Applied biochemistry and biotechnology. — 2005. — Vol. 126, no. 2. — Pp. 79-92.

148. Laser-induced release of encapsulated materials inside living cells / Andre G Skirtach, Almudena Munoz Javier, Oliver Kreft et al. // Angewandte Chemie International Edition. — 2006. — Vol. 45, no. 28. — Pp. 4612-4617.

149. Tetracycline-inducible expression systems with reduced basal activity in mammalian cells / Karin Forster, Vera Helbl, Thomas Lederer et al. // Nucleic acids research. — 1999. — Vol. 27, no. 2. — Pp. 708-710.

150. Tumor necrosis factor receptor I from patients with tumor necrosis factor receptor-associated periodic syndrome interacts with wild-type tumor necrosis factor receptor I and induces ligand-independent NF-kB activation / Nasim Yousaf, David J Gould, Ebun Aganna et al. // Arthritis & Rheumatology. — 2005. — Vol. 52, no. 9. — Pp. 2906-2916.

151. Gene therapy with an improved doxycycline-regulated plasmid encoding a tumour necrosis factor-alpha inhibitor in experimental arthritis / David Gould, Nasim Yousaf, Rewas Fatah et al. // Arthritis research & therapy. — 2007. - Vol. 9, no. 1. - P. R7.

152. Arbeloa, F Lopez. Flourescence self-quenching of the molecular forms of Rhodamine B in aqueous and ethanolic solutions / F Lopez Arbeloa, P Ruiz Ojeda, I Lopez Arbeloa // Journal of luminescence. — 1989. — Vol. 44, no. 1-2. — Pp. 105-112.

153. In situ synthesis of fluorescent carbon dots/polyelectrolyte nanocompos-ite microcapsules with reduced permeability and ultrasound sensitivity / Hui Gao, Andrei V Sapelkin, Magdalena M Titirici, Gleb B Sukhorukov // ACSnano. — 2016. — Vol. 10, no. 10. — Pp. 9608-9615.

154. Zhu, Huiguang. Biomacromolecules electrostatic self-assembly on 3-dimensional tissue engineering scaffold / Huiguang Zhu, Jian Ji, Jia-cong Shen // Biomacromolecules. — 2004. — Vol. 5, no. 5. — Pp. 19331939.

155. Chang, Hsin-I. Cell responses to surface and architecture of tissue engineering scaffolds / Hsin-I Chang, Yiwei Wang // Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. — InTech, 2011.

Список рисунков

1.1 Схематическое представление синтеза молекулярно упорядоченной полимерной плёнки при помощи метода последовательной полиионной адсорбции [42].......... 17

1.2 График зависимости коэффициента поглощения (ось ординат) плёнки (Р88/РБАБМАС)П от количества полиэлектролитных бислоёв (ось абсцисс), в зависимости от концентрации солей №С1 в растворах данных полиэлектролитов. Коэффициент поглощения измерялся на длине волны 226 нм, поскольку спектр поглащения Р88, в

водном растворе, имеет пик на данной длине волны. [43] ... 18

1.3 Атомная силовая микроскопия поверхности (Р88/РБАБМАС)10 плёнки с 10 бислоями полиэлектролитов при концентрации 0.1М (а), 0.3М (б) и 1.0М (в) №С1 в растворах полиэлектролитов. Размер каждого изображения -

5х5 мкм [43]............................. 19

1.4 СЭМ изображения полимерных микро структурированных плёнок с массивами полых контейнеров на их поверхности, которые были сформированы посредствам микропечати (Р88/РБАБМАС). Для микропечати использовалась кремниевая подложка с круглыми, квадратными и коническими паттернами [21]................... 20

1.5 Схематическое представление синтеза полых многослойных микрокапсул методом последовательной адсорбции разнозаряженных полиэлектролитных слоёв [45]........ 21

1.6 Функционализация полиэлектролитных капсул при помощи металлических неорганическими наночастиц, посредствам включения в многослойную полиэлектролитную оболочку микрокапсул (PSS/PAH)4. Типичные ТЭМ-изображения (a) золотые наночастицы AuNP, (b) золотые наностержни AuNR и (с) оксид железа Fe3O4. На вставках показаны отдельные модифицированные капсулы. Масштабные полосы соответствуют 50 нм [65]...................... 23

1.7 (a)-(b) Микрокапсулы, состоящие из синтетических полимеров: a) ТЭМ изображение пустых капсул, б) конфокальная сканирующая лазерная микроскопия микрокапсул после инкапсуляция TRITC-декстрана. (c)-(d) Микрокапсулы, состоящие из биоразлогаемых полимеров, на основе ядер CaCo3: с) Атомная силовая микроскопия сухих микрокапсул, d) конфокальная сканирующая лазерная микроскопия капсул после инкапсуляции FITC-декстрана [67]. 24

1.8 In vivo биолюминесцентная визуализация распределения многослойных микрокапсул, с однослойными углеродными нанотрубками, в тканях крысы. Время наблюдения 10 секунд - 72 часа после введения суспензии капсул в хвостовую вену крысы. [68].............................. 26

1.9 (а) Биолюминисцентные изображения клеток 293Т в 24 луночном клеточном планшете. В каждую лунку высевались 150 000 клеток 293Т. Через 24 часа, микрокапсулы добавлялись в лунки планшета в соотношении 1:1 или 1:10 клеток на капсулу. В лунки столбцов 1,2,5 и 6 добавлялись магнитные микрокапсулы в соотношениях 1:1 или 1:10 клеток на капсулу. В лунки столбцов 3 и 4 добавлялись микрокапсулы без магнетита. Постоянный магнит помещался только под лунки столбцов 5 и 6. Через 72 часа субстрат люциферазы добавлялся в каждую лунку клеточного планшета с последующей регистрацией свечения флуоресценции клеток.Усреднённые значение свечения флуоресценции по всей прямоугольной области, представленны на столбцовой диаграмме (б). Жёлтым столбцам соответствует усреднённый флуоресцентный сигнал из области теоретического нахождения магнита. Красным столбцам соответствует усреднённый флуоресцентный сигнал из зон под которыми находился магнит. Данные усреднялись по 4 лункам соответствующих столбцов клеточного планшета. [32]................ 27

1.10 In vivo магнитная МРТ навигация ферромагнитной сферы диаметром 1,5 мм в сонной артерии живой свиньи. Траектория следования сферы определяется при помощи метода рентгеновской ангиографии. Зелёные точки показывают перемещение сферы в реальном масштабе времени. Белые круги диаметром 20 мм вокруг точек показывают их примерную локализацию, которая определялась при помощи МРТ системы. Белая стрелка показывает направление движения ферромагнитной сферы. Зоны перемещения ферромагнитной сферы маркированы цифрами 1, 2 и 3 [35]........................ 29

1.11 Управляемая (МРТ) химиоэмболизация в печени кролика при помощи терапевтических магнитных носителей (ТМН). Изображение (a) соответствует схематическому представлению ТМН с противоопухолевым препаратом. Изображение (б) представляет собой СЭМ изображение ТМН. Изображения (в, г) - рентгеноконтрастные изображения артерии печени кролика с наложенными изображениями распределения ТМН без (в) и с (г) МРТ навигацией микрокапсул. На изображении (в), микроносители доставляются в артерию печени кролика через катетер. Изображение (г) показывает МРТ навигацию микрокапсул в артерии печени кролика. Изображения (д-ж) соответствуют in vivo Т2 - взвешенным МРТ изображениям печени кролика до (д) и после введения ТМН через катетер без (е) и с МРТ навигацией (ж). Без МРТ навигации, правая и левая доли печени затемнены, что указывает на присутствие ТМН во всей печени. При МРТ навигации потока ТМН в артерии печени, поток ТМН направляется в левое артериальное ответвления, оставляю ткани печени

вокруг правой артериальной ветви, свободными от ТМН [33]. 31

1.12 Артериальный кровоток, основанный на трехмерных изображениях CTA для анализа кровотока в Круге Уиллиса. (a) Снимок 3D CTA-клинического изображение пациента с ишемическим инсультом (б) Трёхмерная сосудистая реконструкция с морфологическим удалением участков изображения костей (с) Цифровая реконструкция сосудов (d) Результаты моделирования кровотока. [88]........... 34

1.13 КТ параметрическая карта (а). Кровоток головного мозга (б). Объёмный кровоток мозга (с). Временная карта транзита контрастирующего агента (д). Цветовые карты кодируются в псевдоцветовом представлении от минимального значения (синий) до максимального (красный). [91]............ 35

1.14 Репрезентативное изображение перфузии головного мозга мыши полученное методом спекл-контраста (а). Гистограмма перфузии микрососудов мозга крысы (б). Перфузионная карта полученная редуцирпованным методом спекл-контраста (с). Гистограмма кровонаполненных микрососудов (д). [100]...................... 37

1.15 ОКТ визуализация сосудов головного мозга мыши. Проекция максимальной интенсивности ОКТ ангиографии (слева), карта скоростей крови (центральная часть), коэффициент диффузии (справа). Глубина сканирования 0-350 мкм. Шкала соответствует 100 мкм (а). Суперпозиция карт скоростей и диффузии (б). Аксиальный профиль скорости и диффузии

для сосуда 31 мкм (слева) и 51 мкм (справа) (с). [104]..... 38

2.1 Стеклянный фантом уединённого кровеносного сосуда..... 45

2.2 Треугольникам с заполнением соответствуют измеренные значения скорости по водному мениску. Треугольникам без заполнения соответствуют расчётные значения скорости методом Р1У анализа. Прямая - линейная регрессия измеренных значений скорости.................. 46

2.3 Адаптивная бинаризация сетей кровеносных сосудов хориоаллантоисной оболочки 12 дневного куриного эмбриона. Изображение кровеносных сосудов (А); адаптивная бинаризация (Б); фильтровались по признаку устойчивости к однократной эрозии (В); Результирующая маска сетей сосудов, полученная при суммировании 50

бинаризованных изображений сетей сосудов (Г)......... 48

2.4 Изображение капиллярной сети хориоаллантоисная оболочка куриного эмбриона (а). Маска капиллярной сети (б). Адаптивное Р1У по рассчитанной маски капиллярной сети (в). Увеличенный сегмент изображения (г)........... 50

2.5 Сплошная линия соответствует нормированному

измеренному поперечному профилю скорости крови PIV методом. Пунктирная линия соответствует нормированному параболическому профилю скорости ламинарного потока жидкости по Пуазейлю....................... 51

3.1 Экспериментальная установка.................. 57

3.2 Схематическое представление магнитного пинцета для in

vivo захвата магнитных микрокапсул............... 58

3.3 Схематическое представление структуры оболочки магнитных флуоресцентных микрокапсул (а) и их конфокальное изображения (б).................. 61

3.4 СЭМ изображения магнитных флуоресцентных микрокапсул . 62

3.5 Распределение магнитного поля постоянного магнита в пределах стелянного капилляра. Каждая точка графика соответствует среднему значению по трём измерениям магнитного поля........................... 63

3.6 Визуализация in vitro микрокапсул, движущихся в потоке цельной крови крысы без магнита (а), улавливание капсул с помощью постоянного магнита через 30, 60 и 90 с после применения магнитного поля (б-г) и соответственно (д и е) -после удаления магнита. Капсулы хорошо видны в виде

белых областей вблизи стеклянной капиллярной стенки. ... 64

3.7 Количество микрокапсул задержанных магнитным полем ... 65

3.8 Фотография брыжейки крысы с указанием ветвей верхней брыжеечной артерии, места инъекции и области визуализации сосудистых сетей и in vivo магнитного захвата микрокапсул............................. 66

3.9 Визуализация in vivo и захват микрокапсул в сосудах брыжейки; (a-в) захвата капсул в Y-разветвленном микрососуде: (a) светлопольное изображение микрососудов (б) флуоресцентый канал визуализации на длине волны возбуждения 532 нм (в) комбинированное изображение сосудов и флуоресценции микрокапсул; (г-е) Дополнительные эксперименты in vivo по захвату капсул в изгибах и бифуркациях микрососудистого русла брыжейки

(желтые линии на (е) обозначают стенку микрососуда..... 67

3.10 Трёхмерное распределение напряжённости магнитного поля в зазоре между концентратарами пары замкнутых электромагнитов........................... 68

3.11 Типичный гистологический срез брыжейки крысы после магнитного захвата капсул: (А) стенка вены, отмеченная желтыми линиями; (Б) эритроциты; (В) небольшой капилляр, заполненный микрокапсулами; (Г) агломерация микрокапсул; (Д) микрокапсулы предположительно проникшие через эндотелий в стенку вены............ 69

3.12 Карта распределения скоростей крови сети сосудов брыжейки крысы до (а,в) и после (б,г) введения многослойных магнитным микрокапсул в системный кровоток, с последующим магнитным захватом микрокапсул,

посредствам магнитного пинцета................. 71

4.1 Экспериментальная установка для визуализации и управляемого магнитного захвата суспензии клеток в стеклянном канале.......................... 77

4.2 Изображения флуоресцентных микрокапсул, полученные при помощи сканирующего электронного микроскопа (а, б)

и флуоресцентного конфокального микроскопа (в)....... 78

4.3 Конфокальная 3Б реконструкция изображений клеток МА-104 с интернализованными микрокапсулами. Клетки меченые кальцеином (а); ТЯ1ТС флуоресценция

микрокапсул (б); Положение капсул в живое клетке (в)..... 78

4.4 Интернализация капсул, меченых ТЯ1ТС (красный), в клеткки МА-104, окрашеные кальцеином (зелёный). Время указано в минутах, с момента добавления суспензии микрокапсул............................. 79

4.5 Тест цитотоксичности микрокапсул РЛИ/Р88 для клеточной линии МА-104............................ 80

4.6 Схема эксперимента магнитного захвата клеток в

стеклянном капилляре, при помощи магнитного пинцета. ... 81

4.7 Карта распределения градиента магнитной индукции относительно поля зрения микроскопа и стеклянного канала . 82

4.8 Клеточная колония, сформированная градиентным магнитным полем (а). Распределение магнитной индукции в поле зрения микроскопа (б) ................... 83

4.9 Поля скоростей магнитных клеток до и после магнитного воздействия. ............................ 83

4.10 Флуоресцентные изображения клеточная колония, после магнитного захвата в стеклянном капилляре, спустя 24 ч(а) и

96 ч(в) соответственно. Клетки прокрашивались кальцеином. 84

4.11 Выживаемость клеток с магнитными капсулами после магнитного воздействия в стеклянном канале и в чашке Петри. 84

5.1 Процесс изготовления полимерной плёнки с массивом полых трёхмерных контейнеров, методом полионионной сборки. . . 88

5.2 СЭМ изображение Р88/РБЛБМЛС полиэлектролитной трёхмерной плёнки (а). Спектр поглощения Р88/РБЛБМЛ полиэлектролитной трёхмерной плёнки с напылённым слоем наночастиц золота (б)........................ 89

5.3 Экспериментальная установка для ИК лазерной активации полимерных микроконтейнеров.................. 90

5.4 Схематическое изображение эксперимента лазерного ИК вскрытия сухой полимерной трёхмерной плёнки, через мультимодовое оптическое волокно................ 92

5.5 Характерные паттерны фототермического повреждения

сухих полиэлектролитных трёхмерных плёнок. ........ 92

5.6 Схематическое изображение эксперимента лазерного ИК вскрытия полимерной трёхмерной плёнки, через мультимодовое оптическое волокно, в водной среде....... 93

5.7 Паттерны фототермического повреждения ПТМП лазерным ИК излучением через многомодовое оптическое волокно в деионизированной воде (а) и соответствующие им СЭМ изображения (б)........................... 94

5.8 Схематическое изображение эксперимента лазерного ИК вскрытия полимерной трёхмерной плёнки, через мультимодовое оптическое волокно, в 1% агарозном геле. . . 95

5.9 Светлопольные изображения полимерной трёхмерной плёнки до(а) и после (б) лазерного ИК воздействия, посредствам оптического многомодового волокна. Флуоресцентные изображения инкапсулированного родамина б, в микроконтейнерах ПТМП до (в) и после (г) лазерного воздействия. Конфокальные изображения повреждённой зоны в зелёном (Б1ТС) (д) и красном (Родамин В) (Е) канале.Наложение изображения в светлом поле и красного конфокального канала визуализации (Ж). Наложение красного и зелёного конфокального канала визуализации (з). Расстояние между концом оптического волокна и поверхностью ПТМП составляло 100 мкм. Плотность мощности лазерного ИК (830 нм) излучения составляла 4,5 кВт/см2....................... 97

5.10 Конфокальные изображения Р88/РБЛБМЛС ПТМП в 1% агарозном геле после лазерного ИК воздействия через многомодовое оптическое волокно. Плотностью мощности лазерного воздействия составляла 5,6 кВт/см2. Красный канал флуоресценции (а) соответствует свечению инкапсулированного родамина В. Зелёный канал флуоресценции (б) соответствует свечению Б1ТС растворённого в 1% агарозном геле. Совмещение светлопольного изображения и красного канала флуоресценции (в).Совмещение красного и зелёного канала флуоресценции (г) демонстрирует локализацию и релиз карго преципитата в зоне лазерного воздействия. Изображения (д) и (е) соответствуют 3Б реконструкции положения флуоресцентного сигнала родамина В и Б1ТС в зоне лазерного воздействия. Рисунок (е), в пространстве предметов, является перевёрнутым относительно оси У таким образом, что центральная выпуклая область (д) флуоресцентного сигнала Б1ТС помещается в вогнутую

область расплавленной полимерной плёнки........... 98

5.11 Зависимость между количеством поврежденных микроконтейнеров Р88/РБЛБМЛС ПТМП и плотностью мощности ИК лазера (расстояние 100 мкм). Черные столбики - количество повреждённых сухих микроконтейнеров, красные столбики - количество повреждённых микроконтейнеров в деионизированной воде, синие столбики - количество повреждённых

микроконтейнеров в 1% агарозном геле.............. 99

6.1 Схематическое представление основных этапов синтеза РЬЛ биополимерной ПТМП посредством метода микропечати (а), СЭМ изображения пустой негативной РЬЛ матрицы, до процесса микропечати (б), СЭМ изображения РЬЛ матрицы, до процесса микропечати, с преципитированными кристаллами доксициклина (в), пустая ПТМП плёнка с С2С12 клеточной колонией (г), ПТМП плёнка с доксициклином и с С2С12 клеточной колонией (д).......106

6.2 Схематическое изображение фототермической активации микроконтейнеров ПТМП, сфокусированным лазерным ИК пучком, на длине волны 830 нм, для локального высвобождения инкапсулированного доксициклина возле тетрациклин-зависимой клетки-мишени с последующей экспрессии ЗФБ...........................110

6.3 Фототермическая активация 2% РЬЛ микроконтейнера ПТМП, посредствам сфокусированного лазерного ИК пучка. Светлопольное изображение ПТМП, до лазерного воздействия (а), Светлопольное изображение ПТМП, после 0,35 с лазерного воздействия (б), Светлопольное изображение ПТМП, после 1,35 с лазерного воздействия (в), Флуоресцентное (ЯИБ) изображение ПТМП, до лазерного воздействия (г), Флуоресцентное изображение ПТМП, после лазерного воздействия (д), СЭМ изображение единичного микроконтейнера ПТМП, после лазерного воздействия (е). . . 113

6.4 Дизайн эксперимента по фототермической активации экспрессии ЗФБ единичных генетически модифицированных клеток на ПТМП клеточном субстрате (а), 10х светлопольное изображение ПТМП с клеточной колонией, до лазерного воздействия (б), зона лазерного воздействия на единичный микроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, до фототермической активации (в), зона лазерного воздействия на единичный микроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, после фототермической активации (г), конфокальные флуоресцентные изображения прокрашеных ядер и цитоскелета клеточной колонии в зоне фототермической активации микроконтейнера ПТМП (д), конфокальные флуоресцентные изображения ЗФБ клеточной колонии в зоне фототермической активации микроконтейнера ПТМП

(е), наложение флуоресцентных каналов (ж)..........114

6.5 Подковообразная область свечения ЗФБ клеток созданная посредствам локальной активации серии микроконтейнеров ПТМП. Красными стрелками обозначены вскрытые микроконтейнеры лазерным воздействием (а), Белыми стрелками указаны клетки, возле активированны микроконтейнеров, которые начали экспрессировать ЗФБ (б), наложение каналов флуоресценции ЗФБ и канала визуализации клеток С2С12 (в), процентное соотношение клеток, возле вскрытых микроконтейнеров ПТМП, которые запустили экспрессию ЗФБ (г), численная модель распределения относительной концентрации высвобожденного доксициклина из единичного микроконтейнера ПТМП, диаметром 5 мкм (д), зависимость интенсивности свечения клеток (ЗФБ экспрессия) от количества БОХ в мгл/мл. Концентрация доксициклина

была той же, что и в контрольном образце ........... 117