Фитофторозные корневые гнили малины и земляники, методы их диагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.07, кандидат сельскохозяйственных наук Копина, Мария Борисовна

• Копина, Мария Борисовна
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Копина, Мария Борисовна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Видовой состав и распространенность возбудителей рода РИуЮрЫкога на малине и землянике

1.2. Биологические особенности возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники

1.2.1. Систематическое положение

1.2.2. Морфология возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники

1.2.3. Симптомы проявления фитофторозов, их вредоносность

1.3. Диагностика фитофторозных корневых гнилей малины и

земляники

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДБ1 ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФИТОФТОРОЗНЫХ КОРНЕВЫХ ГНИЛЕЙ МАЛИНЫ И ЗЕМЛЯНИКИ

3.1 Видовой состав возбудителей рода Рку^рЫИога в насаждениях малины, земляники и посадочном материале отечественного происхождения

3.2 Видовой состав возбудителей рода РИуШрЫкога в посадочном

материале импортного происхождения

ГЛАВА IV. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФИТОФТОРОЗОВ

4.1. Оптимизация методов выделения ДНК из чистых культур возбудителей фитофторозов

4.2. Идентификация возбудителей фитофторозов методом классической ПЦР

4.3. Разработка внутреннего положительного контроля классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени»

ГЛАВА V. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ФИТОФТОРОЗОВ МАЛИНЫ И ЗЕМЛЯНИКИ МЕТОДОМ

МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

5Л. Подбор праймеров и зондов, определение их специфичности

5.2. Оптимизация мультиплексной ПЦР «в реальном времени»

5.3. Определение чувствительности подобранных зондов при

постановке ПЦР «в реальном времени»

ГЛАВА VI. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ БИОПРИМАНОК ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ФИТОФТОРОЗНЫХ

КОРНЕВЫХ ГНИЛЕЙ

ГЛАВА VII. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФИТОФТОРОЗОВ МАЛИНЫ И ЗЕМЛЯНИКИ

7.1. Экономическая эффективность пробоподготовки образцов для диагностики фитофторозов малины и земляники методом ПЦР

7.2. Экономическая эффективность метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени при диагностике фитофторозов малины и

земляники

ВЫВОДЫ

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фитофторозные корневые гнили малины и земляники, методы их диагностики»

ВВЕДЕНИЕ

Малина и земляника наиболее популярны среди ягодных культур. Скороспелость, урожайность, содержание полезных веществ ставят эти культуры на первое место, как в промышленном, так и в любительском садоводстве.

В мире, по данным FAOSTAT (2011), выращивается около 543 тыс. тонн ягод малины в год, производство земляники, на долю которой приходится свыше 70 % общемирового производства ягод, составляет около 4,5 млн. тонн в год. Крупнейшими производителями ягод земляники являются США, Испания, Россия, Корея, Япония, Польша, Италия, Мексика, Турция и Германия. Лидером по производству является США, здесь выращивается 25-28% мирового производства земляники.

Основное мировое товарное производство малины сосредоточено в странах Западной Европы (Сербия, Польша, Германия, Венгрия, Великобритания) и Северной Америке (США, Канада). По информации FAOSTAT в 2011 году лидером по производству малины была Россия, выращивая 140 тыс. тони ягод в год, что составляет 25,7% мирового производства.

Как и многие культурные растения, земляника и малина подвержены поражению многих грибных, бактериальных и вирусных патогенов, вызывающих заболевания всего растения. Проявление инфекции на надземных частях, достаточно известны и хорошо распознаваемы, в то время как поражения подземных органов диагностируются значительно труднее. Среди патогенов, поражающих корневую систему, известны возбудители ризоктониозной гнили Rhizoctonia spp., питиозной гнили Pythium spp., виды из родов Verticillium и Fusarium. Однако, высокую распространенность и наибольшую вредоносность во всем мире имеют фитофторозные корневые гнили ягодных культур. Эти болезни приводят к гибели от 40 % до 78% растений за вегетационный период (Abad et al., 2008; Kroon, 2010). Также эти болезни являются одним из факторов, лимитирующих получение здорового посадочного материала. Вредоносность

корневых гнилей особенно высока в зонах возделывания с повышенной влажностью и низкими температурами.

Впервые фитофторозные корневые гнили идентифицированы в 1926 г, когда возбудитель ранее неизвестной болезни, оказался причиной массового увядания растений земляники в насаждениях (Wardlaw, 1927). В настоящее время эти болезни выделяются по сравнению с другими по своей опасности и экономической значимости. Серьезную угрозу среди возбудителей корневой гнили малины и земляники представляет биотип Phytophthora fragariae Hickman. Этот патоген является карантинным объектом Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР), а с 1998 г. входит в «Перечень вредителей, болезней растений и сорняков, имеющих карантинное значение для России» (Александров, 2004).

В предупреждении распространения вредных организмов важную роль играет фитосанитарный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого посадочного материала. Для предотвращения проникновения возбудителей фитосанитарная служба должна располагать быстрыми и чувствительными методами диагностики, однако идентификация микромицетов часто бывает затруднена из-за отсутствия характерного спороношения возбудителя, схожести симптомов с другими болезнями и т.п.

Сложность определения возбудителей фитофторозных корневых гнилей обусловлена тем, что карантинные и некарантинные виды Phytophthora spp. обладают морфологически и биологически сходными признаками.

В настоящее время для диагностики большого количества растительных образцов применяются классические методы, которые весьма длительны и трудоемки. Разработка новых высокочувствительных и специфичных методов для идентификации возбудителей рода Phytophthora на малине и землянике является актуальной задачей, т.к. между странами происходит широкий обмен посадочным материалом. В последние годы широкое распространение во многих странах получил метод выявления фитопатогенов с помощью полимеразной цепной

реакции (ПЦР). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет выявлять возбудителей РкуЮрЫкога $рр., в растительных и почвенных образцах.

Цель и задачи исследований

Целью проводимых исследований являлось усовершенствование методов диагностики возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

1. Уточнить видовой состав и распространенность оомицетов рода РНу1орЫкога-возбудителей гнилей корней земляники и малины.

2. Оптимизировать методы пробоподготовки при молекулярно-генетической идентификации возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.

3. Разработать и оптимизировать мультиплексную ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации основных возбудителей фитофторозов.

4. Разработать метод диагностики фитофторозов в почве комбинацией метода биоприманок и ПЦР.

Заключение диссертации по теме «Плодоводство, виноградарство», Копина, Мария Борисовна

ВЫВОДЫ:

1. В результате проведенных обследований насаждений малины и земляники, а также посадочного материала отечественного и импортного происхождения было установлено, что в большинстве случаев с корневыми гнилями этих культур ассоциировались оомицеты Ph. cactorum, Ph. nicotianae, Ph. citricola.

2. Применение молекулярных методов идентификации позволило подтвердить наличие в насаждениях малины карантинного объекта Ph. fragariae var. rubi, а в импортном посадочном материале этой культуры - Ph. syringae, Ph.ciyptogea и ранее не выявленного в нашей стране вида Ph. tentaculata.

3. Оптимальным методом выделения ДНК Phytophthora spp. из чистых культур является пробоподготовка с использованием набора «ДНК-Экстран» (ЗАО «Синтол», Москва), что было подтверждено постановкой классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени». Постановка иммуноспецифической ПЦР позволяет идентифицировать чистые культуры возбудителей фитофторозов без этапа выделения ДНК.

4. Разработана система внутреннего положительного контроля, с применением фрагмента гена мыши, встроенного в вектор pTZ57R/T (Fermentas, США), для проведения классической ПЦР и ПЦР в режиме реального времени при диагностике возбудителей рода Phytophthora.

5. Установлено, что оптимальное выделение ДНК из биоприманок для молекулярной диагностики фитофторозов достигается из образца массой 5 мг, отобранного в месте некроза или на границе здоровой и пораженной ткани приманки, со степенью некротизации не превышающей 10 %.

6. На основе выровненных последовательностей гена Yptl возбудителей фитофторозов малины и земляники подобраны праймеры, универсальные для рода Phytophthora spp., и меченные флуоресцентными красителями (HEX, FAM, Су5, ROX) зонды, специфичные для Ph. cactorum, Ph. fragariae, Ph nicotianae, Ph. citricola, соответственно.

7. Подобранные праймеры и зонды позволяют проводить мультиплексную ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации четырех видов оомицетов Ph. nicotianae, Ph. citricola, Ph. fragariae и Ph. cactorum в одной пробирке.

Чувствительность мультиплексной ПЦР «в реальном времени» составила не менее п

3,3x10" миллиграмма мицелия возбудителя фитофтороза в миллилитре.

8. Разработанная мультиплексная ПЦР «в реальном времени» может эффективно использоваться в комплексе с методом плавающих биоприманок, что позволяет сократить длительность пробоподготовки и последующего анализа до 3-4 дней и уменьшить его себестоимость в 3,3 раза.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ

1. Для диагностики Phytophthora spp. в почве (в том числе и карантинного вида Ph. fragariae) следует использовать сочетание двух методов: плавающих биоприманок (Головин, 2001) и метода ПЦР (в классическом формате и в режиме реального времени).

2. При тестировании методом ПЦР для повышения достоверности получаемых результатов выделение ДНК из биоприманок следует проводить согласно методике описанной J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990), при этом оптимальная навеска биоприманки 5 мг (допустимо до 15мг), оптимальная степень некротизации до 10% (допустимо до 25%).

3. С целью сохранения образцов не рекомендуется замораживать биоприманки до -20°С, кратковременное замораживание в течение 1-2 суток приводит к получению ложноотрицательных результатов. В большинстве случаев рекомендуется хранить зараженные приманки при +4°С не более 2 суток.

4. Для амплификации внутреннего положительного контроля (ВПК) в классической ПЦР концентрация вносимой плазмиды должна составлять 0,1 нг/реакцию, при постановке ПЦР в режиме реального времени наиболее оптимальным количеством плазмиды является 0,0005 нг/реакцию.

5. С целью выявления и дифференциации основных возбудителей фитофторозов методом ПЦР «в реальном времени» в качестве мишени для разработки праймеров и зондов необходимо выбирать наиболее вариабельный участок возбудителей Phytophthora spp. ген ras-related protein Yptl.

6. Для диагностики фитофторозов малины и земляники рекомендуется использовать оптимизированные методы пробоподготовки биоприманок в сочетании с мультиплексной ПЦР «в реальном времени» и классической ПЦР с последующим секвенированием гена Yptl.

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Копина, Мария Борисовна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александров, H.H. Методические указания по выявлению и диагностике фитофторозной корневой гнили земляники /И.Н. Александров. - М.: ВНИИКР, 2004.-15 с.

2. Александров, И.Н. Фитофторозная корневая гниль малины /И.Н. Александров, С.Е. Головин// Защита и карантин растений. - 2007. — № 7. — С. 38-41.

3. Баранов, О.Ю. Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках /О.Ю. Баранов, В.А. Ярмолович, C.B. Пантелеев// Лесное и охотничье хозяйство. - 2012. - № 6. - С. 21-29.

4. Барбатунова, Г.А. Изучение фитофтороза земляники и изыскание мер борьбы с ними в центральных районах Нечерноземной полосы: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 06.01.11 /Барбатунова Галина Александровна. - М., 1986.-24 с.

5. Белошапкина, О.О. Особенности поражения грибными заболеваниями оздоровленных от вирусов растений земляники /О.О. Белошапкина//Изв. Тимирязев, с.-х. акад. - 1997. - Вып.2. - С. 113-120.

6. Белошапкина, О.О. Здоровый посадочный материал земляники - основа успеха (Проблемы оздоровления посадочного материала от вирусной и фитоплазменной инфекции)/0.0. Белошапкина, И.И. Ханжаин, Е.Р. Батрак// Защита и карантин растений. - 2001. -№ 8. - С. 23-24.

7. Ванюшева, О.В. Разработка технологии идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК /О.В. Ванюшева, H.A. Шилов, A.C. Карягина, Л.З. Файзуллин, Г.Л. Сухих, В.И. Швец//Биотехнология. - 2005. - №4. - С. 20-28.

8. Гагкаева, Т.Ю. Выявление и идентификация токсигенных видов грибов из родов Fusarium и Altemaria с использованием полимеразной цепной реакции /Т.Ю. Гагкаева, Ф.Б Ганнибал, М.М Левитин, Т. Yli-Mattila//

Фитосанитарное оздоровление экосистем. Второй всероссийский конгресс по защите растений: материалы съезда. - СПб: ВИЗР, 2005. - С. 150-151.

9. Гарибова, JI.B. Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов /Л.В. Гарибова, С.Н. Лекомцева. - М.: Т-во научных изданий, 2005.-215 с.

10. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение, пер. с англ. /Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

11. Говорова, Г.Ф. Болезнь земляники, вызываемая грибом Phytophthora fragariae Hickm. /Г.Ф. Говорова// Бюлл. Глав. Ботан. Сада. - 1966. - № 54. -С. 476-482.

12. Говорова, Г.Ф. Земляника /Г.Ф. Говорова, Д.Н. Говоров. - М.: Издательский Дом МСП, 2003.- 168 с.

13. Головин, С.Е. Корневые и прикорневые гнили ягодных и плодовых культур, их диагностика: монография /С.Е. Головин. - М.: ООО НИЦ «Инженер», 2010.-306 с.

14. Головин, С.Е. Фитофторозная гниль корней малины, причины возникновения, диагностика и меры борьбы /С.Е. Головин// Плодоводство и ягодоводство России. - 1995. - Т. 2. - С. 203-209.

15. Головин, С.Е. Методические указания по диагностике и учету болезней корней и стеблей земляники и малины, передающихся через почву /С.Е. Головин. - М.: ВСТИСП, 2001. - 42 с.

16. Данилевич, В.Н. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в ПЦР /В.Н Данилевич, Е.В. Гришин// Биоорганическая химия. - 2002. - Т.28. - №2. - С. 156-167.

17. Дмитренко, О.А. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси/О.А. Дмитренко, И.А. Шагинян, В.Я. Прохоров, С.М. Матвеев, IO.C. Аляпкина,

О.В. Ванюшева, И.А. Шилов, В.Г. Лунин, A.JI. Гинцбург //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005 - №3 - С. 27-32.

18. Дьяков, Ю.Т. Ботаника: Курс альгологии и микологии /Ю.Т. Дьяков. - М.: Изд-во Московского ун-та, 2007. - 559 с.

19. Дьяков, Ю.Т. Новое в систематике и номенклатуре грибов./Ю.Т. Дьяков, Ю.В. Сергеев. - М.: Национальная академия микологии; Медицина для всех, 2003.-496 с.

20. Жуков, A.M. Научно-методическое пособие по диагностике грибных болезней лесных деревьев и кустарников /A.M. Жуков, П.В. Гордиенко. -М.: ВНИИЛМ, 2001. - 70 с.

21. Илиева, Е.И. Морфологические особенности грибов рода Phytophthora -возбудителей фитофтороза земляники /Е.И. Илиева// Изв. ТСХА. - 1988. -Т. 1. - С. 119-127.

22. Кирай, 3. Методы фитопатологии /3. Кирай, 3. Клемент, Ф. Шоймоши, И. Вереш. - М.: Колос, 1974. - 344с.

23. Копина, М.Б. Сочетание метода биоприманок и ПЦР «в реальном времени» для диагностики корневых гнилей малины и земляники, вызываемых оомицетами рода Phytophthora/М.Б. Копина, Е.С. Мазурин, С.Е. Головин//Плодоводство и ягодоводство России. - 2012. - Т.29, №1. - С. 245-252

24. Костюк, С.А. Полимеразная цепная реакция - современный метод клинической лабораторной диагностики/ С.А Костюк, Г.Я. Хулуп, Н.А Бадыгина, Э.Н. Заборонок^Д.И. Страздин//Медицинские новости. - 2004. -№2. - С.34-38

25. Кошкина, Т.Е. Достижения в ПЦР - диагностике фитовирусов /Т.Е. Кошкина, С.К. Завриев// Экологическая генетика культурных растений / Всерос. науч. исслед. ин-т риса. - Краснодар, 2005. - С. 172-179.

26. Кригер О.В. Основы биотехнологии. Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов /О.В. Кригер, О.С. Габинская. -

Кемерово: Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 2004. - 33с.

27. Мазурин, Е.С. Контроль достоверности результатов фитосанитарной экспертизы при использовании молекулярных методов диагностики /Е.С. Мазурин, М.Б. Копина, Н.А. Шероколава//Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство. - 2012. - №3. - С. 31-38.

28. Наумов, Н.А. Методы микроскопических и фитопатологических исследований /Н.А. Наумов. - М.: JI.,1937. - 272 с.

29. Новотельнова, Н.С. Фитофторовые грибы /II.С. Новотельнова. - JL: Наука, 1974.-235 с.

30. Пидопличко, Н.М. Грибы - паразиты культурных растений. Грибы несовершенные. Определитель/Н.М. Пидопличко. - Киев: Изд-во «Наукова думка». - 1977. Т.2-290 с.

31. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» /Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семёнов, A.M. Савилова, Н.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.

32. Ротаренко, А. Новая болезнь земляники /А. Ротаренко, М Штейнберг// Сельское хоз-во Молдавии. - 1987. - № 1. - С. 58-59.

33. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия /С.Н. Щелкунов. - Новосибирск: Сибирское университетское изд-во, 2004. - 496 с.

34. Ячевский, А.А. Определитель грибов. Совершенные грибы. Фикомицеты/А.А. Ячевский, П.Я. Ячевская. - М.: Сельхозгиз, 1931. - Т. 1. -325 с.

35. Abad, Z.G. Phytophthora bisheria sp. nov., a new species identified in isolates from the Rosaceous raspberry, rose and strawberry in three continents / Z.G. Abad, J.A. Abad, M.D. Coffey, P.V. Oudemans, W.A. Man in 4 Veld, H. de Gruyter, J. Cunnington, F. J. Louws //Mycologia. - 2008. - Vol. 100, № 1. - P. 99110.

36. Alcock, N.L. Strawberry diseases in Lancashire / N.L. Alcock, D.W. Howells, C. E. Foister // Scot. Journal Agriculture. - 1930. - № 13. - P. 242-255.

37. Ali-Shtayeh, M.S. A method for using commercial ELISA tests to detect zoospores of Phytophthora and Pythium species in irrigation water /J.D. MacDonald, J. Kabashima// Plant Disease. - 1991. -№ 75. - P. 305-31 1.

38. Anandhakumar, J. Investigation on the biocontrol of Phytophthora diseases on strawberry based on antagonism /J. Anandhakumar, W. Zeller// Phytopathology. - 2002. - Vol. 26, №4. - P. 379-407.

39. Anderson, H.W. Black stele root rot of strawberry /H.W. Anderson// Phytopathology. - 1935.-№25.-P. 135-140.

40. Bain, H.F. Red stele root disease of the strawberry caused by Phytophthora fragariae /H.F. Bain, J.B. Demaree// Agric. Res. - 1945. - Vol.70, №1. - P. 1-30.

41. Bain, H.F. Isolation of the fungus causing the red stele or red core disease of strawberries /H.F. Bain, J.B. Demaree// Science. - 1938. -№88. - P. 151-152.

42. Barritt, B.II. Breeding for root rot resistance in red raspberry /B.H. Barritt, P.C. Crandall, P.R. Bristow// Journal of the American Society for Horticultural Science. - 1979. - № 1. - P. 85-89.

43. Blair, J.E., A multi-locus phylogeny for Phytophthora utilizing markers derived from complete genome sequences /J.E. Blair, M.D. Coffey, S.Y. Park, D.M. Geiser, S. Kang// Fungal Genetics and Biology. - 2008. - №45. - P. 266-277. ■

44. Bonants, P.J.M. Characterization and detection of Phytophthora fragariae in plant and soil by molecular methods /P.J.M. Bonants, M.P.E. van Gent-Pelzer, M. Hagenaar - de Weerdt// EPPO Bull. - 2001. - Vol.30, Iss. 3-4. - P. 525-531.

45. Bonants, P.J.M. A combination of baiting and different PCR formats, including measurement of real-time quantitative fluorescence, for the detection of Phytophthora fragariae in strawberry plants /P.J.M. Bonants, M.P.E. van Gent-Pelzer, R. Hooftman, D.E.L. Cooke, D.C. Guy, J.M. Duncan // European Journal of Plant Pathology.-2004.-Vol. 110, Iss. 7.-P. 689-702.

46. Bonants, P.J.M. Detection and identification of Phytophthora fragariae Hickman by the polymerase chain reaction /P.J.M. Bonants, M. Hagenaar-de Weerdt, M.P.E. van Gent-Pelzer, I. Lacourt, D.E.L. Dooke, M. Duncan// European Journal of Plant Pathology. - 1997. -V.103, Iss. 4. - P. 345-355.

47. Bonants, P.J.M. Molecular characterization of natural hybrids of Phytophthora nicotianae and P. cactorum /P.J.M. Bonants, M. Hagenaar-de Weerdt, W.A. Man in't Veld, R.P. Baayen// Phytopathology. - 2000. - Vol. 90, № 8. - P. 867-874.

48. Brasier, C.M. Origin of a new Phytophthora pathogen through interspecific hybridization /C.M. Brasier, D.E.L. Cooke, J.M Duncan//Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. - 1999. - Vol. 96 - P. 5878-5883.

49. Cacciola, S.O. Molecular identification and detection of Phytophthora species on some important Mediterranean plants including sweet chestnut / S.O. Cacciola, N.A. Williams, D.E.L. Cooke, J.M Duncan// Forest Snow Landscape Res. -2001.-Vol.76, №3.-P. 351-356.

50. Causin, R. An improved method for the detection of Phytophthora cactorum in infected plant tissues using scar markers /R. Causin, C. Scopel, A. Grendene, L. Montecchio// Journal of Plant Pathology. -2005. - Vol. 87, №1. - P. 25-35.

51. Chang, H.S. Phytophthora species associated with strawberry fruit rot in Taiwan/ H.S. Chang//Botanic Bull Academia Sinica. - 1988. -№ 29. -P. 61-67.

52. Chen, Y. Characterization of a Phytophthora infestans gene involved in vesicle transport/Y. Chen, R. Roxby// Gene. -Vol. 181(1-2). -P. 89-94.

53. Converse, R.I-1. A root rot of red raspberry caused by Phytophthora erythroseptica /R.H Converse, C.D. Schwartze// Phytopathology. - 1968. -Vol.58. -P. 56-59.

54. Converse, R. H. Phytophthora sp. from Washington pathogenic on roots of red raspberry/ R. PI. Converse, C. D. Schwartze // Phytopathology. - 1965. - Vol.55. -P. 503-510.

55. Cooke, D.E.L. Validation and exploitation of a PCR-based diagnostic for detecting Phytophthora in Strawberry and Raspberry/ D.E.L. Cooke, V. Young, D. Guy, J.M. Duncan// Scottish Crop Research Institute. -2000. - P. 34-37.

56. Cooke, D.E.L. Identification of Phytophthora species on the basis of restriction enzyme fragment analysis of the internal transcribed spacer regions of ribosomal RNA/ D.E.L Cooke., J.M. Duncan, N.A. Williams, M. Hagenaar-de Weerdt, P.J.M. Bonants// OEPP/EPPO Bulletin. - 2000. - Vol. 30, № 3. - P. 519-523.

57. Cooke, D.E.L. Tools to detect, identify and monitor Phytophthora species in natural ecosystems /D.E.L. Cooke, L. Schena, S.O. Cacciola// Journal of Plant Pathology. - 2007. - №89. - P. 13-28.

58. Cooke, D.E.L. Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on ITS1 and ITS2 sequences of the ribosomal RNA gene repeat/D.E.L. Cooke, J.M. Duncan// Mycol. Res. -1997. - Vol. 101, №6. - P. 667-677.

59. Dick, M. W. 18S rDNA for species of Leptolegnia and other Peronosporomycetes\ justification for the subclass taxa Saprolegniomycetidae and Peronosporomycetidae and division of the Saprolegniaceae sensu lato into the Leptolegniaceae and Saprolegniaceae/M. W. Dick, M.C. Vick, J.G. Gibbings, T.A. Hedderson, C.C. Lopez Lastra//Mycological Research. - 1999. - Vol.103. -P. 1119-1125.

60. Doyle, J. J. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue/J.J. Doyle, J.L Doyle//Phytochemical Bulletin. - 1990. - Vol.12. - P. 13-15.

61. Duncan, J.M. A technique for detecting red stele {Phytophthora fragariae) infection of strawberry stocks before planting/J.M. Duncan// Plant Disease. -1980.-№64.-P. 1023-1025.

62. Duncan, J.M. Effect of temperature and host genotype on the production of inoculums by Phytophthora-fragariae var fragariae from the roots of infected strawberry plants/ J.M. Duncan, D.M. Kennedy// Plant Pathology. - 1995. -Vol.44, № l.-P 10-21.

63. Duncan, J.M. Identities and pathogenicities of Phytophthora sp. causing root rot of red raspberry/J.M. Duncan, D.M. Kennedy, E. Seemuller //Plant Pathology. -1987. - Vol.36, №7. - P. 276-289.

64. Duncan, J.M. Relationships between non-papillate, soilborne species of Phytophthora: root rot of raspberry. /J.M. Duncan, D.M. Kennedy, P.H. Scott// Symposium of the British Mycological Society. - Dublin: Cambridge University Press, 1991. - P.129-147.

65. Ersek, T. PCR Amplification of species-specific DNA sequences can distinguish among Phytophthora species/T. Ersek, J.E. Schoelz, J.T. English//Applied and Environmental Microbiology. - 1994. -№60. - P. 2616-2621.

66. Erwin, D.C. Phytophthora diseases worldwide ID.C. Erwin, O.K. Ribeiro. -Minnesota, USA: APS Press, 1996. - 263 p.

67. Forster, H. Molecular characterization of Phytophthora isolates with nonpapillate sporangia causing root rot of raspberry using mtDNA restriction fragment length polymorphisms/H. Forster, M.D Coffey// Mycol Res. - 1992. - Vol.58. - P. 571577.

68. Garbelotto, M. Sudden oak death syndrome fells tree oak species/M. Garbelotto, P. Svihra, D.M. Rizzo //Calif Agric. - 2001. - Vol.55. - P. 9-19.

69. Gourley, C.O. Economic loss from strawberry red stele disease in Nova Scotia/Gourley C.O., Delbridge R.W.//Report, Research Station Kentville, Nova Scotia, Canada - 1971. - P. 63-64

70. Hansen, E.M. Phytophthora beyond agriculture /E M. Hansen, P.W. Reeser, W. Sutton //Annu. Rev. Phytopathol. - 2012. - Vol.50. - P.359-378

71. Harris, D.C, Studies on the possible role of micropropagation in the dissemination of the strawberry crown rot pathogen Phytophthora cactorum /D.C Harris., D.W. Simpson, J.A Bell// The Journal of Horticultural Science and Biotechnology.- 1997.-Vol. 72, № i._p. 125-133.

72. Hayden, K.J. Detection and Quantification of Phytophthora ramorum from California Forests using a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay/K.J. Hayden, D. Rizzo, J. Tse, M. Garbelotto//American Phytopathological Society. -2004. - Vol. 94, № 10.-P. 1075-1078.

73. Heiberg, N. Raspberry root rot in Norway/N. Heiberg, J.M. Duncan, D.M. Kennedy, L. Semb// Acta ITortic. - 1989. - Vol. 262. - P. 189-191.

74. Hickman, C.J. The red core root disease of the strawberry caused by Phytophthora fragariaelC.L Hickman//J Pomol Hortic Sei. - 1940. - Vol.18. -P.89-119.

75. Ippolito, A. Real-time detection of Phytophthora nicotianae and P. citrophthora in citrus roots and soil/ A. Ippolito, L. Schena, F. Nigro, V. Soleti, L. Yaseen, T Yaseen// European Journal of Plant Pathology. - 2004. - Vol.110. - P.833-843.

76. loos, R. Usefulness of single copy genes containing introns in Phytophthora for the development of detection tools for the regulated species P ramorum and P fragariae / R. loos, L. Laugustin, N. Schenck, S. Rose, C. Husson, P. Frey// European Journal of Plant Pathology. - 2006. - Vol.116. - P. 171-176.

77. Islam, S.Z. Characterization of Phytophthora capsici isolates from processing pumpkin in Illinois /S.Z. Islam, M. Babadoost, K. Lambert, A. Ndeme, H.M. Fouly// Plant Disease. - 2004. - Vol.88. - P.248-259.

78. Judelson, H.S. Enhanced PCR methods for detection and quantification of Phytophthora infestans in plants/H.S. Judelson, P.W. Tooley// Phytopathology. — 2000. - Vol.90.-P.l 112-1115.

79. Kennedy, D.M. A papillate Phytophthora species with specificity to Rubus /D.M. Kennedy, J.M. Duncan//Mycol. Res. - 1995. - Vol. 99, №1. - P.57-68.

80. Kao, C.W. Strawberry fruit rot by Phytophthora cactorum and P. citrophthora / C.W. Kao, L.S. Leu //Plant Protection Taiwan. - 1979. - Vol. 21. - P. 239-243.

81. Kong, P. Single-strand-conformation polymorphism of ribosomal DNA for rapid species differentiation in genus Phytophthora!P. Kong, C.X. Hong, P.A. Richardson, M.E. Gallegly//Fungal Genet Biol. - 2003. - №39. - P. 238-249.

82. Koprivica, M. Methods for detection of Phytophthora fragariae var. rubi on Raspberry/M. Koprivica, I. Dulic-Markovic, R. Jevtic, D.E.L. Cooke// Pestic. Phytomed. (Belgrade). - 2009. - Vol. 24, №3. - P. 177-184.

83. Kroon, L.P.N.M. Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on mitochondrial and nuclear DNA sequences/L.P.N.M. Kroon, F.T. Bakker, G.B.M. van den Bosch, P.J.M. Bonants, W.G. Flier//Fungal Genet. Biol. - 2004. -Vol. 41.-P. 766-782.

84. Kroon, L.P.N.M. The genus Phytophthora; phylogeny, speciation and host specificity /L.P.N.M. Kroon. - Wageningen University, 2003. - 186p.

85. Lacourt, I. Specific detection of Phytophthora nicotianae using the polymerase chain reaction and primers based on the DNA sequence of its elictin gene ParAl/I. Lacourt, J.M. Duncan//European Journal of Plant Pathology. - 1997. -Vol.103.-P. 73-83.

86. Latorre, B.A. Root rot of red raspberry caused by Phytophthora citricola and P. citrophthora in Chile /B.A. Latorre, R. Munoz// Plant Dis. - 1993. - Vol. 77. - P. 715-718.

87. Kroon, L.P.N.M. The Genus Phytophthora anno/L.P.N.M. Kroon, H. Brouwer, A.W. Cock, F. Govers// Phytopathology. - 2012. - V.102, №4. - P.348-362

88. Lilja, A. Phytophthora spp. a new threat to tree seedlings and trees/A. Lilja, M. Kokkola, J. Hantula, P. Parikka// Aktuelt fra skogforskningen. - 2006. - №1/06. -P. 48-51.

89. MacDonald, J.D. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants/J.D. MacDonald, J. Stites, J Kabashima// Plant Dis. - 1990. - Vol.74. -P. 655-659.

90. Man in't Veld, W.A. Natural Hybrids of Phytophthora nicotianae and Phytophthora cactorum Demonstrated by Isozyme Analysis and Random Amplified Polymorphic DNA/W.A. Man in 't Veld, W.J. Veenbaas-Rijks, E. Ilieva, A.W. de Cock, P.J.M. Bonants, R. Pieters //Phytopathology. - 1998. -Vol. 88, №9.-P. 922-929.

91. Man in't Veld, W.A. Gene flow analysis demonstrates that Phytophthora fragariae var. rubi constitutes a distinct species, Phytophthora rubi comb. nov./W.A. Man in't Veld// Mycologia. - 2007. - Vol. 99, №2. - P. 222-226.

92. Marks, G.C. Detection of Phytophthora cinnamomi in soils/G.C. Marks, F.Y. Kassaby// Australian Forestry. - 1974. -№ 36. - P. 198-203.

93. Martin, F.N. Identification of Phytophthora isolates to species level using restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction amplified region of mitochondrial DNA/F.N. Martin, P.W. Tooley //Phytopathology. - 2004. - Vol.94. - P. 983-991.

94. Milenkovic, S. Monitoring of soft fruit mother plantings aimed at control of Phytophthora fragariae, causal agent of root rot/S. Milenkovic, D. Sretenovic// Agriculturae Conspectus Scientificus. - 2006. - Vol.71, № 4. - P. 141-144.

95. Milholland, R.D. Criteria for identifying pathogenic races of Phytophthora fragariae on selected strawberry genotypes/R.D. Milholland, W.O. Cline, M.E. Daykin// Phytopathology. - 1989. - Vol. 79. - P. 535-538.

96. Milholland, R.D. A monograph of Phytophthora fragariae and the red stele disease of strawberry /R.D. Milholland. - North Carolina Agricultural Research Service, 1994.-306 p.

97. Moralejo, E. First report of Phytophthora tentaculata on Verbena sp. in Spain/ E. Moralejo, M. Puig, W.A. Man in't Veld// New Disease Reports. - 2004. - № 9. -P. 38.

98. Montgomery, I.G. The pathogenicity of Phytophthora species to red raspberry /I.G. Montgomery, D.M. Kennedy// Acta Horticulture. - 1980. - № 112. - P. 167-171.

99. Nourrisseau, J.G. Un Phytophthora cause de deperissement du fraisier en France /J.G. Nourrisseau, A. Baudry// Phytoma. - 1987. -№ 384. - P. 39-41.

100.Newhook, F.J. Tabular key to the species of Phytophthora de Bary /F.J.-Newhook, G.M. Waterhouse, D.J. Stamps. - UK.: Commonw. Mycol. Inst. Kew, Surrey, - 1978.-20p.

101. O'Brien, P.A. Detecting Phytophthora /P.A. O'Brien, N. Williams, G. St J Hardy// Critical reviews in microbiology. - 2009. - Vol.94, №3. - P. 169-181.

102. Olsson, C.I I.B. Diagnosis of Phytophthora infections in raspberry and strawberry plants by ELISA tests /C.H.B. Olsson// Phytopathology. - 1995. - Vol.143. - P. 307-310.

103. Otterbacher, A.G. The induction of stelar reddening in strawberry roots /A.G. Otterbacher, D. Powell, C.C. Zych// Plant disease reporter. - 1969. - Vol. 53. - P. 794-797.

104. Perez-Sierra, A. Outbreak of a New Phytophthora sp. associated with severe decline of almond trees in eastern Spain /A. Perez-Sierra, M. Leon, L.A. Alvarez,

S. Alaniz, M. Berbegal, J. Garcia-Jimenez, P. Abad-Campos// Plant Disease. -2010. - Vol.94,№5. - P.534-541.

105. Stammler, G. Analysis of RFLPs in nuclear and mitochondrial DNA and the taxonomy of Phytophthora fragariae/G. Stammler, E. Seemuller, J.M. Duncan// Mycol. Res. -1993. - Vol.97. - P. 151-156.

106. Schena, L. Assessing the potential of regions of the nuclear and mitochondrial genome to develop a 'molecular tool box' for the detection and characterization of Phytophthora species/L. Schena, D.E.L. Cooke//J. Microbiol. Meth. - 2006. -Vol.67. -P.70-85.

107. Schena, L. Development and application of a PCR-based 'molecular tool box' for the identification of Phytophthora species damaging forests and natural ecosystems /L. Schena, J.M. Duncan, D.E.L. Cooke// Plant Pathol. - 2008. -Vol.57.-P. 64-75.

108. Schena, L. Detection and quantification of Phytophthora ramorum, P. kernoviae, P. citricola and P. quercina in symptomatic leaves by multiplex real-time PCR /L. Schena, K.J. Hughes, D.E.L. Cooke// Molecular Plant Pathology. - 2006. -Vol.7, №5. - P.365-379.

109. Schubert, R. Detection and quantification of Phytophthora species which are associated with root-rot diseases in European deciduous forests by species-specific polymerase chain reaction/R. Schubert, G. Bahnweg, J. Nechwatal, T. Jung, D.E.L. Cooke, J.M. Duncan, G. Muller-Starck, C. Langebartels, Jr.H. Sandermann, W. Oswald// European Journal Forest Pathology. - 1999. - Vol.9. -P. 169-188.

110. Stamps, D.J. Revised tabular key to the species of Phytophthora /D.J. Stamps, G.M. Waterhouse, F.J. Newhook, G.S. Hall. - UK.: Com Mycol Soc, Kew, Mycol Pap, 1990.-28 p.

111. Stensvand, A. Presence of Phytophthora fragariae var. fragariae in Norway /A. Stensvand, M.L. Herrero// OEPP/EPPO Bulletin. - 1997. - Vol.27. - P. 243-248.

112. Tsai, H.L. Detection of orchid Phytophthora disease by nested PCR/H.L. Tsai, L.C. Huang, P.J. Ann, R.F. Liou// Botanical Studies. - 2006. -Vol.47. - P. 379387.

113.Valois, D. Glucanolytic actinomycetes antagonistic to Phytophthora fragariae var. rubi, the causal agent of raspberry root rot ID. Valois, K. Fayad, T. Barasubiye, M. Garon, C. De.Ry, R. Brzezinski, C. Beaulieul// American Society for Microbiology. - 1996.-Vol. 62,№5. - P. 1630-1635.

114. Wangsomboondee, T. Optimization of sample size and DNA extraction methods to improve PCR detection of different propagules of Phytophthora infestans IT. Wangsomboondee, J.B Ristaino// Plant Disease. - 2002. - Vol. 86, № 3. - P. 247-253.

115.Wardlaw, C.W. The strawberry disease in Lanarkshire /C.W. Wardlaw//. Ann. Appl. Biol. - 1927. - Vol. 14. - P. 197-201.

116. Washington, W.S. Phytophthora cryptogea as a cause of root rot of raspberry in Australia; resistance of raspberry cultivars and control by fungicides/W.S. Washington//Plant Pathol. - 1988. - Vol. 37, № 2. - P. 225-230.

117. Wattier, R.A.M. 2003. Sequence variation of intergenic mitochondrial DNA spacers (mtDNAIGS) of Phytophthora infestans (Oomycetes) and related species/R.A.M. Wattier, L.L. Gathercole, S.J. Assinder, C.J. Gliddon, K.L. Deahl, D.S. Shaw, D.I. Mills// Mol Ecol Note. - 2003. -Vol.3 - P.136-138.

118. Waterhouse, G.M. 1963. Key to the species Phytophthora de Bary /G.M. Waterhouse. - UK: Mycological paper, 1963. - 28 p.

119. Waterhouse, G.M. The genus Phytophthora de Bary/ G.M. Waterhouse. - UK: Kew, Eng. Commonwealth Mycological Institute, 1970.-59 p.

120. Waterson, J.M. A note on the association of a species of Phytophthora with a 'dieback' disease of the raspberry. /J.M. Waterson //Trans. R. Soc. Edinburgh. -1937.-Vol.32.-P.251-259

121. Wilcox, W.F. Integrated control of Phytophthora root rot of red raspberry /W.F. Wilcox, M. Pritts, M.J. Kelly// Plant Dis. - 1999. - Vol.83. - P. 1149-1154.

122. Wilcox W.F. Identity, virulence, and isolation frequency of seven Phytophthora spp. causing root rot of raspberry in New York/W.F. Wilcox// Phytopathology. -1989.-Vol. 79.-P. 93-101.

123. Wilcox, W.F. Identity of a Phytophthora species attacking raspberry in Europe and North America /W.F. Wilcox, P.H. Scott, P.D. Hamm, D.M. Kennedy, J.M. Duncan, C.M. Brasier, E.M. Hansen// Mycol. Res. - 1993. - Vol. 97. - P. 817831.

124. White, T. J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols/ T.J. White, T. Bruns, S. Lee, J.W. Taylor// San Diego, California: Academic Press. - 1990. - P.315-322.

125. Winterbottom, C. Evaluation of relative resistance of different strawberry cultivars to Phytophthora and Verticillium dahliae as a potential alternative to methyl bromide /C. Winterbottom, F. Westerlund, J. Mircetich, L. Galper// Proceeding from Annual International Research conference on Methyl bromide alternative. - Orlando, Florida, 1996. - P. 1-5.

Распространение Phytophthora fragariae var. fragariae (EPPO Plant Quarantine Data Retrieval System PQR, 2011)

Распространение Phytophthora fragariae var. rubi (EPPO Plant Quarantine Data

Retrieval System PQR, 2011)

Обозначения:

® Возбудитель распространен повсеместно + Возбудитель распространен ограничено

Морфология возбудителей рода РкуЮрЫкога

А-хламидоепоры Рк. megasperma; Б - пустые спорангии с инцистированными зооспорами РИ.саМогипг, В - мицелий Рк.са&огит\ Г - ооспора Рк. fragariae маг.

гиЫ

Приложение 2 продолжение Спорангии возбудителей фитофторозов

Д-епорангий Ph.cactorum; Е - прорастание спорангия Ph. nicotianae; Ж -спорангий Ph. fragariae var. rub г, 3 - спорангий Ph. cryptogea

Таблица 1 -Праимсры и зонды, использованные в работе

Праймер Мишень Вид, на который подобран праймер Последовательность Длина продукта, п.о. Литературный источник

Идентификация возбудителей фптофторозов

Phyls ITS-28S rDNA Phytophthora spp. act ttc cac gtg aac cgt ate a 1000 Tsai et al., 2006

Phy2a gca cga gee act cag gga tg

Y PlilF Yptl Phytophthora spp. cga cca tkg gtg tgg act tt 470 Schena et al., 2008

Y Ph2R acg ttc tcm cag gcg tat ct

YmeglF Yptl Ph. megasperma tet gct ctt ccg act tgg te 196 Schena et al., 2008

Ymeg2R tgg cat tag tta gtt teg tcc a

Yeac2R Yptl Ph. cactorum cca tac aaa att ctg cgc tag g 194 Schena et al., 2008

YeaelF aga cac аса agt gga ccg tta g

PUF parAl Ph. nicotianae cca cca cgc age aaa ctg cgg с 230 Kong et al., 2003

PHR ttg agt acc agg ccg ctc gta g

DC6 ITS-18S rDNA Ph. fragariae gag gga ctt ttg ggt aat ca 1310 Bonants et al., 1997

ITS4 tcc tcc gct tat tga tat ge

DC1 ITS 1 rDNA act tag ttg ggg gee tgt ct 533

DC5 cgc cga ctg gee аса cag

TRP 1F TRP 1 Ph. fragariae ctacctccctaagcttatca 403 Ioos et al.,2006

TRP 2R acgcagcatcatagaaaat

Праимсры «Locwe» - Ph. fragariae - 1000 -

- - 500

1TS1 ITS-5.8S rDNA Phytophthora spp. tcc gta ggt gaa cct tgc gg 500 - 1300 Wliite et al. 1990;

ITS 4 tcc tcc gct tat tga tat ge

Разработка внутреннего положительного контроля

M13/pUC MCS регион вектора pTZ57R/T gta-aaa-cga-cgg-cca-g ti SOIOI Fermentas

M13/pUCrev cag-gaa-aca-gct-atg-ac

Mus 714F 1700042G15 ctt-ctg-gcg-ttt-cag-aga-cc 714 Мазурин, Конина, Шероколава, 2012

Mus 714R ggc-tcc-tct-tgt-gca-gat-tc

Mus 969F aga-gcc-tgt-ggt-cag-ctg-tt 969

Mus 969R tgt-taa-gtg-ggg-agg-cag-ag

Mus 1061F aga-gcc-tgt-ggt-cag-ctg 1061

Mus 106 IR gtc-aca-gaa-gca-gtg-gct-ga

Mus 1087F aat-gac-ccc-aag-cat-ttg-ag 1087

Mus 1087R gtc-aca-gaa-gca-gtg-gct-ga

Mus 139F atg-atg-aag-tgg-gag-cca-ag 139

Mus 139R ggc-tcc-tct-tgt-gca-gat-tc

Mus 139P R6G-gcc-acc-tga-gag-tcc-aag-cca-gt-RTQ 1 -

Mus 109F tca-gcc-act-gct-tct-gtg-at 109

Mus 109R ctt-ggc-tcc-cac-ttc-atc-at

Mus 109 P R6G-ctt-ttc-tgg-gct-gct-ttt-gcc-ac RTQ1 -

Разработка мультиплексной ПЦР«в реальном времени»

PHL Yptl Phytophthora spp. caa-gac-yat-caa-gct-sca 431 Кошша, Мазурин, Головин,2012

PHR gtt-gtt-gaa-cga-hga-ctc-ytg-g

Ph.cit Y ptl Ph. citricola ROX-ggt-tgt-gcc-aat-tca-ctt-gtg-ct-BHQ2 -

Ph.cac Yptl Ph. cactorum R6G-acg-tgg-cgt-gtt-tcc-tat-BHQ2 -

Ph.ніс Yptl Ph. nicotianae Cy5-ccg-atg-tac-caa-atc-acg-tgt-gtg-tc-BHQ2 -

Pli.FR Y ptl Ph. fragariae FAM-cat-ttc-gcc-ggc-taa-gcg-tg-RTQl -