Фармакогностическое изучение морозника абхазского (Helleborus abchasicus A.Br.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Ищенко, Залина Васильевна

• Ищенко, Залина Васильевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Ищенко, Залина Васильевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Систематическое положение рода НеИеЬогиз Ь

1.2 Морфологические признаки видов рода НеИеЬогиз Ь

1.3 Ареал распространения рода НеИеЬогиз Ь

1.4Химическая изученность видов рода НеИеЬогиз Ь

1.5 Фармакологическое исследование основных групп биологически активных веществ рода НеИеЬогиз Ь. и применение в официальной медицине

ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Метод фенологических наблюдений

2.2.2 Методы обнаружения и идентификации биологически активных соединений

2.2.2.1 Приготовление извлечений для проведения качественных реакций

2.2.2.2 Аминокислоты

2.2.2.3 Дубильные вещества

2.2.2.4 Флавоноиды

2.2.2.5 Полисахариды

2.2.2.6Липиды

2.2.2.7 Алкалоиды

2.2.3 Хроматографические методы

2.2.3.1 Методы бумажной и тонкослойной хроматографии

2.2.3.2 Метод препаративной хроматографии

2.2.3.3 Метод газо-жидкостной хроматографии

2.2.3.4 Метод жидкостной хроматографии

2.2.3.5 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.2.4 Спектральные методы

2.2.4.1 Метод УФ-спектрофотометрии

2.2.4.2 Метод масс-спектроскопии

2.2.4.3 Метод эмиссионного спектрального анализа

2.2.5 Гравиметрические методы

2.2.6 Титриметрические методы

2.2.7 Технологические методы

2.2.8 Фармакологические методы исследования

2.2.8.1 Изучение острой токсичности жирного масла морозника кавказского

2.2.8.2 Изучение противовоспалительного действия олеогеля с маслом морозника кавказского

2.3 Микробиологические методы

2.3.1 Определение микробиологической чистоты сырья морозника кавказского и морозника абхазского

2.3.2 Определение микробиологической чистоты олеогеля

2.4 Методы стандартизации сырья и масла

2.4.1 Отбор проб для анализа

2.4.2 Методы морфолого-анатомического исследования

2.4.3 Определение числовых показателей качества сырья

2.4.4 Определение срока хранения масла

2.5 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ И ТРАВЫ МОРОЗНИКА КАВКАЗСКОГО И МОРОЗНИКА АБХАЗСКОГО

3.1 Изучение липидов семян и корневищ с корнями морозника кавказского и

морозника абхазского

3.1.1 Определение основных показателей масла семян и корневищ с корнями морозника кавказского и морозника абхазского

3.1.2 Определение количественного содержания нейтральных и полярных липидов

3.1.3 Определение классового состава нейтральных и полярных липидов

3.1.4 Изучение жирнокислотного состава

3.1.5 Определение содержания пигментов в липидах корневищ с корнями и семян исследуемых видов

3.1.6 Определение количественного содержания алкалоидов в полярных

липидах и в шроте после выделения липидов

3.2 Фитохимическое изучение травы морозника кавказского и морозника абхазского

3.2.1 Изучение фенольных соединений

3.2.2 Изучение аминокислотного состава

3.2.3 Определение содержания полисахаридов

3.2.4 Изучение элементного состава

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3

ГЛАВА 4 ИНТРОДУКЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРОЗНИКА КАВКАЗСКОГО И МОРОЗНИКА АБХАЗСКОГО НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

4.1 Изучение онтогенеза морозника кавказского и морозника абхазского

4.2 Изучение ритма сезонного развития морозника кавказского и морозника абхазского

4.3 Определение урожайности корневищ с корнями и семян морозника

кавказского и морозника абхазского

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4

ГЛАВА 5 МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОРОЗНИКА КАВКАЗСКОГО И МОРОЗНИКА АБХАЗСКОГО И УСТАНОВЛЕНИЕ ТОВАРОВЕДЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СЫРЬЯ

5.1 Морфолого-анатомическое исследование

5.1.1 Установление морфологических и анатомо-диагностических признаков корневищ с корнями

5.1.2 Установление морфологических и анатомо-диагностических признаков стебля

5.1.3 Установление морфологических и анатомо-диагностических признаков листовой пластинки

5.2 Определение товароведческих показателей

5.3 Определение срока хранения масла морозника кавказского

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5

ГЛАВА 6 РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ

КОСМЕТИЧЕСКОГО ОЛЕОГЕЛЯ С МАСЛОМ МОРОЗНИКА КАВКАЗСКОГО

6.1 Биофармацевтические исследования с целью обоснования состава косметического олеогеля

6.2 Изучение намазывающей и прилипающей способности олеогеля с маслом морозника кавказского

6.3 Разработка технологической схемы производства косметического олеогеля с маслом морозника кавказского

6.4 Изучение термостабильности и коллоидной стабильности олеогеля

6.5 Микробиологическая чистота

6.6 Определение стабильности олеогеля в процессе хранения с целью

установления срока годности

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 6

ГЛАВА 7 ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЖИРНОГО МАСЛА И ОЛЕОГЕЛЯ С МАСЛОМ МОРОЗНИКА КАВКАЗСКОГО

7.1 Изучение острой токсичности жирного масла

7.2 Изучение противовоспалительного действия олеогеля

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 7

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

120

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакогностическое изучение морозника абхазского (Helleborus abchasicus A.Br.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.)»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Интерес к изучению липидов и разработке лекарственных препаратов на их основе связан с тем, что они выполняют защитную, энергетическую, иммуномодулирующую, барьерную функции, обеспечивают механическую плотность клеток и принимают участие в важнейших биохимических процессах. Основными компонентами липидов, отвечающими за их биологическую активность, являются жирные кислоты, в числе которых наибольший интерес представляют так называемые эссенциальные семейств со-3, со-6, со-7 и со-9.

Среди растительных источников липидов флоры Северного Кавказа несомненный практический и научный интерес представляют виды рода морозник: морозник абхазский {НеИеЪогт аЪсказгст А. Вг.) и морозник кавказский (НеПеЬогш саисазкш А. Вг.) семейства лютиковых (ЯапипсЫасеае). Данные виды являются многолетними травянистыми вечнозелеными декоративными растениями и накапливают жирное масло не только в семенах в количестве около 30%, но и в корнях и корневищах (до 18%), что является нехарактерным для высших растений.

Изучение грузинскими учеными (Э.П. Кемертелидзе, Ц.М. Далакашвили и др.) липидов семян и корней морозника кавказского (м. кавказского) и морозника абхазского (м. абхазского) показало, что нейтральные липиды семян морозника отличаются от липидов семян высших растений высоким содержанием свободных жирных кислот (около 70%) и низким - триацилглицеридов (4-6%), а липиды корневищ с корнями представляют интерес, т.к. характеризуются специфической противоопухолевой активностью. На основе липидов корней и корневищ разработан препарат Геллипол для лечения раковых опухолей; в гомеопатии используется тинктура и масло корней морозника. Подземные органы морозника содержат буфадиенолиды и ранее использовались в качестве сырья для получения препарата Коге1Ьопп К кардиотонического действия.

В настоящее время численность видов рода морозник сокращается в результате вырубки лесов, сбора цветов на букеты, и, главное, выкопки корневищ для использования их в качестве лекарственного средства. Одним из способов уменьшения нагрузки на природные сообщества является введение данных видов в культуру. Именно поэтому интродукция, изучение биологических особенностей развития м. кавказского и м. абхазского в условия Ставропольского края, исследование липидов корневищ с корнями и семян для обоснования возможности комплексного рационального использования сырья являются актуальной задачей для фармацевтической науки и практики.

Степень разработанности темы В результате исследований, проведенных учеными института фармакохимии им. И. Кутателадзе и Пятигорской фармацевтической академии, был установлен буфадиенолидный, стероидный, микроэлементный, аминокислотный и полисахаридный составы м. кавказского и м. абхазского. Из экстракта листьев м. кавказского было выделено 9 фуростаноловых гликозидов, названных кавказозидами Е-М. При извлечении сердечных гликозидов из корней и корневищ м. абхазского в институте Фармакохимии им. И. Кутателадзе в качестве побочного продукта было получено жирное масло в количестве 15-18%, мажорными жирными кислотами которого явились линолевая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая.

Интродукционных исследований и изучения фитохимического состава морозников в условиях интродукции не проводилось.

Цель и задачи работы Цель работы - введение в культуру морозника кавказского и морозника абхазского в условиях Ставропольского края и экспериментальное обоснование применения семян и корней интродуцированных видов как сырьевых источников масла, содержащего эссенциальные жирные кислоты семейства со-3 и со-6;

проведение фитохимических исследований надземной части для определения возможности рационального использования сырья.

Задачи исследования:

1. Провести интродукционные исследования морозника кавказского и морозника абхазского на базе ботанического сада Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России;

2. Провести подробное сравнительное изучение липидов семян и корневищ с корнями дикорастущих и интродуцированных видов;

3. Провести сравнительное фитохимическое исследование надземной части морозника кавказского и морозника абхазского;

4. Установить диагностические признаки и определить товароведческие показатели сырья;

5. Создать космецевтическое средство (олеогель) на основе масла исследуемых видов.

6. Провести определение острой токсичности и противовоспалительного действия выделенного масла и разработанного олеогеля.

Научная новизна

Впервые проведены исследования по интродукции морозника кавказского и морозника абхазского в условиях Ставропольского края: изучены особенности развития видов и урожайность. Впервые установлен состав БАС репродуктивных и вегетативных органов интродуцированных видов морозника. Подробно изучен состав нейтральных и полярных липидов корневищ с корнями и семян м. кавказского и м. абхазского. В траве интродуцированных видов определено количественное содержание фенольных соединений и выявлен их компонентный состав.

Проведено морфолого-анатомическое изучение корневищ с корнями исследуемых видов морозника, установлены их диагностические признаки и товароведческие показатели.

На основе масла корневищ с корнями м. кавказского разработано космецевтическое средство (олеогель).

Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость. В результате проведенных экспериментальных исследований химического состава липидов семян и корней интродуцированных м. кавказского и м. абхазского доказана целесообразность их применения как источников жирного масла, содержащего со-3 и со-6 эссенциальные жирные кислоты для применения в космецевтике. Изучение химического состава извлечений из травы свидетельствуют о перспективности их дальнейших фармакологических исследований.

Практическая значимость. Методики анализа масла морозника, включенные в проект ФСП «Масло морозника для наружного применения», апробированы в ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» Министерства Здравоохранения РСО-Алания (акт апробации от 07.05.2013г.).

Методология и методы исследования Методология фармакогностического исследования подразумевает научно обоснованную и целесообразно организованную последовательность действий и включает несколько блоков: информационно-исследовательский, фитохимический, технологический, стандартизационный и фармакологический. При проведении работы использовались следующие методы исследований: биологические, химические, физико-химические (ГЖХ, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ, жидкостная хроматография, масс-спектроскопия и др.), микробиологические, технологические и фармакологические.

Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование применения корневищ с корнями и семян морозника абхазского и морозника кавказского в качестве сырья для получения жирного масла, богатого эссенциальными жирными кислотами.

2. Результаты изучения липидов семян и корней м. абхазского и м. кавказского.

3. Результаты фитохимического изучения травы исследуемых видов.

4. Результаты интродукционных исследований морозника кавказского и морозника абхазского.

5. Результаты определения анатомо-диагностических признаков корней исследуемых видов.

6. Результаты технологических исследований по разработке космецевтического средства - олеогеля.

Степень достоверности и апробация результатов Достоверность полученных результатов достигается благодаря использованию современных химических, физико-химических, технологических, биологических и фармакологических методов, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. Результаты измерений статистически обработаны. Апробация методик анализа липидов в условиях ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» МЗ РСО-Алания показала их воспроизводимость, что также подтверждает достоверность полученных данных. Основные положения диссертационной работы доложены на VII Всероссийской конференции с молодежной научной школой «Химия и медицина, 0рхимед-2009» в июле 2009 года (г. Уфа); научной конференции Пятигорского филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» в январе 2013 г. (г. Пятигорск). По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в т.ч. 2 - в журналах, рекомендованных ВАК.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

1. ГЛ - гликолипиды

2. ДАТ - диацилглицериды

3. МАГ - моноацилглицериды

4. НЛ - нейтральные липиды

5. ПЛ - полярные липиды

6. СЖК - свободные жирные кислоты

7. СЭТС - сложные эфиры тритерпеновых соединений

8. ТАГ - триацилглицериды

9. ФЛ - фосфолипиды

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Систематическое положение рода Helleborus L.

Род Helleborus L. относится к классу Магнолиопсид (Magnoliopsida) или Двудольных (Dicotylédones), подклассу Ранункулиды (Ranunculidae), семейству лютиковых (Ranunculaceae) [83]. Научно установленным род Helleborus L. считается с 1753 года, когда К. Линней привел его с видами: Н. niger и H. viridis.

Это сравнительно небольшой подкласс, насчитывающий около десяти семейств, произошедший видимо от магнолиид, предками которых были растения типа современных бадьяновых. Растения, входящие в эту группу, преимущественно, травянистые и среди них нет бессосудистых форм. Тычинки и плодолистики также более специализированого типа, пыльцевые зерна никогда не бывают однообразными [85].

В подклассе один надпорядок - Лютиковые (Ranunculaceae), который объединяет три порядка: Лютиковые (Ranunculaceae), Маковые (Papaverales) и Пионовые (Paeoniaceae).

Порядок Лютиковые (Ranunculaceae) включает в себя следующие семейства: лардизобаловые, саржентодоксовые, лунносемянниковые, барбарисовые, глауцидиевые, лютиковые, цирцеастровые. Большей частью это травы, кустарники и лианы.

Семейство лютиковые (Ranunculaceae) насчитывает около 50 родов и более 2000 видов, произрастающих чаще в умеренных и холодных областях. В тропиках и субтропиках лютиковые встречаются реже и в основном в горных районах, предпочитая умеренный и прохладный климат. Среди представителей семейства немало водяных растений, или растений, требующих высокой влажности, имеются также эндемы [26].

Семейство Яапипси1асеае делится на 4 подсемейства: гидрастисовые, лютиковые, василисниковые и кингдониевые. Род Морозник (НеПеЬогш) подсемейства Лютиковые насчитывает более 20 видов, распространенных по горным системам юга Западной и Средней Европы, Малой Азии, Кавказа, Западной и центральной Азии [10].

1.2Морфологические признаки видов рода НеПеЬогиБ Ь.

По ряду примитивных признаков, в том числе и вечнозелёности, род Морозник НеПеЬогиБ (лат. «убивать» и «пища, еда») может претендовать на положение исходного, предкового таксона в подсемействе НеИеЬогасеае [45,59].

Виды рода морозник - это многолетние травянистые растения высотой 2550 см, имеющее короткие, горизонтальные корневища бурого цвета с многочисленными длинными, шнуровидными, темно-бурыми придаточными корнями. Прикорневые листья одиночные (реже 2), обычно кожистые, зимующие, по 1-2 на длинных черешках, пластинка листа в очертании округло-почковидная 10-25(40) см в диаметре рассечена на 5-11 широкоэллиптических (м. кавказского, м. абхазского и др.) или эллиптических (м. черный), к основанию суженых, пильчатых сегментов до 15 см длиной, с резко выступающей сетью жилок, темно-зеленого цвета, снизу более светлых и слегка опушенных. Стеблевые листья, в количестве 1-2, сидячие, значительно мельче и менее рассечены, чем прикорневые. Цветоносы 20-50 см высотой с 1-3 цветками на верхушке стебля, крупные, до 8 см в диаметре, околоцветник неопадающий, простой из пяти-шести лепестковидных, широкояйцевидных листочков, достигающих 20-40 мм длины, различной окраски от светло-зеленых, бело-зеленых, желто-зеленых светло палевых и белых с темно-пурпуровыми точками у основания (м. кавказский и

абхазского), до крапчатых, пурпурных и даже темных окрасок (м. краснеющий, черный). Нектарники (видоизмененные лепестки) золотистые или золотисто -зеленые, в количестве 5-12 [87, 90].

Плоды из 3-5 несросшихся в зрелом состоянии кожистых листовок с длинным носиком, вскрывающиеся вдоль с внутренней стороны. Семена темные, эллиптические или шаровидные, с небольшим носиком, сбоку килеватые, ячеистые, 4-5 мм длиной, созревают в конце апреля - июня [10, 14].

Семена морозников быстро осыпаются, поэтому вокруг взрослых растений всегда можно видеть обильный самосев. Единичные всходы могут появиться осенью, а массовые - весной следующего года.

К концу первого года жизни растения образуют 1-2 листа и достигают высоты 3-4 см. Зацветают морозники на 4-5-й год после посева в декабре -апреле. Вегетируют до поздней осени и долгое время (более 10 лет) могут расти на одном месте без пересадки.

1.3 Ареал распространения рода Helleborus L.

Род Helleborus L. распространен от Атлантической Европы до центральной Азии, от 35° ю. ш. до 54° с.ш. Из субтропической зоны некоторые виды рода заходят в умеренную зону до линии: Северный Кавказ, Саврань на Южном Буге, Рашков, Жванец на Днепре, до 54° с.ш. на западе Европы.

Для Северного Кавказа характерными являются два 2 вида: морозник кавказский (Helleborus caucasicus A.Br.) и морозник абхазский (Helleborus abhasicus A.Br.).

Первые упоминания о представителях рода морозник, произрастающих на Кавказе, имеются в работе А. Брауна «Index seminum Hort Berol.» (1853г.), где он

дает подробное описание 4 видам: Н. caucasicus A.Br., Н. abhasicus A.Br., Н. ponticus A. Br., Н. guttatus A.Br. Et Sauer [25].

При дальнейшем изучении систематики рода Helleborus L. флоры Кавказа A.A. Колаковский указывает на полиморфизм вида, и по окраске чашелистиков выделяет 10 разновидностей, объединенных в 1 вид - Н. polychromus (comb. Nova).

A.A. Гроссгейм во «Флоре Кавказа» представляет 3 описанных А. Брауном вида (Н. caucasicus, Н. abhasicus и Н. guttatus).

И.М. Крашенников считал, что на Кавказе обитает 3 самостоятельных вида: Н. abhasicus A.Br. - эндемик Западного Закавказья, Н. guttatus A.Br. Et Sauer -эндемик Восточного Закавказья и Н. caucasicus A.Br. - вид, широко распространенный на Кавказе и в Малой Азии [25].

Нами было принято решение об изучении 2 видов морозника, наиболее распространенных во флоре Северного Кавказа - Helleborus caucasicus A.Br. и Helleborus abhasicus A.Br.

M. кавказский (Helleborus caucasicus A. Br.) и морозник абхазский (Helleborus abhasicus A.Br.) произрастают по опушкам, в дубовых, буковых и пихтово-еловых лесах юго-западной части Краснодарского края (район по с. Псебай), на территории Карачаево-Черкесской республики (пос. Курджиново), в некоторых районах Ставропольского края, предгорий Кубани и Черноморского побережья.

Почти перекрывая ареал м. кавказского, произрастает эндемичный вид м. абхазский: Кавказ, Западный Кавказ, предгорье Кубани и Черноморского побережья: Туапсе, Сочи, Адлер, Хоста и др.

В Западной части Атлантической Европы, в предальпийском поясе северовосточных и южных цепей Альп, в Польше, Сербии, Греции, на Карпатах и на Украине встречаются еще несколько видов, в том числе: Helleborus niger L.- м. черный, Н. purpurescens Waldst. Et Kit.- м. краснеющий, Н. foetidus — м. вонючий,

H. orientalis - м. восточный, Н. х hybridus hört. - м. гибридный, Н. argutifolius = Н. corsicus - м. корсиканский).

Все виды, произрастающие на территории бывшего СССР, относятся к редким растениям (балл редкости 3), однако в Биологическом Энциклопедическом словаре отмечено, что в охране особенно нуждаются кавказские виды морозника, так как в последнее время они хищнически истребляются, и запасы их сокращаются [92].

Ранее в промышленных масштабах использовали только м. красноватый (Н. purpurascens) как источник для получения сердечного гликозида корельборина П. С конца 60-х годов производство этого препарата на опытном заводе в г. Харькове было прекращено в связи с нехваткой сырьевой базы.

1.4 Химическая изученность видов рода Helleborus L.

На первой стадии исследований интерес к растениям рода Helleborus L. обуславливался наличием в них карденолидов - буфадиенолидов, которые сочетают положительные стороны действия препаратов наперстянки и строфанта, так же относящихся к группе растений, содержащих сердечные гликозиды [27,28].

Буфадиенолиды - сложные органические соединения типа эфиров, расщепляющиеся при гидролизе под влиянием энзимов (ферментов), содержащихся в растениях, на сахара (гликоны) и бессахаристую часть (агликоны, или генины). Агликоны имеют стероидную (циклопентанпергидрофенантреновую) структуру с различными радикалами в разных положениях ядра.

Буфадиенолиды представляют собой С24-стероиды, имеющие в боковой цепи дважды ненасыщенное шестичленное лактонное кольцо, они так же несут

14(3 - гидроксильную группу. В отличии от карденолидов, являющихся растительными агликонами, буфадиенолиды - продукты синтеза как растительных, так и животных организмов (некоторых видов жаб).

Существенным отличием буфадиенолидов от карденолидов является то, что биологическая активность свободных буфадиенолидов (при внутривенном введении) не уступает соответствующим им буфотоксинам, а в некоторых случаях превосходит их.

Основные исследования по изолированию и изучению гликозидного состава растений рода НеНеЬошБ пришлись на 40-50-е годы прошлого века: в 1948 году А. Михайловым впервые был выделен высокоактивный аморфный гликозид геллебореин (С- биозид) из м. кавказского (Н. саисазюиэ). В 1949-1950 гг. ученым Харьковского НИИ химии и технологии лекарственных средств Д.Г. Колесникову и М.Я. Троппу методом перекристаллизации из метилового спирта удалось получить корельборин К, аналогичный дезглюкогеллебрину, полученному из м. черного, и корельборин П в кристаллическом виде. В ходе дальнейших химических исследований было установлено наличие в агликоновой части молекулы шестичленного лактонного кольца, а так же выявлено, что из Корельборина П, являющимся дигликозидом, путем энзиматического расщепления может быть получен монозид, который оказался идентичным

СН

Рисунок 1 - Структурная формула буфадиенолидов

корельборину К как по физико-химическим, так и биологическим свойствам [7, 47].

Из корневищ с корнями других видов рода Helleborus L. (Н. viridis (м. зеленый), Н. niger L. (м. черный) и Н. foetidus (м. вонючий) Гуземаном и Марме были выделены два гликозида: геллебореин и геллеборин, первый из которых является буфадиенолидом и оказывает кардиотоническое действие, второй -сапонином и проявляет гемолитический эффект. В дальнейшем геллебореин и геллебрин были получены в кристаллическом виде.

Основательно учеными Харьковского НИИ химии и технологии лекарственных средств изучался и другой вид - м. краснеющий Н. purpurescens Waldst. Et Kit. Из корней и корневищ м. красноватого был выделен гликозид, оказавшийся идентичным геллебрину, а также дезглюкогеллброл, дезглюкогеллебрин и геллебригенин. Было так же отмечено, что геллебригенин, в противоположность другим свободным агликонам проявляет более высокую биологическую активность, нежели его гликозид [57].

Буфадиенолиды (геллебортин А, И и С) были обнаружены в метанольном экстракте семян морозника украшенного Helleborus torquatus [103].

Китайскими учеными из корней м. тибетского Helleborus thibetanus French, помимо известных буфадиенолидов (геллебригенина и дезглюкогеллебрина), были выделены два новых, названных тигенказид А и тигенказид В [109].

Большой вклад в изучение рода Helleborus, а именно м. абхазского внесли грузинские ученые (Э.П. Кемертелидзе, Ц.М. Далакишвили) института фармакохимии им. И. Кутателадзе, которые установили буфадиенолидный и стероидный составы вида. В составе буфадиенолидов идентифицировали корельборин К (дезглюкогеллебрин) (0,65%) и корельборин - П (геллебрин) (0,16%), в составе стероидов - ситостерин (2,9%) и эфиры стеринов (0,7%) [15,16].

Ряд работ также был посвящен фитохнмическому анализу надземной части различных видов морозника.

Так, исследование химического состава травы цветущего м. черного отражено в работе Мартинека (Магипек А.). Автором в листьях были обнаружены у- лактоны ранункозид и ранункулин (более 0,1%) [107].

В надземной части м. кавказского и м. красноватого выявлено высокое содержание экдистероидов. Данные виды являются видами вторичного значения по содержанию экдистероидов во флоре России [86].

В листьях, лепестках и тычинках м. черного идентифицированы флавоноидных соединений: кемферола и гликозида кверцетина [102].

В корнях и листьях м. абхазского определено содержание у-лактона ранункулина и анемонина в количестве более 0,1 % [20].

В Пятигорской фармацевтической академии был изучен микроэлементный и полисахаридный состав м. кавказского: установлено, что содержание водорастворимых полисахаридов составляет около 6,5 %. Из корней и корневищ м. кавказского выделена липидная фракция (11,5%), идентифицировано наличие у - лактонов, ранункулина и анемонина, в гидролизате корневищ с корнями обнаружена феруловая кислота. Методом ТСХ изучен аминокислотный состав [5, 60].

Пхеидзе Т.А. с соавторами в листьях и цветках м. абхазского был идентифицирован стероидный сапонин смилагенин [71].

Грузинскими учеными Тбилисского института Фармакохимии им. И. Кутателадзе совместно с итальянскими исследователями института Биомедицины и фармации в 2008 году из метанольного экстракта надземной части м. кавказского были выделены новые фуростаноловые гликозиды (буфадиенолиды и экдистероиды), названные кавказозидами А, В, С, Б [108], а в 2011 году из метанольного экстракта листьев м. кавказского были выделены еще 9 гликозидов

(кавказозиды Е-М), основой структуры котор! полигидроксилированные нестероидные агликоны [100]. явл [Я ю тся

При выделении сердечных гликозидов из корней и корневищ м. абхазского в институте Фармакохимии им. И. Кутателадзе в качестве побочного продукта было получено жирное масло в количестве 15-18%. Исследования выделенного масла показали, что оно отличается от липидов семян высших растений высоким содержанием свободных жирных кислот и низким - триацилглицеридов. Мажорными жирными кислотами масла явились линолевая (45,6%), пальмитиновая (36,9%), олеиновая (13,1%) и стеариновая (4,4%). Из фракции стеринов были выделены пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая жирные кислоты, выявлено, что основным компонентом смеси эфиров стеринов является Р-ситостерин. В триглицеридной фракции масла, помимо глицерина, были обнаружены диолы - этиленгликоль и бутандиол [18,19,101].

Изучение зависимости химического состава липидов корневищ с корнями от фаз вегетации - повторного созревания семян и первого цветения показало, что содержание липидов в подземных органах повышается в фазу бутонизации до созревания семян (февраль, март, апрель, май) а затем резко снижается (июнь, июль) (табл. 1).

С фазы повторной бутонизации в августе наблюдается активизация накопления липидов, которая достигает максимума в период повторного созревания.

Помимо химического состава корневищ с корнями м абхазского, в институте Фармакохимии им. И. Кутателадзе, в частности Ц.М. Далакишвили, был исследован липидный состав семян второй фазы вегетации. Выделено около 30% липидов и установлено, что нейтральные липиды семян м. абхазского второй фазы вегетации обогащены углеводородами и свободными жирными кислотами [17, 21].

Таблица 1 - Содержание липидов в подземных органах м. абхазского по фазам

вегетации

Время сбора Фаза развития растения Содержание суммы липидов, %

22.IX.74 цветение 16,2

20.Х.74 созревание семян 17,9

21.IX.74 созревание семян 11,8

26.VII.75 вегетация 11,4

20.1.75 вегетация 11,8

27.111.75 бутонизация 14,2

20.11.75 цветение (повторное) 14,3

29.IV.75 цветение (повторное) 15,9

20.У.75 созревание семян 15,8

22.VI.75 вегетация 13,1

21.VII.75 вегетация 12,9

25.VIII.75 повторная бутонизация 14,2

1.5 Фармакологическое исследование основных групп биологически активных веществ рода НеПеЬогш Ь. и применение в официальной медицине

О кардиотонической активности различных видов морозника было известно давно. Упоминания о его применении можно найти еще у древних греков. Выдающийся философ и медик Авиценна отзывался о морознике как о ядовитом и сильнодействующем растении. В дальнейшем морозник привлекал внимание многих исследователей.

Так, в 1861 году В.Г. Дыбковский, а затем в 1866 г. К.А. Лопушинский в опытах на лягушках и собаках установили действие морозника на сердечнососудистую систему. В 1887 г. ординатор известного русского врача С.П. Боткина Н. Чистович показал, что экстракт м. зеленого тонизирует сердце теплокровных животных. Данные исследования, а также результаты клинического применения морозника дали основание Н. Чистовичу сделать вывод, что морозник проявляет кардиотоническую активность.

Исследования м. кавказского показали, что данный вид обладает большей кардиотонической активностью (88 ЛЕД в 1мг), чем м. красноватый (66 ЛЕД в 1мг), хотя содержит те же вещества буфадиенолидной природы [69].

Фармакологические исследования гликозидов м. краснеющего и м. кавказского выявили, что основными эффектами являются кардиотропный -усиление сократительных свойств миокарда, положительные ино- и тонотропное и отрицательное хронотропное действие [72].

Корельборин П усиливает сократительные свойства миокарда, вызывает длительное замедление атрио-вентрикулярной проводимости и укорочение электрической систолы сердца. Его применение оправдано при нарушении кровообращения, главным образом, при хронической недостаточности сердца, особенно в тех случаях, когда требуется быстрый и длительный эффект (что выгодно отличает его от препаратов наперстянки и строфанта). Действие сохраняется и при приеме внутрь. Диуретические свойства определяются химической близостью этих гликозидов к гликозидам морского лука. Гликозиды морозников оказывают также сильное успокаивающее действие, скорее всего, за счет воздействия на обмен серотонина. Исследование м. пахучего, произрастающего в Болгарии, показало, что содержащиеся в нем гликозиды также обладают значительной кардиотонической активностью, которая в 10 раз превышает активность гликозидов наперстянки и в 3,5 раза ниже активности строфантина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ищенко, Залина Васильевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аравийская, Е.Р. Профилактика и коррекция возрастных изменений кожи с помощью омега-3 ПНЖК / Е.Р. Аравийская, Е.В. Соколовский, Д.В. Васильев // Эксперим. и клинич. дерматокосметология. - 2009. - №3. - С.31-35.

2. Бандюкова, В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографирования на бумаге / В.А. Бандюкова // Раст. ресурсы. - 1965. - Т. 1, вып. 4. - С. 591-596.

3. Березовская, И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения / И.В. Березовская // Хим.-фармац. журн. - 2003. - Т.37, № 3. - С. 32-34.

4. Биофармация: учеб. / А.И. Тихонов [и др.]. - Харьков: Золотые страницы, 2003. - 240 с.

5. Бутенко, Л.И. Разработка методов анализа гомеопатических препаратов морозника / Л.И. Бутенко, С.А. Кулешова, Л.С. Ушакова // Человек и лекарство, тезисы 12 нац. Конг. 18-22 апр. 2005. - С. 741.

6. Васьковский, В.Е. Липиды / Е.В. Васьковский // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - № 3. - С. 32-37.

7. Вигдорович, Ш. И это все о нем: три взгляда на одно растение / Ш. Вигдорович // Провизор. - 2002. - № 1. - С. 26-29.

8. Вопросы онтогенеза растений: Межвузовский сборник / Отв. ред. Э. В. Шестакова, ред. кол. Л. А. Жукова [и др.] - Йошкар - Ола: изд-во МарГУ, 1988. - 124с.

9. Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований / под ред. Н.В. Лазарева. - Л.: Медгиз, 1954. -393с.

Ю.Галушко, А.И. Флора Северного Кавказа / А.И. Галушко; под ред. С.К. Черепанова. - Ростов-на-Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1980. - Т. 2.-350с.

П.Гейссман, Т.А. Цветные реакции на флавоноидные соединения / Т.А. Гейссман // Химические методы анализа растений. Сб. статей. - М.: Изд-во ИП, 1960.-469с.

^.Государственная фармакопея Российской Федерации. - 12-е изд. - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. -Ч. 1. - 704с.

13.Государственная фармакопея СССР: в 2-х вып. / МЗ СССР. - 11-е изд., -доп. - М.: Медицина, 1987-1989. - Вып. 1,2.

Н.Гроссгейм, A.A. Флора Кавказа / A.A. Гроссгейм. - Изд. 2-е, перераб. и доп. - Д.: Наука, 1967. - Т. 7. - 893с.

15.Далакашвили, Ц.М. Жирнокислотный состав липидов семян Helleborus abchasicus / Ц.М. Далакашвили // Химия природ, соединений. - 1983. -№5.-С. 565-568.

16. Далакашвили, Ц.М. Химический состав липидов морозника абхазского / Ц.М. Далакашвили, Э.П. Кемертелидзе // Материалы 1 съезда фармацевтов Грузии. - Тбилиси, 1978. - С. 149-150.

17.Далакашвили, Ц.М. Нейтральные липиды семян Helleborus abchasicus / Ц.М. Далакашвили // Химия природ, соединений. - 1983. - № 1. - С. 913.

18.Далакашвили, Ц.М. Исследование триглицеридной фракции жирного масла Helleborus abchasicus / Ц.М. Далакашвили, Э.П. Кемертелидзе // Химия природ, соединений. - 1968. - № 5. - С. 312-313.

19.Далакашвили, Ц.М. О жирном масле Helleborus abchasicus / Ц.М. Далакашвили, Э.П. Кемертелидзе // Химия природ.соединений. - 1968. -№2.-С. 129-130.

20.Далакашвили, Ц.М. Ранункулин и анемонин из Helleborus abchasicus / Ц.М. Далакашвили, Э.П. Кемертелидзе // Химия природ, соединений. -1970.-№ 4.-С. 464-465.

21. Далакашвили, Ц.М. Жирные кислоты масла морозника абхазского / Ц.М. Далакашвили, Э.П. Кемертелидзе // Раст. ресурсы. - 1970. - Т. 4, вып. 1.-С. 70-76.

22.Динамика липидов и их некоторых компонентов древесной зелени лиственницы сибирской / О.Г. Пеньков [и др.] // Химия раст. сырья. -2009. -№3.- С. 99-102.

23.Дмитрук, С.И. Фармацевтическая и медицинская косметология: учеб. / С.И. Дмитрук. - М.: Мед. информ. Агенство, 2007. - 179 с.

24.Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта с основами статистической обработки результатов исследований / Б.А. Доспехов. - М.: Колос, 1979. -416с.

25.Епишина, A.M. Онтогенез и ритм сезонного развития Морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.) в условиях предгорной зоны Адыгеи, как часть элективного курса «Реликты Республики Адыгеи» / A.M. Епишина. - сб. науч. тр. 4 Междунар. студенческой электронной конф. - Москва, 2012. - С. 35-43.

26.Жизнь растений: в 6 т. Цветковые растения / под ред. A.JI. Тахтаджяна. -М.: Просвещение, 1981. - Т. 5, ч. 2. -511с.

27.3оз, И.Г. Морозники - источник новых лекарственных сердечных средств // И.Г. Зоз // Бот. журн. - 1956. - Т. 41, № 9. - С. 1318-1324.

28.3оз, И.Г. Буфадиенолид-карденолидсодержащие растения флопы СССР /И.Г. Зоз, Н.Ф. Комиссаренко, H.A. Черных // Раст.ресурсы. - 1967. - Т. 3, № 2. - С. 276-280.

29.Иванов, A.JI. Конспект флоры Ставрополья / A.JI. Иванов. -Ставрополь: Изд - во СГУ, 2001. - 200с.

ЗО.Иванов, B.B. Микроэлементный состав рейноутрии сахалинской (Rheynoutria sachalinensis) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus) / B.B. Иванов, З.В. Ищенко, О.Н. Денисенко // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: сб. науч. тр. Всерос. науч.-практич. конф. - Владикавказ, 2010. - С. 42-45.

31 .Идентификация некоторых фенольных соединений 4 видов лекарственных растений (бурачника лекарственного, энотеры двухлетней, морозника кавказского, морозника абхазского) методом ВЭЖХ / С.С. Ляшенко [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. -Вып. 68. - С. 65-67.

32. Изменение жирнокислотного состава масел энотеры двухлетней (Oenothera biennis L.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.) в процессе хранения / Е.В. Чернова [и др.] // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых 4 междунар. научн.-практ. конф. - Владикавказ, 2013. - С.261 - 263.

33.Изучение жирнокислотного состава полярных липидов некоторых представителей флоры Кавказа (Helleborus abchasicus A.Br, и Helleborus caucasicus A.Br., Borago officinalis L., Oenothera biennis L.) / З.В. Ищенко [и др.] // Вопр. биологич., мед. и фармац. химии. - 2013. - № 3. - С. 5256.

34.Инагамов, С.Я. Поликомплексные гели на основе натрий карбоксиметилцеллюлозы - новые пролонгаторы лекарственных препаратов / С.Я. Инагамов, М.Ю. Мухамеджанова, Г.И. Мухамедов // Химия раст. сырья. - 2011. - № 2. - С. 51-56.

35.Ищенко, З.В. Аминокислотный состав надземной части магнолии суланжа (Magnolia soulangeana), магнолии кобус (Magnolia kobus) и

морозника кавказского (Helleborus caucasicus) / З.В. Ищенко, М.И. Филонова // Вестн. Перм. гос. фармац. акад. - 2010. - № 7. - С. 81-83.

36.Ищенко, З.В. Биофармацевтические исследования с целью обоснования состава косметического геля с маслом морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Проблемы фармацевтической науки и практики: сб. материалов 3 Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием.- Владикавказ, 2013. - С. 158-161.

37.Ищенко, З.В. Изучение жирного масла корневищ с корнями морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 57-58.

38.Ищенко, З.В. Жирнокислотный состав масла морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 68-69.

39.Ищенко, З.В. Интродукция морозника абхазского в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА / З.В. Ищенко, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011. - Вып. 64. - С. 46-47.

40.Ищенко, З.В. Липиды корней и корневищ морозника кавказского/ З.В. Ищенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Химия и медицина, Орхимед-2009: тез. докл. VII Всерос. конф. с молодеж. науч. школой 1-5 июля 2009 г. - Уфа, 2009. - С. 200.

41.Ищенко, З.В. Флавоноидный состав надземной части морозника абхазского (Helleborus abhasicus А.Вг) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus А. Вг.) / З.В. Ищенко, М.И. Кодониди, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011. - Вып.

66.-С. 103-104.

42.Кейтс, М. Техника липидологии: пер. с англ. / М. Кейтс.- М.: Мир, 1975.- 322с.

43.Кемертелидзе, Э.П. Биологически активные соединения и лекарственные препараты из некоторых растений, произрастающих в Грузии / Э.П. Кемертелидзе // Химия в интересах устойчивого развития. -2008.-№ 16.-С. 77-86.

44.Кемертелидзе, Э.П. Биологически активные липиды некоторых растений, произрастающих в Грузии / Э.П. Кемертелидзе, Ц.М. Далакашвили - Тбилиси: Мецниереба, 1996. - С. 22-56.

45.Кирий, П.В. Эколого-биологические особенности Helleborus caucasicus A.Br, флоры Сочинского Причерноморья: автореф. дис. ...канд. биол. наук: 03.00. 16 // Кирий Петр Васильевич. - Краснодар, 2006. - 171 с.

46.Кирхнер, Ю. Тонкослойная хроматография: пер. с англ. в 2 т. / Ю. Кирхнер - М.: Химия, 1981. - Т.1. - 616 е.; Т.2. - 535с.

47.Колесников, Д.Г. Сердечные гликозиды корней морозника / Д.Г. Колесников, М.Я. Тропп // Мед. пром-сть СССР. - 1952. - №5. - С. 17.

48.Кудрявцева, A.A. Методика и техника постановки полевого опыта на стационарных участках / A.A. Кудрявцева. - М.: Сельхозгиз, 1949. -271с.

49. Липиды семян Oenothera с различных мест произрастания. Сообщение 1 / С.Г. Юнусова [и др.] // Химия природ, соединений. - 2007. - № 5. -С. 430-433.

50.Лобанова, И.Е. Элементный состав Astragalus glycyphyllus / И.Е. Лобанова, О.В. Чанкина // Химия раст. сырья. - 2012. - № 2. - С.93-99.

51.Ляшенко, С.С. Анатомо-диагностические признаки некоторых представителей семейств Лютиковые и Бурачниковые флоры Северного Кавказа / С.С. Ляшенко, З.В. Ищенко, О.Н. Денисенко // Вопросы

образования и науки: теоретический и методический аспекты. Сборник науч. трудов по материалам Междунар. Научн.-практ. Конф. 30 апреля 2012. Часть 6. - Тамбов, 2012.Изд-во: ТРОО «Бизнес-Наука-Общество» - С. 74-76.

52.Ляшенко, С.С. Оценка перспективности использования бурачника лекарственного с точки зрения его экологической чистоты и возможности введения в культуру / С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Известия Самар. науч. центра РАН. - 2010. - Т. 12, № 1(8). - С. 20762078.

53.Методика исследования при интродукции лекарственных растений / Майсурадзе Н.И. [и др.] // Лекарственное растениеводство: обзорная информация. - М., 1984. - № 3. - 51с.

54.Методы биохимического анализа растений / под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова. - Л.: Изд-во Ленинград, ун-та, 1978. - 192с.

55.Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков [и др.].-Л.: Колос, 1972. - 112с.

56.Михеев, А.Д. Особенности флоры региона Кавказских Минеральных вод / А.Д. Михеев // Изучение флоры Кавказа: тез. докл. Междунар. науч. конф. 27 сент.-1 окт. 2010 г. - Пятигорск, 2010. - С.77-78.

57.Морозник. Сообщение и сведения о химическом составе различных видов морозника (Helleborus) и применение в медицине / Л.И. Бутенко [и др.] // Рос. курорт, журн. - № 3. - 1998. - С. 30-41.

58.Назаров, П.Е. Полиненасыщенные жирные кислоты как универсальные эндогенные биорегуляторы / П.Е. Назаров, Г.И. Мягкова, Н.В. Гроза // Вестн. МИТХТ.- 2009.- Т.4, № 5.- С. 3-19.

59.Нельяшевич, Е.Г. Ономастика в фармакогнозии / Е.Г. Нельяшевич, Г.Н. Бузук // Вестн. фармации. - 2010. - № 3. - С. 49.

60.Обоснование использования гомеопатических препаратов корней

морозника / Л.И. Бутенко [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. -Пятигорск, 2004. - Вып. 60. - С. 250-251.

61.0дегова, Т.Ф. Микробиологическая чистота - один из основных параметров стандартов GMP и GLP / Т.Я. Одегова, О.В. Гунар // Фармация. - 2010. - № 5. - С. 8-9.

62.Онтогенетический атлас растений. Научное издание. Том V. Йошкар-Ола, 2007.: МарГУ, 2007. - Т. 5. - 372 с.

63.Определение содержания пигментов в жирных маслах некоторых представителей флоры Северного Кавказа / З.В. Ищенко [и др.] // Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации: Материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (7-9 декабря 2011 г.). - С. 207-208.

64.Орел, Н.М. Биохимия липидов: практикум для студентов биологического факультета / Н.М. Орел. - Минск: Изд-во БГУ, 2007. -35с.

65.Орехов, А.П. Химия алкалоидов / А.П. Орехов. - М.: Изд-во АН СССР, 1955.-860с.

66.0ФС 42-0013-03 Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб. - М.: Изд-во стандартов, 2003. - 21с.

67.Поиск перспективных растительных источников липидов флоры Северного Кавказа / З.В. Ищенко [и др.] // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых 2 междунар. научн.-практ. конф. - Владикавказ, 2011. - С. 208-211.

68.Полюдек-Фабини, Р. Органический анализ: пер. с нем. / Р.Полюдек-Фабини, Т. Бейрих.- Л.: Химия, 1981.- 624с.

69.Попов, Д.М. Об адекватности физико-химических и биологических методов оценки препаратов морозника /Д.М. Попов // Фармация. - 1976. - № 1. - С. 80-81.

70.Правила доклинический оценки безопасности фармакологических средств (GLP). РД 64-126-91. - М.: МЗ РФ, 1992. - 78с.

71.Пхеидзе, Т.А. Стероидные сапогенины из некоторых растений, произрастающих в Грузии. / Т.А. Пхеидзе, Т.Н. Качухашвили, Э.П. Кеметрелидзе // 9-й Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - 1965.-№4.-С.90-91.

72.Резниченко, A.A. Новые данные о буфадиенолидном составе морозников красноватого и кавказского / A.A. Резниченко, Д.Г. Колесников, М.Я. Тропп // Мед.пром-сть СССР. - 1961. - №3. - С. 1517.

73.Руководство по методам исследования, технохимическому контролю и отчету производства в масложировой промышленности: в 6 т. / под ред. В.П. Ржехиной, А.Г. Сергеевой. - Л.: ВНИИЖ, 1965. - Т.2. - 418с.

74.Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. В.П. Фисенко. - М.: Ремедиум, 2000. - 398с.

75.Салтанов, А.И. Применение фармаконутриентов в онкологической практике / А.И. Салтанов, A.B. Снеговой // Вестн. Москов. онкол. общества. - 2009. - № 5. - С. 2-3.

76.СанПиН 2.3.2.560-96. Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. - М.: Госкомсанэпиднадзор России, 1997. - 270 с.

77. Сборник методических рекомендаций по стандартизации лекарственных средств. / Научн. центр экспертизы средств мед.

применения. - М.: Пеликан, 2006. - 392с.

78.Семкина, O.A. Мази, гели, линименты и кремы, содержащие фитопрепараты (обзор) / O.A. Семкина // Хим.-фармац. журн. - 2005. -№7. -С. 30-36.

79.Сернов, JI.H. Элементы экспериментальной фармакологии / JI.H. Сернов, В.В. Гацура. - М.: Всерос. науч. центр по безопасности биологически активных веществ, 2000. - 352с.

80.Скрябина, E.H. Аминокислоты растений рода Melampyrum L. / E.H. Скрябина, Е.Е. Галишевская, В.Д. Белоногова // Мед. альманах. — 2012. -№5.-С. 206-208.

81. Сокольская, Т. А. Требования к стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на его основе / Т.А. Сокольская, Т.Д. Даргаева, Т.Б. Шемерянкина // Вопр. биологич., мед. и фармац. химии. - 2010. - № 3. - С. 9-12.

82.Справочник биохимика: пер. с англ./ Р. Досон [и др.].- М.: Мир, 1999. -544с.

83.Сравнительное морфолого-анатомическое исследование двух видов морозника (Helleborus) семейства лютиковые (Ranunculaceae) / З.В. Ищенко [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2012. -№ 6. - 6с.

84.Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды): учеб. пособие для вузов / Б.Н. Степаненко. - М.: Высш. шк., 1978. - 256с.

85.Тахтаджян, А.Л. Система магнолиофитов / А.Л. Тахтаджян. - Л.: Наука, 1987.-439с.

86.Тимофеев, Н.П. Исследования по экдистероидам: использование в медицине, интернет-ресурсы, источники и биологическая активность [Электронный ресурс] / Н.П. Тимофеев. - Режим доступа: http://www.ivtn.ru/2003/biomedchem/enter/r_pdf/dok_63.pdf.

87.Флора СССР / Под ред. Б.К. Шишкина. - М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1953.-Т. 19.-751с.

88.Хаджиева, З.Д. Определение реологических показателей и создание технологической схемы производства олеогеля / З.Д. Хаджиева, И.Н. Зилфикаров, Е.А. Теунова // Научные ведомости. Серия медицина, фармация. - 2010. - № 22 (93). - С. 58-61.

89.Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. -М.: Высш. шк., 1984.-176с.

90.Черепанов, С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) / С.К. Черепанов. - СПб.: Мир и семья, 1995.-992 с.

91. Чечета, О.В. Методика определения каротиноидов методом хроматографии в тонком слое сорбента / О.В. Чечета, Е.Ф. Сафонова, А.И. Сливкин // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т.8, вып. 2.- С. 320-326.

92.Чукуриди, С.С. Состояние естественных популяций и особенности выращивания в культуре морозника кавказского Helleborus caucasicus Var. Flavor-guttatus Br. и скополии карниолийской Scopolia carniolica Jacq. / С.С. Чукуриди, A.H. Бакалов // Субтропическое декоративное садоводство. - 2009. - Т.1, № 42. - С. 188-192.

93.Шкроботько, П.Ю. Аминокислотный состав корневищ с корнями валерианы Фори и валерианы бузинолистной / П.Ю. Шкроботько, Д.М. Попов, Н.С. Фурса // Фармация. - 2009. - № 7. - С. 19-23.

94.Шталь, Э. Хроматография в тонких слоях: пер. с нем. / Э. Шталь. - М.: Мир, 1965. - 508с.

95.Щербак, Ф.И. Почвенно-мелиоративные и климатические условия ботанического сада института / Ф.И. Щербак // Ученые записки Пятигорск, гос. фармац. ин-та - Пятигорск. - 1959. - Т. 6. - 320с.

96.Юнусова, С.Г. Введение в химию липидов / С.Г. Юнусова. - Уфа: Реактив, 2000. - 43с.

97.Ямалеева, А.А. Метаболиты лекарственных растений и перспективы их использования в пищевой и фармацевтической промышленности / А.А. Ямалеева, Т.Е. Осокина // Вест. Оренбург, гос. ун-та. - 2009. - № 6. - С. 523-525.

98.Antioxidant and antiproliferative activities of Helleborus odorus Waldst. & Kit, H. multifidus Vis. and H. hercegovinus Martinis. / J. Cakar [et al.] // Nat Prod Res. - 2011. - Vol. 25, № 20. - P. 1696-1674.

99.Antibacterial activity of Helleborus bocconei Ten. subsp. siculus root extracts / S. Puglisi [et al.] // J. Ethnopharmacol. - 2009. - Vol. 125, № 1. -P. 175-177.

100. Caucasicosides E-M, furostanol glycosides from Helleborus caucasicus / T. Muzashvili [et al.] // Phytochemistry. -2011. - Vol. 72, № 17. - P. 21802188.

101. Colombo, M.L. Lipid content and fatty acid composition in hypogeous organs of Helleborus species (Ranunculaceae) / M.L. Colombo, F. Tome, C. Bugatti // Pl.Syst. Evol. - 1991. - Vol. 178. - P. 55-63.

102. Citalini, S. Study on secondary metabolite content of Helleborus niger L. leaves / S. Citalini, G. Fico, A. Braca, // Fitoterapia. - 2011. - Vol. 82. - P. 152-154.

103. Ecdysteroids and bufadienolides from Helleborus torquatus (Ranunculaceae) / Y. Meng [et al.] // Phytochemistry. - 2001. - Vol. 57, № 3.-P. 401-407.

104. Furostanol glycosides from the rhizomes of Helleborus orientalis / Y. Mimaki [et al.] // J. Nat Med. - 2010. - Vol. 64. - P. 452-459.

105. Furostanol saponins and ecdysones with cytotoxic activity from Helleborus bocconei ssp. intermedins / S. Rosselli [et al.] // Phytother Res. - 2009. -Vol. 23, №9.-P. 1243-1249.

106. Gerchev, G. Amino acid composition of milk from tsigal and karakachanska sheep breeds reared in the central Balkan mountains region / G. Gerchev, G.Mihailova, I. Tsochev // Biotechnology in Animal Husbandry.-2005.-Vol. 21, N5-6. - P. 111-115.

107. Martinek, A. An unknown glycoside from dried leaves of Helleborus niger (author's transl) / A. Martinek // Planta Med. - 1973. - Vol. 24, № 1. - P. 7382.

108. Steroidal glycosides from the underground parts of Helleborus caucasicus / C. Bassarello [et al.] // Phytochemistiy. - 2008. -Vol. 69, № 5. - P. 12271233.

109. Two new bufadienolides from the rhizomes of Helleborus thibetanus Franch. / J. Yang [et al.] // Fitoterapia. - 2010. - Vol. 81(6). - P. 636-639.

110. Vaskovsky, V.E. A universal reagent for phopholipid analysis / V.E. Vaskovsky, E.Y. Kostetsky, I.M. Vasendin // J. Chromatogr. - 1975. - Vol. 114, N 1. -P.129-141.

111. Ziboh, V. A. Metabolism of polyunsaturated fatty acids by skin epidermal enzymes: generation of antiinflammatory and antiproliferative metabolites / V.A Ziboh, C.C. Miller, Y. Cho // American J. of Clinical Nutrition. - 2000. -Vol. 71, N 1.-P. 361-366.