Фармакологические эффекты регуляторных пептидов при токсических поражениях печени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Чуланова Анна Александровна

• Чуланова Анна Александровна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Чуланова Анна Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фармакологические эффекты пептидных препаратов

1.1.1 Пептидные иммуномодуляторы и их эффекты

1.1.2 Влияние регуляторного пептида ОИК на функции организма

1.2 Токсические поражения печени, механизмы их развития и иммунитет... 19 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Экспериментальные исследования

2.2 Выбранные для исследования препараты, способы их применения

2.3 Экспериментальные модели поражения печени

2.4 Оценка регенерации гепатоцитов

2.5 Определение выраженности свободно-радикальных реакций и антиоксидантных эффектов пептидов в плазме крови и гомогенате печени

2.6 Определение биохимических показателей функциональной активности гепатоцитов

2.7 Оценка активности фагоцитоза нейтрофилов и их кислородзависимых механизмов

2.8 Статистическая обработка материала

2.9 Основные разделы исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Влияние тимогена и его новых, модифицированных D-аланином аналогов на репаративные, антиоксидантные и иммунотропные эффекты

при поражениии печени тетрахлорметаном

3.2 Эффекты тимогена и его новых, модифицированных D-аланином аналогов, при поражениии печени гидразином

3.3 Влияние повышенных доз тимогена и его новых, модифицированных Б-аланином аналогов при поражениии печени гидразином

3.4 Эффекты совместного примененния тимогена и его новых, модифицированных D-аланином аналогов с гепатотропным пептидом

ОИК при поражениии печени гидразином

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакологические эффекты регуляторных пептидов при токсических поражениях печени»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Успехи химического синтеза и сформировавшиеся представления о механизмах действия регуляторных пептидов позволяют создавать на их основе новые лекарственные средства. Для них характерна достаточно высокая биологическая активность при небольших дозах, а также отсутствие токсических и аллергических побочных эффектов [57]. Однако лекарственные средства пептидной природы обладают низкой устойчивостью к действию протеолитических ферментов, что ограничивает их эффективность и, как следствие, широкое применение. При этом известно, что включение Б-аминокислот в структуру пептидной молекулы может повышать ее устойчивость к протеолизу [94, 117, 134]. Этот способ защиты подтверждается более чем 30-летним использованием препарата даларгин в клинической практике, где Б-аланин был включен для стабилизации молекулы и защиты от протеолиза [5].

Важной медико-социальной проблемой современного общества являются заболевания печения, которые достаточно часто встречаются в клинической практике [4, 6, 87]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) существенно повысился за последние 20 лет наблюдается рост заболеваний печени различной этиологии [3]. В России смертность, связанная с этими заболеваниями, занимает ведущее место в структуре гастроэнтерологической смертности [59]. Показательно, что заболевания печени поражают в основном людей трудоспособного возраста [42, 113]. Данное обстоятельство обуславливает необходимость разработки новых эффективных гепатопротекторных средств.

Особенностью пептидных препаратов является то, что они распадаются до обычных аминокислот [47], не оказывающих токсического действия на клетки печени, так как не являются ксенобиотиками. Это представляется особенно важным при патологии печени, когда дополнительная нагрузка на нее, сказывается на функциональной активности этого органа. Поэтому пептидные препараты могут представлять особую значимость при таких заболеваниях. Учитывая тот факт, что иммунная система участвует в восстановлении

пораженных органов [63, 91, 114] было бы целесообразно использовать их для активации репарации и пораженной печени.

В настоящее время в клинической практике применяется препарат «Тимоген», который является активной частью тималина и чья последовательность была установлена благодаря многолетним исследованиям Российских ученых [57, 77]. Он представляет собой дипептид (глутамил-триптофан), отнесен к фармакологической группе иммуномодуляторов и также рекомендован для комплексного лечения заболеваний печени [10, 21, 39].

При воспалительных заболеваниях наблюдается выход протеаз из зоны воспаления [11, 43], что может ослабить эффекты тимогена, за счет его инактивации. Поэтому в настоящее время активно разрабатываются способы защиты от инактивации пептидов. Так препарат "Семакс" - фрагмент АГТГ 4-7 был дополнен защитной группой Pro-Gly-Pro [49]. Также известно защитное действие Б-аминокислот от протеолиза пептидов [94, 117]. Этот способ защиты подтверждается более чем 30-летним использованием препарата даларгин в клинической практике, где Б-аланин был включен для стабилизации молекулы и защиты от протеолиза [5]. В связи с этим представляется актуальным оценить эффекты структурно модифицированных аналогов тимогена Б-аланином (Б-А1а) с К- или С-конца его молекулы при экспериментальных моделях поражения печени.

В то же время значительный интерес представляют вопросы потенцирования или ослабления эффектов регуляторных пептидов [55,57], в связи с чем также целесообразно изучение эффектов комбинированного введения пептидных субстанций, особенно таких высокоактивных молекул как тимоген и трипептид глицил-гистидил-лизин (ОИК) (фактор роста клеток печени). Целесообразно также выявить гепатотропные эффекты и комбинированного применения ОИК с новыми аналогами тимогена.

Все изложенные факты обусловили выбор пептидов, а изучение их иммунотропного и антиоксидантного действия и сопряженного с этим восстановительных процессов в печени представляется актуальным как с позиций

дальнейшего исследования их механизмов действия, так и с целью поиска и доклинической апробации новых гепатотропных препаратов.

Степень разработанности темы исследования. В доступной литературе отсутствует сравнительная оценка репаративных, иммунотропных и антиоксидантных эффектов тимогена при поражениях печени, отличающихся разным уровнем иммунной реактивности. Что касается новых аналогов тимогена, синтезированных с включением Б-аланина с С- или К-конца пептида, то никаких известных данных по их эффектам в литературе как отечественной, так и зарубежной не описано. Поэтому все выявленные эффекты этих молекул являются новыми. Кроме того, вопросы потенцирования или ослабления эффектов регуляторных пептидов остаются малоизученной областью научных исследований, а эффекты комбинированного введения новых аналогов тимогена, модифицированных Б-аланином с известным гепатотропным пептидом глицил -гистидил - лизин (ОИК) при поражениях печени совсем неизвестны.

Цель исследований - выявление гепатотропных, антиоксидантных и иммунотропных эффектов тимогена, его модифицированных Б-аланином аналогов, а также их комбинаций с пептидом ОИК при токсических поражениях печени.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности влияния тимогена, его модифицированных Б-аланином аналогов на показатели репаративной регенерации печени, активности свободно-радикальных реакций и иммунной функции в условиях гепатопатии, вызванной тетрахлорметаном.

2. Установить особенности влияния тимогена, его модифицированных Б-аланином аналогов на показатели репаративной регенерации печени, активности свободно-радикальных реакций и иммунной функции в условиях гепатопатии, вызванной гидразином.

3. Выяснить наиболее целесообразную область разовых доз для применения тимогена и его новых аналогов, модифицированных Б-аланином, при токсическом поражении печени.

4. Выявить эффекты комбинированного введения тимогена и его модифицированных Б-аланином аналогов с гепатотропным пептидом ОИК при токсическом поражении печени.

5. Провести сравнительную оценку фармакологической эффективности тимогена, его модифицированных Б-аланином аналогов, а также их комбинаций с пептидом ОИК и выбрать наиболее активные в условиях экспериментальных гепатопатий.

Научная новизна. Установлены репаративные, иммунотропные, а также антиоксидантные эффекты тимогена и его модифицированных Б-аланином аналогов при токсических поражениях печени, отличающихся разным уровнем иммунной реактивности. Показано иммуностимулирующее действие тимогена как в моделях, сопровождающихся повышением иммунной функции (отравление ТХМ), так и при снижении иммунитета (отравление гидразином).

Установлено иммуномодулирующее действие модифицированных Б-аланином аналогов тимогена в отношении активности нейтрофилов крови при токсических поражениях печени как со снижением иммунной функции (отравление гидразином), так и с повышением (отравление ТХМ). Выявлено гепатопротекторное действие тимогена и его модифицированных Б-аланином аналогов в условиях отравления гидразином (экспериментальная модель со сниженной иммунной функцией), а также этих же пептидов при отравлении ТХМ (экспериментальная модель с повышением иммунной реактивности), если пептиды вводились одновременно с ТХМ. Установлено, что при использовании препаратов до и одновременно с введением ТХМ эффекты препаратов снижались. Установлена более выраженная активность новых модифицированных Б-аланином аналогов тимогена по сравнению с изначальной молекулой (тимогеном) в отношении репаративной и антиоксидантной активностей. Показана более выраженная гепатозащитная активность пептида П2 (И2К-Ь-О1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООИ) по сравнению с тимогеном и пептидом П1 (ШК-Б-А1а-Ь-О1и-Ь-Тгр-СООИ) при поражениях печени тетрахлорметаном и гидразином.

Выявлено синергичное действие тимогена и его аналогов при сочетанном введении парных комбинаций этих молекул с гепатотропным пептидом GHK в эквимолярных дозах при отравлении гидразином, особенно в отношении репаративной и антиоксидантной активностей.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведены доклинические испытания двух новых фармакологических субстанций - аналогов тимогена модифицированных Б-аланином с разных концов его молекулы при двух экспериментальных моделях токсических поражений печени. Показана перспективность применения тимогена и его новых аналогов, модифицированных Б-аланином при токсических поражениях печени, со сниженной иммунной функцией (поражение гидразином). Установлено, что при поражениях печени, сопровождающихся повышением иммунной функции (отравление ТХМ) применение тимогена следует осуществлять с осторожностью, не используя его до начала патологического процесса. Подобрана наиболее подходящая курсовая схема введения пептидов - пятидневная одновременно и после поражения печени. Определена наиболее целесообразная область разовых доз применения пептидов как тимогена (1 и 10 мкг/кг) так и его новых аналогов, модифицированных Б-аланином (1,2 и 12 мкг/кг). Выявлено, что превышение разовой дозировки пептидов - тимогена (до 100 мкг/кг), а его аналогов в эквимолярной дозе до (120 мкг/кг) не ухудшают морфолого - гистологические показатели печени. Показана возможность усиления гепатопротекторного эффекта путем одновременного использования тимогена (1 мкг/кг) или его новых модифицированных Б-аланином аналогов (1,2 мкг/кг) с гепатотропным пептидом ОИК (1 мкг/кг). При сравнении гепатозащитной активности у тимогена и его новых аналогов были выявлены более выраженные гепатопротекторные эффекты у пептида П2 (ШК-Ь-О1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООИ).

Выявленные особенности действия тимогена в зависимости от уровня иммунной реактивности могут быть учтены при его клиническом применении.

На разработанные новые субстанции (модифицированные Б-аланином аналоги тимогена) получены патенты на изобретения.

Методология и методы исследования. Методологической составляющей диссертационного исследования стали труды отечественных и зарубежных ученых (Хавинсон В.Х., Жуков В.В., Дейгин В.И., Коротков А.М., 1988; Бобынцев И.И., 2014; Смахтин М.Ю., 2014; РюкаП Ь., 2012).

В диссертационной работе использованы биохимические, иммунологические, гистологические, а также основные правила работы с экспериментальными животными при доклинических исследованиях фармакологических препаратов.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, тематикой проблемной комиссии «Фармакология, клиническая фармакология» (номер государственной регистрации АААА-А19-119020590116-1 дата регистрации 5 февраля 2019 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Тимоген и его модифицированные Б-аланином аналоги с введением этой аминокилоты с К- или С-концов молекулы тимогена обладают гепатопротекторной и репаративной активностями при токсических поражениях печени при пятидневном курсовом введении одновременно и после начала поражения.

2. Модифицированные Б-аланином аналоги тимогена обладают более выраженной репаративной и антиоксидантной активностями по сравнению с изначальной молекулой (тимогеном) с наиболее выраженной гепатозащитной активностью у пептида П2 (ШК-Ь-О1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООИ).

3. Модифицированные Б-аланином аналоги тимогена обладают иммуномодулирующим действием в отношении активности нейтрофилов крови при токсических поражениях печени с разным уровнем иммунной реактивности.

4. Гепатопротекторный эффект может быть усилен путем одновременного использования парных сочетаний тимогена или его новых модифицированных Б-аланином аналогов с гепатотропным пептидом ОИК.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебно-методическую и научно-

исследовательскую деятельность кафедры фармакологии и клинической фармакологии и НИИ Фармакологии живых систем ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и в учебный процесс кафедры биологической химии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, что подтверждается соответствующими актами внедрения.

Степень достоверности и апробация результатов. Научные положения и выводы диссертационного исследования основаны на анализе экспериментального материала, полученного при проведении опытов с использованием современных биохимических, гистологических и иммунологических методов. Статистическая обработка осуществлялась с применением комплекса учетно-оценочных и аналитических показателей, адекватных математических методов и ЭВМ, что определяет достоверность полученных результатов.

Основные положения диссертации представлены на восьмой международной дистанционной научной конференции, посвященной 82-летию Курского государственного медицинского университета «Инновации в медицине» (Курск, 5 декабря 2018); международной научной конференции, посвященной 83-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2 февраля 2018); международной научной конференции, посвященной 85-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 7 февраля 2020); международной научно-практической конференции, посвященной 30-летнему юбилею Медицинского института ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет» «Современная медицина: новые подходы и актуальные исследования» (Грозный, 22 октября 2020); IV Всероссийской дистанционной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию Курского государственного медицинского университета и 75-летию Победы в Великой Отечественной войне 1941-1945 гг. «Фармакология разных стран» (Курск, 29-30 сентября 2020); международной научно-практической конференции «Медицинская наука в эру цифровой трансформации»

(Курск, 10 декабря 2021); международной научной конференции, посвященной 87-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 4 февраля 2022); I Международной научно-практической электронной онлайн-конференции, посвященной 90-летию со дня рождения профессора Л.Г. Прокопенко «Прокопенковские чтения» (Курск, 24 мая 2022); 87-й Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 20-21 апреля 2022); 88-й Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 20-21 апреля 2023); VI Международной научно-практической конференции, посвященной 89-летию Курского государственного медицинского университета и Году педагога и наставника «Фармакология разных стран» (Курск, 25-26 октября 2023); 2-й Всероссийской научной конференции молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.А. Никулина и 80-летию Рязанского государственного медицинского университета им. Академика И.П. Павлова «Достижения современной фармакологической науки» (Рязань, 28-29 сентября 2023); международной научной конференции, посвященной 89-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 8-9 февраля 2024); II международной научно-практической конференции, посвященной памяти Л.Г. Прокопенко «Прокопенковские чтения 2024» (Курск, 21 марта 2024).

Личный вклад автора. Автором составлен план и дизайн исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, лично проводилось моделирование повреждений печени, забор крови и печени. Автором проводилось определение показателей перекисного окисления и антиоксидантной защиты, биохимических показателей, функции нейтрофилов крови, анализировались репаративные процессы в печени. Диссертантом самостоятельно выполнялись анализ и обобщение результатов, составление таблиц, написание диссертации, сопоставление с литературными данными.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ в центральной и местной печати, в том числе 7 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, среди них три работы в изданиях, индексируемых в международных базах данных, и два патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 29 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы, включающего 65 отечественных и 70 иностранных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Фармакологические эффекты пептидных препаратов

1.1.1 Пептидные иммуномодуляторы и их эффекты

Иммуномодуляторами или иммунокорректорами считаются фармакологические средства, которые восстанавливают нормальное состояние иммунной функции [96]. Иммуномодуляторы могут быть микробного происхождения, выделенные из тимуса или костного мозга. Также известны цитокины и иммуномодуляторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Есть ряд химически синтезированных препаратов [58].

Из бактериальных стенок был выделен мурамилпептид, который затем синтезировали. Он содержит дисахарид - глюкозаминилмурамила, с которым связан дипептид Ь-аланил-О-изоглутамин [36]. Этот препарат назвали «Полиоксидоний». Эффектами его являются - активация фагоцитоза, пролиферации лимфоцитов и антителообразования [36].

Препарат миелопид состоит из миелопептидов, выделенных из костного мозга [24]. Разные миелопептиды могут иметь и разные эффекты. Они активируют Т-хелпера, снижают деление клеток опухолей, стимулируют фагоцитоз лейкоцитов. Противоопухолевым действием обладает бивален [58], серамил же имеет антибактериальный эффект [28].

Цитокины, которые представляют собой небольшие пептиды, регулируют иммунный ответ [21, 57]. Они могут иметь естественное происхождение или рекомбинантное. Суперлимф, а также лейкинферон относятся к первой группе. Ронколейкин, а также бета-лейкин и лейкомакс были получены рекомбинантным путем.

Синтетические олигопептиды также могут оказывать иммуномодулирующее действие. Это - гепон и глутоксим, а также аллоферон.

Препарат гепон назначают при иммунодефицитах и лечении некоторых инфекций. Этот пептид содержит 14 аминокислот в своем составе [34].

Пептид, содержащий глутаминовую кислоту, цистеин и глицин называется глутоксим и показан при профилактике гнойных осложнений, иммунодефицитах, гепатитах B и C [50].

Аллофероны представляют собой пептиды, полученные от насекомых, и могут применяться для коррекции иммунитета. Эффектами их считается-активация синтеза интерферонов. Они также активируют естественные киллеры; что сопровождается уничтожением дефектных клеток. Эти пептиды могут применяться при гепатитах, герпесе и папилломавирусной инфекции [60].

Интерфероны, а также их индукторы обладают противовирусным действием. Кроме того они способны активировать лимфоциты и иммунную функцию [32, 118].

Иммунокорригирующим действием обладают молекулы, выделенные из тимуса и костного мозга [10]. Сначала тимозин, а затем Т-активин имеют тимическое происхождение. Но недостатком их является то, что они являются смесями пептидов [64].

Более перспективными являются их аналоги синтезированные искусственно, например иммунофан. Он состоит из шести аминокислот и оказывает не только иммунорегуляторное действие, но и антиоксидантное, с чем видимо связано проявление гепатопротекторных эффектов [8].

Препарат вилон, считающийся пептидным иммуномодулятором, состоит из лизина и глутаминовой кислоты (Lys-Glu) также синтезирован искусственно [13].

Широко применяется в клинической практике иммуномодулятор тимоген, который является активной частью тималина и чья последовательность была установлена благодаря многолетним исследованиям Российских ученых [10, 24, 57]. В настоящее время тимоген (L-Glu-LTrp), входящий по данным РЛС в фармакологическую группу иммуномодуляторов производится компанией "Цитомед" (Россия) и также рекомендован для лечения заболеваний печени [ 10, 21,39].

Тимоген накапливается в лимфоузлах и печени, а также тимусе и селезенке. Кроме этого он обнаруживается в надпочечниках и почках. Время полужизни

тимогена составляет примерно около часа. Он инактивируется путем протеолиза и поэтому его выделение с почками и желчью практически минимальна. Он распадается до составляющих его аминокислот, то есть на глутаминовую кислоту и триптофан [10].

При этом одним из способов повышения устойчивости пептидов к протеазной деградации является включение в аминокислотную последовательность Б-аминокислот [5, 86, 94, 132]. В частности, в ряде работ использовалась аминокислота Б-А1а [5, 49].

В связи с этим представляется актуальным разработка новых структурно модифицированных Б-аланином аналогов. Причем активную часть молекулы лучше не подвергать структурным изменениям. Это может привести к ослаблению, исчезновению или даже к изменению направленности эффектов молекулы. Даже изменение тех же аминокислот в их молекулах с Ь-изомера на Б-изомер часто приводит к изменению направленности эффектов в противоположную сторону или их полное нивелирование [64,65].Так тимоген, содержащий Ь-О1и и Ь-Тгр, считается иммуномодулятором,а препарат тимодепрессин, содержащий те же аминокислоты, но в Б-конфигурации, проявляет противоположные - иммуносупрессирующие эффекты [19, 39].

Этот факт связан с тем, что регуляторные пептиды представляют собой особый класс сигнальных молекул, структурное сходство которых не является основанием для сходства их биологических эффектов. Замена аминокислот в их молекулах с Ь-изомера на Б-изомер часто приводит к изменению направленности эффектов в противоположную сторону или их полное нивелирование [64, 65]. Особенно данные закономерности характерны для коротких пептидов [64].

В связи с этим, учитывая многочисленные данные исследований биологических эффектов регуляторных пептидов, при таких модификациях их молекул, как изменение Ь-аминокислот на их Б-изомеры, заранее невозможно предполагать, как изменятся их эффекты в сравнении с исходной молекулой. Напротив, в данном случае, можно предполагать проявление новых самых различных биологических эффектов. Поэтому для сохранения

иммуномодулирующих свойств тимогена присоединение Б аланина желательно проводить с концов первичной молекулы. Структурные свойства тимогена и Б-А1а позволяют выполнить такую модификацию пептида [49].

Тимоген обладает регуляторным влиянием на секрецию цитокинов таких как ИЛ-1а и ИЛ-8, а также ФНОа. [50]. Пептид способен повышать цитотоксическую активность при ослаблении иммунитета [98]. Тимоген оказывает геропротективное действие [55, 56, 74, 96] и способен ослаблять канцерогенез [1, 119]. Имеются сведения о противовоспалительных эффектах тимогена [10], его антидепрессивных эффектах [62].

Применяется тимоген и при инфекционных заболеваниях в составе комплексного лечения [131]. Известны факты его применения и при заболеваниях легких [10]. Он включен в рекомендации по борьбе с осложнениями, связанными с СОУГО-19 [41].

Известен эффект тимогена на активацию фибринолиза и снижению активности свертывания крови [10]. Есть целая группа гастроэнтерологических заболеваний, где были показаны положительные эффекты тимогена в составе комплексной терапии [116, 130].

Показано антиоксидантное действие препарата [31], его противоишемические эффекты [29, 115, 124]. Кроме того, у больных с диагнозом ишемической болезни сердца при использовании этого дипептида наблюдалось восстановление показателей иммунитета [10]. Показаны положительные эффекты, а именно ускорение рубцевания и эпителизации при кожных заболеваниях и травмах [10]. Установлено радиопротективное действие тимогена [10, 119].

Показано протективное действие тимогена в условиях дистрофии гепатоцитов [104]. В настоящее время для клинического применения он использовуется в комплексной терапии гепатитов [10, 39]. В значительной степени гепатопротекторное действие тимогена осуществляется за счет регулирующего воздействия на состояние иммунитета. Так было показано на модели частичной гепатэктомии, что введение тимогена стимулирует восстановление печени и взаимосвязано с его корригирующим влиянием на

иммунную функцию [46].

Однако применение тимогена при хронических заболеваниях печени с повышенной иммунной реактивностью и уровнем иммуноглобулинов в крови часто приводило к обострению патологии [21]. Поэтому применение иммуномодуляторов при поражении печени не всегда однозначно и требует проведения дальнейших исследований.

Таким образом, иммуноактивные фармакологические препараты пептидной природы, применяются в лечении не только инфекционных заболеваний, когда чаще всего страдают легкие, но и в комплексной терапии других пораженных органов.

1.1.2 Влияние регуляторного пептида СИК на функции организма

Сейчас известна группа пептидов способная оказывать непосредственное влияние на процессы регенерации тканей [80, 88, 89]. Это так называемые матричные пептиды. Трипептид ОНК с формулой КН2-01у-Ь-Н1Б-Ь-Ьув-С00Н относится к этой группе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чуланова Анна Александровна, 2024 год

/ * I I

С пгцм

Рисунок 6 - Микрофотография паренхимы печени в экспериментальной группе с

интоксикацией ТХМ. Ув.х100. Окр. Г+Э

При морфометрии срезов печени было установлено снижение митотического индекса (МИ) и площади ядер гепатоцитов (ПЯГ) в группе животных отравленных ТХМ (таблица 3). Эти данные проказывают ослабление регенерации гепатоцитов в этих условиях. По индексу двуядерных гепатоцитов (ИДГ) изменений в этой группе выявлено не было. При введении тимогена стимулирующего эффекта также выявлено не было. При этом в группах, получавших пептиды П1 и П2, наблюдалось повышение МИ в 6,3 и 7,5 раза по сравнению контрольными отравленными животными, восстанавливалась площадь ядер гепатоцитов до уровня контроля без отравления. Также оба пептида П1 и П2 незначительно повышали индекс двуядерных гепатоцитов, которые считаются резервом регенерации [13].

Таким образом, при этой схеме введения наблюдается стимуляция репаративной регенерации гепатоцитов при использовании двух аналогов тимогена, в отличие от изначальной молекулы.

При изучении уровня МДА в крови и гомогенате печени были получены не однонаправленные результаты в этих условиях 10-дневного введения пептидов по схеме - до и одновременно с ТХМ (таблица 4).

Таблица 3 - Гепатотропная активность (М±ш) тимогена и его аналогов (10 дней введения) в условиях отравления ТХМ

Группы животных МИ, митотический индекс (%о) ИДГ, индекс двуядерных гепатоцитов (%), ПЯГ, площадь ядер гепатоцитов, мкм2

1. Животные без отравления (введение масла и изотонического раствора (КаС1)) (п = 8) 2,9±0,2 11,2±0,2 40,1±0,2

Отравление ТХМ + введение пептидов 10 дней (до и одновременно с ТХМ)

2. Контроль (КаС1) введение изотонического раствора (п = 8) 2,4±0,10 11,4±0,3 38,7±0,40 1

3. Тимоген (п = 9) 2,7±0,1*2 10,4±0,3*12 38,3±0,30 1

4. П1 ШК-Б-Ак-Ь-аи-Ь-Тгр-СООН (п = 9) 15,1±0,2о* 123 12,3±0,4о*1'2'3 39,7±0,2*1'2'3

5. П2 ШК-Ь-аи-Ь-Тгр-Б-Ак-СООН (п = 9) 17,9±0,2о*1'2'3'4 12,8±0,3о*1-2'3 39,7±0,3*2'3

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных; цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Таблица 4 - Влияние пептидов (10 дней введения) на концентрацию МДА (M±m)

в условиях отравления тетрахлорметаном (ТХМ)

№ п/п Группы животных МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в гомогенате печени

1. Без отравления (NaCl) (n=8) 4,3±0,4 3,6±0,4

Отравление ТХМ + введение пептидов 10 дней (до и одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl) (n=8) 6,4±0,6 о1 7,3±0,8 о1

3. Тимоген (n=9) 2,3±0,3°*1;2 6,2±0,6 о1

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (n=9) 1,6±0,2°*12 7,6±0,8 о1

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (n=9) 0,9±0,2°*1-4 6,8±0,7 о1

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Введение гепатотропного яда приводило к повышению уровня МДА в 1,5 раза в плазме крови и в 2,0 раза в гомогенате печени, что свидетельствовало об активации свободно - радикальных реакций в этих условиях по сравнению с животными без отравления, получавшими только соответствующие иньекции изотоничного раствора (КаС1). Введение тимогена и его модифицированных D-аланином аналогов приводило к снижению уровня МДА в крови, соответственно в 2,8 раза, а новых аналогов в 4,0 (П1) и 7,1 раза (П2) по сравнению с контрольной группой отравленных ТХМ животных, получавших иньекции изотоничного раствора (КаС1). При этом в гомогенате печени достоверного снижения уровня МДА не наблюдалось (таблица 4). Можно предположить, что это связано с

гиперактивацией иммунной системы в условиях этой модели поражения печени и выраженной воспалительной реакцией [9, 38]. В этих условиях нельзя исключить активацию свободно-радикальных реакций в печени, вызванную повышенной инфильтрацией печени фагоцитами, продуцирующими свободные радикалы и активирующие тем самым в ней процессы перекисного окисления. В связи с этим преждевременное введение иммуностимуляторов в этих условиях может быть малоэффективным.

Изучение антиоксидантных механизмов защиты клеток по активности каталазы, представлены в таблице 5. В этих условиях отравления ТХМ существенного изменения активности каталазы в крови выявлено не было, по сравнению с животными без отравления, но в гомогенате печени наблюдалось снижение ее активности в 1,3 раза. Тогда как десятидневное введение тимогена приводило к повышению активности каталазы в 1,7 раза в крови и также в 1,7 раза в гомогенате печени, по сранению с отравленным контролем. Введение синтетических новых аналогов тимогена также приводило к повышению ее активности в 1,5 раза как в крови, так и в 1,9 в печени - при введении П1. Применение П2 приводило к повышению активности каталазы в крови в 2,0 раза и в 1,8 раза в гомогенате печени по сравнению с отравленными животными, получавшими физиологический раствор.

Таким образом, и тимоген и его аналоги при десятидневном введении в условиях отравления ТХМ повышали антиоксидантную защиту в печени и в крови, повышая активность конечного фермента инактивирующего пероксид водорода - каталазу. Причем в крови более выраженным эффектом обладал аналог П2.

Исследование биохимических показателей в условиях этой модели показало выраженное поражение печени. Наблюдалось повышение активности АЛТ и АСТ в крови животных, получавших ТХМ и физиологический раствор по сравнению с животными без отравления, так же получавших физиологический раствор (таблица 6).

Таблица 5 - Влияние пептидов (10 дней введения) на активность каталазы (M±m)

в условиях отравления тетрахлорметаном (ТХМ)

№ п/п Группы животных Каталаза в плазме крови, мкат/л Каталаза в гомогенате печени, мкат/л

1. Без отравления (NaCl) (n=8) 10,2±0,5 6,2±0,3

Отравление ТХМ + введение пептидов 10 дней (до и одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl) (n=8) 10,0±0,3 5,0±0,2 о1

3. Тимоген (n=9) 16,7±0,9*12 8,3±0,5*1'2

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (n=9) 15,1±0,8*12 9,5±0,6* 12

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (n=9) 19,6±1,2*1-4 8,8±0,5*12

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, р<0,05; * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Так уровень АЛТ повышался в крови в 3,2 раза, а АСТ в 1,9 раза, что свидетельствовало о развитии выраженного цитолиза гепатоцитов при отравлении ТХМ. Также в крови отравленных животных в 3,6 раза повышался уровень билирубина и в 2,6 раза активности ЩФ, что показывает развитие синдрома холестаза. В этих условиях десятикратное введение тимогена и его новых аналогов до и одновременно с ТХМ не выявило достоверного снижения этих показателей.

При исследовании функции нейтрофилов было установлено повышение их активности при отравлении ТХМ (таблица 7). В этой модели активация иммунной функции связана с выделением провоспалительных цитокинов [38].

Таблица 6 - Влияние пептидов (10 дней введения) на биохимические показатели (M±m) в плазме крови крыс в условиях

отравления тетрахлорметаном (ТХМ)

№ Группы животных АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Билирубин, мкмоль/л Щелочная фосфатаза, нмоль/(с * л)

1. Без отравления, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 0,35±0,03 0,17±0,02 20,9±2,1 191,8±15,3

Отравление ТХМ + введение пептидов 10 дней (до и одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl), введение изотонического раствора (n=8) 1,12±0,11 о1 0,32±0,03 о1 75,9±7,3 о1 490,6±42,1 о1

3. Тимоген (n=9) 0,94±0,10 о1 0,35±0,03 о1 73,8±7,1 о1 535,2±48,2 о1

4. П1 HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (n=9) 0,81±0,08 о12 0,31±0,02 о1 69,3± 6,5 о1 465,2±43,4 о1

5. П2 HN-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (n=9) 0,84±0,09 о1 0,32±0,02 о1 67,4± 5,9 о1 387,8±40,3 о1

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Таблица 7 - Влияние пептидов (10 дней введения) на функциональную активность нейтрофилов (M±m) в условиях

отравления тетрахлорметаном ТХМ

№ Группы животных ФИ НСТ-сп. НСТ-инд. Функциональный резерв

1. Без отравления, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 49,8 ±4,1 11,2 ±1,0 26,3 ±2,5 15,1 ±1,5

Отравление ТХМ + введение пептидов 10 дней (до и одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl), введение изотонического раствора (n=8) 65,6 ±4,4 о 1 17,5 ±1,7 о1 40,3 ±3,5 о1 22,8 ±1,8 о

3. Тимоген (n=8) 77,6 ±5,9 о* 1 23,8 ±1,9 о* 1,2 52,2 ±3,9 о *1,2 28,4 ±2,1 о *

4. П1 HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (n=8) 56,2 ±4,3 *3 17,8 ±1,8 о*1,3 40,9 ±3,5 о*3 1 23,1 ±2,3 о1

5. П2 HN-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (n=8) 55,6 ±4,2 *3 17,7 ±1,7 о*1,3 40,2 ±3,1 о*3 1,3 22,5 ±2,2 о

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия по сравнению с группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе; ФИ - фагоцитарный индекс (%) (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе). НСТ- показатели НСТ-теста в %.

В дальнейшем проводилось выявление эффектов пептидных препаратов в отношении функции нейтрофилов крови. Нейтрофилы имеют несколько видов биологической активности - от системы иммуного надзора, до нейроэндокринной регуляции [14]. Также, активность фагоцитоза имеет важное значение для осуществления антигеннеспецифических механизмов иммунной защиты организма [25, 63].

Было установлено, что при пятидневном введении ТХМ наблюдается активация иммунной функции, а именно повышается функциональная активность нейтрофилов крови (таблица 7). Наблюдалось повышение как поглотительной активности нейтрофилов (ФИ), так и реакций НСТ теста (спонтанной и стимулированной). Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН), оцениваемый по разности стимулированной и спонтанной реакций НСТ теста также повышался у отравленных ТХМ животных, по сравнению с контролем без отравления. Повышение активности нейтрофилов в этих условиях, скорее всего, связано с секрецией провоспалительных цитокинов в этой модели поражения печени [38].

Применение тимогена в этих условиях, еще до поступления гепатотропного яда, а затем одновременно с ним приводило еще к большему повышению фунции нейтрофилов крови (таблица 7). Использование же пептидов П1 и П2 вело к ослаблению повышенной активности нейтрофилов. Но корригирующее влияние было выявлено только в отношении ФИ, но не кислородзависимой активности нейтрофилов.

Таким образом, в этих условиях тимоген оказывал преимущественно иммуностимулирующее влияние, тогда как его аналоги пептиды П1 и П2 проявляли сопоставимое друг с другом иммуномодулирующее действие.

Также применение пептидов до введения ТХМ и потом одновременно с ТХМ оказалось не эффективным по коррекции уровня МДА в печени и биохимических показателей в крови.

В связи с тем, что выраженность действия регуляторных пептидов может зависить от схемы их введения, в следующей серии экспериментов было проведено исследование тех же показателей, но при пятидневном введении

препаратов - только одновременно с поступлением ТХМ. То есть во второй серии экспериментов пептиды до поступления гепатотропного яда не вводились.

При изучении фрагментов печени в экспериментальной группе животных, получавших тимоген пятикратно одновременно с поступлением ТХМ, было установлено, что в паренхиме печени в перилобулярной зоне отмечалось снижение выраженности проявления капельной и жировой дистрофии. В портальных сосудах определялись застойные явления с расширением их просветов. Сохранялся интестициальный отек и слабо выраженная лимфоцитарная инфильтрация. Балочное строение гепатоцитов в данной зоне нарушено. Участков некроза не было выявлено (рисунок 7).

Рисунок 7 - Микрофотография перипортальных отделов печеночной дольки в экспериментальной группе Тимоген+ТХМ. Ув.х100. Окр. Г+Э

Центральные вены также были расширены. Гепатоциты 1 и 2 зоны с выраженными признаками капельной и жировой дистрофии с увеличенными

размерами. Гепатоциты 3 зоны преимущественно не были изменены, встречалось большое количество полиплоидных клеток с несколькими ядрышками (рисунок 8).

Рисунок 8 - Микрофотография центролобулярных отделов печеночной дольки в экспериментальной группе Тимоген+ТХМ. Ув.х100. Окр. Г+Э

При изучении фрагментов печени в экспериментальной группе с коррекцией интоксикацией пептидом 1 в структуре триада определяется выраженные застойные явления и склерозом сосудов. При этом дистрофические изменения практически не выражены. Явление отека уменьшено, однако сохраняется умерено выраженная периваскулярная инфильтрация лимфоцитами (рисунок 9).

При этом в области портальной вены определятся более выраженная вакуольная дистрофия с нарушением балочного строение гепатоцитов всех зон. Большое количество гепатоцитов увеличены в размерах округлой формы с крупными включениями в цитоплазме. Гепатоциты преимущественно 1 -ядерные (рисунок 10).

шшшшят

> Л • - * <% ГШ л. ' V .. .1»?

Рисунок 9 - Микрофотография перипортальных отделов печеночной дольки экспериментальной группе П1+ТХМ. Ув.х200. Окр. Г+Э

ЖжйхЛ ■ ■ * © •

200иш

1Л|. 11 I I м

НШш

рофотография центрол экспериментальной группе П1+ТХМ. Ув.х200. Окр. Г+Э

111 1~гтг т** ■ пи—ми жгж

Рисунок 10 - Микрофотография центролобулярных отделов печеночной дольки

Сходная морфологическая картина наблюдалась при изучении фрагментов печени в экспериментальной группе с коррекцией интоксикацией пептидом 2. Застойные явления не выражены. Вокруг триады отмечается нарушение балочного строения гепатоцитов. При этом клетки с большим хроматофильным ядром. В поле зрения встречается большое количество полиплоидных клеток. Отмечается выраженная лимфоцитарная периваскулярная инфильтрация (рисунок 11, 12).

Рисунок 11 - Микрофотография перипортальных отделов печеночной дольки экспериментальной группе П2+ТХМ. Ув.х100. Окр. Г+Э

Просветы центральных вен расширены, стенки незначительно утолщены. Окружающая паренхима преимещественно балочного строения, одна размеры гепатоцитов значительно увеличены за счет проявления гидропической и жировой дистрофии.

Таким образом, 5-дневное введение тимогена и его новых аналогов (пептидов 1 и 2) в эквимолярных дозах и одновременно с поступлением ТХМ приводило к снижению выраженности воспалительных проявлений в печени и слабо выраженному ослаблению ее дистрофических признаков.

Рисунок 12 - Микрофотография центролобулярных отделов печеночной дольки экспериментальной группе П2+ТХМ. Ув.х100. Окр. Г+Э

Так же при морфометрии срезов печени было установлено повышение митотического индекса гепатоцитов в группах животных, получавших пептидые препараты (таблица 8). МИ повышался в 1,8 раз при введении тимогена, тогда как при введении П1 в 4,9 раза, а П2 в 5,2 раза соответственно. Также для всех пептидов повышался ИДГ и ПЯГ с большей выраженностью для аналогов тимогена.

Таким образом, при пятидневном введении репаративный эффект сохранялся и проявлялся также и для тимогена, в отличие от десятидневного применения препаратов. Наиболее выраженная активация репаративной регенерации наблюдалась в группах животных, получавших новые аналоги П1 и П2.

Также для подтверждения результатов обычной морфометрии был проведен иммуногистохимический (ИГХ) тест с антителами к крысиным ядрам. При проведении ИГХ-исследования в гепатоцитах наблюдалось ядерное окрашивание на Кь67 - маркер пролиферации клеток.

Ядерный антиген; выявлялсяся во всех пролиферирующих клетках в G1 (поздней), S, М и G2 фазах клеточного цикла. Анализ положительно-окрашенных клеток показал те же изменения митотического индекса, что и при обычной микроскопии с максимальной выраженностью в опытных группах, где вводились новые аналоги П1 и П2 (рисунки 13-17).

При исследовании функции нейтрофилов в этих условиях было установлено повышение как поглотительной, так и кислородзависимой активностей нейтрофилов крови (таблица 9). При пятидневном введении тимоген не снижал, но и не повышал ФИ, показатели НСТ теста спонтанного и индуцированного, а также ФРН нейтрофилов. В то время как новые аналоги тимогена и П1, и П2 снижали все повышенные показатели функции нейтрофилов до уровня животных без отравления, оказывая тем самым корригирующее воздействие на активность нейтрофилов.

Рисунок 13 - Микрофотография паренхимы печени, в группе Без отравления, введение изотоничного раствора КаСЬ. Ув.х400. Окр. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Кь67, докрашивание -гематоксилином

Рисунок 14 - Микрофотография паренхимы печени, в группе ТХМ+КаС1. Ув.х400. Окр. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Кь67,

докрашивание -гематоксилином

Рисунок 15 - Микрофотография паренхимы печени, в группе ТХМ+Тимоген. Ув.х400. Окр. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Кь67,

докрашивание -гематоксилином

Рисунок 16 - Микрофотография паренхимы печени, в группе ТХМ+П1. Ув.х400. Окр. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Кь67, докрашивание -

гематоксилином

Рисунок 17 - Микрофотография паренхимы печени, в группе ТХМ+П2. Ув.х400. Окр. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Кь67, докрашивание -

гематоксилином

Таблица 8 - Гепатотропная активность (М±ш) тимогена и его аналогов (5 дней введения) в условиях отравления ТХМ

Группы животных МИ, митотический индекс (%о) ИДГ, индекс двуядерных гепатоцитов (%), ПЯГ, площадь ядер 2 гепатоцитов, мкм

1. Животные без отравления (введение масла и изотонического раствора (КаС1)) (п = 8) 3,1±0,1 11,4±0,2 40,3±0,2

Отравление ТХМ + введение пептидов 5 дней (одновременно с ТХМ)

2. Контроль (КаС1) введение изотонического раствора (п = 8) 2,5±0,10*1 11,1±0,2 38,3±0,2 о*1

3. Тимоген (п = 8) 4,6±0,1о*1 2 12,4±0,3*1, 2 39,8±0,2*2

4. П1 Н2К-Б-А1а-Ь-а1и-Ь-Тгр-СООН (п = 8) 12,3±0,3о*1, 2, 3 13,6±0,3*1, 2, 3 40,8±0,2*2, 3

5. П2 Н2К-Ь-а1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН (п = 8) 13,1±0,4о*1, 2, 3 13,9±0,4*1, 2, 3 40,9±0,3*2, 3

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, 0 - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Таблица 9 - Влияние пептидов (5 дней введения) на функциональную активность нейтрофилов (M±m) в условиях отравления ТХМ

№ Группы животных ФИ НСТ-сп. НСТ-инд. Функциональный резерв

1. Без отравления, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 51,6 ±4,1 10,9 ±0,9 26,4 ±2,3 15,5 ±1,5

Отравление ТХМ + введение пептидов 5 дней (одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl) введение изотонического раствора (n=8) 65,4 ±4,7 о1 17,7 ±1,6 о1 41,5 ±3,8 о1 23,8 ±1,9 о

3. Тимоген (n=8) 78,5 ±6,1 о1 19,8 ±1,9 о1 46,1 ±4,1 о1 26,3 ±2,3 о1

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (n=8) 57,7 ±4,8*3 12,2 ±1,2*2,3 28,5 ±2,7*2,3 16,3 ±1,7*3

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (n=8) 56,2 ±4,7*3 11,3 ±1,1*23 27,2 ±2,3*2,3 15,9 ±1,4*3

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия по сравнению с группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

При изучении уровня МДА в крови и гомогенате печени по схеме -пятикратно и одновременно с ТХМ, были получены следующие результаты (таблица 10).

Таблица 10 - Влияние пептидов (5 дней введения) на концентрацию МДА (M±m, n=8) в условиях отравления тетрахлорметаном (ТХМ)

№ п/п Группы животных МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в гомогенате печени

1. Без отравления (NaCl) 4,1±0,4 3,8±0,4

Отравление ТХМ + введение пептидов 5 дней (одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl) 6,1±0,6 оП 6,9±0,7 ^

3. Тимоген 3,4±0,4о*2 5,1±0,5*2

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 2,3±0,3о*1 2 4,8±0,5*2

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 1,4±0,2о*1-4 4,5±0,4*2

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Введение ТХМ и изотоничного раствора (КаС1) приводило к повышению уровня МДА в 1,5 раза в плазме крови и в 1,8 раза в гомогенате печени, по сравнению с животными без отравления, получавшими только физиологический раствор. Введение тимогена приводило к снижению уровня МДА в крови в 1,8 раза, а модифицированных D-аланином аналогов приводило к снижению уровня МДА в крови в 2,7 раза (пептид П1) и в 4,4 раза (пептид П2) по сравнению с контролем отравленных животных. При исследовании уровня МДА в гомогенате

печени были получены однонаправленные изменения с уровнем МДА в крови. При введении тимогена уровень МДА снижался в 1,4 раза, при введении пептида П1 - так же в 1,4 раза, а при применении пептида П2 в 1,5 раза (таблица 10). Можно заключить, что при этой схеме введения и тимоген и его аналоги снижали активность свободно-радикальных реакций, как в крови, так и в печени.

Исследование активности каталазы при пятидневной схеме введения ТХМ показало повышение ее активности и в крови и в гомогенате печени в 1,5 раза при введении тимогена, в 1,7 и 1,8 раза при использовании пептида П1, 1,8 раза при введении пептида П2 (и в крови и в печени) по сравнению отравленными животными, которым вводили физиологический раствор (таблица 11 ).

Таблица 11 - Влияние пептидов (5 дней введения) на активность каталазы (M±m,

n=8) в условиях отравления тетрахлорметаном (ТХМ)

№ п/п Группы животных Каталаза в плазме крови, мкат/л Каталаза в гомогенате печени, мкат/л

1. Без отравления (NaCl) 9,8±0,6 6,0±0,3

Отравление ТХМ + введение пептидов 5 дней (одновременно с ТХМ)

2. Контроль (NaCl) 8,6±0,6 4,9±0,2 оП

3. Тимоген 12,6±0,8*1; 2 7,2±0,4**1; 2

4. П1 H2N - D-Ala -L-Glu-L-Trp-COOH 14,2±1,1*1; 2 8,6±0,5*1; 2'3

5. П2 H2N -L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 15,4±1,2*1;2'3 8,9±0,5*1'2' 3

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, р<0,05; * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса,р<0,05; п - количество животных в группе

Повышение активности каталазы в крови и в печени свидетельствует об активации антиоксидантной защиты клеток также и при использовании пятидневного введения выбранных для исследования пептидов при одновременном отравлении ТХМ.

Введение ТХМ приводило к выраженному повышению активности АЛТ и АСТ, билирубина и ЩФ . Это показывает выраженное поражение печени (таблица 12). При введении тимогена и его новых аналогов одновременно с ТХМ наблюдалось снижение этих показателей, что свидетельствовало об ослаблении поражения печени.

Таким образом, пятидневное введение препаратов показало более стабильные гепатотропные эффекты. Вероятно, это связано с активацией иммунной функции в условиях этой модели поражения печени, когда преждевременное введение иммуностимулирующих препаратов (еще до поражения печени) может привести к гиперактивации иммунитета и ослаблению гепатозащитного действия.

Таблица 12 - Влияние пептидов (5 дней введения) на биохимические показатели (М ± т, п=8) в плазме крови крыс в

условиях отравления тетрахлорметаном (ТХМ)

№ Группы животных АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Билирубин, мкмоль/л Щелочная фосфатаза, нмоль/(с * л)

1. Без отравления, введение изотонического раствора (КаС1) (п=8) 0,35±0,03 0,17±0,02 20,9±2,1 191,8±15,3

Отравление тетрахлорметаном + введение пептидов 5 дней (одновременно с ТХМ)

2. Контроль (КаС1), введение изотонического раствора (п=8) 1,12±0,11 оП 0,32±0,03 о*1 75,9±7,3 о*1 490,6±42,1 о*1

3. Тимоген (п=8) 0,94±0,10 0,35±0,03 о*1 73,8±7,1 о*1 535,2±48,2 о*1

4. П1 ШК-Б-Ак-Ь-аШ-Ь-Тгр-СООН (п=8) 0,81±0,08 0,31±0,02 о*1 69,3± 6,5 о*1 465,2±43,4 о*1

5. П2 Н2К-Ь-а1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН (п=8) 0,84±0,09 о*1, 2 0,32±0,02 о*1 67,4± 5,9 о*1 387,8±40,3 о*1- 3

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

3.2 Эффекты тимогена и его новых, модифицированных D-аланином аналогов, при поражениии печени гидразином

Поражение печени гидразином также приводит к развитию зернистой дистрофии (рисунок 18).

Рисунок 18 - Микрофотография паренхимы печени в экспериментальной группе с интоксикацией гидразином. Ув.х200. Окр. Г+Э

В паренхиме печени основным проявлением токсической гепатопатии являлась капельная дистрофия, отдельные клетки с зернистостью и неравномерным просветлением цитоплазмы, а также кариолизисом.

При десятидневном введении пептидов в условиях отравления гидразином, при морфометрии срезов печени был установлен выраженный репаративный эффект пептидов П1 и П2 (таблица 1 3). В отличие от тимогена эти пептиды повышали МИ и ИДГ по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. Наиболее выраженная активация репаративной

регенерации наблюдалась при десятидневном введении пептида П2. По площади ядер гепатоцитов достоверных изменений выявлено не было (рисунок 19).

При пятидневной схеме введения пептидов одновременно и после поражения печени гидразином так же наблюдалось повышение репаративной активности гепатоцитов при введении пептидов П1 и П2 (таблица 14). Об этом свидетельствовало повышение всех показателей МИ, ИДГ и ПЯГ.

Таким образом, пятидневное введение пептидов также обладало выраженной репаративной активностью.

Рисунок 19 - Микрофотография паренхимы печени в экспериментальной группе

П2 + Гидразин. Ув.х200. Окр. Г+Э

В паренхиме печени дистрофические изменения не выявлены. В поле зрение большое количество 2-ядерных гепатоцитов.

Таблица 13 - Гепатотропная активность (М±ш) тимогена и его аналогов (10 дней введения) в условиях отравления

гидразином

Группы животных МИ, митотический индекс (%о) ИДГ, индекс двуядерных гепатоцитов (%), ПЯГ, площадь ядер гепатоцитов, мкм2

1. Животные без отравления (введение масла и изотонического раствора (КаС1)) (п = 8) 2,8±0,1 11,4±0,2 40,3±0,2

Отравление гидразином + введение пептидов 10 дней (до, одновременно и после гидразина)

2. Контроль (КаС1) введение изотонического раствора - (п = 8) 2,9±0,2 16,5±0,2 °*1 38,3±0,2 *1

3. Тимоген (п = 8) 2,4±0,1* 13,1±0,2 о* 1,2 40,1±0,2*2

4. П1 ШК-Б-Ак-Ь-аи-Ь-Тгр-СООН (п = 8) 4,0±0,1* ° 1-3 18,1±0,3* о 1-3 66,6±0,2 *1-3

5. П2 ШК-Ь-аи-Ь-Тгр-Б-Ак-СООН (п = 8) 22,1±0,3* ° 1-4 22,7±0,4* о 1-4 78,1±0,3 *1-4

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры - показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Таблица 14 - Гепатотропная активность (М±ш) тимогена и его аналогов (5 дней введения) в условиях отравления

гидразином

Группы животных МИ, митотический индекс (%) ИДГ, индекс двуядерных гепатоцитов (%), ПЯГ, площадь ядер гепатоцитов, мкм2

1. Животные без отравления (введение масла и изотонического раствора №С1)) (п = 8) 3,1±0,3 11,3±0,4 40,6±0,5

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней (одновременно и после гидразина)

2. Контроль, введение изотонического раствора (КаС1) (п = 8) 2,8±0,2 16,5±0,5*1 38,4±0,4*1

3. Тимоген (п = 8) 2,3±0,2*1 13,1±0,5*12 39,6±0,5*2

4. П1 Н2К-Б-А1а-Ь-аи-Ь-Тгр-СООН (п = 8) 22,5±0,5*1-3 24,3±0,7*1-3 63,6±0,6*1-3

5. П2 Н2К-Ь-аи-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН (п = 8) 17,3±0,4*1-4 16,3±0,5*1,3,4 73,6±0,6*1-4

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

При исследовании уровня МДА были получены однонаправленные результаты (таблица 15).

Таблица 15 - Влияние пептидов (10 дней введения) на концентрацию МДА (M±m, n=8) в условиях отравления гидразином

№ п/п Группы животных МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в гомогенате печени

1. Без отравления (NaCl) 3,4±0,3 3,7±0,4

Отравление гидразином + введение пептидов 10 дней (до, одновременно и после введения гидразина)

2. Контроль (NaCl) 5,4±0,4 6,5±0,6 оП

3. Тимоген 3,3±0,3*2 4,8±0,4*2

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 3,6±0,4*2 3,7±0,4*2 3

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 3,0±0,3*2 3,2±0,3*2 3

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - означает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, р<0,05; цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, п - количество животных в группе

Введение гидразина приводило к повышению уровня МДА в 1,6 раза в плазме крови и в 1,8 раза в гомогенате печени, что также как и при отравлении ТХМ показывает выраженную активацию реакций перекисного окисления в этих условиях по сравнению с животными без отравления, получавшими иньекции физиологического раствора. При введении тимогена уровень МДА в крови снижался в 1,6 раза, а использовании новых аналогов в 1,5 (П1) и 1,8 раза (П2) по сравнению с контрольной группой отравленных гидразином животных. В гомогенате печени концентрация МДА снижалась в 1,4 раза при использовании

тимогена, в 1,8 раза при введении П1 и в 2,0 раза при использовании П2. Введение новых аналогов (П1 и П2) оказалось более выраженным в отношении снижения уровня МДА в печени по сравнению с тимогеном в этих условиях. Эффекты же в отношении МДА крови у пептидов были сопоставимы (таблица 15).

Изучение активности каталазы показало ее снижение в 1,3 раза и в крови и в печени в условиях отравления гидразином (таблица 16).

Таблица 16 - Влияние пептидов (10 дней введения) на активность каталазы (M±m, n=8) в условиях отравления гидразином

№ п/п Группы животных Каталаза в плазме крови, мкат/л Каталаза в гомогенате печени, мкат/л

1. Без отравления (NaCl) 10,1±0,5 6,1±0,4

Отравление гидразином + введение пептидов 10 дней (до, одновременно и после гидразина)

2. Контроль (NaCl) 7,7±0,4 о1 4,7±0,3 о1

3. Тимоген 15,8±1,5* о12 5,9±0,3*2

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 16,4±1,8* о12 6,0±0,5*2

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 15,2±1,2* о1,2 6,4±0,5*2

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - означает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, р<0,05; цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, п - количество животных в группе

Возможно, что гидразин влияет на белковую структуру этого антиоксидантного фермента, следствием чего является ослабление антиоксидантной защиты клеток. Введение пептидов восстанавливает активность этого фермента в печени и даже повышает ее активность в крови по сравнению с

животными без отравления.

Таким образом, при отравлении гидразином пептиды обладали стимулирующим влиянием на активность каталазы, что способствует восстановлению антиоксидантной защиты клеток печени.

В дальнейшем была использована схема пятидневного введения пептидов -одновременно и после введения гидразина (таблица 17).

Таблица 17 - Влияние пептидов (5 дней введения) на концентрацию МДА (M±m, n=8) в условиях отравления гидразином

№ п/п Группы животных МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в гомогенате печени

1. Без отравления (NaCl) 3,8±0,3 3,6±0,4

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней (одновременно и после введения гидразина)

2. Контроль (NaCl) 5,1±0,5 о 6,3±0,6 о

3. Тимоген 3,5±0,3*2 4,6±0,5*2

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 3,6±0,3*2 3,4±0,4*2

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 2,7±0,3*2'4 4,1±0,5 *2

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - означает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, р<0,05; цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, п - количество животных в группе

При такой схеме введения пептиды также как и при 10-дневном применении снижали уровень МДА и в крови, и в гомогенате печени, проявляя тем самым антиоксидантную активность и восстанавливая нормальную активность свободно -радикальных реакций (таблица 17). Причем более выраженной активностью в

этих условиях обладал пептид П2, который снижал уровень МДА в крови в 1,9 раза по сравнению с контролем отравленных животных.

Таким образом, эффекты пептидов в отношении МДА при 5 дневном введении были практически сопоставимы с более длительным 10 дневным введением препаратов, что может быть использовано для сокращения длительности их курсового применения.

Активность каталазы, изначально сниженная введением гидразина, также восстанавливается и в крови, и в печени и при пятидневном введении всех пептидов (таблица 18).

Таблица 18 - Влияние пептидов (5 дней введения) на активность каталазы (M±m, n=8) в условиях отравления гидразином

№ п/п Группы животных Каталаза в плазме крови, мкат/л Каталаза в гомогенате печени, мкат/л

1. Без отравления (NaCl) 11,2±1,3 6,4±0,6

Отравление гидразином + введение пептид* (одновременно и после гидразина) ов 5 дней

2. Контроль (NaCl) 8,0±0,6 о1 4,9±0,3 о1

3. Тимоген 12,2±1,2*2 6,2±0,5*2

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 11,4±1,1*2 6,3±0,5*2

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 10,9±1,0*2 6,5±0,6*2

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - означает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, р<0,05; цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, п - количество животных в группе

В условиях этой модели отравления гидразином также наблюдалось выраженное повышение биохимических показателей, характеризующих выраженность цитолиза гепатоцитов и холестаза (таблица 19). Так уровень АЛТ повышался в крови в 3,2 раза, а АСТ в 2,8 раза в группе отравленных животных, получавших физиологический раствор. Также в крови в 3,9 раза повышался уровень билирубина и в 2,4 раза активность ЩФ. Десятикратное введение тимогена и пептида П1 до, одновременно и после гидразина не сопровождалось достоверным снижением активности АЛТ и АСТ в крови, тогда как введение пептида П2 приводило к снижению уровня АЛТ в 1,6 раза по сравнению с отравленным контролем. По активности АСТ изменений не было выявлено. На уровень билирубина и ЩФ в крови тимоген и пептид П1 сопоставимо друг с другом снижали уровень билирубина в 1,3 раза, ЩФ в 2,1 и 2,7 раз соответственно. Тогда как пептид П2 сопоставимо с ними снижал активность ЩФ в 2,2 раза, но более выраженно по сравнению с ними влиял на уровень билирубина, понижая его в 2,1 раз соответственно.

Таким образом, в условиях отравления гидразином все пептиды при десятидневном введении ослабляли выраженность синдрома холестаза, а пептид П2 частично и цитолиза, снижая уровень АЛТ. Поэтому можно полагать, что в условиях этой модели и схемы введения пептиды проявляют гепатозащитное действие в отличие от ТХМ с той же схемой введения.

При пятидневной схеме введения препаратов направленность эффектов не только сохранялась, но даже наблюдалось сопоставимое снижение уровня АЛТ у всех пептидов в 1,6 раза (таблица 20). Тимоген оказывал сопоставимое с препредыдущей схемой введения уровней билирубина и ЩФ. Пептиды же П1 и П2 проявляли более выраженное влияние на эти показатели по сравнению с тимогеном. Достоверного снижения АСТ в этих условиях не было выявлено.

Таким образом, по изменению выбранных биохимических показателей крови пятидневная схема введения пептидов оказалась не хуже десятидневной, а по АЛТ даже превосходило ее.

Таблица 19 - Влияние пептидов (10 дней введения) на биохимические показатели (М ± т) в плазме крови крыс в

условиях отравления гидразином

№ Группы животных АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Билирубин, мкмоль/л Щелочная фосфатаза, нмоль/(с * л)

1. Без отравления, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 0,33±0,02 0,15±0,2 23,5±2,2 185,8±19,3

Отравление гидразином + введение пептидов 10 дней (до, одновременно и после гидразина)

2. Контроль, введение изотонического раствора (КаС1) (п=8) 1,06±0,06 0,42±0,04 оП 91,9±9,2 оП 446,0±40,5

3. Тимоген (п=8) 1,03±0,11 0,43±0,04 оП 71,9±6,5*п 208,6±21,2*2

4. П1 ШК-Б-Ма-Ь-аШ-Ь-Тгр-СООН (п=8) 1,08±0,08 0,46±0,05 оП 76,7±7,4*п 168,2±18,3*2

5. П2 ШК-Ь-ОЬ-Ь-Тгр-Б-Ма-СООН (п=8) 0,67±0,07 *1-4 0,38±0,03 оП 44,7±4,6*1-4 206,4±20,1*2

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Таблица 20 - Влияние пептидов (5 дней введения) на биохимические показатели (М ± т) в плазме крови крыс в

условиях отравления гидразином

№ Группы животных АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Билирубин, мкмоль/л Щелочная фосфатаза, нмоль/(с * л)

1. Без отравления, введение изотонического раствора (КаС1) (п=8) 0,38±0,04 0,18±0,02 25,5±2,6 192,9±17,6

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней (одновременно и после гидразина)

2. Контроль, введение изотонического раствора (КаС1) (п=8) 0,97±0,08 о*1 0,39±0,04 о*1 90,2±8,5 о*1 477,5±60,8 о*1

3. Тимоген (п=8) 0,62±0,06**1' 2 0,38±0,04 о*1 69,7±7,1*1 260,6±49,1**2

4. П1 ШК-Б-Ак-Ь-аШ-Ь-Тгр-СООН (п=8) 0,65±0,05**1' 2 0,33±0,03 о*1 50,9±5,2*1-3 145,2±13,2*2' 3

5. П2 Н2К-Ь-а1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН (п=8) 0,66±0,04**1' 2 0,36±0,04 о*1 51,9±5,6*1-3 135,4±12,3**1-3

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Изучение функции нейтрофилов крови показало существенное снижение их активности по всем показателям при отравлении гидразином (таблица 21). При десятидневном введении тимоген повышал активность нейтрофилов крови, а пептиды П1 и П2 обладали корригирующим эффектом.

При пятидневной схеме введения препаратов наблюдалось повышение сниженной функции нейтрофилов под влиянием тимогена, но не до уровня животных без отравления (таблица 22). Пептиды П1 и П2 обладали корригирующим воздействием на активность нейтрофилов в этих условиях.

Таким образом, пятидневное введение препаратов было сопоставимо по иммунотропному воздействию с десятидневным введением пептидов.

Таким образом, в условиях токсического поражения печени гидразином, выбранные для исследования пептиды - тимоген и его два аналога модифицированных D-аланином проявляли репаративную, антиоксидантную и иммуностимулирующую активности. Причем пятидневное введение препаратов по большинству показателей было сопоставимо с десятидневным введением, а по некоторым показателям превосходило последнее. В этих условиях рядом более выраженных эффектов обладал пептид П2 с добавлением D-аланина с С-конца молекулы тимогена.

Возможно, что преждевременная мобилизация регуляторных систем организма - еще до поступления гепатотропных ядов может приводить к ослаблению адаптивных систем организма и восстановлению печени в том числе. Кроме того, явным преимуществом пятидневного курса применения препаратов является их экономия при использовании, что непосредственно отражается на стоимости восстановительных мероприятий.

Таблица 21 - Влияние пептидов (10 дней введения) на функциональную активность нейтрофилов (M ± m) в условиях

отравления гидразином

№ Группы животных ФИ НСТ-сп. НСТ-инд. Функциональный резерв

1. Без отравления, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 46,1 ±4,2 11,5 ±1,0 27,4 ±2,6 16,1± 1,6

Отравление гидразином + введение пептидов 10 дней (до, одновременно и после гидразина)

2. Контроль, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 27,1 ±2,4 о 1 7,3 ±0,6 о 1 14,6 ±1,3 о 1 7,3 ±0,7 о 1

3. Тимоген (n=8) 34,8 ±2,7* о1 9,6 ±0,6* о2 20,8 ±1,4* о 2 11,2 ±0,7* о

4. П1 H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (n=8) 45,7 ±3,4*3 2 11,5 ±0,8* 23 26,6 ±1,8*23 15,1 ±1,2*3 2

5. П2 H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (n=8) 47,1 ±3,6* 2,3 11,9 ±0,7* 23 27,9 ±2,1*2,3 16,0 ±1,4*3 2

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Таблица 22 - Влияние пептидов (5 дней введения) на функциональную активность нейтрофилов (М ± т, п=8) в плазме

крови крыс в условиях отравления гидразином

№ Группы животных ФИ НСТ-сп. НСТ-инд. Функциональный резерв

1. Без отравления, введение изотонического раствора (КаС1) (п=8) 48,1 ±4,1 12,3 ±1,0 28,3 ±2,6 16,0± 1,3

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней (одновременно и после гидразина)

2. Контроль, введение изотонического раствора (КаС1) (п=8) 26,4±2,3 о1 7,0 ±0,5 о1 14,1 ±1,3 о1 7,1 ±0,6 о1

3. Тимоген (п=8) 34,2 ±2,7* о1,2 9,3 ±0,6* о1,2 19,8 ±1,4* о12 10,5 ±0,7* о

4. П1 Н2К-Б-А1а-Ь-а1и-Ь-Тгр-СООН (п=8) 50,9 ±=4,3*3 2,3 10,9 ±0,8*3 2 25,9 ±2,1*3 2,3 15,0 ±1,2*3 2

5. П2 Н2К-Ь-а1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН (п=8) 54,3 ±4,6*3 2,3 10,7 ±0,7*3 2 26,8±2,2*3 2,3 16,1 ±1,4*3 23

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

В связи с тем, что в эквимолярных дозах при токсическом поражении печени как ТХМ, так и гидразином пятидневное введение пептидов имело преимущества перед десятидневным введением, то в дальнейших исследованиях была выбрана только схема пятидневного применения. А учитывая тот факт, что иммунная функция при большинстве заболеваний печени, как правило, снижается [3, 48], то в дальнейших исследованиях использовалась экспериментальная модель поражения печени гидразином.

Известно, что эффекты фармакологических средств и пептидных препаратов в том числе, как правило, зависят от разовых доз применения, которые разработы для каждого средства и рекомендованы к использованию [39]. Поэтому в дальнейших исследования было целесообразно выявить эффекты и других разовых доз тимогена и его Б-модифицированных аналогов.

Были использованы разовые дозы десятикратно и стократно превышающие изначально выбранные дозы. То есть пептиды опять вводились в эквимолярных дозах, только десятикратно повышенных (10 мкг/кг для тимогена и 12 мкг/кг для П1 и П2) и стократно увеличенных (100 мкг/кг для тимогена и 120 мкг/кг для П1 и П2). Пептиды П1 и П2 имели одинаковые дозы (12 мкг/кг и 120 мкг/кг) так как молекулярный вес этих молекул не отличается друг от друга. Использовалась уже предварительно отработанная схема пятидневного введения препаратов одновременно и после отравления гидразином.

Была установлена высокая репаративная активность гепатоцитов и в других дозах этих препаратов (таблица 23). При повышении дозы пептидов в десять раз у тимогена (10 мкг/кг) так же наблюдается стимулирующий эффект. Тогда как при использовании его аналогов П1 и П2 в эквимолярной ему дозе (12 мкг/кг) регенерация переходит в сторону повышения числа двуядерных гепатоцитов, которые считаются резервом регенерации, так как повышался ИДГ, но не МИ гепатоцитов.

Таблица 23 - Гепатотропная активность (М±т) повышенных доз тимогена и его аналогов (5 дней введения) в условиях

отравления гидразином

Группы животных МИ, митотический индекс (%о) ИДГ, индекс двуядерных гепатоцитов (%), ПЯГ, площадь ядер 2 гепатоцитов, мкм2

1. Животные без отравления (введение изотонического раствора (КаС1) (п = 8) 2,9±0,1 11,3±0,2 38,3±0,2

Отравление гидразином + введение пептидов 10 дней (до, одновременно и после гидразина)

2. Введение гидразина и изотонического раствора - (п = 8) 3,6±0,21 10,9±0,21 40,0±0,31

3. Тимоген (10 мкг/кг) 19,5±0,5*12 о 13,7±0,3* о1,2 40,4±0,32

4. П1 (12 мкг/кг) Н2К-Б-А1а-Ь-а1и-Ь-Тгр-СООН 2,7±0,1 1,3 15,0±0,3* о1-3 40,7±0,32

5. П2 (12 мкг/кг) Н2К-Ь-а1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН 3,0±0,21,2,3,4 14,7±0,3* о1,2 42,8±0,42

6. Тимоген (100 мкг/кг) 19,3±0,4* о1,2,4,5 10,6±0,2345 38,2±0,22-5

7. П1 (120 мкг/кг) Н2К-Б-А1а-Ь-а1и-Ь-Тгр-СООН 20,4±0,5* о1-5 10,3±0,21-5 37,9±0,21-5

8. П2 (120 мкг/кг) Н2К-Ь-а1и-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН 19,8±0,5* о1-5 7 11,2±0,23,4,5,7 40,0±0,32,5,7

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

При изучении фрагментов печени в экспериментальной группе с коррекцией интоксикации гидразином пептидом П2 (12 мкг/кг) паренхима печени на большем протяжении имеет нормальное строение, участков некроза не отмечается. Сосуды не расширены. Дистрофические изменения слабо выражены (рисунок 20).

Рисунок 20 - Микрофотография фрагмента печеночного ацинуса в экспериментальной группе (гидразин +пептид П2 (12 мкг/кг)). Ув.х40. Окр. Г+Э

При стократно увеличенных дозах (100 мкг/кг для тимогена и 120 мкг/кг для П1 и П2) наблюдается повышение МИ, но не ИДГ. По всей видимости, изменение разовой дозы пептидов влияет на способ репаративной регенерации гепатоцитов - с помощью митозов или полиплоидизации.

При изучении фрагментов печени в экспериментальной группе с коррекцией интоксикации гидразином П2 (120 мкг/кг) денегеративные изменения печени отсутствуют. Сосуды в структуре триад, а также центральные вены без застойных изменений, не расширены. Явление отека и периваскулярной воспалительной инфильтрации не определяется (рисунок 21).

ЛИГ V1«

> ^^Д» * ** •-»у'*г*т' ^ДГ ^^Др^. - 'К

лета

¡, » Л > г». ,¡5 ."М»Т**• • '»* *ГЧ»■*-,

Рисунок 21 - Микрофотография фрагмента печеночного ацинуса в экспериментальной группе (гидразин +П2 (120 мкг/кг)). Ув.х40. Окр. Г+Э

При этом в области центральной вены балочное строение гепатоцитов восстановлено. Центральные вены незначительно расширены (рисунок 22).

-А'*

сШ&ЯгЯж

гаЮЯЯНЧИ^п*'' V: с *

-"«■■¿с; - -., •>, . * •

»¡.Ч* 1

а м мо "Ьо гоо ¿»\0е

Рисунок 22 - Микрофотография центролобулярных отделов печеночной дольки экспериментальной группе (гидразин +П2 (120 мкг/кг)). Ув.х40. Окр. Г+Э

В паренхиме печени дистрофические изменения практически отсутствуют. Клетки слегка набухшие только вокруг центральной вены. В поле зрения большое количество 2-ядерных гепатоцитов (рисунок 23).

Рисунок 23 - Микрофотография паренхимы печени в экспериментальной группе (гидразин + П2 (120 мкг/кг)). Ув.х200. Окр. Г+Э

При исследовании функции нейтрофилов было установлено, что при снижении их активности в условиях отравления гидразином тимоген и в более высоких дозах оказывает стимулирующее действие на активность нейтрофилов крови (таблица 24). Так тимоген в дозе 10 мкг/кг оказывал корригирующее влияние на показатели поглотительной и кислородзависимой активности нейтрофилов. Более выраженный эффект наблюдался при использовании новых аналогов тимогена - пептида П1(12 мкг/кг) и особенно пептида П2 (также 12 мкг/кг) в эквимолярных тимогену дозах. В отношении уровня ФИ эффекты пептида П2 выражены в большей степени по сравнению с тимогеном и сопоставимы с пептидом П1. Резерв кислородзависимой активности нейтрофилов (ФРН) также максимально повышал пептид П2.

Таблица 24 - Влияние повышенных доз пептидов (5 дней введения) на функциональную активность нейтрофилов (M±m, n=8) в плазме крови крыс в условиях отравления гидразином

№ Группы животных ФИ НСТ-сп. НСТ-инд. Функциональный резерв

1. Без отравления, введение изотонического раствора (NaCl) (n=8) 51,2 ±4,1 11,3 ±1,0 26,4 ±2,6 15,0± 1,3

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней (одновременно и после гидразина)

2. Контроль, введение изотонического раствора (NaCl) 26,8±2,2 о 1 7,1 ±0,5 о 1 14,2 ±1,3 о 1 7,1 ±0,6 о 1

3. Тимоген (10 мкг/кг) 46,7 ±3,8* 2 9,5 ±0,7* 2 22,9 ±1,4* 2 13,4 ±1,3* 2

4. П1 (12 мкг/кг) H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 53,3 ±4,1* 2 10,8 ±0,9* 2 23,2 ±1,4* 2 12,4 ±1,2* 2

5. П2 (12 мкг/кг) H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 56,9 ±4,2*23 10,7 ±0,7* 2 27,9 ±1,8*2,3,4 17,2 ±1,4*2-4

6. Тимоген (100 мкг/кг) 50,9 ±=4,5* 2 10,9 ±0,8* 2 25,5 ±2,1* 2 14,6 ±1,3* 2

7. П1 (120 мкг/кг) H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 48,6 ±=4,1* 2 11,9 ±0,9* 2 25,9 ±2,2* 2 14,0 ±1,2* 2

8. П2 (120 мкг/кг) H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 48,4 ±=4,0* 2 11,2 ±0,8* 2 25,6 ±2,1* 2 14,4 ±1,3*2

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

Его стимулирующий эффект был выше и тимогена и пептида П1, которые корригировали ФРН в этих условиях сопоставимо друг с другом.

При повышении разовой дозы в сто раз эффекты пептидов в отношении функции нейтрофилов не усиливались. Так тимоген (100 мкг/кг) и эквимолярные ему дозы новых аналогов П1 (120 мкг/кг) и П2 (120 мкг/кг) обладали корригирующим влиянием на активность нейтрофилов. Но усиления эффекта выявлено не было (таблица 24).

Таким образом, повышение дозы этих пептидов не приводит к пропорциональному усилению иммунокорригирующего эффекта в отношении функции нейтрофилов.

При использовании повышенных разовых доз пептидов уровень МДА также снижался как в крови, так и в гомогенате печени (таблица 25).

Таблица 25 - Влияние повышенных доз пептидов (5 дней введения) на

концентрацию МДА (М±т, п=8) в условиях отравления гидразином

№ п/п Группы животных МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в гомогенате печени

1. Без отравления (КаС1) 3,6±0,4 3,4±0,3

Отравление Гидразином + введение пептидов 5 дней

2. Контроль (№С1) 6,2±0,5 о 1 5,6±0,5 о 1

3. Тимоген (10 мкг/кг) 4,6±0,4*2 3,5±0,3*2

4. П1 (12 мкг/кг) ШК-Б-АЬ-Ь-аи-Ь-Тгр-СООН 4,1±0,3*2 2,1±0,2*1'2'3

5. П2 (12 мкг/кг) Н2К-Ь-аи-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН 4,4±0,4*2 2,0±0,1*1'2'3

6. Тимоген (100 мкг/кг) 3,3±0,3*2'3'5 3,6±0,3*2'4'5

7. П1 (120 мкг/кг) Н2К-Б-А1а-Ь-аи-Ь-Тгр-СООН 3,2±0,3*2-5 3,5±0,4*2'4'5

8. П2 (120 мкг/кг) Н2К-Ь-аи-Ь-Тгр-Б-А1а-СООН 1,9±0,2*1-7 3,3±0,3*2'4'5

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - означает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, р<0,05; цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, п - количество животных в группе

Так применение тимогена в дозе 10 мкг/кг приводило к снижению МДА в 1,4 раза в крови и в 1,6 раза в печени. Пептиды П1 и П2 в эквимолярной с тимогеном дозе 12 мкг/кг сопоставимо с тимогеном снижали уровень МДА в крови в 1,5 и 1,4 раза соответственно, но более выраженно по сравнению с тимогеном понижали концентрацию МДА в гомогенате печени в 2,7 и 2,8 раза. Их эффекты (П1 и П2) при использовании этой разовой дозы были сопоставимы друг с другом.

При стократном повышении дозы тимогена до 100 мкг/кг его эффект в отношении снижения уровня МДА усиливался только в крови, но не в гомогенате печени, где он был сопоставим с дозой 10 мкг/кг (таблица 25). Повышение разовой дозы пептида П1 до 120 мкг/кг также усиливало антиоксидантный эффект в крови, но ослабляло его в печени, и становился сопоставим с эффектом дозы пептида П1 12 мкг/кг. Повышение разовой дозы пептида П2 до 120 мкг/кг также приводило к усилению эффекта в отношении снижения МДА в крови, но и также ослабляло его в печени, и он также становился сопоставим с дозой пептида П2 12 мкг/кг.

Пептид П2 в дозе 120 мкг/кг имел максимальную выраженность эффекта среди всех пептидов в отношении МДА в крови и снижал его уровень в 3,3 раза по сравнению с отравленными животными, получавшими физиологический раствор. В печени же максимальную выраженность эффекта наблюдалась у пептидов П1 и П2 в дозе 12 мкг/кг.

При исследовании каталазы повышения ее активности не наблюдалось при использовании повышенных доз всех пептидов (таблица 26). Так повышение разовой дозы пептидов в десять и даже в сто раз не приводило к пропорциональному повышению активности каталазы в крови и в печени. Также наблюдался корригирующий эффект пептидов на активность каталазы и в повышенных дозах аналогичный тому, что было ранее при исследовании малых эквимолярных доз пептидов, что было выявлено в предыдущей серии экспериментов.

№ п/п Группы животных Каталаза в плазме крови, мкат/л Каталаза в гомогенате печени, мкат/л

1. Без отравления (NaCl) 10,9±1,0 6,5±0,5

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней

2. Контроль (NaCl) 7,9±0,6 о 1 5,0±0,3 о 1

3. Тимоген (10 мкг/кг) 10,1±0,8* 2 6,8±0,6* 2

4. П1 (12 мкг/кг) H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 10,4±0,9* 2 6,3±0,5*

5. П2 (12 мкг/кг) H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 10,6±1,0* 2 6,5±0,5* 2

6. Тимоген (100 мкг/кг) 10,8±1,1* 2 6,4±0,5* 2

7. П1 (120 мкг/кг) H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 11,1±1,2* 2 6,6±0,5* 2

8. П2 (120 мкг/кг) H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 11,4±1,3* 2 6,7±0,5* 2

Примечания: о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, * - означает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, р<0,05; цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, п - количество животных в группе

По биохимическим показателям крови тимоген ослаблял выраженность синдрома холестаза в дозе 10 мкг/кг, снижая концентрацию билирубина и ЩФ, повышение которых было вызвано поражением печени гидразином (таблица 27). В дозе 100 мкг/кг тимоген снижал только уровень ЩФ. Достоверного ослабления других показателей под действием тимогена не было выявлено. Новые аналоги

проявляли более выраженную активность в отношении снижения, повышенных в результате отравления, биохимических показателей. Наиболее выраженное снижение уровней АЛТ, АСТ, билирубина и ЩФ отмечалось при введении пептида П2 в дозе 12 мкг/кг. В отношении ЩФ было выявлено даже корригирующее влияние. Но повышение доз пептидов в десять раз не дало усиления этих эффектов (таблица 27).

Таким образом, повышение доз пептидов в наибольшей степени проявлялось в отношении антиоксидантной активности, а именно уровня МДА. В отношении других эффектов усиления их эффектов повышением разовых доз пептидов добиться не удалось. Учитывая расход препаратов и проявляемые ими эффекты, в дальнейшем можно рекомендовать к использованию малые и средние дозы пептидов. Так для тимогена - это 1 или 10 мкг/кг и соответствующие эквимолярные дозы пептидов П1 или П2 (1,2 или 12 мкг/кг). По ряду показателей более выраженную активность в отношении изученных эффектов проявлял пептид П2.

Таблица 27 - Влияние повышенных доз пептидов (5 дней введения) на биохимические показатели (М ± т, п=8) в плазме крови крыс в условиях отравления гидразином

№ Группы животных АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Билирубин, мкмоль/л Щелочная фосфатаза, нмоль/(с * л)

1. Без отравления, введение изотонического раствора (КаС1) 0,41±0,04 0,19±0,02 26,7±2,6 199,3±18,2

Отравление гидразином + введение пептидов 5 дней

2. Контроль, введение изотонического раствора (NaCl) 1,21±0,11 о 1 0,38±0,04 о 1 89,8±8,5 о 12 502,6±48,4 о 1

3. Тимоген (10 мкг/кг) 0,91±0,09 о * 1 0,36±0,03 о 1 56,9±5,7 о * 1'2 342,6±32,3 о * 1'2

4. П1 (12 мкг/кг) H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 0,82±0,08 о * 1'2 0,31±0,03 о 1 68,7±5,8 о * 1'2 246,8±25,2 о *2'3

5. П2 (12 мкг/кг) H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 0,78±0,08 о * 1'2 0,27±0,02 о * 1'23 55,1±5,1 о *1'2'4 162,8±15,8*23'4

6. Тимоген (100 мкг/кг) 0,89±0,09 о * 1 0,34±0,04 о 1 66,9±6,5 о * 1 311,2±30,3 о *1'2'5

7. П1 (120 мкг/кг) H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH 0,91±0,09 о * 1 0,32±0,03 о 1 62,5±5,9 о * 1'2 229,1±20,4*2'3'5'6

8. П2 (120 мкг/кг) H2N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 0,81±0,08 о * 12 0,35±0,03о 1 63,0±6,1 о * 12 223,5±19,5*2'3'5'6

Примечания: * - показывает достоверные отличия по сравнению с контролем отравленных животных, о - показывает достоверные отличия по сравнению с животными без отравления, цифры показывают достоверные отличия между группами по критерию Крускала-Уоллиса, р<0,05; п - количество животных в группе

при поражениии печени гидразином

Известно, что эффекты пептидов могут быть усилены синергичным или даже потенцирующим действием различных пептидов однонаправленного действия [55, 57]. Поэтому, эффекты тимогена и его новых аналогов с другими гепатопротекторными пептидами требует дальнейшего изучения. При этом известным гепатотропным пептидом является так называемый фактор роста клеток печени или пептид ОИК (Гли-Гис-Лиз), который обладает выраженными репаративными эффектами [110, 112, 120], в том числе и при токсических поражениях печени [9, 48].

В связи с этим следующим этапом стало выявление комбинированного применения пептидов - тимогена и его аналогов с пептидом ОИК, который также можно рассматривать как гепатопротекторный пептидный препарат сравнения.

Поскольку существенного усиления гепатопротекторного эффекта повышением разовой дозы пептидов добиться не удалось, то в дальнейшем были использованы начальные эквимолярные разовые дозы. Тимоген и его новые аналоги вводились в парных сочетаниях с пептидом ОИК в условиях отравления гидразином. Поскольку оба эти пептида имеют практически одинаковую молекулярную массу, то и тимоген и ОИК вводились в одинаковых разовых дозах (1 мкг/кг). Новые модифицированные аналоги тимогена тяжелее на остаток Б-аланина, поэтому они вводились в эквимолярной к тимогену и ОИК дозе (1,2 мкг/кг).

Репаративные эффекты сочетанного введения пептидов представлены в таблице (таблица 28). Пептиды по отдельности (тимоген и ОИК) стимулировали репаративную регенерацию гепатоцитов, тогда как при использовании парных сочетаний наблюдалось усиление репаративного эффекта как тимогена и ОИК, так и аналогов тимогена и ОИК.

Таблица 28 - Влияние введения комбинаций пептидов (5 дней введения) на регенерацию гепатоцитов (M±m, n=8) в плазме крови крыс в условиях отравления гидразином

№ Группы животных МИ, митотический индекс (%о) ИДГ, индекс двуядерных гепатоцитов (%), ПЯГ, площадь ядер 2 гепатоцитов, мкм