Фармакологический анализ грелиновых механизмов подкрепления тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат наук Виноградов Петр Михайлович

• Виноградов Петр Михайлович
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Виноградов Петр Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ГРЕЛИН, ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ И УЧАСТИЕ

В ПОДКРЕПЛЕНИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. История открытия грелина

1.2. Генетический контроль, молекулярный предшественник грелина, молекулярные формы грелина

1.3. Рецепторы грелина

1.4. Топография грелиновых рецепторов и грелин-продуцирующих

клеток

1.5. Основные функции грелина

1.5.1. Гипоталамические функции грелинов: энергетический баланс, регуляция метаболизма глюкозы, стимуляция пищевого поведения, эндокринная регуляция

1.5.2. Экстрагипоталамические функции грелина

1.5.2.1. Модуляция механизмов подкрепления и аддикции

1.5.2.2. Участие грелиновой системы в процессах запоминания и обучения

1.6. Действие различных молекулярных форм грелина

1.7. Онтогенез грелиновой системы

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выбор животных

2.2. Процедура хронической алкоголизации

2.3. Выращивание животных в условиях социальной изоляции

2.4. Метод моделирования психической травмы

2.5. Методы исследования поведения

2.5.1. Условная реакция предпочтения места

2.5.2. Исследование поведения крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»

2.5.3. Исследование поведения крыс в тесте «открытое поле»

2.5.4. Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент»

2.6. Методы иммунохимического анализа (ИФА)

2.7. Фармакологические вещества, используемые в работе

2.8. Статистические методы анализа

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола, эмоционально-исследовательскую активность и его содержание в структурах головного мозга у крыс при хронической алкоголизации

3.1.1. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола

3.1.2. Исследование участия грелина и антагониста грелина

3

[D-Lys ]^;ИКР-6 в контроле эмоционального и исследовательского поведения у крыс

3.1.3. Исследование содержания дезацилированной формы грелина в структурах головного мозга крыс при экспериментальной хронической алкоголизации

3.2. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола и эмоционально-исследовательскую активность у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции

3.2.1. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола у животных, выращенных в условиях социальной изоляции

3.2.2. Исследование участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции

3.3. Исследование участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс с постстрессовым

расстройством

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ВОП - вентральная область покрышки

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота.

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГГНС - гипоталамо-гипофиз-надпочечниковая система.

ГОАТ - грелин-О-ациламинотрансфераза

ДА - дофамин

КРГ - кортикотропин-рилизинг гормон, кортиколиберин УРПМ - условная реакция предпочтения места ЦНС - центральная нервная система

GHRP6 - фактор, стимулирующий выделение гормона роста 6 GHSR1A - грелиновые рецепторы 1А GHSR1B - грелиновые рецепторы 1В. D1 - рецептор дофамина 1-го типа

-5

[D-Lys ]-GHRP-6 - антагонист рецепторов грелина

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакологический анализ грелиновых механизмов подкрепления»

Актуальность исследования

Интерес к исследованиям механизмов зависимости от психоактивных веществ и подкрепления как базовых механизмов, лежащих в основе эмоциональной деятельности человека и животных, в последние годы неуклонно растет. Важную роль в указанных механизмах играет аномальное функционирование эмоциогенных структур мозга, прежде всего, расширенной миндалины и мезолимбической системы мозга, включая гипоталамус и миндалевидное тело (Шабанов П.Д. и др., 2014). Среди химических трансмиттеров и модуляторов, опосредующих эмоциональные эффекты психоактивных веществ, привлекает внимание пептидный гормон грелин, открытый в конце ХХ века (Kojima M. et al., 1999). Гормон вырабатывается в слизистой желудка, состоит из 28 аминокислот и включает три изоформы: ацилированный грелин, неацилированный (дезацил-грелин) и обестатин (Chen Ch.-Y. et al., 2009). Рецептор к этим лигандам был впервые описан A.D. Howard и соавторами (1996). Грелиновый рецептор имеет две молекулярные формы: GHSR1A и GHSR1B, при этом биологическую активность связывают только с первой формой - GHSR1A. Рецепторы GHSR1A располагаются в основном в островках поджелудочной железы, надпочечниках, щитовидной железе, миокарде, а также структурах головного мозга, таких как передняя доля гипофиза, аркуатное ядро гипоталамуса, гиппокамп, черная субстанция, вентральная область покрышки (Guan X.M. et al., 1997; Gnanapavan S. et al., 2002).

Показано, что грелин способствует увеличению объема принимаемого жира и пищи посредством воздействия на гипоталамус, поэтому изначально функция грелина оценивалась только как гормона голода (Tschop et al., 2000). В то же время гормон может действовать и на специализированные клетки гипоталамуса, вызывающие аппетит, т. е. обусловливать эмоционально-мотивационные характеристики удовлетворения пищевой потребности

(Kroemer et al., 2012; Holsen et al., 2014). В последние годы также показано участие грелина и в механизмах подкрепления при формировании алкогольной и наркотической зависимости (Jerlhag et al., 2009). На фоне введения грелина принятие алкоголя у алкоголизированных крыс вызывало повышение экстраклеточного дофамина в вентральной области покрышки (Jerlhag et al., 2009; Kaur, Ryabinin, 2010).

Исследования последних лет показали значимую роль грелина в физиологической реакции мозга на стресс, поскольку одна из возможных мишеней грелина в стрессорной реакции - это кортиколиберин-продуцирующие нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса. В частности, был описан механизм, по которому грелин активирует кортиколибериновые нейроны у мышей (Patterson Z.R. et al., 2010).

В связи с этим изучение физиологической роли грелина и его рецепторов в реализации механизмов подкрепления и зависимости от психоактивных веществ, а также влияние лигандов грелина на эмоционально-исследовательскую и двигательную активность при алкоголизации и стрессорных воздействиях является актуальной проблемой, как для физиологии, так и нейрофармакологии, рассматривающей систему грелина в качестве мишени для воздействия лекарственных средств.

Степень разработанности темы

В исследованиях последних лет продемонстрировано, что системное, внутрижелудочковое и внутриструктурное (в вентральную область покрышки - ВОП) введение грелина вызывают увеличение выработки экстраклеточного дофамина (ДА) в прилежащем ядре, а также повышает двигательную активность животных (Jerlhag E. et al., 2011). С другой стороны, введение антагониста рецептора грелина в вентральную область покрышки уменьшает способность грелина увеличивать высвобождение дофамина в n. accumbens (Jerlhag E. et al., 2011). Кроме того, продемонстрировано, что повышенный уровень грелина связан с активацией

поискового поведения при лекарственной зависимости, в частности, поиска психостимулятора кокаина у крыс (Davis K.W. et al., 2007; Tessari M. et al., 2007). Ограничение потребления пищи, вызывающее повышение уровня грелина (Gualillo O. et al., 2002), также увеличивает локомоторную активность, вызванную амфетамином и кокаином, усиливает поведение поиска животным кокаина (Carroll M.E. et al., 1979). Внутрижелудочковое и внутриструктурное (в ВОП) введение грелина повышают потребление алкоголя у мышей (Jerlhag E. et al., 2011). При этом работ, свидетельствующих о регуляции грелином или компонентами его системы (дезацил-грелином, обестатином) эмоционально-исследовательской и двигательной активности при хронической алкоголизации, не проводилось.

К экстрагипоталамическим мишеням, на которые непосредственно действует грелин, относится и система расширенной миндалины, стресс-зависимая система головного мозга, опосредующая механизмы подкрепления и зависимости (Zigman J.M. et al., 2006). Исследования показали, что периферическое и центральное введение грелина активирует кортиколибериновые нейроны и, как следствие, гипоталамо-гипофизно-надпочечниковую систему (Cabral A. е! al., 2012). Активация этой системы важна, если грелин играет защитную роль против развития депрессивных симптомов при хроническом стрессе (Tung Y.L., et al., 2004). В то же время, работ по действию грелина на системы подкрепления и эмоционального поведения при стрессорных воздействиях в доступной литературе сравнительно мало, не ясны также механизмы и последствия этого влияния.

Цель и задачи исследования

Целью исследования было изучение участия грелина и антагониста его рецепторов [D-Lys3]-GHRP-6 в механизмах безусловного и условного подкрепления, стресс-индуцированного поведения и алкогольной зависимости у крыс.

Задачи исследования

1. Исследовать действие грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на эмоционально-исследовательское поведение и условную реакцию предпочтения места этанола при хронической алкоголизации у крыс.

2. Изучить динамику уровней дезацилированной формы грелина в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации и последующей отмене этанола.

3. Анализировать действие грелина и антагониста рецепторов грелина

[D-Lys3]-GHRP-6 на эмоционально-исследовательское поведение, двигательную активность и условную реакцию предпочтения места этанола у крыс, выращенных в условиях стресса социальной изоляции.

4. Изучить участие грелина в организации эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, перенесших острое витальное стрессорное воздействие в период формирования посттравматического стрессорного расстройства (ПТСР).

Научная новизна

Результаты экспериментов позволили получить оригинальные данные о значении грелиновых механизмов подкрепления в формировании зависимости от этанола. Доказано, что блокада рецепторов грелина в головном мозге устраняет или существенно уменьшает подкрепляющее действие алкоголя. Интраназальное введение грелина у хронически алколизированных крыс, напротив, вызывает проявление агрессии, снижение коммуникативного поведения и исследовательской активности. При этом

-5

антагонист рецепторов грелина [D-Lys ]^;ИКР-6 обладает мягким анксиолитическим и нормализующим поведение действием у таких животных. С другой стороны, у крыс, не получавших этанол, антагонист

-5

рецепторов грелина [D-Lys ]^;ИКР-6 обладает анксиогенным действием и вызывает повышение коммуникативной активности. Динамика содержания

дезацил-грелина отличается в различных структурах головного мозга и меняется в ходе алкоголизации и последующей отмене алкоголя. В миндалине наблюдается снижение его концентрации с последующим повышением в разные сроки отмены (2-7 суток) этанола. В гиппокампе концентрация дезацил-грелина снижается как при формировании зависимости от этанола, так и при ее отмене. В гипоталамусе отмечается резкое увеличение концентрации дезацил-грелина, особенно в период

отмены этанола. При стрессе социальной изоляции у крыс антагонист

3

рецепторов грелина [D-Lys ]^НЯР-6 проявляет типичные анксиолитические свойства, снижает исследовательскую активность, коммуникативное поведение и проявления агрессии. Эти свойства не воспроизводятся в период формирования посттравматического стрессового расстройства у крыс, перенесших острую витальную психогенную травму (экспозицию с питоном). Напротив, в этих условиях анксиолитические свойства проявляет сам грелин, вводимый интраназально в виде курса (7 дней). Таким образом, полученные данные создают предпосылки для создания противоалкогольных и анксиолитических средств среди агонистов и антагонистов рецепторов грелина, меняющих активность подкрепляющих и стресс-лимитирующих систем мозга.

Теоретическая и практическая значимость Показано, что интраназальное введение антагониста рецепторов

-5

грелина [D-Lys ]^НЯР-6 блокирует экспрессию условной реакции предпочтения места (УРПМ) и возобновление реакции после ее угашения у алкоголизированных крыс. Внутрибрюшинное введение этанола в дозах 0,50,75-1,5 г/кг при хронической алкоголизации оказывает как подкрепляющее,

так и аверсивное действие. Интраназальное введение антагониста рецепторов

3

грелина [D-Lys ]^НЯР-6 крысам, выращенным в условиях социальной изоляции с 17-го дня жизни, блокирует экспрессию УРПМ этанола и возобновление реакции после ее угашения. В противоположность этому, иинтраназальное введение грелина крысам, выращенным в условиях

социальной изоляции, вызывает анксиогенный эффект, повышение исследовательской активности и агрессии, снижение коммуникативного поведения. Антагонист рецепторов грелина [D-Lys ]^;ИКР-6 в этих условиях обладает мягкой анксиолитической активностью, снижает исследовательскую активность, коммуникативное поведение и проявления агрессии. В то же время, грелин при курсовом интраназальном применении в течение 7 дней у крыс, подвергнутых острому психогенному витальному стрессу (экспозиция с питоном), проявляет анксиолитическое действие без существенного влияния на проявления агрессии. Антагонист рецепторов

-5

грелина

[D-Lys3]-GHRP-6 в данных условиях, наоборот, вызывает анксиогенный эффект, при этом у животных увеличивается локомоторная активность. Данные о включении грелиновой системы в организацию эмоционального и следовательского поведения открывает перспективы для рассмотрения грелина и компонентов его системы в качестве новых мишеней для создания эффективных корректоров эмоционально-мотивационного поведения, прежде всего, из числа антагонистов рецепторов грелина.

Методология и методы исследования

Методологической основой исследования было изучение у грызунов (крыс) подкрепляющих свойств ряда психоактивных веществ, которые оценивались при помощи условной реакции предпочтения места (УРПМ), а также других методов изучения эмоционально-исследовательского и двигательного поведения («открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», «чужак-резидент»), моделирования хронической алкоголизации, социальной изоляции и постсттравматического стрессового расстройства, оценки концентраций дезацил-грелина в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации и последующей отмене этанола методом иммуноферментного анализа. Исследования выполнены на основе требований и правил доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту:

з

1. Интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-б блокирует экспрессию и возобновление условной реакции предпочтения места после ее угашения у алкоголизированных крыс. При

-5

этом антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-6 обладает мягким анксиолитическим и сбалансированным действием на эмоциональное поведение.

2. Динамика содержания дезацил-грелина отличается в различных структурах головного мозга и изменяется в ходе алкоголизации и последующей отмене алкоголя. Наиболее чувствительными структурами головного мозга являются миндалина и гиппокамп, где наблюдается снижение концентрации дезацил-грелина при алкоголизации с возрастанием уровней пептида после отмены этанола. В гипоталамусе, напротив, концентрация дезацил-грелина при алкоголизации не меняется, но возрастает после острой отмены этанола.

3

3. Интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-б блокирует экспрессию и возобновление УРПМ после ее угашения у крыс, выращенных в условиях стресса социальной изоляции. При этом антагонист рецепторов грелина [Э-ЬуБ ]-ОИЯР-6, как и в случае с алкоголизацией, проявляет свойства анксиолитика и снижает проявления агрессии. Данные о включении грелиновой системы в организацию эмоционального и следовательского поведения открывает перспективы для рассмотрения грелина и его аналогов как корректоров эмоционально-мотивационного поведения.

4. Грелин при курсовом (в течение 7 дней) интраназальном введении после острого витального стрессогенного воздействия (экспозиция с питоном) проявляет анксиолитическое действие, но повышает проявления агрессии. Антагонист рецепторов грелина

после его

введения в течение 7 дней, наоборот, вызывает анксиогенный эффект, при этом увеличивается локомоторная активность.

Степень достоверности и апробация материалов исследования Достоверность исследования определяется значительным количеством экспериментальных животных (340 крыс), использованием принципов рандомизации, формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными современными поведенческими, фармакологическими, биохимическими и токсикологическими методами исследования, достаточными сроками наблюдения и корректными методами математической обработки полученных результатов.

Реализация результатов Материалы исследования используются в курсе лекций профильных кафедр фармакологии медицинских вузов Санкт-Петербурга и Великого Новгорода (Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет МЗ РФ, Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова МЗ РФ, Институт медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого МОН РФ). Работа включена в плановые научно-исследовательские темы ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований РАН (РФФИ №13-0400186).

Апробация результатов Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на 8-й международной научной конференции «Steroids and nervous system» (Турин, Италия, 2015), на Всероссийской конференции, посвященной 150-летию Н.П. Кравкова (Рязань, 2015), на 23-й международной конференции «Stress and Behavior» (Санкт-Петербург, 2016), научных заседаниях отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова (2014-2016) ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Работа одобрена локальным комитетом по этике ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

Апробация диссертации прошла на заседании отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 научных работы, в их числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 19 тезисов и статей в сборниках научно-практических работ.

Личный вклад автора

Автор лично участвовал во всех этапах работы, планировал эксперименты, их непосредственно выполнял, обрабатывал полученные результаты, проводил обсуждение результатов, осуществлял написание статей и тезисов, диссертации и автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертация соответствует ГОСТу и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований, включающей 3 подраздела, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель включает 211 ссылок, в том числе 38 отечественных и 173 иностранных.

Глава 1. ГРЕЛИН, ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ И УЧАСТИЕ

В ПОДКРЕПЛЕНИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. История открытия грелина В середине 1970-х годов прошлого столетия были открыты опиоидные пептиды, которые способствовали высвобождению гормона роста из передней доли гипофиза (Bowers C.Y. et al., 1984; Kojima M. et al., 1999; Guan X.M. et al., 1997; Willesen V.G. et al., 1999; Nagaya N. et al., 2004). Действие этих пептидов осуществлялось путем связывания с так называемым рецептором секретогога гормона роста (англ. growth hormone secretagogue receptor 1A - GHSR). Молекулы, которые ученые описали как пептиды, высвобождающие гормон роста, были синтезированы путем модификации метэнкефалина и включали в себя пептид, высвобождающий гормон роста 2 и 6, а также гексарелин (Smith R.G. et al., 1997). Изначально предполагали, что эти пептиды действовали исключительно на гипофиз, но вскоре стало очевидно, что они также действуют и на арочное ядро гипоталамуса (Dickson S.L. et al., 1993), в особенности на нейроны, высвобождающие гормон роста. Механизмы, с помощью которых эти молекулы стимулируют высвобождение гормона роста, были неизвестны, но они были отличными от механизма соматостатинового пути (Blake A.D. et al., 1991; Dickson S.L. et al., 1993). Кроме наблюдения, что этот пептид стимулирует активацию рецептора 1А и усиливает экспрессию нейропептида Y (Dickson S.L. et al., 1993), эти данные позволяют предположить присутствие неизвестного эндогенного лиганда рецептора 1А, который, возможно, регулирует системный метаболизм. В последующие годы многочисленные исследования были направлены на идентификацию этого лиганда. Этот неизвестный лиганд не удавалось установить до 1999 года, когда группа ученых под руководством M. Коджима выявили близкий агонист для рецептора 1А из очищенного экстракта желудка крысы, который является эндогенным

лигандом для рецепторов секретогога гормона роста и состоит из 28 аминокислот, и назвали его «грелин» (Kojima M. et al., 1999). Название данного пептида происходит от корня «гре» - индоевропейского слова «рост». Этот гормон способен стимулировать выработку гормона роста из передней доли гипофиза, что, по-видимому, является основной функцией грелина на ранних стадиях индивидуального развития (Kojima M. et al., 1999). Рецептор грелина стал привлекать к себе интерес с 1980-х, когда в качестве сильного стимулятора гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) был идентифицирован пептид под названием «фактор, стимулирующий выделение гормона роста 6» (Growth Hormone Releasing Peptide 6 - GHRP-6), относящий к классу стимуляторов секреции ростовых факторов (Bowers C.Y. et al., 1984). Рецептор к этим лигандам, грелиновый рецептор, был впервые описан позднее группой из компании Merck (Howard A.D. et al., 1996).

1.2. Генетический контроль, молекулярный предшественник грелина,

молекулярные формы грелина

В состав грелиновой системы включают три пептида, биосинтез которых контролируется одним геном. Ген грелина у мыши и человека имеют в своем составе по пять экзонов (Chen Ch.-Y. et al., 2009). Продуктами экспрессии гена грелиновой системы являются три формы пептидов: ацилированный грелин, неацилированный (дезацил-грелин) и обестатин. Кроме того, к грелиновой системе относят грелиновые рецепторы. Грелин - это гормон, который содержит 28 аминокислотных остатков, полученный последовательной протеолитической деградацией белкового предшественника препрогрелина и прогрелина. Грелин преимущественно синтезируется в желудке и секретируется в общий кровоток. В плазме грелин существует в двух формах: ацетилированный грелин и дезацетилированный грелин. Считается, что пострансляционное ацилирование грелина необходимо для его основной функциональной активности. Ацилированный грелин имеет уникальную для олигопептидов посттрансляционную

модификацию, заключающуюся в присоединении остатка октановой кислоты к аминокислотному остатку серина, что происходит путем формирования сложноэфирной связи. Наличие ацильного (алкильного) остатка в молекуле является необходимым для связывания грелина с соответствующим специфическим рецептором в ЦНС - грелиновым рецептором типа 1А (Sato S. et al., 2012). Грелин кодируется препрогрелиновым геном, который кроме грелина также кодирует и сигнальные белки, и 23-аминокислотный пептид обестатин. Изначально предполагали, что обестатин является эндогенным лигандом рецепторов грелина, а функции обестатина могут вступать в противодействие с грелином (Zhang J.V. et al., 2005), то есть, ингбириовать прием пищи и моторику желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Однако несколько независимых групп исследователей не смогли подтвердить эти факты (Depoortere I., 2012). Для активации его единственного рецептора требуется прикрепление жирной кислоты боковой цепочкой к своему сериновому остатку в положении 3, уникальной посттранскрипционной модификации, которое достигается с помощью грелин-О-ациламинотрансферазой (ГОАТ) (Depoortere, I., 2012; Gutierrez J.A. et al., 2008). Открытие данного фермента, ответственного за процесс ацилирования грелина (Gutierrez J.A. et al., 2008), было важным прорывом в понимании роли, которую ацилированный грелин играет в физиологии. Эта форма грелина, в основном октановая и меньше декановая, необходима для воздействия грелина на системный метаболизм. Данные, демонстрирующие решающую роль ГОАТ в активации грелина, ясны. Во-первых, этот фермент и дезацил-грелин достаточны для продукции ацилированного грелина (Gutierrez J.A. et al., 2008). Во-вторых, грелин и ГОАТ имеют похожие тканевые профили у людей и грызунов с высоким содержанием ГОАТ в поджелудочной железе, желудке у людей и желудке и кишечнике у грызунов (Gutierrez J.A. et al., 2008; Lim C.T. et al., 2011). В-третьих, ГОАТ, так же как и грелин, очень специфичен для позвоночных. Человек и грызуны проявляют функциональную активность ГОАТ. Наконец, наиболее убедительные

данные в пользу того, что ГОАТ является ферментом для ацилирования грелина, то, что мыши, у которых отсутствует ГОАТ, продемонстрировали отсутствие октановой и декановой форм грелина (Zhao T.J. et al., 2010; Gutierrez J.A. et al., 2008). Интересно, что липиды, используемые для активации грелина, напрямую поступают из молочных жиров из пищи (Nishi Y. et al., 2005). Возможно, это связано с тем, что грелин-продуцирующие клетки расположены в железах дна желудка. Большое число этих клеток контактируют между собой в эпителии полости желудка, что дает прямой доступ к молочным липидам (Armand M. et al., 1996). Более того, предпочтительные субстраты жирных кислот для ГОАТ образуются из триглицеридов средней длины, которые могут напрямую поступать в кровоток, не расщепляясь липазой и желчными кислотами (Armand M. et al., 1996). Несмотря на эти доказательства, эффект синтезированных жирных кислот по сравнению с напрямую полученными из пищи жирными кислотами остается неизвестным. Исследования продемонстрировали, что глицин-1, серин-3, и фенилаланин-4 являются важными компонентами распознавания последовательности для ГОАТ, тогда как серин-2, лейцин-5, серин-6 и пролактин-7 представляются менее важными для этого. С точки зрения биохимии, ГОАТ представляет собой фермент для двух важных субстратов: дезацил-грелина и коротких или средних цепей жирных кислот, этерифицированных коэнзимом А. Клетки, содержащие грелин и ГОАТ, синтезируют серин-3-ацил-грелин вместе с ацильной частью прекурсоров, полученных из жирных кислот от ацетатов до тетрадекановой кислоты (Gutierrez J.A. et al., 2008). Длина жирных кислот, используемых для ацилирования грелина, представляется важным фактором для метаболизма грелина, так как изменение длины жирной кислоты приводит к изменению активации рецептора грелина 1А in vitro и изменяет влияние грелина на пищевое поведение и ожирение in vivo. Таким образом, модификация ацильной боковой цепи может представлять интерес в виде терапевтического рычага для будущих вмешательств.

Октановые и декановые формы грелина являются оптимальными лигандами для активации рецепторов 1А. Исследования, проводимые in vitro, воспроизводящие ацилирование грелина, с дезацил-грелиновыми пептидами, жирными кислотами и ГОАТ, определяют субстратную специфичность для ГОАТ. Структурные ограничения представляются специфичными только для грелина и предполагают, что грелин является основным субстратом для фермента ГОАТ. Последние исследования подчеркивают важность метаболизма специфических жирных кислот в клетках, продуцирующих ацилированный грелин (Kirchner H. et al., 2009). Последние исследования с генетически модифицированными мышами, у которых либо отсутствовал ГОАТ, либо уровни ГОАТ и грелина были повышены, выявили, что ГОАТ-грелиновая система действует как пищевой сенсор, информирующий организм о присутствии пищи, а не об ее отсутствии, как предполагалось ранее (Kirchner H. et al., 2009). Несколько наблюдений поддерживают это утверждение. Во-первых, продолжительное голодание мышей приводило к уверенно выявляемому повышению уровня общего грелина, что было вызвано увеличением дезацил-грелина, а не ацилированной его формы. Это увеличение дезацил-грелина происходит на фоне снижения уровня ГОАТ в ответ на длительное голодание (Kirchner H. et al., 2009). В соответствии с этим наблюдением мыши с нулевым уровнем ГОАТ демонстрировали значительное повышение уровня общего грелина, вызванного только увеличением дезацил-грелина, так как эти мыши неспособны ацилировать грелин (Gutierrez J.A. et al., 2008; Kirchner H. et al., 2009). Во-вторых, некоторые исследования продемонстрировали, что какие-то цепи жирных кислот средней длины могут быть прямым источником субстратов для ацилирования грелина у мышей, а также, что восприятие жирных кислот средней длины включает в себя вкусовой G-белок (Janssen S. et al., 2012). В-третьих, выявлено, что мыши, в пище которых были жирные кислоты средней длины и у которых отсутствовал ГОАТ, имеют меньшую массу тела и меньшую массу жира по сравнению с другими мышами. В то же время

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Виноградов Петр Михайлович, 2017 год

актов

Агрессия 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,1±0,3

Примечание: *р<0,05 относительно контрольной группы. §р<0,05 относительно хронически алкоголизированных животных.

Следовательно, грелин 20 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально алкоголизированным животным, действут подобно антагонисту рецепторов грелина [В-Ьув3]-ОИКР-6, в целом проявляя депримирующий эффект на центральную нервную систему. Единственным отличием в действии грелина было умеренное возрастание агрессивности, не свойственное крысам Вистар. Если сравнить данные по действию грелина и его антагониста на поведение алкоголизированных животных в тесте «чужак-резидент», оно не будет достоверно отличаться по отдельным показателям.

Таким образом, при хронической алкоголизации у крыс было показано, что антагонист грелина [0-Ьув3]-0НКР-6 проявляет себя как препарат сбалансированного действия. В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» он восстанавливал поведение экспериментальных животных практически до значений контрольной группы, получавшей воду. В свою очередь у животных, не получавших этанол, антагонист рецепторов грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 проявлял анкиогенные свойства, снижая время нахождения животных в светлом рукаве установки. В тесте «чужак-резидент» антагонист

рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 восстанавливал сниженную этанолом коммуникативную активность. В свою очередь, грелин, наоборот, приводил к снижению коммуникативного поведения и проявлению агрессии. Как сам грелин, так и его антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 снижали исследовательскую активность в тесте «открытом поле».

3.1.3. Исследование содержания дезацилированной формы грелина в структурах головного мозга крыс при экспериментальной хронической

алкоголизации

Всего в эксперименте было использовано 28 крыс Вистар с начальной массой 180-200 г. 21 крысу подвергали полунасильственной алкоголизации в течение 6 мес, когда единственным источником жидкости выступал 15%-ный раствор этанола. В контрольную группу вошли 7 крыс того же привоза (возраста), которые получали воду. В первой экспериментальной группе (алкоголизация 6 мес, 7 животных) структуры мозга были выделены через 2 ч после последнего приема алкоголя. Во второй и третьей экспериментальных группах (алкоголизация 6 мес, по 7 животных в каждой) выделение структур головного мозга и определение дезацил-грелина происходило после двух и семи суток отмены алкоголя, соответственно.

Общий белок в струтурах головного мозга крыс определяли по методу Бредфорд. С помощью высокочувствительного иммуноферментного метода дезацил-грелин был выявлен во всех образцах структур головного мозга всех обследованных животных (табл. 8).

Проведенные эксперименты с последующей обработкой данных показали, что в ходе экспериментальной хронической алкоголизации концентрация дезацил-грелина в миндалине крыс достоверно снижена по сравнению с другими экспериментальными группами. В контрольной группе средняя концентрация дезацил-грелина составила 72,9±21,2 пг/мг, средняя концентрация дезацил-грелина в миндалине при хронической алкоголизации

Таблица 8

Содержание дезацил-грелина в структурах головного мозга крыс

Контроль Хроническая алкоголизация 6 месяцев Отмена этанола 2 дня Отмена этанола 7 дней

Миндалина 72,9±21,2 51,5±7,9 57,8±8,0 68,0±8,4

Гиппокамп 63,0±5,6 55,9±5,6 53,8±3,1 51,7±4,2

Гипоталамус 48,2±5,2 49,5±4,9 57,4± 4,5 48,8± 6,6

Примечание: *р<0,05 относительно соответствующей контрольной группы.

Средние величины дезацил-грелина в миндалине при 2- и 7-дневной отмене составили соответственно 57,8±8,0 пг/мг и 68,0±8,4 пг/мг. Для большей наглядности эти данные представлены в виде графика на рис. 7.

В гиппокампе в контрольной группе животных, средняя концентрация дезацил-грелина составила 63,0±5,6 пг/мг. Хроническая алкоголизация несколько снижала концентрацию дезацил-грелина в гиппокампе до 55,9±5,6 пг/мг. При 2- и 7-дневной отмене алкоголя в гиппокампе было отмечено еще большее снижение концентрации дезацил-грелина до 53,8±3,1 пг/мг и 51,7±4,2 пг/мг соответственно (рис. 8).

С 0)

90'

80'

70'

60-

(О

п

£ 50'

40'

30'

*

2 3

Группы

4

Рис. 7. Содержание дезацил-грелина в структурах миндалины крыс (пг/мг) после длительной (6 мес) алкоголизации и отмены этанола 1 - контрольная группа крыс (6 мес получала воду), 2 - группа крыс с алкоголизацией в течение 6 мес, 3 - алкоголизация 6 мес, 2-дневная отмена этанола, 4 - алкоголизация 6 мес, 7-дневная отмена этанола; *р<0,05 относительно контрольной группы.

*

1

Группы

Рис. 8. Содержание дезацил-грелина в гиппокампе крыс (пг/мг) после длительной (6 мес) алкоголизации и отмены этанола 1 - контрольная группа крыс (6 мес получала воду), 2 - группа крыс с алкоголизацией в течение 6 мес, 3 - алкоголизация 6 мес, 2-дневная отмена этанола, 4 - алкоголизация 6 мес, 7-дневная отмена этанола; *р<0,05 относительно контрольной группы.

В гипоталамусе средняя концентрация дезацил-грелина в контрольной группе животных составила 48,2±5,2 пг/мг, в группе хронической алкоголизации - 49,5±4,9 пг/мг. При 2-дневной отмене алкоголя концентрация дезацил-грелина составила 57,4±4,5 пг/мг, при 7-дневной отмене алкоголя - 48,8± 6,6 пг/мг (рис. 9).

70 щ

60

х

| 50

40

30

Группы

Рис. 9. Содержание дезацил-грелина в гипоталамусе крыс (пг/мг) после длительной (6 мес) алкоголизации и отмены этанола 1 - контрольная группа крыс (6 мес получала воду), 2 - группа крыс с алкоголизацией в течение 6 мес, 3 - алкоголизация 6 мес, 2-дневная отмена этанола, 4 - алкоголизация 6 мес, 7-дневная отмена этанола; *р<0,05 относительно контрольной группы.

2

3

4

Из приведенных графиков видно, что содержание дезацил-грелина в разных структурах мозга варьирует. В контрольных группах концентрация грелина была наибольшей в миндалине и достоверно отличалась от гипоталамуса (рис. 10). В группе хронической алкоголизации концентрация грелина в миндалине снижается, наибольшая концентрация грелина сохраняется в гиппокампе (рис. 11). В группе хронической алкоголизации с 2-дневной отменой этанола концентрация в гиппокампе достоверно ниже в сравнении с миндалиной и гиппокампом (рис. 12). При 7-дневной отмене

100'

90'

с х~

s Ц

о

CP

80'

70'

60'

С5

<0

й 50'

40'

30'

Миндалина

Гиппокамп Группы

Гипоталамус

Рис. 10. Содержание дезацил-грелина (пг/мг) в структурах головного мозга крыс в контрольных группах (получали воду) *p<0,05 относительно миндалины.

70

60

2 "lI

с

z

s

50

с

s ^

та м v

40

30

Миндалина

Гиппокамп Группы

Гипоталамус

Рис. 11. Содержание дезацил-грелина (пг/мг) в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации в течение 6 мес *p<0,05 относительно миндалины.

*

*

70 п

60-

х

с

с 5

40-

30'

Миндалина

Гиппокамп Группы

Гипоталамус

Рис. 12. Содержание дезацил-грелина (пг/мг) в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации в течение 6 мес и 2-дневной отмене

этанола

*р<0,05 относительно миндалины.

90

80-

70

£ 60

« 50

а)

с!

40

30

Миндалина

Гиппокамп Группы

Гипоталамус

Рис. 13. Содержание дезацил-грелина (пг/мг) в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации в течение 6 мес и 2-дневной отмене

этанола

*р<0,05 относительно миндалины.

*

*

*

Таким образом, при экспериментальной хронической алкоголизации было выявлено достоверное снижение концентрации дезацил-грелина в структурах миндалины с последующим повышением показателей при 2- и 7-дневной отмене этанола. В гиппокампе отмечали тенденцию к снижению концентрации дезацил-грелина во всех экспериментальных группах, наибольшее снижение регистрировали в группах хронической алкоголизации с 2- и 7-дневной отменой этанола. В гипоталамусе отмечали резкое увеличение концентрации дезацил-грелина при 2-дневной отмене алкоголя по сравнению с другими группами. Результаты показали, что дезацил-грелин при алкоголизации по-разному аккумулируются в различных структурах головного мозга. Динамика содержания дезацил-грелина в различных структурах головного мозга различна и изменяется в ходе алкоголизации и последующей отмене этанола.

3.2. Исследование условных подкрепляющих свойств грелина и его участия в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции

3.2.1. Исследование условных подкрепляющих свойств антагониста рецепторов грелина [0-Ьу83]-0НКР-6 у крыс, выращенных в условиях

социальной изоляции

Все животные были разделены на 3 группы: 1) выращенные в группе, 2) выращенные и содержавшиеся в условиях социальной изоляции от сородичей и 3) выращенные и содержавшиеся в условиях социальной изоляции, получавшие интраназально физиологический раствор (контроль) в дозе 20 мкл либо антагонист грелина [В-Ьув3]-ОНКР-6 в дозе 10 мкг в 20 мкл (по 10 мкл в каждую ноздрю). У крыс Вистар вырабатывали УРПМ этанола 0,5 г/кг внутрибрюшинно. Из 30 крыс 8 составили контрольную группу, их содержали в отдельной клетке группой, 7 крыс выращены и содержались в условиях социальной изоляции (в индивидуальных клетках) и получали

Таблица 9

Влияние антагониста рецепторов грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 на выработку УРПМ этанола у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции

Группа Время нахождения в камере УРПМ, ассоциированной с этанолом (сек) Процент времени нахождения в камере УРПМ, ассоциированной с этанолом

Крысы, выращенные в сообществе, получавшие этанол 0,5 г/кг в/бр 632,1±41,8 70,2±4,6

Крысы, выращенные в сообществе, получавшие физиологический раствор и/наз, без введения этанола 540,7±81,0* 60,1±9,0

Крысы, выращенные в сообществе, получавшие антагонист грелина [Э-ЬуБ3]-ОИКР-6 и/наз без введения этанола 542,3±79,4* 60,2±8,8

Контрольные крысы, выращенные в изоляции, получавшие этанол в/бр 530,8±85,9* 58,9±9,5

Крысы, выращенные в изоляции и получавшие антагонист грелина [Э-ЬуБ3]-ОИКР-6 и/наз + этанол в/бр 462,4±95,8* 51,3±10,6*

Примечание: и/наз - интраназально, в/бр - внутрибрюшинно. р<0,05 относительно животных, выращенных в сообществе.

Крысы, вошедшие в контрольную группу, проводили в камере УРПМ, ассоциированной с введением этанола, в среднем 632,1±41,8 сек (70,2±4,6% времени эксперимента). Контрольные животные из группы изолянтов, получившие интраназально 20 мкл физиологического раствора, проводили в

камере УРПМ в среднем 530,8±85,9 (58,9±9,5% времени эксперимента). Крысы-изолянты, получавшие антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОНЯР-6, снизили среднее пребывание в камере УРПМ до 462,4±95,8 сек (51,3±10,6 % времени эксперимента). Данные формирования УРПМ этанола представлены в таблице 9.

Следовательно, антагонист рецепторов грелина [О-Ьув3]-ОНКР-6 практически не влияет на выработку УРПМ этанола у крыс, выращенных в сообществе, и умеренно нарушает ее у крыс-изолянтов.

Тест возобновления реакции предпочтения места после ее угашения у контрольных животных показал стойкость сохранения УРПМ. В камере УРПМ крысы контрольной группы сообщества проводили 658,5±36,8 сек (73,1±4,0% времени эксперимента). Крысы, получавшие антагонист рецепторов грелина [0-Ьув3]-0НКР-6 снизили среднее пребывание в камере УРПМ до 419,2±102,8 секунды (46,5±11,4 % времени эксперимента). Время нахождения крыс-изолянтов, получавших интраназально физиологический раствор, в камере алкоголизации составило 535,4±103,1 сек (59,4±11,4% времени эксперимента), демонстрируя сохранение УРПМ этанола (табл. 10). Группа крыс-изолянтов, получавших антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОНКР-6 интраназально, находились в камере алкоголизации 404,0±127,2 секунды (44,8±14,1% времени эксперимента), демонстрируя явное снижение УРПМ этанола.

условиях социальной изоляции

Группа Время нахождения в камере УРПМ, ассоциированной с этанолом (сек) Процент времени нахождения в камере УРПМ, ассоциированной с этанолом

Крысы, выращенные в сообществе, получавшие этанол в/бр 658,5±36,8 73,1±4,0

Крысы, выращенные в изоляции, получавшие этанол в/бр 535,4±103,1 59,4±11,4

Крысы, выращенные в сообществе и получавшие антагонист грелина [Э-Ьув3]-ОИЯР-6 и/наз + этанол в/бр 419,2±102,8* 46,5±11,4

Крысы, выращенные в изоляции, получавшие антагонист рецепторов грелина [Э-Ьу83]-ОИЯР-6 и/наз без этанола 404,0±127,2* 44,8±14,1*

Примечание: и/наз - интраназально, в/бр - внутрибрюшинно. р<0,05 относительно животных, выращенных в сообществе.

Следовательно, крысы-изолянты отличаются от сородичей, выращенных в сообществе, меньшей стойкостью к сохранению УРПМ этанола. Однако, антагонист рецепторов грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 действует на крыс из сообщества и крыс-изолянтов сходным образом, нарушая возобновление выработанной УРПМ этанола после ее угашения.

3

Изучение участия грелина и антагониста грелина - [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 в организации эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции, было проведено с помощью поведенческих тестов: "Приподнятый крестообразный лабиринт", тест "Открытое поле", тест "Чужак-резидент". Животные были разделены на следующие группы: животные, выращенные в сообществе, животные, выращенные в условиях социальной изоляции, животные,

выращенные в сообществе, получавшие интраназально антагонист

3

грелиновых рецепторов [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 в дозе 20 мкг, животные, выращенные в сообществе, получавшие интраназально грелин, животные,

выращенные в условиях социальной изоляции и получавшие интраназально

3

антагонист грелиновых рецепторов [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 в дозе 20 мкг, животные, выращенные в условиях социальной изоляции и получавшие интраназально грелин в дозе 20 мкг.

В «приподнятом крестообразном лабиринте» оценивали анксиолитическую активность грелина и антагониста грелина. Фиксировали время нахождения в светлом, темном рукавах, количество свешиваний, число актов груминга и число перебежек из одного рукава в другой.

В группе животных, выращенных в сообществе и не получавших препараты, время нахождения в светлых рукавах составило 51,2±20,9 сек, время нахождения в темных рукавах - 248,7±21,7 сек, число свешиваний -6,8±2,3 актов, число перебежек по рукавам - 1,8±0,3 актов, число актов груминга - 1,7±1,7. В группе животных, выращенных в условиях социальной изоляции, время нахождения в светлых рукавах составило 149,8±43,3 сек, время нахождения в темных рукавах - 150,1±41,8 сек, число свешиваний с платформы - 9,28±1,32 актов, число перебежек из рукава в рукав -

1,2±0,2 актов, актов груминга выявлено не было. В группе животных, выращенных в сообществе и получавших антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОНКР-6 интраназально, время нахождения в светлых рукавах составило 31,1±13,4 сек, время нахождения в темных рукавах -268,8±12,4 сек, число перебежек в рукавах - 2,6±1,2 актов, число свешиваний - 4,1±1,5 актов, число актов груминга - 3,0±1,6 (табл. 11).

Таблица 11

Влияние интраназально вводимого антагониста рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОНКР-6 на поведение крыс, выращенных в условиях социальной изоляции, в «приподнятом крестообразном лабиринте»

Показатель Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие антагонист грелина [Б-Ьу83]-аНЯР-6 и/наз

Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции

Время нахождения в светлом рукаве, сек 51,2±20,9 149,8±43,3* 31,1±13,4§ 147,4±38,8*

Время нахождения в темном рукаве, сек 248,7±21,7 150,1±41,8 268,8±12,4 152,5±33,9

Число свешиваний 6,8±2,3 9,2±1,3* 4,0±1,5*§ 10,2±1,3

Число перебежек из рукава в рукав 1,8±0,3 1,2±0,2 2,6±1,2 2,7±0,4

Число актов груминга 1,7±1,7 0,0±0,0 3,0±1,6§ 1,8± 0,6

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно крыс, выращенных в сообществе, §р<0,05 относительно крыс, выращенных в изоляции.

В группе животных, выращенных в условиях социальной изоляции и получавших интраназально антагонист рецепторов ОНБ-КЛЛ грелина 20 мкл, время нахождения в светлом рукаве составило 147,4±38,8 сек, время нахождения в темных рукавах - 152,5±33,9 сек, число свешиваний -10,28±1,39 актов, число перебежек из рукава в рукав - 2,7±0,4 актов, число актов груминга - 1,8±0,6.

Следовательно, контрольные крысы, выращенные в условиях социальной изоляции и получавшие интраназально физиологический раствор, демонстрировали повышение анксиолитических свойств, что проявлялось существенным увеличением времени пребывания в освещенных отсеках лабиринта и, соответственно, уменьшением его в темных рукавах лабиринта. Точнее говоря, это время было одинаково, и в светлых, и в темных рукавах лабиринта, что указывает на отсутствие у данных крыс страха освещенных пространств. Животные, выращенные в сообществе и получавшие интраназально антагонист грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 10 мкг в 20 мкл, мало отличались от сородичей, получавших физиологический раствор; у них лишь один показатель (число свешиваний с платформы) был ниже, чем у контрольных крыс из сообщества. Крысы-изолянты, получавшие интраназально антагонист грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 10 мкг в 20 мкл, демонстрировали тип поведения, который также был характерен для крыс-изолянтов, получавших физиологический раствор, то есть, они практически не дифференцировали светлые и темные рукава лабиринта. Единственно, у них умеренно возрастал показатель груминга, свидетельствующий о повышении комфортности пребывания в лабиринте.

В группе животных, выращенных в сообществе и получавших интраназально грелин, время нахождения в светлых рукавах составило 68,5±41,5 сек, время нахождения в темных рукавах - 231,5±42,3 сек, число перебежек из рукава в рукав - 2,5±0,6 актов, число свешиваний -1,5±0,4 акта, актов груминга не наблюдалось. Наконец, в группе животных, выращенных в условиях социальной изоляции и получавших интраназально грелин в дозе 20 мкг в 20 мкл, показатели были следующие: время нахождения в светлых рукавах составило 110,7±36,6 сек, время нахождения в темных рукавах - 189,2±31,4 сек, число свешиваний - 7,8±1,0 актов, число перебежек из рукава в рукав - 3,5±0,6 актов, актов груминга выявлено не было (табл. 12).

лабиринте»

Показатель Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие грелин и/наз

выращенные в сообществе Выращенные в изоляции Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции

Время нахождения в светлом рукаве, сек 51,2±20,9 149,8±43,3* 68,5±41,5§ 110,71±36,64*

Время нахождения в темном рукаве, сек 248,7±21,7 150,1±41,8* 231,5±42,3 189,28±36,64*

Число свешиваний 6,8±2,3 9,2±1,3 1,5±0,4*§ 7,85±1,01

Число перебежек из рукава в рукав 1,8±0,3 1,2±0,2 2,5±0,6*§ 3,5±0,6*§

Число актов груминга 1,7±1,7 0,0±0,0* 0,0±0,0* 0,00±0,00*

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно крыс, выращенных в сообществе, §р<0,05 относительно крыс, выращенных в изоляции.

Следовательно, крысы-изолянты, получавшие физиологический раствор интраназально, по показателям резко отличались от крыс из сообщества: они не дифференцировали светлый и темный отсеки лабиринта, что указывает на отсутствие у них чувства страха освещенных пространств. В противоположность действию антагониста грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6, который не менял поведения крыс-изолянтов, грелин 20 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально, уменьшал время пребывания в освещенных рукавах лабиринта и увеличивал число перебежек из рукава в рукав, то есть, частично нормализовал поведение крыс-изолянтов в сторону, типичную для крыс из сообщества. Вместе с тем, показателей сообщества эти животные не достигали.

В тесте «открытое поле» исследовали свободную двигательную активность. Регистрировали несколько простых двигательных актов: вертикальную и горизонтальную активность, груминг, норковый рефлекс. В группе крыс, выращенных в сообществе и не получавших препараты, число пересеченных секторов составило 11,2±3,9, число заглядываний в норки -0,4±0,2 актов, число принюхиваний - 0,4±0,2 актов, число актов груминга -1,0±0,2, число вертикальных стоек - 0,4±0,2 актов, число стоек с упором на стенку - 0,4±0,2 актов, число болюсов дефекации - 1,4±0,6. В группе животных, выращенных в условиях социальной изоляции и не получавших препараты, число пересеченных секторов составляло 8,71±2,10, число заглядываний в норки - 1,2±0,5 актов, число принюхиваний - 0,7±0,2 актов, число актов груминга - 1,0±0,2, число стоек с упором - 0,71±0,28 актов, число вертикальных стоек - 0,0±0,2 актов, число болюсов дефекации -

1,4±0,4. В группе животных, выращенных в сообществе и получавших

3

антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 интраназально, число пересеченных секторов составило 11,8±2,6, число заглядываний в норки - 1,0±0,5 актов, число принюхиваний - 5,5±2,2 актов, число актов груминга - 0,3±0,2, число вертикальных стоек -1,5±0,4 актов, число стоек с упором - 4,5±1,2 актов, число болюсов дефекации - 2,1±1,1 (табл. 13).

изоляции, в «открытом поле»

Показатель (число актов) Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие антагонист грелина [D-Lys3]-GHRP-6 и/наз

выращенные в сообществе выращенные в изоляции выращенные в сообществе выращенные в изоляции

Груминг 1,0±0,2 1,0±0,2 0,3±0,2*§ 0,0±0,0*§

Число пересеченных секторов 11,2±3,9 8,7±2,1 11,8±2,6 7,8±2,3*

Движение в секторе 2,1±0,5 1,5±0,4 1,3±0,8 3,5±0,5

Принюхивание 0,4±0,2 0,7±0,2 5,0±2,2*§ 0,5±0,2

Замирание 2,7±1,3 2,2±0,4 1,8±0,6 1,7±0,5*

Стойки 0,4±0,2 0,0±0,2 1,5±0,4*§ 0,5±0,2

Стойки с упором 0,4±0,2 0,7±0,2 4,5±1,2*§ 0,5±0,2

Заглядывание в норки 0,4±0,2 1,2±0,5 1,0±0,5 2,2±0,6*§

Число болюсов 1,4±0,6 1,4±0,4 2,1±1,1 2,1±0,7

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно крыс, выращенных в сообществе, §р<0,05 относительно крыс, выращенных в изоляции.

В группе, животных, выращенных в условиях социальной изоляции и получавших антагонист грелина [D-Lys ]-GHRP-6 интраназально, число пересеченных секторов составляло 7,8±2,3, число заглядываний в норки -2,2±0,6 актов, число принюхиваний - 0,5±0,2 актов, актов груминга не наблюдалось, число вертикальных стоек - 0,5±0,2 актов, число стоек с упором на стенку - 0,5±0,2 актов, число болюсов дефекации - 2,1±0,7.

Следовательно, у крыс-изолянтов умеренно снижалась двигательная активность, но возрастало исследовательское поведение (например, показатель заглядывания в норки увеличивался в 3 раза), эмоциональность не менялась. Антагонист рецепторов грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 10 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально крысам из сообщества, умеренно менял их поведение: восстанавливалась горизонтальная двигательная активность, вертикальный ее компонент резко возрастал, хотя число заглядываний в норки не менялось, снижался показатель груминга, но возрастала эмооциональность (число болюсов дефекации). У крыс-изолянтов антагонист рецепторов грелина [В-ЬуБ3]-ОИКР-6 также умеренно снижал двигательную активность животных с увеличением исследовательского компонента поведения и снижением показателя груминга до нуля, эмоциональность при этом не менялась.

В группе животных, выращенных в сообществе и получавших интраназально грелин 20 мкг в 20 мкл, число пересеченных секторов составило 23,0±3,0, число заглядываний в норки - 3,1±0,9 актов, число принюхиваний -15,0±1,2 актов, число актов груминга - 1,6±0,9, число вертикальных стоек - 2,0±1,1 актов, число стоек с упором - 2,8±0,7 актов, число болюсов дефекации - 1,6±1,2. В группе животных, выращенных в условиях социальной изоляции и получавших интраназально грелин, число пересеченных секторов составило 24,2±4,8, число заглядывание в норки -1,4±0,5 актов, число принюхиваний - 4,5±2,6 актов, число актов груминга -5,0±1,7, число стоек с упором - 4,5±2,6 актов, число вертикальных стоек -4,5±2,6 актов, число болюсов дефекации - 2,28±0,68 (табл. 14).

Показатель (число актов) Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие грелин и/наз

Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции Выращенные в сообществе выращенные в изоляции

Груминг 1,0±0,2 1,0±0,2 1,6±0,9 5,0±1,7*§

Число пересеченных секторов 11,2±3,9 8,7±2,1 23,0±3,0*§ 24,2±4,8*§

Движение в секторе 2,1±0,5 1,5±0,4 4,8±1,0*§ 3,7±1,1§

Принюхивание 0,4±0,2 0,7±0,2 15,0±1,2*§ 4,5±2,6*§

Замирание 2,7±1,3 2,2±0,4 1,3±0,4 1,2±0,2*

Стойки 0,4±0,2 0,0±0,2 2,0±1,1*§ 4,5±2,6*§

Стойки с упором 0,4±0,2 0,7±0,2 2,8±0,7*§ 4,5±2,6*§

Заглядывание в норки 0,4±0,2 1,2±0,5 3,1±0,9* 1,4±0,5*

Число болюсов 1,4±0,61 1,4±0,4 1,6±1,2 2,2±0,6

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно крыс, выращенных в сообществе, §р<0,05 относительно крыс, выращенных в изоляции.

Следовательно, грелин 20 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально, активирует двигательное поведение крыс из сообщества и изолянтов, повышает у них исследовательскую активность, но не меняет эмоциональность. В отличие крыс из сообщества грелин резко растормаживает груминговые реакции у крыс-изолянтов.

В тесте «чужак-резидент» оценивали коммуникативные поведенческие акты, акты агрессии, а также общее число двигательных актов. В группе крыс, выращенных в сообществе, проявление актов коммуникации составило 14,0±2,6, актов агрессии не наблюдалось. В группе крыс, выращенных в условиях социальной изоляции, число актов коммуникации составило 13,1±1,2, число актов агрессии - 0,5±0,5. В группе животных, выращенных в сообществе и получавших интраназально антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6, число актов коммуникации составило 18,1±3,6 актов, актов

агрессии выявлено не было. В группе животных, выращенных в условиях

3

социальной изоляции и получавших антагонист рецепторов грелина [Э-ЬуБ ]-ОНЯР-6 интраназально, число актов коммуникации составило 11,2±0,7, число актов агрессии - 0,2±0,2 (табл. 15).

Следовательно, социальная изоляция не влияет на коммуникативное поведение крыс, но растормаживает компоненты агрессии и резко снижает число замираний (реакция страха). Антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 10 мкг в 20 мкл не менял поведение крыс, выращенных в сообществе, но снижал груминговые реакции, реакции замирания и акты агрессии у крыс-изолянтов.

изоляции, в тесте «чужак-резидент»

Показатель Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие антагонист грелина [О-Ьу83]-ОНКР-6 и/наз

Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции

Груминг 3,7±1,2 2,5±0,8 3,1±1,7 1,4±0,5*

Замирание 7,5±2,1 0,1±0,1* 6,5±0,9 1,5±0,4*

Стойка 12,4±2,5 12,0±1,8 12,3±2,1 7,5±0,8

Коммуникация 14,0±2,6 13,1±1,2 18,1±3,6 11,2±0,7

Агрессия 0,0±,0 0,5±0,5* 0,0±0,0 0,2±0,2

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно крыс, выращенных в сообществе, §р<0,05 относительно крыс, выращенных в изоляции.

В группе животных, выращенных в сообществе и получавших интраназально грелин, число актов коммуникации составило 9,3±0,7, актов агрессии также выявлено не было. Наконец, в группе животных, выращенных в условиях социальной изоляции и получавших грелин интраназально, число актов коммуникации составило 11,7±0,7, актов агрессии не наблюдалось (табл. 16).

Показатель Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие грелин и/наз

Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции Выращенные в сообществе Выращенные в изоляции

Груминг 3,7±1,2 2,5±0,8 1,6±0,9* 2,8±1,2

Замирание 7,5±2,1 0,1±0,1* 2,0±0,3*§ 0,4±0,4*

Стойка 12,4±2,5 12,0±1,8 10,1±1,6 8,4±2,0

Коммуникация 14,0±2,6 13,1±1,2 9,3±0,7 11,8±0,7*

Агрессия 0,0±,0 0,5±0,5 0,0±0,0 0,0±0,0

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно крыс, выращенных в сообществе, §р<0,05 относительно крыс, выращенных в изоляции.

Следовательно, интраназально вводимый грелин 20 мкг в 20 мкл крысам из сообщества устраняет реакцию агрессии, умеренно снижает коммуникационные акты и груминговые реакции. У крыс-изолянтов грелин оказывает сходное с сообществом действие, но восстанавливает груминговые реакции. То есть, в обоих случаях действие грелина может расцениваться как анксиолитическое.

Таким образом, у животных, выращенных в условиях социальной

з

изоляции антагонист грелина р-ЬуБ ]-ОИКР-6 в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» обладал незначительной анксиолитической активностью (достоверно не менял время нахождения животных в светлом и темном рукавах, но увеличивал число свешиваний с платформы). Грелин в данном тесте обладал анксиогенным эффектом, снижая время нахождения изолированных животных в светлом рукаве и снижая число свешиваний. В

3

тесте «открытого поля» антагонист рецепторов грелина [Э-Ьув ]-ОИЯР-6 снижал эмоционально-исследовательскую активность, грелин ее увеличивал.

изоляции, в отличае от животных, выращенных в сообществе, проявляли

3

умеренную агрессивную реакцию. Антагонист грелина снижал коммуникативную активность, а также незначительно снижал проявление агрессии у животных, выращенных в условиях изоляции. Грелин также приводил к снижению коммуникативного поведения и снижал проявление агрессии животных, выращенных в условиях социальной изоляции.

психической травмой

Как уже отмечалось в разделе методов исследования, часть животных подвергали процедуре острого психогенного стресса, помещая их в вольер с питоном. Питон в присутствии 20 крыс удушал одну из них и заглатывал, удовлетворяя свои пищевые потребности. Остальные крыси наблюдали за этим событием, подвергаясь стрессу. Поведенческие исследования проводили на 7-е сутки после стрессирования животных, когда, по данным С.Г. Цикунова и соавторов (2000, 2006, 2012) и П.Д.Шабанова и соавторов (2014) развиваются наиболее выраженные поведенческие нарушения.

3

Изучение участия грелина и антагониста рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 в организации эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс с посттравматическим стрессовым расстройством было проведено с помощью поведенческих тестов: "Приподнятый крестообразный лабиринт", тест "Открытое поле", тест "Чужак-резидент". Животные были разделены на следующие группы:

контрольные животные, стрессированные животные, контрольные животные,

3

получавшие интраназально антагонист рецептров грелина [Э-ЬуБ ]-ОНЯР-6

в дозе 20 мкг, стрессированные животные, получавшие интраназально

3

антагонист рецептров грелина [Э-ЬуБ ]-ОНЯР-6 в дозе 20 мкг, контрольные животные, получавшие интраназально грелин, стрессированные жзивотные, получавшие интраназально грелин в дозе 20 мкг.

В «приподнятом крестообразном лабиринте» оценивали

анксиолитические/анксиогенные свойства грелина и антагониста его

3

рецепторов [Э-ЬуБ ]-ОНЯР-6, которые вводили интраназально в течение 7 дней 1 раз в сутки, начиная со дня стрессового воздействия, последнее введение было за 30 мин до проведения тестирования. Регистрировали время

нахождения в светлых, темных рукавах, число свешиваний с плапформы, груминговые реакции и число перебежек из рукава в рукав.

В группе крыс, не подвергавшихся стрессированию и не получавших препараты, время нахождения в светлом рукаве составило 92,1±21,0 сек, время нахождения в темном рукаве - 207,8±28,0 сек, число свешиваний -5,8±1,1 актов, число перебежек по рукавам - 5,1±1,2 актов, число актов груминга - 0,5±0,5. В группе стрессированных животных (экспозиция с питоном), получавших интраназально физиологический раствор, время нахождения в светлых рукавах составило 68,3±43,2 сек, время нахождения в темных рукавах - 231,6±46,7 сек, число свешиваний с платформы -1,3±0,5 актов, число перебежек из рукава в рукав - 1,6±0,5 актов, число актов груминга - 0,1±0,1. В группе животных, не подвергавшихся стрессированию и получавших антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-6 интраназально, время нахождения в светлых рукавах лабиринта составило 31,1±13,4 сек, время нахождения в темных рукавах - 268,8±12,4 сек, число перебежек из одного рукава в другой - 2,6±1,2 актов, число свешиваний с платформы - 4,1±1,5 актов, число актов груминга - 3,0±1,6 (табл. 17).

Таблица 17

Влияние интраназально вводимого антагониста рецепторов грелина Р-Ьув3]-ОИКР-6 на поведение крыс, перенесших острое психогенное воздействие, в «приподнятом крестообразном лабиринте»

Показатель Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие антагонист грелина [Б-Ьу83]-ОИЯР-6 и/наз

Без стресса Стресс (ПТСР) Без стресса Стресс (ПТСР)

Время нахождения в светлом рукаве, сек 92,1±21,0 68,3±43,2* 31,1±13,4*§ 25,6±8,1*§

Время нахождения в темном рукаве, сек 207,8±28,0 231,6±46,7 268,8±12,4 274,3±8,3

Число свешиваний 5,8±1,1 1,3±0,5* 4,0±1,5 1,3±0,8*

Число перебежек из рукава в рукав 5,1±1,2 1,6±0,5* 2,6±1,2* 1,7±0,5*

Число актов груминга 0,5±0,5 0,1±0,1 3,0±1,6*§ 2,1±0,8*§

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно контрольной группы крыс без стресса, §р<0,05 относительно крыс, перенесших острый психогенный стресс (ПТСР).

антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОНЯР-6 в дозе 10 мкг в 20 мкл, время нахождения в светлых рукавах составило 25,6±8,1 сек, время нахождения в темных рукавах - 274,3±8,3 секунд, число свешиваний -1,3±0,8, число перебежек из рукава в рукав - 1,7±0,5, число актов груминга -2,1±0,8.

Следовательно, процедура стрессирования у контрольных животных приводила к умеренной анксиогении, что сопровождалось снижением показателей пребывания в светлых рукавах лабиринта, числа свешиваний с платформы, числа перебежек из рукава в рукав и числа актов груминга. Антагонист грелина [О-ЬуБ3]-ОНКР-6 при интраназальном введении интактным крысам и крысам, подвергшимся стрессированию, оказывал сходный со стрессом результат, то есть резко снижал время пребывания в освещенных рукавах лабиринта, число свешиваний с края платформы и число перебежек из рукава в рукав. По сути, у стрессированных животных антагонист грелина [О-ЬуБ3]-ОНКР-6 усугублял проявления стресса, что проявлялось более низкими значениями показателей числа свешиваний с края платформы, число перебежек из рукава в рукав и актов груминга.

В группе животных, не подвергавшихся стрессированию и получавших интраназально грелин, показатели теста «приподнятый крестообразный лабиринт» были следующие: время нахождения в светлом рукаве составило 68,5±41,5 сек, время нахождения в темном рукаве - 231,5±42,3 сек, число перебежек из рукава в рукав - 2,5±0,6 актов, число свешиваний с платформы - 1,5±0,4 акта, актов груминга не наблюдалось.

Наконец, в группе стрессированных животных, получавших интраназально грелин в дозе 20 мкг в 20 мкл, показатели были следующие: время нахождения в светлом рукаве составило 67,7±17,4 сек, время нахождения в темном рукаве - 232,2±15,9 сек, число свешиваний - 3,6±0,7, число перебежек из рукава в рукав - 7,0±1,8, число актов груминга - 1,1±0,4 (табл. 18).

лабиринте»

Показатель Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие грелин и/наз

Без стресса Стресс (ПТСР) Без стресса Стресс (ПТСР)

Время нахождения в светлом рукаве, сек 92,1±21,0 68,3±43,2* 68,5±41,5* 67,7±17,4*

Время нахождения в темном рукаве, сек 207,8±28,0 231,6±46,7 231,5±42,3 232,2±15,9

Число свешиваний 5,8±1,1 1,3±0,5 * 1,5±0,4* 3,6±0,7§

Число перебежек из рукава в рукав 5,1±1,2 1,6±0,5* 2,5±0,6* 7,0±1,8§

Число актов груминга 0,5±0,5 0,1±0,1 0,0±0,0* 1,1±0,4

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно контрольной группы крыс без стресса, §р<0,05 относительно крыс, перенесших острый психогенный стресс (ПТСР).

Следовательно, интраназально вводимый грелин 20 мкг в 20 мкл практически не менял показателей поведения у крыс, не подвергавшихся и подвергавшихся стрессированию. Значительные различия заключались в более высоких показателях числа свешивания с краев платформы и числа перебежек из рукава в рукав у крыс с ПТСР в сравнении с неподвергшимися стрессированию крысами.

В тесте «открытое поле» исследовали свободную двигательную активность. Регистрировали несколько простых двигательных актов: вертикальную и горизонтальную активность, груминг, заглядывание в норки,

количество болюсов. В группе животных, не подвергавшихся стрессированию и не получавших препараты, число пересеченных секторов составляло 50,8±7,1, число заглядываний в норки - 7,5±1,5 актов, число принюхиваний - 7,5±1,1 актов, число актов груминга - 2,6±1,3, число вертикальных стоек - 4,5±2,4 актов, число стоек с упором на стенку - 7,5±1,8 актов, число болюсов дефекации - 3,6±1,4. В группе крыс, подвергнутых стрессированию и получавших физиологический раствор интраназально (активный контроль), число пересеченных секторов составляло 50,6±3,8, число заглядываний в норки - 15,0±1,0 актов, число принюхиваний - 2,8±0,8 актов, число актов груминга - 4,5±2,5, число стоек с упором - 6,5±1,0 актов, число вертикальных стоек - 0,5±0,2 актов, число болюсов дефекации -1,6±0,6. В группе интактных крыс получавших антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-6 10 мкг в 20 мкл интраназально, число пересеченных секторов составило 11,8±2,6, число заглядываний в норки - 1,0±0,5 актов, число принюхиваний - 5,5±2,2 актов, число актов груминга - 0,3±0,2, число вертикальных стоек - 1,5±0,4 актов, число стоек с упором - 4,5±1,2 актов, число болюсов дефекации - 2,1±1,1. В группе стрессированных животных, получавших антагонист грелина [О-Ьув ]-ОИЯР-6 интраназально, число пересеченных секторов составило 26,1±4,6, число заглядываний в норки -5,3±1,3 актов, число принюхиваний - 12,1±2,4 актов, число актов груминга -1,3±0,7, число вертикальных стоек - 0,8±0,5 актов, число стоек с упором на стенку - 5,5±1,2 актов, число болюсов дефекации - 3,0±0,8 (табл. 19).

Следовательно, острый психогенный стресс у контрольных крыс не меняет двигательную активность (число пересеченных квадратов, движение в секторе, стойки с упором), но вдвое повышает исследовательскую активность (норковый рефлекс) и груминговые реакции, снжая эмоциональность (болюсы дефекации).

Таблица 1 9

Показатель (число актов) Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие антагонист грелина [О-Ьу83]-ОИЯР-6 и/наз

Без стресса Стресс (ПТСР) Без стресса Стресс (ПТСР)

Груминг 2,6±1,3 4,5±2,5* 0,3±0,2*§ 1,3±0,7§

Число пересеченных секторов 50,8±7,1 50,6±3,8 11,8±2,6*§ 26,1±4,6*§

Движение в секторе 4,8±0,9 2,6±0,7 1,3±0,8* 4,7±0,6

Принюхивание 7,5±1,1 2,8±0,8* 5,0±2,2 12,1±2,4

Замирание 1,3±0,6 0,5±0,3* 1,8±0,6 3,6±0,4*§

Стойки 4,5±2,4 0,5±0,2* 1,5±0,4* 0,8±0,5*

Стойки с упором 7,5±1,8 6,5±1,0 4,5±1,2 5,5±1,2

Заглядывание в норки 7,5±1,5 15,0±1,0* 1,0±0,5*§ 5,3±1,3§

Болюсы 3,6±1,4 1,6±0,6 2,1±1,1 3,0±0,8

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно контрольной группы крыс без стресса, §р<0,05 относительно крыс, перенесших острый психогенный стресс (ПТСР).

Антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОИКР-6 10 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально, у крыс, не подвергавшихся стрессированию, резко снижал двигательную активность (в 4,5 раза горизонтальную и менее существенно вертикальную) и почти блокировал исследовательскую активность и груминговые реакции. У крыс с ПТСР антагонист рецепторов грелина [О-Ьув3]-ОИКР-6 оказывал сходное, но менее выраженное угнетающее действие на двигательную активность, частично восстанавливая

Таблица 20

Влияние интраназально вводимого грелина на поведение крыс, перенесших острое психогенное воздействие, в «открытом поле»

Показатель (число актов) Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие грелина и/наз

Без стресса Стресс (ПТСР) Без стресса Стресс (ПТСР)

Груминг 2,6±1,3 4,5±2,5* 1,6±0,9 2,8±1,0§

Число пересеченных секторов 50,8±7,1 50,6±3,8 23,0±3,0*§ 24,2±3,3*§

Движение в секторе 4,8±0,9 2,6±0,7* 4,8±1,0 8,0±1,5*§

Принюхивание 7,5±1,1 2,8±0,8 15,0±1,2*§ 9,7±1,1§

Замирание 1,3±0,6 0,5±0,3 1,3±0,4 9,8±0,9*§

Стойки 4,5±2,4 0,5±0,2* 2,0±1,1*§ 1,6±0,9*§

Стойки с упором 7,5±1,8 6,5±1,0 2,8±0,7* 5,1±0,8

Заглядывание в норки 7,5±1,5 15,0±1,0* 3,1±0,9*§ 6,2±1,7*

Болюсы 3,6±1,4 1,6±0,6* 1,6±1,2* 2,0±0,7

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно контрольной группы крыс без стресса, §р<0,05 относительно крыс, перенесших острый психогенный стресс (ПТСР).

В группе животных, не подвергавшихся стрессированию и получавших интраназально грелин 20 мкг в 20 мкл, число пересеченных секторов составило 23,0±3,0, число заглядываний в норки - 3,1±0,9 актов, число принюхиваний - 15,0±1,2 актов, число актов груминга - 1,6±0,9. Число

вертикальных стоек в данной группе составило 2,0±1,1 актов, число стоек с упором - 2,8±0,7 актов, число болюсов дефекации - 1,6±1,2. В группе стрессированных животных, которые получали интраназально грелин, число пересеченных секторов составило 24,2±3,3, число заглядываний в норки -6,2±1,7 актов, число принюхиваний - 9,7±1,1 аков, число актов груминга -2,8±1,0, число стоек с упором - 5,1±0,8 актов, число вертикальных стоек -1,6±0,9 актов, число болюсов дефекации - 2,0±0,7.

Следовательно, грелин 20 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально, оказывал сходное депримирующее действие на крыс, не подвергавшихся и подвергавшихся стрессированию, но у крыс с ПТСР более значимо восстанавливал исследовательскую активность (норковый рефлекс), груминговые реакции при высоких значения показателя «замирание», свидетельствующего о сохранении реакции страха.

В тесте «чужак-резидент» определяли коммуникативные поведенческие акты, проявления агрессии, а также общее число двигательных актов. В группе контрольных крыс, не подвергавшихся стрессированию, но получавших физиологический раствор интраназально, число актов коммуникации составило 12,1±3,2 актов, актов агрессии не наблюдалось. В группе крыс, не подвергавшихся стрессированию и получавших интраназально антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-6, число актов коммуникации составило 18,1±3,6 актов, актов агрессии выявлено также не было. В группе стрессированных животных, получавших интраназально физиологический раствор (активный контроль), число актов коммуникации составило 10,8±1,0 актов, актов агрессии не наблюдалось. В группе стрессированных животных, получавших интраназально антагонист грелина

число актов коммуникации составило 9,5±1,0 актов, Актов агрессивного поведения также не было вывлено (табл. 21).

Таблица 21

Влияние интраназально вводимого антагониста рецепторов грелина [О-Ьув3]-ОИКР-6 на поведение крыс, перенесших острое психогенное воздействие, в тесте «чужак-резидент»

Показатель (число актов) Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие антагонист грелина [О-Ьу83]-ОИЯР-6 и/наз

Без стресса Стресс (ПТСР) Без стресса Стресс (ПТСР)

Груминг 2,5±0,8 2,1±1,4 3,1±1,7§ 1,0±0,3

Замирание 1,1±0,5 1,3±0,3 6,5±0,9*§ 1,5±0,6

Стойка 12,8±3,5 7,8±2,7* 12,3±2,1 6,3±0,9*

Коммуникация 12,1±3,2 10,8±1,0 18,1±3,6* 9,5±1,0*

Агрессия 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно контрольной группы крыс без стресса, §р<0,05 относительно крыс, перенесших острый психогенный стресс (ПТСР).

Следовательно, стрессирование крыс помещением в клетку с питоном существенно не влияло на структуру повещения агрессии/защиты, за исключением умеренного снижения вертикального компонента двигательной активности. Антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОИКР-6 10 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально, у крыс, не подвергавшихся стрессированию, повышал коммуникативные компонентны поведения, но увеличивал число замираний (свидетельство сохранения реакции страха). У крыс, перенесших ПТСР антагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ3]-ОИКР-6 нормализовал коммуникабельность животных, снижал двигательную активность, число замираний и груминговые реакции. Все перечисленное свидетельствует об анксиолитическом действии [О-ЬуБ3]-ОИКР-6 у крыс с ПТСР.

Показатель (число актов) Контрольные крысы, получавшие физиологический раствор и/наз Крысы, получавшие грелин и/наз

Без стресса Стресс (ПТСР) Без стресса Стресс (ПТСР)

Груминг 2,5±0,8 2,1±1,4 1,6±0,9 0,6±0,3*§

Замирание 1,1±0,5 1,3±0,3 2,0±0,3 4,7±1,4*§

Стойка 12,8±3,5 7,8±2,7 10,1±1,6 5,5±1,5*

Коммуникация 12,1±3,2 10,8±1,0 9,3±0,7 9,3±0,9

Агрессия 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,1±0,1*§

Примечание: и/наз - интраназально; *р<0,05 относительно контрольной группы крыс без стресса, §р<0,05 относительно крыс, перенесших острый психогенный стресс (ПТСР).

В группе животных, не подвергавшихся стрессированию и получавших интраназально грелин, число актов коммуникации составило 9,3±0,7 актов, актов агрессии выявлено не было. Наконец, в группе стрессированных животных, получавших грелин интраназально, число актов коммуникации составило 9,3±0,9 актов, число актов агрессии составило 0,1±0,1 (табл. 22).

Следовательно, грелин 20 мкг в 20 мкл, вводимый интраназально, не менял поведения агрессии/защиты у крыс, не подвершихся острому психогенному стркссу. Напротив, у крыс, перенесших стрессогенную ситуацию, грелин почти вдвое уменьшал вертикальную двигательную активность и груминговые реакции, при этом показатели коммуникативности не менялись, а число замираний (показатель страха) и компоненты агрессивного поведения возрастали. Это указывает на отсутствие у грелина типичных анксиолитических свойств, но наличие седативного действия на двигательную активность.

В настоящей работе показано, что интраназальное введение пептидного антагониста грелина [0-Ьув3]-0НКР-6 в дозе 10 мкг в 20 мкл интраназально замедляло формирование УРПМ этанола на 30% (р<0,05). Экспрессия УРПМ этанола после двух дней ее угашения также снижалась антагонистом грелина Р-Ьу83]-ОНКР-6 в дозах 20 мкг на 35% и 40% (Виноградов П.М. и др., 2015). Это в целом согласуется с литературными данными, касающимися возможного участия системы грелина в механизмах подкрепления. В частности, было показано, что, грелиновая система в головном мозге важна для процессов внутримозгового подкрепления, активируемо наркотическими веществами (Е§есю§1и Е. й а1., 2010; Каиг Б. Й а1., 2010; Реге11о М. е! а1., 2010; 1егШа§ Е. е! а1., 2011). Так, введение антагониста рецепторов грелина [О-Ьув3]-ОИКР-6 значительно снижает подкрепляющие свойства амфетамина, а также психомоторного стимулятора кокаина.

Интерес представляю полученные нами данные, что внутрибрюшинное введение этанола в дозах от 0,5 до 1,5 г/кг может обладать как подкрепляющими, так и аверсивными свойствами, причем с увеличением дозы этанола подкрепляющие свойства его не всегда увеличиваются. Это, как мы уже отмечали, возможно, связано с индивидуальными особенностями животных в исследуемой неоднородной популяции (Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2010; Шабанов П.Д., Сапронов Н.С., 2010). В настоящей работе нами показана роль грелиновой системы мозга в механизмах патологического влечения к алкоголю (хронической алкоголизации в течение 6 мес) и возможность использования антагонистов грелина с целью снижения уровня подкрепления, им активированного. Исследования по грелиновой системе касались, главным образом, регуляции пищевого поведения. В частности, ограничение потребления пищи, вызывающее повышение уровня грелина (ОиаНПо О. е! а1., 2002; Ситт^Б О.Е. е! а1., 2006), также увеличивает и вызванную амфетамином и кокаином локомоторную активность, усиливает поведение поиска кокаина и повышает самовведение кокаина и амфетамина у

3

грелина [D-Lys3]-GHRP-6. Было показано значительное снижение подкрепляющих свойств этанола, которые измеряли по уровню дофамина в прилежащем ядре и особенностям поведения (локомоторная активность и условная реакция предпочтения места). Введение грелина (внутрижелудочковое или локальное в вентральную область покрышки) повышало потребление алкоголя у мышей (Jerlhag E. et al., 2011). Кроме того, было показано, что действие грелина наиболее выражено у грызунов, которые ранее уже потребляли алкоголь, так как периферическое введение грелина крысам, не потреблявшим ранее алкоголь, незначительно повышает его потребление (Jerlhag E., et al., 2011; Lyons A.M., et al., 2008).

Таким образом, грелин и его GHS-R1A рецепторы могут регулировать уровень потребления и поиск аддиктивных веществ (Виноградов П.М. и др., 2015). Поэтому лечение пациентов с алкогольной зависимостью с помощью фармакологических веществ, действующих на грелиновую систему, может оказаться перспективным направлением современной психофармакологии и биологической наркологии.

При исследовании эмоционального поведения крыс нами было показано, что грелин обладает модулирующим действием на эмоциональное и исследовательское поведение (Виноградов П.М. и др., 2015.) Ранее (Шабанов П.Д. и др., 2002; 2010) было показано, что нейропептиды КРГ, субстанция Р, орексин, алаптид и другие также способны модулировать данные формы поведения. При этом каждая пептидергическая система имеет свои особенности действия на эмоционально-мотивационную и когнитивную сферы (Asakawa A., et al., 2001; Шабанов П.Д., 2008; 2010). При исследовании поведения в тесте Порсолта этими исследователями было показано, что этанол обладает дерессантным действием, снижая время иммобилизации и увеличивая время плавания. В то же время в наших экспериментах антагонист грелина [D-Lys ]-GHRP-6 показал себя как

вещество сбалансированного действия, нормализуя поведение животных до уровня контрольной группы. Так, [D-Lys ]-GHRP-6 10 мкг в 20 мкл интраназально в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» не обладал выраженной анксиолитической активностью: время нахождения в светлом и темном рукавах, а также число свешиваний достоверно не менялось по сравнению с контрольной группой. Он существенно не влиял на коммуникативную активность крыс в тесте «чужак-резидент». В то же время грелин 20 мкг в 20 мкл интраназально, напротив, снижал коммуникативное поведения и проявления агрессии. Как сам грелин, так и его антагонист [D-

3

Lys ]-GHRP-6 снижали исследовательскую активность в тесте «открытое поле».

Это укладывается в современные представления о направленности действия грелина. В частности, грелин активирует преимущественно мотивационные аспекты потребления пищи, связанные с повышением аппетита, включая поведенческие реакции, которые предшествуют приему пищи. После введения грелина (и орексинов) системно или в желудочки мозга у грызунов увеличивается число подходов к кормушке, запасание пищи, ожидание пищевого подкрепления, пищевое предпочтение и пищевая мотивация (Dickson S.L. et al., 1993) В то же время прямых данных о влиянии грелина на эмоциональное поведение и исследовательское поведение при использовании стандартных тестов (открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт, плавательный тест отчаяния Порсолта, «чужак-резидент»), обычно используемых для оценки анксиолитического (транквилизирующего) действия препаратов, в доступной литературе не отмечено. Поэтому полученные нами данные об участии грелиновой системы в организацию и контроль эмоционального и исследовательского поведения открывает определенные перспективы для рассмотрения грелина и его аналогов в качестве возможных корректоров эмоционально-мотивационной и когнитивной сфер (Виноградов П.М. и др., 2015). Речь идет не только о пищевом поведении, где эффекты грелина описаны (грелин не только

инициирует прием пищи, но и повышает мотивационное поведение и достижение пищевого подкрепления), но и о регуляции внутривидового поведения (агрессия, коммуникативное поведение), исследовательского поведения, а также реакций на введение психотропных веществ (Виноградов П.М. и др., 2015).

Специальный раздел работы был посвящен использованию высокочувствительного иммуноферментного анализа для определения дезацил-грелина, стабильного продукта обмена грелина, в крови экспериментальных животных (крыс). Было подтверждено, что данный пептид выявляется во всех экспериментальных группах крыс (при длительной алкоголизации в течение 6 мес и ее отмене), как в крови, так и в структурах головного мозга. При длительной полунасильственной алкоголизации крыс в течение 6 мес выявлено достоверное снижение концентрации дезацил-грелина в миндалине с последующим повышением при 2- и 7-дневной отмене этанола. В гиппокампе отмечали тенденцию к снижению концентрации дезацил-грелина во всех экспериментальных группах. Статистически значимых различий при этом не было выявлено. В гипоталамусе отмечается резкое увеличение концентрации дезацил-грелина при 2-дневной отмене алкоголя по сравнению с контрольной группой, хронической алкоголизацией и 7-дневной отменой. Тенденции изменения концентрации грелина в структурах расширенной миндалине аналогичны изменениям в сыворотке, полученными в нашей лаборатории (Хохлов П.П. и др., 2014; Виноградов П.М. и др., 2015). В гиппокампе выявлена противоположная тенденция. Результаты показали, что дезацил-грелин при алкоголизации по-разному аккумулируются в различных структурах головного мозга. Динамика содержания дезацил-грелина в различных структурах головного мозга различна, она изменяется в ходе алкоголизации и последующей отмене алкоголя (Виноградов П.М. и др., 2015).

В настоящей работе обосновывается значимая роль грелиновой системы мозга в механизмах патологического влечения к алкоголю и возможность

использования антагонистов грелина в блокаде подкрепления при социальной изоляции животных (Виноградов П.М. и др., 2015). Поскольку грелин и его рецептор GHS-R1A могут регулировать потребление и поиск подкрепляющих агентов среды, то лечение пациентов с алкогольной зависимостью с помощью данных фармакологических средств может быть перспективным направлением в психофармакологии и биологической наркологии.

При исследовании эмоционального и исследовательского поведения у животных, выращенных в условиях стресса социальной изоляции, нами

3

показано, что антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-6 в «приподнятом крестообразном лабиринте» обладал незначительной анксиолитической активностью у животных, выращенных в условиях социальной изоляции: время нахождения в светлом и темном рукавах достоверно не менялось, но число свешиваний увеличивалось. Грелин, напротив, проявлял анксиогенный эффект, снижая время нахождения животных, выращенных в изоляции, в

светлом рукаве и снижая число свешиваний. В «открытом поле» антагонист

3

грелина [Э-ЬуБ ]-ОИЯР-6 10 мкг в 20 мкл интраназально снижал эмоционально-исследовательскую активность а грелин 20 мкг в 20 мкл,

наоборот, ее увеличивал (Виноградов П.М. и др., 2015). В тесте «чужак-

3

резидент» антагонист грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-6 снижал коммуникативную активность, а также и незначительно снижал проявление агрессии у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции. Грелин в этих условиях эксперимента проявил аналогичное действие, снижая коммуникативное поведение и проявления агрессии у животных, выращенных в изоляции.

Ряд исследователей считает, что для полноценного формирования мозга необходимы определенный уровень (как правило, оптимальный для даненого вида животных) и качество афферентных поступлений в раннем онтогенезе. Действительно, односторонняя обонятельная депривация (пересечение обонятельного нерва) во время постнатального развития приводит к значительным анатомическим и нейрохимическим изменениям в

депривированной обонятельной луковице. В частности, следствием депривации является резкое снижение содержания дофамина (ДА) и повышению чувствительности D2 ДА-ергических рецепторов в обонятельной луковице (Guthrie K.M. et al., 1991). Выращивание в условиях социальной изоляции может вызывать ряд типичных поведенческих фенорменов, обусловленных снижением активности центральных ДА-ергических механизмов (Jones et al., 1992). Крысы, выращенные в изоляции, демонстрируют набор форм поведения, которые, как правило, наблюдаются после введения агонистов ДА, например, амфетамина. Так, у них наблюдается спонтанная двигательная гиперактивность (Einon D.F., Sahakian B.J., 1979; Gentsch C. et al, 1988) и компоненты персеверативного поведения (Jones G.H. et al., 1992). На фоне введения d-амфетамина и апоморфина у животных-изолянтов усиливается стереотипные характеристики поведения (Einon D.F., Sahakian B.J., 1979; Chitkara B. et al., 1984), увеличивается самовведение психостимулирующих средств (Schenk S. et al., 1982), двигательная активность (Oehler J. et al., 1985). Эти данные означают повышение чувствительности к агонистам ДА амфетаминового типа и другим подкрепляющим стимулам у изолированных крыс (Jones G.H. et al., 1992).

В литературе имеются и другие данные, не совпадающие с данными, описанными выше. Изоляция, как правило, вызывает гиперчувствительность рецепторов ДА и норадреналина у мышей (Вальдман А.В., Пошивалов В.П., 1984). У крыс, выращенных в изоляции от сородичей, после разрушения системы ВОП (Лебедев А.А., 1986; Панченко Г.Н., Лебедев А.А., 1992) наблюдается изменение различных форм поведения. Повышение гиперактивности после введения нейротоксина 6-гидроксидофамина, наблюдаемое у крыс-изолянтов, но не у сгруппированных животных, видимо, объясняется тем, что выраженное истощение катехоламинов после повреждения нейротоксином провоцирует у крыс «синдром катехоламиновой гиперчувствительности», и эффекты изоляции и нейротоксического

воздействия потенцируются (Пошивалов В.П., 1986). Повышенная чувствительность ДА-зависимых форм поведения, описываемая как гиперсенситивность, по-видимому, во многом зависит от индивидуального опыта животных, причем эти формы поведения детерминируются мотивационными факторами (Jones G.H. et al., 1992; Виноградов П.М. и др., 2015). Выращивание животных в изоляции изменяет подкрепляющие свойства внутривенного самовведения кокаина, а также внутриструктурное самовведение d-амфетамина в прилежащее ядро (Phillips G.D. et al., 1994). Так, если у крыс, выращенных в условиях обычного общения с сородичами (в группе) введение антагонистов D1 и D2 рецепторов повышает самовведение кокаина, то у крыс, выращенных в изоляции, напротив, снижает. У крыс, выращенных в изоляции, наблюдается менее интенсивное самовведение d-амфетамина. Социальная депривация изменяет чувствительность не только ДА-ергической, но и норадренергической системы мозга. Так, выращивание приматов в изоляции снижает концентрацию норадреналина в спинномозговой жидкости. В то же время, у крыс-изолянтов в структурах лимбической системы определяется увеличение числа пресинаптических а2-адренорецепторов, приводящее к повышению функции этих рецепторов (Fulford A.J. et al., 1994). Найдето также, что у крыс в условиях длительной изоляции уменьшается концентрация серотонина в гиппокампе и фронтальной коре, но не прилегающем ядре (Jaffer E.H. et al., 1993).

Исследования показали, что при электрическом раздражении структур мезокортиколимбической системы у крыс, выращенных в изоляции, наблюдается повышение преимущественно негативных эффектов подкрепления (Лебедев А.А., 1986). В опытах на мышах было показано, что у особей с генным нокаутом грелиновых рецепторов GHSR социальная изоляция происходит интенсивнее и быстрее. Воздействие грелина на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему (ГГНС) - это, по-видимому, один из физиологических механизмов, по которому грелин

помогает животным адекватно реагировать на стрессовые ситуации (Chuang J.C. et al., 2011).

В заключение этого раздела необходимо отметить, что нейрофармакологический анализ роли нейрохимических систем мозга как инструмент изучения функций мозга является весьма актуальным и важным средством анализа подкрепляющих механизмов мозга. В то же время онтогенетический аспект развития подкрепляющих систем мозга изучен недостаточно и требует дальнейших исследований. Вопрос влияния внешней среды на формирование эмоциональных механизмов мозга, особенно при дефиците биологически важных воздействий, представляется одним из ключевых в понимании основных принципов развития, самоорганизации мозга и повышения ее надежности функционирования, что и обусловило направление данной работы, то есть изучение мозгового и нейрохимического субстрата эмоций у животных с различным индивидуальным опытом.

Исследование с помощью УРПМ позволило изучить участие грелина и его антагонистов в реализации механизмов условного подкрепления. В основе указанного механизма, как было показано рядом систематических исследований, лежит активация мезокортиколимбической системы мозга и системы расширенной миндалины, определяемые функционированием системы активности рецепторов ДА, КРГ, норадреналина и серотонина при активации тормозного ГАМК-ергического контроля и модулирующем влиянии на него опиоидной системы мозга (Панченко Г.Н. и др., 1992; Panchenko G.N. et al., 1998; Шабанов П.Д. и др., 2015). Эти результаты указывают на существование гетерохимического лимбико-диэнцефального контроля системы положительного подкрепления при безусловной определяющей роли мезокортиколимбической системы мозга и, особенно, системы расширенной миндалины, которую ты также изучали (Виноградов П.М. и др., 2015). В то же время, социальная изоляция в онтогенезе приводит к выраженным структурно-функциональным и нейрохимическим перестройкам указанного жестко детерминированного механизма эмоций,

которые имеют преимущественно (!) ДА-ергическую природу. Как отмечают П.Д.Шабанов и А.А.Лебедев (2014), в основе указанных перестроек лежит определенный дисбаланс пре- и постсинаптических элементов мезокортиколимбической системы, проявляющийся, в частности, повышением чувствительности D2 рецепторов ДА. Безусловно, ДА-ергическая система положительного подкрепления является определяющим фактором в формировании и саморазвитии центральных механизмов подкрепляющей функции мозга в онтогенезе, она определяет гедонистическую функцию мозга и в первую очередь реагирует на ограничение социальной и сенсорной афферентации в онтогенезе. Норадренергическая, серотонинергическая и ГАМК-ергическая системы мозга, считают П.Д.Шабанов и А.А.Лебедев (2004, 2014), скорее модулируют развитие ДА-ергических механизмов внутримозгового подкрепления и в меньшей степени оказывают самостоятельное действие на указанные механизмы, особенно при ограничении индивидуального опыта в онтогенезе. По-видимому, полноценный индивидуальный опыт, социальные контакты, иноое воздействие разных по спектру биологически значимых раздражителей до времени полового созревания стимулируют не только развитие адаптивных функций мозга, но и гибкость процессов функциональной реорганизации нейронных систем, направленных на сравнительно быструю компенсацию раннего постнатального периода. Мозг таких животных, характеризующийся в первую очередь гиперчувствительностью к патогенным воздействиям и дисбалансом систем подкрепления (Вартанян Г.А., Петров Е.С., 1989), оказывается неспособным или, по крайней мере, малоспособным компенсировать «выпадение» из саморазвивающейся мезокортиколимбической системы определенных значимых звеньев, что позволило в определенной мере выявить их роль в регуляции эмоционального поведения, в частности, не только медиаторных, но и пептидных механизмов.

В настоящей работе определена роль системы грелина в механизме эмоционального поведения не только после стресса социальной изоляции, но и у животных с посттравматическим стрессовым расстройством (ПТСР). ПТСР моделировали экспозицией группы крыс с питоном, в течение которой он удушал и заглатывал одну из крыс. Это запускало механизм острого психогенного стресса, которое со временем (обычно в течение недели и более) не только не проходило, но и усиливалось. Именно поэтому мы рассматриваем данную модель как модель ПТСР у крыс (Цикунов С.Г. и др., 2014).

У крыс курсовое интраназальное введение антагониста грелина

з

[D-Lys ]-GHRP-6 10 мкг в 20 мкл интраназально в течение 7 дней после экспозиции крыс с питоном в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» вызывало анксиогенный эффект: время нахождения в светлом рукаве по сравнению с другими группами снижалось. Грелин 20 мкг в 20 мкл интраназально, напротив, проявлял анксиолитический эффект, при этом время нахождения крыс в светлом рукаве доходило до значений контрольных групп, растормаживалась локомоторная активность животных. В «открытом поле» значимого влияния на поведение стрессированных крыс ни антагонист

3

грелина [D-Lys ]-GHRP-6, ни грелин не оказывали. В тесте «чужак-резидент» у стрессированных животных антагонист грелина [D-Lys ]-GHRP-6, как и сам грелин, снижал коммуникативную активность по сравнению с контрольными группами. Грелин также растормаживал проявление агрессии у стрессированных крыс.

Полученные нами результаты в целом согласуется с данными литературы. Показано, что грелин связан с системой КРГ в головном мозге. Исследования показали ключевую роль грелина в физиологической реакции мозга на стресс, поскольку одна из возможных мишеней грелина в стрессорной реакции - это КРГ-продуцирующие нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса (Patterson Z.R. et al., 2010). В частности, был описан механизм, по которому грелин активирует

кортиколибериновые нейроны у мышей. Периферическое или внутрижелудочковое введение грелина значительно активировало c-fos-маркер клеточной активации в КРГ-продуцирующих нейронах. Кроме того, грелин повышал экспрессию гена КРГ в паравентрикулярном ядре гипоталамуса (Cabrai A. et al., 2012). Существует мнение о родстве между грелином и кортиколиберином, поскольку грелиновые рецепторы были найдены в паравентрикулярном ядре - основном источнике кортиколиберина и в ядре Вестфаля-Эдингера (Якубовича) - место экспрессии урокортина (Yolanda Diz-Chaves, 2011).

Грелин плазмы повышался в ответ на стресс, вызванный острой или хронической нехваткой калорий в пище (Perello M. et al., 2011). Грелин также повышался в ответ на разные формы острого и хронического психологического стресса (Asakawa A. et al., 2001). Нокаутные мыши по гену GHSR были не способны в той же степени реагировать на стресс, как интактные животные (Lutter M., et al., 2008; Patterson Z.R. et al., 2010). Возможный механизм взаимодействия грелиновой и кортиколибериновой систем может включать активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), которая является одной из точек приложения грелина в мозге (Wren A.M. et al., 2002; Mozid A.M. et al., 2003; Smith S.M. et al., 2006). Грелин стимулирует экспрессию мРНК КРГ в гипоталамусе и повышает уровень АКТГ и глюкокортикоидов в плазме у грызунов (Wren A.M. et al., 2002; Stevanovic D. et al., 2007). Исследования показали, что периферическое и центральное введение грелина активирует кортиколибериновые нейроны и, как следствие, ГГНС (Cabral A. et al., 2012). Активация ГГНС - это возможный механизм, через который грелин регулирует некоторые физиологические процессы. Активация этой системы может быть важна, когда грелин играет роль защиты против депрессивных симптомов при хроническом стрессе (Tung Y.L. et al., 2004). В опытах на мышах было показано, что у особей с генным нокаутом рецепторов GHSR социальная изоляция происходила быстрее. Грелиновое воздействие на

ГГНС может также рассматриваться как физиологический механизм, по которому грелин помогает животным адекватно реагировать на стрессовые ситуации (Chuang J.C. et al., 2011). Более того, центральное введение грелина вызывает гипертрофию и пролиферацию кортикотропных клеток (Wren A.M. et al., 2002). Таким образом, возможная роль центрально-образованного грелина - это модуляция КРГ-продуцирующих нейронов (Cabral A. et al al., 2012).

ВЫВОДЫ

1. Интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-б блокирует экспрессию условной реакции предпочтения места этанола и возобновление реакции после ее угашения у хронически алкоголизированных в течение 6 месяцев крыс. У таких животных однократное введение этанола в дозах от 0,5 до 1,5 г/кг может обладать как подкрепляющими, так и аверсивными свойствами.

2. Грелин, вводимый интраназально хронически алкоголизированным крысам, провоцирует агрессию, снижение коммуникативного поведения и исследовательской активности. Напротив, антагонист рецепторов грелина [О-

у таких животных обладает мягким анксиолитическим и балансирующим поведение действием. Без алкоголизации обладает анксиогенным действием и вызывает повышение коммуникативной активности.

3. Динамика содержания дезацил-грелина отличается в различных структурах головного мозга и меняется в ходе алкоголизации и последующей отмены алкоголя. В миндалине и гиппокампе при алкоголизации концентрация дезацил-грелина в разной степени снижается с последующим повышением в период отмены этанола. В гипоталамусе уровень дезацил-грелина меняется (возрастает) только в период отмены этанола.

4. Интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОИЯР-б крысам, выращенным в условиях социальной изоляции, блокирует экспрессию и возобновление условной реакции предпочтения места этанола, что подтверждает участие системы грелина в регуляции положительного подкрепления, активируемого этанолом.

5. Интраназальное введение грелина у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции, вызывает типичный анксиогенный эффект, повышение исследовательской активности, проявления агрессии и снижение коммуникативного поведения. Антагонист рецепторов грелина [Э-ЬуБ ]-ОИЯР-б в этих условиях проявляет анксиолитическое действие, снижает

исследовательскую активность, коммуникативное поведение и проявления агрессии.

6. В отличие от хронической алкоголизации и социальной изоляции, у крыс, переживших острый витальный стресс от взаимодействия с хищником (питоном) грелин при курсовом (в течение 7 дней) интраназальном введении оказывает типичное анксиолитическое действие, не влияя на агрессию. В этих условиях аантагонист рецепторов грелина [О-ЬуБ ]-ОИКР-6, напротив, вызывает у крыс анксиогенный эффект с увеличением локомоторной активности. Таким образом, при формировании посттравматического стрессорного расстройства в грелиновой системе происходит инверсия эмоциогенных эффектов.

На основании доказательств участия системы грелина в механизмах регуляции положительного подкрепления, активируемого этанолом, целесообразен поиск противоалкогольных и анксиолитических средств среди антагонистов грелина.

Эффекты агонистов и антагонистов грелина могут инвертироваться при разных патологических состояниях. Примером может служить инверсия эмоциогенных эффектов (с анксиолитического на анксиогенный) антагониста

Л

рецепторов грелина при формировании

посттравматического стрессорного расстройства.

В экспериментальных и клинических условиях необходимо учитывать возможность активации/угнетения системы грелина с помощью интраназального введения препаратов.

1. Вальдман, А.В. Фармакологическая регуляция внутривидового поведения / А.В. Вальдман, В.П. Пошивалов. - Л.: Медицина, 1984. - 208 с.

2. Вартанян, Г.А. Эмоции и поведение / Г.А. Вартанян, Е.С. Петров. -Л.: Наука, 1989. - 147 с.