Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Шлеев, Сергей Валерьевич

• Шлеев, Сергей Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шлеев, Сергей Валерьевич

Введение

Список используемых сокращений Часть 1. Литературный обзор

Глава 1. Азотфиксирующий клубенек бобового растения

1.1. Образование и строение клубеньков

1.2. Бактерии и бактероиды

Глава 2. Легоглобин и его функционирование в клубеньках 2:1. Строение молекулы легоглобина

2.2. Компоненты и биосинтез легоглобина

2.3. Состояние и локализация легоглобина в клубеньках

2.4. Функционирование легоглобина

Глава 3. Восстановление легоглобина 3:1. Ферментативное восстановление 3.2. Неферментативное восстановление

Часть 2. Материалы и методы исследований

1. Материал, использованный в работе

2. Получение белков из цитозоля клубеньков 3: Определение концентрации легоглобина и других кислородпереносящих гемопротеидов

4. Проведение электрофореза белков. Получение зимограмм

5. Определение молекулярной массы

6. Изоэлектрическое фокусирование

7. Концентрирование белков методом ультрафильтрации

8. Определение активности метлегоглобинредуктазы

9. Определение активности компонента К

10. Спектрофотометрические исследования

11. Проведение жидкостной колоночной хроматографии

12. Получение окисленных, восстановленных и оксигенированных гемопротеидов

13. Проведение электрохимических экспериментов

14. Определение негеминового железа

15. Определение содержания белка

16. Реактивы, использованные в работе Часть 3. Результаты и их обсуждение

1. Множественные формы метлегоглобинредуктазы в клубеньках желтого люпина

1.1. Разработка метода получения в препаративных количествах множественных форм метлегоглобинредуктазы и компонентов легоглобина из клубеньков бобовых растений

1.2. Изучение множественных форм метлегоглобинредуктазы желтого люпина

2. Метлегоглобинредуктаза и легоглобин узколистного люпина и гороха посевного

2.1. Изучение метлегоглобинредуктаз узколистного люпина и гороха посевного

2.2. Изучение легоглобина узколистного люпина и гороха посевного

3. Изучение свойств и строения неферментативных восстановителей из клубеньков желтого люпина

3.1. Выделение и изучение свойств компонента Л

3.2. Выделение и изучение свойств компонента В

4. Восстановление легоглобина в клубеньках бобовых растений

4.1. Расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса легоглобина в цитозоле клубеньков бобовых растений

4.2. Схема возможного механизма ферментативного восстановления легоглобина ш vivo

5. Разработка и усовершенствование некоторых методов, использованных при изучении легоглобина и его восстановителей

5.1. Программа расчета концентраций трех форм кислородпереносящих гемопротеидов в растворе

5.2. Ячейка для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений»

Актуальность проблемы. Биологическая фиксация атмосферного азота -глобальный процесс, обеспечивающий возможность существования жизни на Земле. Способность восстанавливать N2 до ЫН/ выявлена у многих прокариот, но у эукариотических организмов она до сих пор не обнаружена. Однако многие растения, грибы и животные могут вступать в симбиоз с азотфиксаторами, что существенно расширяет экологические возможности как микро-, так и макросимбионта.

Наиболее активно изучается процесс симбиотической азотфиксации микробно-растительными сообществами, и, в частности, бобово-ризобиальными симбиозами. Проблема фиксации азота бобово-ризобиальной симбиотической системой включает в себя большое количество тесно связанных между собой вопросов. Одним из важнейших является изучение легоглобина (леггемоглобина) - гемопротеида бобовых растений, участвующего в регуляции кислородного режима в клубеньках бобовых. Он необходим для нормального функционирования бактероидов, в которых содержится нитрогеназа - фермент, катализирующий реакцию восстановления молекулярного азота. Легоглобин способен функционировать только в физиологически активном, восстановленном состоянии. Описано несколько путей восстановления легоглобина, как ферментативных, так и неферментативных, однако многие из них пока недостаточно изучены.

Изучение легоглобина и процесса его восстановления важно как с точки зрения теоретических аспектов (изучение механизмов симбиотической азотфиксации и теории эволюции гемопротеидов), так и чисто практических, каковыми являются поиск путей повышения плодородия почв и методов лечения 6 заболеваний, связанных с нарушениями в функционировании гемоглобина (например, метгемоглобинемии).

Цель и задачи работы. Настоящая работа была направлена на изучение как самого легоглобина, так и процесса его восстановления, а также различных восстановителей, поддерживающих легоглобин в физиологически активном состоянии, из различных видов бобовых растений. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выяснение наличия в цитозоле клубеньков различных бобовых множественных форм метлегоглобинредуктаз и разработка метода их получения в препаративных количествах в гомогенном состоянии.

2. Изучение и сравнение метлегоглобинредуктаз и легоглобина различных видов бобовых.

3. Изучение процесса неферментативного восстановления легоглобина и некоторых низкомолекулярных восстановителей, а также оценка вклада различных путей восстановления в процесс поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод одновременного получения различных форм метлегоглобинредуктаз и компонентов легоглобина из цитозоля клубеньков бобовых растений в электрофоретически гомогенном состоянии.

В цитозоле клубеньков желтого и узколистного люпинов обнаружены две формы метлегоглобинредуктазы (мономерный флавопротеид и димерный негемовый железофлавопротеид), в клубеньках гороха - одна (димерный флавопротеид). 7

Изучены различные свойства низкомолекулярных, восстановителей из клубеньков бобовых растений. Высказано предположение об их возможной роли в азотфиксирующих клубеньках.

Произведен расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса Lb в цитозоле клубеньков бобовых растений.

Разработана программа расчета концентраций различных форм гемопрогеидов для персональных компьютеров «1ВМ». Разработана конструкция ячейки для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок и 7 таблиц. Список цитируемой литературы включает 199 наименований, в т.ч. 131 на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шлеев, Сергей Валерьевич

Выводы

1. Разработан метод одновременного получения в гомогенном состоянии множественных форм метлегоглобинредуктазы и компонентов легоглобина из клубеньков бобовых растений.

2. Выделены и получены в гомогенном состоянии метлегоглобинредуктазы из клубеньков узколистного люпина и гороха посевного.

3. Клубеньки разных видов бобовых различаются по наличию различных форм метлегоглобинредуктазы. В то время, как в клубеньках обоих видов люпина содержатся две ее формы, сильно различающиеся по свойствам, в клубеньках гороха содержится лишь одна форма фермента.

3. Показано, что в клубеньках желтого люпина содержатся две формы метлегоглобинредуктазы: гомодимерная железосодержащая с молекулярной массой 120 кДа и мономерная с молекулярной массой 62 кДа, не содержащая металлов. Более активной является мономерная метлегоглобинредуктаза.

5. Из клубеньков желтого люпина выделен новый низкомолекулярный восстановитель легоглобина (компонент Я). Компонент имеет массу около 500 Да, содержит в своем составе индольный цикл.

6. Из клубеньков желтого люпина выделен низкомолекулярный восстановитель -компонент В, ранее обнаруженный в клубеньках других видов бобовых. Впервые изучено его строение. Показано наличие в его составе имидазольного цикла. В отличие от компонента Л, компонент В не способен восстанавливать кислородпереносящие гемопротеиды в отсутствие доноров электронов.

7. Проведен расчет термодинамической возможности восстановления легоглобина в клубеньках различными восстановителями. Показано, что в нормально функционирующих клубеньках потенциала флавинсодержащих редуктаз достаточно для поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.

142

В заключение хочу выразить глубокую благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук Топунову Алексею Федоровичу за предложенную тему и всемерную поддержку при выполнении данной работы.

Хочу выразить глубокую благодарность кандидату биологических наук Шубину Владимиру Вениаминовичу (ИНБИ РАН) за помощь в проведении спектроскопических исследований, доктору биологических наук профессору Ванину Станиславу Федоровичу и кандидату биологических наук Воевудской Нине Владиславовне за помощь при проведении ЭПР-спектроскопии (ИХФ РАН), кандидату химических наук Кузнецову Сергею Викторовичу (БГПУ), помогавшему в изготовлении оборудования и проведении электрохимических экспериментов, Кузнецову Александру Валентиновичу, Хлупову Александру Юрьевичу (МПГУ) и Ионову Александру Вячеславовичу (МГГУ), оказавшим существенную помощь при математической обработке данных, кандидату биологических наук Софьину Алексею Владимировичу (ИНБИ РАН) за ценные замечания при обсуждении полученных результатов.

Также выражаю искреннюю благодарность заведующему лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им. А.Н. Баха доктору биологических наук профессору Валерию Романовичу Шатилову и всем сотрудникам лаборатории за неизменно доброжелательное отношение к себе и своей работе.

Хочу также поблагодарить обслуживающий персонал нашего института, особенно стеклодува Николая Яковлевича Александрова, за помощь в изготовлении и ремонте оборудования.

Работа была выполнена при поддержке РФФИ (гранты 96-04-50379 и 9904-48640) и Госпрограммы Миннауки России "Фитобиотехнология".

143

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шлеев, Сергей Валерьевич, 2000 год

1. Артюхов В.Г., Путинцева О.В. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем. Воронеж: Изд. ВГУ. 1996. 240 с.

2. Арутюнян Э.Г. К вопросу о сродстве гемоглобинов к молекулярному кислороду (по данным структуры леггемоглобина люпина). // Докл. АН СССР. 1980. Т.252. N 2. С.413-420.

3. Арутюнян Э.Г. Структура леггемоглобина. // Молек. биол. 1981. Т. 15. N 1. С.27-43.

4. Атанасов Б.П., Пейве Я.В. Окислительно-восстановительные равновесия леггемоглобина люпина (Lupinus luteus L.) и некоторых родственных гемсодержащих белков // Докл. АН СССР. 1974. Т. 216. N 5. С. 1161-1164.

5. Барбацкий С. Люпин. М.: Иностранная литература, 1959, 261 с.

6. Баширова Н.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л. Влияние ферментативного восстановления Lb и Mb на азотфиксирующую активность бактероидов Rhizobium lupini. II Физиология растений. 1978. Т.25. N 4. С.720-725.

7. Баширова Н.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. Очистка, свойства. // Биохимия. 1979. Т.44. N 7. С.1240-1245.

8. Бороденко Л.И., Генина О.С., Жизневская Г.Я., Измайлов С.Ф. Редуктазные свойства негеминового железофлавопротеида из клубеньков люпина желтого. //Физиология растений. 1990. Т.37. N 6. С.1131-1137.

9. Бороденко Л.И., Жизневская Г.Я. Диафоразная активность негеминового железопротеида из клубеньков люпина. // Физиология растений. 1978. Т.25. N 3. С.455-463.144

10. Высшая школа, 1989. 384 стр. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа. М.: Мир. 1974. 256 с.

11. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции / под ред. И.А.

12. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. 1022 с.

13. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. 544 с.

14. Дуброво П.Н. Определение содержания восстановленных и окисленных НАД и НАДФ в тканях клубеньков люпина желтого // Физиология растений. 1978 Т. 25. N3. С. 615-622.

15. Егоров Ц.А., Казаков В.К., Шахпаронов М.И., Фейгина М.Ю. Аминокислотная последовательность леггемоглобинов I и II из клубеньков желтого люпина. // Биоорган, химия. 1980. Т. 6. N 5. С. 666-683.145

16. Жабаева М.У. Метфитоглобинредуктаза й функционирование легоглобина в клубеньках люпина. Дис. . канд. биол. наук. М.: ИНБИ им. А.Н. Баха РАН. 1991.170 с.

17. Жизневская Г.Я. Медь, молибден и железо в азотном обмене бобовых растений. М.: Наука, 1972. 335 с.

18. Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И., Меклер В.И., Белоногова О.В., Измайлов С.Ф. Взаимодействие гемина и леггемоглобина с липидным бислоем в перибактероидной мембране клубеньков люпина желтого. // Физиология растений. 1994а. ТТП.И 1. С.80-84.

19. Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И., Федорова Е.Е., Кудрявцева Н.Н, Андреева И.Н., Измайлов С.Ф. Исследование локализации леггемоглобина в клубеньках люпина желтого. // Физиология растений. 1994. Т.41. N 1. С.70-79.

20. Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник биохимика. Киев: Изд. "Наукова думка". 1971. 1014 с.

21. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. М.: Химия, 1974. 287 с.

22. Коржуев П.А. Гемоглобин. М.: Наука. 1964. 287 с.

23. Кретович В.Л. Усвоение и метаболизм азота у растений. М.: Наука. 1987. 488 с.

24. Кретович В.Л., Мелик-Саркисян С.С., Матус В.К. Состав цитохромов клубеньков люпина желтого. // Биохимия. 1972. Т.37. N 4. С.711-719.146

25. Ливанова Г.И., Жизневская ГЛ., Андреева H.H. Внетриклеточная локализация леггемоглобина в клубеньках Lupinus luteus L. // Докл. АН СССР. 1979. Т.245. N 3. С.739-742.

26. Лихтенштейн Г.И. Многоядерные окислительно-восстановительныеметаллоферменты. М.: Наука, 1979. 324 с. Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов. М.: Наука, 1989. 87 с.

27. Мелик-Саркисян С.С., Баширова Н.Ф., Владзиевская Л.П., Карпиленко Г.П., Кретович В.Л. Изучение легоглобина клубеньков люпина методом изоэлектрического фокусирования. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1975. N 6. С. 837-845.

28. Мелик-Саркисян С.С., Баширова Н.Ф., Зауралова Н.О., Кретович В.Л. Ферментативное восстановление легоглобина. // Биохимия. 1976. Т.41. N 7. С.1330-1333.

29. Органическая электрохимия. / Под ред. М. Бейзера и X. Лунда, М.: Химия, 1988. 1022 с.

30. Остерман J1.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммунноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. 304 с.

31. Остерман J1.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, 536 с.

32. Пейве Я.В. Микроэлементы и биологическая фиксация атмосферного азота. XXXI Тимирязевское чтение. М.: Наука. 1971.

33. Пейве Я.В., Атанасов Б.П., Жизневская Г.Я.; Краснобаева H.H. Способ получения леггемоглобина из клубеньков люпина методом дробного высаливания (NH4)2S04. // Физиология растений. 1973. Т. 20. N 4. С.852-856.

34. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я. Гемоглобин в клубеньках бобовых культур, микроэлементы и фиксация молекулярного азота. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1966. N 5. С.644-652.

35. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И. Кристалический гемоглобин из клубеньков люпина Lupinus luteus L. // Физиология растений. 1972. Т. 19. N 5. С.1053-1061.

36. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я., Ливанова Г.И. Кристалический гемоглобин из клубеньков люпина Lupinus luteus L. // Докл. АН СССР. 19676. Т. 177. N 5. С.1229-1231.

37. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я., Ливанова Г.И., Сафонов В.И. Сравнительное исследование гемоглобинов из клубеньков сои, кормовых бобов и люпина методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. // Докл. АН СССР. 1967а. Т. 173. N4. С.956-959.148

38. Пейве Я.В., Ягодин Б.А., Бакеева Н.М. Препаративный электрофорез белков на полиакриламидном геле // Биофизические методы в физиологии растений / Под ред. Ю.Г. Молотковского. М.: Наука, 1971.С. 5.

39. Пейве Я.В., Ягодин Б.А., Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И. Полиморфизм кристаллов гемоглобина из клубеньков различных видов люпина. // Физиология растений. 1970. Т. 17. N 2. С.290-294.

40. Практикум по электрохимии. / Под ред. Б. Б. Дамаскина, М.: Химия, 1991. 287 с.

41. Проворов H.A. Взаимосвязь между таксономией бобовых и специфичностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями. // Ботанический журнал. 1992. T.77.N8. С. 21-32.

42. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. М.: Мир, 1986. 398 с.

43. Сухотин A.M. Справочник по электрохимии. Л.: Химия. 1981. 488 с.

44. Топунов А.Ф. Легоглобин и его роль в регуляции кислородного режима в азотфиксирующих клубеньках бобовых. // Биохимия. 1995. Т.60. N 1. С.66-74.

45. Топунов А.Ф. Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых. Дис. . доктора биол. наук. М.: ИНБИ им. А.Н. Баха РАН. 1996. 232 с.

46. Топунов А.Ф., Голубева Л.И. Редуктазы, восстанавливающие кислородпереносящие гемопротеиды: гемоглобин, миоглобин, легоглобин. // Успехи биол. химии. 1989. Т.30. С.239-252.

47. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Осокин П. Л., Осокина М.В., Кретович В.Л. Исследование с использованием ЭВМ процесса ферментативного восстановления легоглобина. //Докл. АН СССР. 1986. Т.289. N 1. С.236-239.149

48. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Сварадж К., Кретович В.Л. Метлегоглобин редуктаза и цитохром-с-редуктаза клубеньков сои. // Докл. АН СССР. 1985. Т.281. N 5. С.1258-1261. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Карпиленко Г.П., Кретович

49. B.Л. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. Некоторые свойства. // Биохимия. 1980. Т. 45. N 11. С. 2053-2059.

50. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Кретович В.Л. Свойства метлегоглобинредуктазы клубеньков люпина. // Биохимия. 1982. Т.47. N 11.1. C.442-445.

51. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых и классическая концепция стресса. // Физиология растений. 1997. Т.44. С.671-675.

52. Шаронов Ю.А., Яровенко В.В., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л. Исследование дисперсии магнитооптического вращения легоглобина люпина. //Биохимия. 1973. Т.38. N 1. С.80-86.150

53. Шемаханова Н.М., Бунько И.П. Содержание витаминов группы «В» и глутатиона в клубеньках и корнях фасоли. // Сельхоз. биология. 1968. Т.6. С.859-863.

54. Яковлев В.А., Сырцова J1.A. Выделение и. изучение железосодержащего белка негеминовой природы из Azotobacter vinelandii. В сборнике: «Механизмы дыхания, фотосинтеза и фиксации азота». М.: Наука, 1967. С.351-353.151

55. Arredondo-Peter R., Moran J.F., Sarath G., Luan P., Klucas R.V. Molecular cloning of the cowpea leghemoglobin II gene and expression of its cDNA in Escherichia coli. II Plant Physiol. 1997. V.l 14. P.493-500.

56. Allen O.N., Allen E.K. The Leguminosae. A source book of characteristics, uses and nodulation. Madison, 1981. 800 p.

57. Andrews P. Estimation of the molecular weight of protein by Sephadex gel-filtration // Biochem. J., 1964, V. 91. N 2, P. 222-223.

58. Appleby C.A. The oxigen equilibrium of leghemoglobin. // Biochim. Biophys. Acta. 1962, V.60. N 2. P.226-235.

59. Appleby C.A. The origin and function of haemoglobin in plants // Sci. Progr. 1992. V. 76. P. 365-398.

60. Appleby C.A., Bergersen F.J. Preparation and experimental use of leghaemoglobin. // Methods of evaluating biological nitrogen- fixation. / Ed.: Wiley & Sons. 1980. Canberra. Australia.

61. Appleby C.A., Nicola N.A., Hurrell J.G.R., Leach S.J. Characterization and improved separation of soybean leghemoglobin. // Biochemistry. 1975. V.14. N 20. P.4444-4450.

62. Becana M., Klucas R.V. Enzymatic and nonenzimatic mechanisms for ferric leghemoglobin redaction in legume root nodules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P.7295-7299.

63. Becana M., Klucas R.V. Oxidation and reduction of leghemoglobin of leguminous plants. // Plant Physiol. 1992. V.98. P. 1217-1221.

64. Becana M., Klucas R.V. Transition metals in legume root nodules: Iron-dependent free radical production increases during nodule senescence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 8958-8962.

65. Becana M., Salin M.L., Ji L., Klucas R.V. Flavin-mediated reduction of ferric leghemoglobin from soybean nodules // Planta. 1991. V. 183. P. 575-583.

66. Behnke J.N., Dagher S.M., Massey T.H., Deal W.C. I I Anal. Biochem. 1975. V. 69. P. 1-9.

67. Beinert H. Iron sulphur proteins, the most diversified components of the mitochondrial electron transfer system // Iron and Copper Proteins / Ed. Beinert H.N.Y.; L.: Pergamon Press, 1976. P. 137-145.

68. Bergersen F.J. Oxygenation of leghemoglobin in soybean root nodules in relation to the external oxygen tension. // Nature. 1962. V.1'94. N 4833. P.1059-1061.

69. Bergersen F.J., Appleby C.A. Leghemoglobin within bacteroid-enclosing membrane envelopes in soybean root nodules. // The Fourth Int. Symp. On Nitrogen Fixation. Programme and Abstracts. Canberra. 1980. P.83.

70. Bergersen F.J., Appleby C.A. Leghemoglobin within bacteroid-enclosing membrane envelopes from soybean root nodules. // Planta. 1981. V. 52. N 6. P. 534-543.

71. Bergersen F.J., Goodchild D.J. Cellular localization and concentration of leghemoglobin in soybean root nodules. // Aust J. Biol. Sci. 1973. V.26. N 4. P.741-756.

72. Bergersen F.J., Turner G.L., Appleby C.A. Studies of the effects of nitrogen on soybean nodule extracts. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V.292. N 1. P.272.

73. Bergersen F.J., Turner G.L. Comparative studies of nitrogen fixation by soybean root nodules bacteroid suspensions and cell-free extracts. // J. Gen. Microbiol. 1968. V. 53. N2. P.205-220.

74. Bergman K., Gulash-hoffee M., Hovestadt R.E. Phisiology of behavorial mutants of Rhizobium meliloti: evidence for a dual chemotaxis pathway // J. Bacteriology. 1988.V. 170. P. 3249-3254.

75. Bethlenfalvay N. C., Waterman M.R., Lima J.E., Waldrup T. Cytosolic and membrane-bound methemoglobin reductases in erythrocytes of the opossum, Didelphis virginiana. II Comp. Biochem. Physiol. 1982. V.73b. N 3. P.518-594.

76. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein due binding. // Anal. Biochem. 1976. V.72. N 1. P.248-254.

77. Brisson N., Verma D.P.S. Soybean leghemoglobin gene family: normal, pse.udo and truncated genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. N 13. P. 4055-4059.

78. Broughton W.J., Dilworth M.J. Control of leghaegemoglobin synthesis in Snake Beans // Biochem. J. 1971. V. 125. P. 1075-1080.

79. Broughton W.J., Dilworth M.J., Godfrey C.A. Molecular properties of lupin and serradella leghaemoglobins // Biochem. J. 1972. V. 127. P. 309-314.

80. Chrambach A., Reisfeld R.A., Wyckoff M., Laccari J.A. Procedure for rapid and sensitive staining of protein fractionated by polyacrilamide gel electrophoresis. // Anal. Biochem. 1967. V.20. N 1. P. 150-154.).

81. Coventry D.E., Dilworth M.J. Synthesis and turnover of leghemoglodin in lupin root nodules, i! Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.447. N 1. P.l-10.

82. Cutting J. A.,, Schulman H.M. Leghemoglobin concerning the sites of biosynthesis of its components. // Federation Proc. 1968. V.27. N 2. P.768.

83. Cutting J.A.,, Schulman H.M. The determinant in the Rhizobium-legume symbiosis for leghemoglobin specificity. // Biochem. Biophys. Acta. 1971. V.229. N 1. P.58-62.

84. Dart P.J. Legume root nodules. Initiation and development. // The Development and Function of Roots. L., N.-Y.: Acad. Press. 1975. P.468-469.

85. Dart P.J., Mercer P.V. Development of the bacteroid in the root nodule of barrel medic (Medicago tribuloides Desr.) and subterraneum clover (Trifolium subterraneum L.). II Arch. Microbiol. 1963. V.46. N 4. P.382-401.

86. Dazzo F.B. Bacterial attachment as related to cellular recognition in Rhizobium-legume symbiosis // J. Supermolec. Struct. Cell. Biochem. 1981. V. 16. P. 29-41.

87. Denison R.F. Mathenatical modeling of oxygen diffusion and respiration in legume nodules. // Plant Physiol. 1992. V.98. P.901-907.

88. Devis B.J. Disc electrophoresis II. Method and application to human serum proteins. // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1964.V.121. Part 2. P.404-427.

89. Diaz C.A., Melchers L.S., Hooykaas P.J. Competitive nodulation blocking of Afghanistan pea is determined by nodDABC and nodEF alleles in Rhizobium leguminosarum. II Mol. And Gen. Genet. 1989. V. 216. P. 170-174.

90. Dilworth M.J.,, Kidby D.K. Localization of iron and leghemoglobin in the root nodule by electrone microscope autoradiography. // Exp. Cell. Res. 1968. V. 49. N 1. P. 148159.

91. Dixon M. The acceptor specifity of flavins and flavoproteins // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 226. P.238-242.

92. Dutton P.L. Redox potentiometry: determination of midpoint potentials of oxidation-reduction components of biological electron-transfer systems. // Methods in Enzymology. N.Y. etc.: Acad. Press, V. 54. 1978. P. 411-435.

93. Elfolk N. Crystallin leghemoglobin. II. The molecular weights and shapes of the tho main components. // Acta Chem. Scand. 1960. V. 14. N 8. P. 1819-1827.

94. Elfolk N., Sievers G. Crystallin. leghemoglobin. X. The ferrihemochromt of leghemoglobin. // Acta Chem. Scand. 1967. V.21. N 6. P.1457-146.1.

95. Elfolk N., Sievers G. The primary structure of soybean leghemoglobin. // Biochim. Biophis. Acta. 1971. V. 25. N 9. P.3532-3534.

96. Elfolk N., Virtanen A. Electrophoresis of leghemoglobin // Acta Chem. Scand. 1950. V. 4. N.7. P. 1014-1019.

97. Fred E.B., Balwin I.L., McCoy E. Root nodule bacteria and legumin plants. Madison: University Wisconsin Press. 1932.

98. Fuchsman W.H., Appleby C.A. Separation and determination of the relative concentrations of the homogeneous components of soybean leghemoglobin by isoelectric focusing // Biochim. et Biophys. Acta. 1979. V. 579. P. 314-324.

99. Goodfrey C.A., Dilworth MJ. Haem biosyntesis from 14C.-d-aminolaevulinic acid in laboratory grown and root nodule Rhizobium lupini. 11 J. Gen. Microbiol. 1971. V.69. N 3. P.385-390.

100. Gourret J.P., Fernandez-Arias H. Etude ultrastructurale et cytochimique de la différenciation des bacteroides de Rhizobium trifolium. Dangeard dans les nodules de Trifolium repens. // Can. J. Microbiol. 1974. V.20. N 8. P.l 169-1181.

101. Gresshoff P.M., Caetano-Anolles G. Systemic regulation of nodulation in legumes // Plant Biotech. Develop. Boca Raton etc., 1992. P. 87-100.

102. Henderson R.W., Appleby C.A. The redox potential of leghaemoglobin // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 283. P. 187-191.

103. Henderson R.W., Rawlinson W.A. Potentiometric and other syudes on preparations of cytochrome c from ox- and horse-heart muscle. // Biochem. J. 1956. V. 62. N 1. P. 21-29.

104. Holl F.B., Milliron M.L., Delafied S.J. Quantative variation in root nodulee leghemoglobins: intra-specific variation in component profiles. // Plant Sci. Lett. 1983. V. 32. N 3. P.321-326.

105. Kubo H. Uber das Hemoprotein aus den Wurrelknollchen von Leguminosen. II Acta. Phytochim. 1939. V. 11. N 1. P. 195-200.

106. Marcker K.A., Bojsen K., Jensen E.J., Paludan K. The soybean leghemoglobin genes. // In: Advances in Nitrogen Fixation Recearch. Proc. 5th Int. Symp. On Nitrogen

107. Fixation. The Netherlands, 1983. / Ed. C.Veeger, W.E.Newton. The Hague etc.: Martinus Nijhoff, Dr. W.Junk Publishers & Wageningen: Pudoc. 1984. P.493.

108. Mennes A.M. Indole-3-acid oxidase activity in root nodules and roots of Lupinns luteus L. Purification and kinetics of the enzyme. Ph. D. Thesis. Elve, Leiden. 1972. 96 pp.

109. Nash D.T., Schulman H.M. The absence of oxidized leghemoglobin in soybean root nodules during nodule development. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 68. P. 781-785.

110. Nesterenko M.V. et al. // Biochem. Biophys. Method. 1994. V.28. N 3. P.239-242.

111. Newton W.E., Fisher K., Kim C.H. et al. Probing catalytic function through amino-acid substitutions in Azotobacter vinelandi molybdenium-dependent nitrogenase // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Dordrecht etc., 1995. P. 91-96.

112. O'Brian M.R. Heme synthesis in the Rhizobium-legume symbiosis: a palette for bacterial and eukaryotic pigments //J. Bacteriology. 1996. V. 178. P. 13-24.

113. Ollis D.L., Appleby C.A., Colman P.M., Cutten A.E., Guss J.M., Vencatappa M.P., Freeman H.C. Crystal structure of soybean ferric leghemoglobin a nicotinate at a resolution of 3.3. // Aust. J. Chem. 1983. V. 36. N 3. P. 451-468.

114. Passon P.G., Hultquist D.E. Soluble cytochrome b5 reductase from human erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 275. N 1. P. 62-73.

115. Pate J.S. Studies of the growth substances of legume nodules using paper . chromatography. //Aust. J. Biol. Sci. 1958. V.l 1. P.516-528.

116. Puppo A., Rigaud J. Indole-3-acetic acid (IAA) oxidation by leghemoglobin from soybean nodules. // Physiol. Plant. 1975. V.35. P.181-185.

117. Puppo A., Rigaud J. A possible redacion pathway for leghemoglobin in vivo. // Febs letters. 1979. V.108. N 1. P.181-185.

118. Puppo A., Rigaud J., Job D. Leghemoglobin reduction by a nodule reductase. // Plant Sci. Lett. 1980. V.20. P. 1-6.

119. Puppo A., Rigaud J., Job D. Role of superoxide anion in leghemoglobin autoxidation. 11 Plant Science Letters. 1981. V.22. P. 353-360.

120. Quast R., Vesterberg O. Isoelectric focusing and separation of hemoglobins of Myxine glutinosa L. in a natural pH gradient. // Acta Chem. Scand. 1968. V.22. N 5. P. 14991508. '

121. Rhichardson V., Dilworth M.J., Scawen M.D. The amino acid sequence of leghaemoglobin I from root nodules of broad bean (Vicia faba L.). // FEBS Letters. 1975. V. 57. N l.P. 33-37.

122. Robertson J.C., Warburton M.P., Lyttleton P., Bullivant S., Grauston G.F. Membranes in lupin root nodules. I. The role of Golgi bodines in biogenesis of infection threads and peribacteroid membranes. // J. Cell. Sci. 1978. V.30. N 2. P. 129-149.

123. Roth L.T., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from three sources // Europ. J. Cell. Biol. 1989. Vol. 49. P. 13-23.

124. Rydstrom J. Evidence for a proton-dependent regulation of mitochondrial nicotinamide-nucleotide transhydrogenase // Eur. J. Biochem. 1974. V. 45. P. 67-76.

125. Saari L.L., Klucas R.V. Ferric leghemoglobin reductase from soybean root nodules. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V.231. N 1. P.102-113.

126. Saari L.L., Klucas R.V. Nonenzymatic redaction of ferric leghemoglobin. 7/ Biochim. Biophys. Acta. 1987. V.912. P.198-202.

127. Scott E.M. Purification of diphosphopyridine nucleotide diaphorase from methemoglobin erythrocytes. // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1962. V.9. N 1. P.59-62.

128. Sievers G., Huhtala M.L., Ellfolk N. The primary structure of soybean (Glycine max) leghemoglobin c. // Acta Chem. Scand. 1978. V. 32. N. 5. P. 380-386.

129. Sinclair T.R., Goudiaan J. Physical and morphological constraints on transport in nodules. // Plant Physiol. 1981. V.67. N 1. P.143-145.

130. Smith J.D. The concentration and distribution of hemoglobin in the root nodules of leguminous plants. // Biochem J. 1949. V.44. N 5. P.585-591.

131. Sprent J.I., Raven J.A. Evolution of nitrogen-fixing symbiosis // Biological Nitrogen Fixation. New York; London, 1992. P. 461-496.

132. Subba-Rao N.S., Mateos P.F., Baker D., Pankratz H.S., Palma J., Dazzo F.B., Sprent J.I. The unique root-nodule symbiosis between Rhizobium and aquatic legume, Neptunia natans (L.f.) Druce.// Planta. 1995. Vol. 196. P. 311-320.

133. Suganuma N., Kitou M., Yamamoto Y. Carbon metabolism in relation to cellular organisation of soybean root nodules and respiration of mitochondria aided by leghemoglobin. // Plant Cell Physiol. 1987. V.28. N 1. P.l 13-122.

134. Sullivan D., Brisson N., Goodchild B., Verma D.P.S., Thomas D.Y. Molecular cloning and organization of two leghaemoglobin genomic sequences of soybean. // Nature. 1981. V.289. N 5797. P.516-518.

135. Swaraj K., Garg O.P. Changes in the protein composition of leghemoglobin in greening nodulles of bengal gram (Cicer arietinum L.). IIZ. Pflanzenphysiol. 1977a. V. 81. N 2. P. 180-183.

136. Swaraj K., Garg O.P. The effect of ascorbic acid, when applied to the rooting medium on nodulation and nitrogen fixation in Gram (Cicer arietinum L.). II Physiol. Plant. 1969. V.23. P.889-897.

137. Swaraj K., Garg O.P. The effect of ageing on the leghemoglodin of cowpea nodules. //

138. Physiol. Plantarum. 1977b. V. 39. N 2. P. 185-189. Taylor J.F. Measurement of the oxidation-reduction equilibria of hemoglobin and mioglobin. // Methods in Enzymology. N.Y. etc.: Acad. Press, V.76. 1981. P. 577578.

139. Taylor J.F., Hastings A.B. Oxidation-reduction potentials of the methemoglobin system.

140. J. Biol. Chem. 1939. V. 131. N 2. P. 649-662. Thorogood E. Oxigenated ferroheme proteins from soybean nodules. // Science. 1957.

141. V.126. N 3281. P.1011-1012. Thumfort P.P., Atkins C.A., Layzell D.B. A re-evaluation of the role of the infected cell in the control of O2 diffusion in legume nodules. // Plant Physiol. 1994. V.105. P.1321-1333.

142. Tjepkema J.D., Yokum C.S. Measurment of oxygen partial pressure within soybeannodules by oxygen microelectrodes. // Planta. 1974. V. 119. N 4. P.351-360. Tombs M.P., Akroyd P. Akrylamide gel electrophoresis. // Shandon Instr. Appl. 1967. N 18. P.l-16.

143. Van Iersel A.A.J., Blaauboer B.J. NADH-ferrihemoglobin reductase in avian erithrocytes. // Comp. Biochem. Physiol. B. 1985. V. 81. P.1027-1031.

144. Verma D.P.S. Regulation of leghemoglobin gene expression during root nodule development. // Colloques Int. Acides nucliqes et synth se des prot ines chez les v getaux. Paris. 1977. P.319-325.

145. Verma D.P.S., Ball S.B. Intracellular site of synthesis and localization of leghemoglobin in root nodules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V.73. N 11. P.3843-3847.

146. Verma D.P.S., Long S. The molecular biology of Rhizobium-legumQ symbiosis. // Int. Rev. Cytol. 1983. V.14. Suppl. P.211-245.

147. Vesterberg O., Svensson H. Isoelectric fractionation analysis and characterization of ampholytes innatural pH gradients. IV. Further studies on the resolving in connection with separation of mioglobins. // Acta Chem. Scand. 1966. V.20. N 3. P.820-834.

148. Virtanen A.I., Miettinen J.K. Biological nitrogen fixation. // Plant Physiol. 1963. V.3. P.539-669.

149. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis. // J. Biol. Chem. 1969. V.244. N 16. P.4406-4412.

150. Werner D. Physiology of nitrogen-fixing legum nodules: compartments and functions // Biological Nitrogen Fixation. N.-Y., L. 1992. P. 399-431.

151. Whittaker R.G., Lennox S., Appleby C.A. Relationship of the minor soybean leghemoglobins di, d2 and d3 to the major leghemoglobins Ci, c2 and c3. // Biochem. Int. 1981. V.3.N 2. P.l 17-124.

152. Wittenberg J.B. Utilization of leghemoglobin-bound oxygen by Rhizobium bacteroids.// Nitrogen Fixation. Proc. 3rd Int. Symp. On Nitrogen Fixation, Madison, 1978. / Ed. Newton W.E., Orme-Johnson N.V. Baltimore: Univ. Park Press. 1980. Part 2. P.53-67.

153. Witty J.F., Skot L., Revsbech N.P. Direct evidence for changes in the resistans of legume root nodules to oxigen diffusion. // J. Exp. Bot. 1987. V.38. P.l 129-1140.

154. Wood S. J. Purification and characterization of soybean root nodule ferric leghemoglobin reductase. M. S. Thesis. Lincoln, Nebraska. 1990. 158 pp.

155. Yokum C.S. Leghemoglobin as oxygen transporter to bacteroids. // Science. 1964. V. 146. P.432.

156. Yubisui T., Takeshita M. Amino acid sequense of NADH-cytochrome b, reductase of human erythrocytes. // J. Biochem. 1984. V.96. N 2. P.579-582.

157. Yubisui T., Takeshita M. Purification and properties of NADH-cytochrome bj reductase of rabbit erythrocytes. // J. Biochem. 1982. V. 91. P.1467-1477.