Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук Проворов, Николай Александрович

• Проворов, Николай Александрович
• доктор биологических наук
• 2009

Заключение диссертации по теме «Генетика», Проворов, Николай Александрович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель пашей работы заключалась в изучении филогенетических закономерностей и популяционно-генетических механизмов эволюции мутуа-листического симбиоза, необходимом для реконструкции процессов коэволюции растений и микроорганизмов, а также для создания хозяйственно-ценных надорганизменных комплексов.

Используя модель бобово-ризобиального симбиоза, мы исследовали связь филогении растений со специфичностью, проявляемой ими при взаимодействии с бактериями. Оказалось, что специфичность, проявляемая бобовыми при образовании клубеньков, коррелирует с таксономическим делением растений, тогда как для специфичности, проявляемой при образовании эффективного (Ы2-фиксирующего) симбиоза, такой корреляции не обнаружено. Это показывает, что способность индуцировать и поддерживать азотфиксирующуго активность у находящихся в клубеньках ризобий представляет собой эволюцпопно более лабильный признак растений, чем само образование клубеньков, и что генетические механизмы эволюции этих признаков существенно различаются.

Данный вывод подтвердился при изучении симбиотических признаков у культурных бобовых, которое мы проводили, исходя из того, что окультуривание и селекция растений являются важнейшими факторами их эволюции, которые по своей формообразующей активности не уступают природным эволюционным факторам (Вавилов, 1935; Жуковский, 1950). Анализ полученных данных показал, что при доместикации и селекции бобовых происходило существенное снижение эффективности азотфиксируюших симбиозов, наблюдаемое на фоне сохранения растениями способности к образованию клубеньков. Это снижение определяется, в первую очередь, интенсивным использованием азотных удобрений, которое привело к авто-селекции растений, у которых баланс между симбиотрофным и автотрофным типами азотного питания сдвинут в пользу второго типа. На биохимическом уровне снижение симбиотической активности бобовых растений может быть связано с повышением чувствительности азотфиксирующей системы к ингибированию азотными соединениями, например, накапливающимися в клубеньках продуктами ^-фиксации. Определенную роль в снижении симбиотической активности растений могла сыграть селекция на повышение регенерационной активности, а также содержания в семенах С-соединений (крахмала, жиров), которое у некоторых бобовых (маш, арахис) проявляет отрицательную корреляцию с симбиотической активностью. Очевидно, что восстановление и преумножение симбиотического потенциала, утраченного бобовыми в ходе сельскохозяйственной деятельности человека, является одной из первоочередных задач селекции и генетической инженерии растений.

Для оценки потенциала изменчивости азотфиксирующих симбиотических систем, который может быть использован для решения этой задачи, мы изучили генетический полиморфизм симбиозов, образуемых рядом бобовых растений с ризобиями (люцерна, донник и пажитник - с Sinorhizobium meliloti, горох - с Rhizobium leguminosarum bv. viceae). Оказалось, что основные признаки, характеризующие проявление мутуализма - Ы2-фиксирующая (нитрогеназная) активность и симбиотическая эффективность (влияние инокуляции бактериями на биологическую продуктивность растений) — существенно различаются по закономерностям своего варьирования, что может быть связано с разным генетическим контролем этих признаков. Отбор ризобий на повышение нитрогеназной активности обычно сопровождается более существенным ростом количества азота, чем биомассы растений, что может быть связано с их неспособностью к полной передаче фиксированного азота из корней и клубеньков в надземные органы. Связь между показателями азотфиксирую-щей активности и симбиотической эффективности обычно не выявляется при сопоставлении генетически разнородных сортов бобовых, однако может быть достаточно четкой при анализе более однородного материала (например, индивидуальных растений внутри сортов или же линий, полученных из одного сорта).

Селекция растений на повышение симбиотической эффективности может проводиться путем экспресс-анализа нитрогеназной активности "ацетиленовым методом", что было подтверждено нами в опытах с козлятником восточным, у которого путем отбора по нитрогеназной активности получены формы, способные развивать повышенную продуктивность при инокуляции ризобиями. Ранее аналогичные результаты были получены на горохе (Тихонович и др., 1987), у которого повышение биомассы выявлено при достоверном, но умеренном (на 30-40%) увеличении нитрогеназной (С2Н2 - редуктазной) активности, тогда как ее резкое (в 5-7 раз) возрастание может приводить к снижению массы растений, связанному с перерасходом энергии. По-видимому, повышение эффективности симбиоза требует отбора не только на повышение интенсивности работы нитрогеназы, но и на оптимизацию широкого комплекса признаков, связанных с ассимиляцией азота, снабжением симбиотического аппарата углеродом и энергией, а возможно также с процессами узнавания и сигнального взаимодействия партнеров.

Полученные данные позволили выявить сопряженную изменчивость растений и микроорганизмов по ключевым показателям активности симбиоза, которая говорит о тесно скоординированной эволюции растений и микроорганизмов. Для ее изучения мы создали и проанализировали экспериментальные и математические модели, которые позволили нам исследовать связь эффективности мутуалистического симбиоза с его специфичностью и с уровнем полиморфизма партнеров.

Анализ взаимодействия разных сортов растений и штаммов бактерий показал, что высокая эффективность (которую оценивали на основе биомассы растений или накопления в них азота) характерна для тех бобово-ризобиальных систем, у которых в наибольшей степени проявляется специфичность взаимодействия партнеров (неаддитивные генетические эффекты, выявляемые при двухфакторном дисперсионном анализе). На основании этих данных, а также анализа динамики симбиотических признаков при окультуривании растений, мы сформулировали основные принципы координированной селекции партнеров на повышение симбиотической активности, которые заключаются в необходимости: 1) максимально широкого использования дикорастущих и мало окультуренных форм бобовых, в полном объёме сохранивших природный симбиотпче-ский потенциал, 2) подбора комплементарных сочетаний генотипов партнеров, оптимальных для эффективного симбиоза. Использование обоих подходов наиболее результативно при снижении популяционной изменчивости растений до уровня, который обеспечивает возможность подбора штаммов бактерий, специфичных для всего спектра имеющихся в сорте генотипов.

С целью анализа популяционно-генетических механизмов коэволюции растений и микроорганизмов в системах мутуализма мы разработали методику математического моделирования популяционной динамики бобово-ризобиального симбиоза, реализуемой при действии микроэволюционных факторов (различные формы естественного отбора и генетико-автоматические процессы), которые индуцируются при развитии клубеньков. В основу построения и аиализа моделей было положено представление о растении-хозяине как о ведущем факторе эволюции симбиотических микроорганизмов, поскольку в системе "хозяин-среда" микросимбионты претерпевают регулярную смену экологических ниш (у ргообий она осуществляется по схеме "почва—^ризосфера—»клубеньки—»почва"), в ходе которой происходят закономерные преобразования пространственной и генетической структуры микробных популяций.

Построенные модели позволили нам приступить к изучению действия в симбиотических системах естественного отбора, которое исследовано гораздо менее полно, чем молекулярные механизмы эволюции симбиоза. Результаты компьютерных экспериментов позволили предположить, что одним из основных факторов эволюции симбиотических признаков ризобий является частотно-зависимый отбор, индуцируемый в почвенных или ризосферных популяциях при конкуренции за формирование клубеньков. Мы показали, что этот отбор может определять основные свойства популяций ризобий — их повышенную, по сравнению со свободноживущими бактериями, генетическую гетерогенность и панмикточность. На основе построенных моделей была предложена обобщенная схема формирования ризобиальных популяций, в соответствии с которой их панмиктическая структура устанавливается в тесной связи с поддержанием сбалансированного ("экотипического") полиморфизма по способности вступать в симбиоз с растениями.

При изучении механизмов, направляющих эволюцию симбиоза на повышение эффективности мутуализма, мы исходили из того, что ключевую роль в этом повышении играют положительные обратные связи, которые основаны на обмене партнеров продуктами азотфиксации и фотосинтеза. Результаты проведенных нами компьютерных экспериментов показали, что закрепление или даже доминирование в популяции ризобий ^-фиксирующих "истинных мутуалистов", которое происходит, несмотря на присутствие не фиксирующих N2, но вирулентных "симбионтов-обманщиков", может быть обеспечено положительной обратной связью партнеров в сочетании с частотно-зависимым отбором. Метаболические обратные связи партнеров индуцируют их популяционные обратные связи, обеспечивающие коэволюцию растений и бактерий на повышение эффективности симбиоза.

Анализ нацпгх моделей позволил объяснить многие важные закономерности, выявленные при эмпирическом изучении бобово-ризобиальных систем, а также предложить эволюционно обоснованные подходы для их генетического улучшения. Использование модели муль-тиштаммовой конкуренции показало, что, корреляция эффективности и специфичности симбиоза может быть обусловлена тем, что при взаимодействии полиморфных популяций партнеров интенсивность отбора в пользу специфичных штаммов ризобий, образующих азотфиксирующие клубеньки лишь с некоторыми имеющимися растительными генотипами, выше, чем интенсивность отбора в пользу неспецифичных штаммов, которые образуют азотфиксирующие клубеньки со всеми растительными генотипами. Однако высокая эффективность симбиоза не может быть достигнута в отсутствии неспецифичных мутуалистов, которые обеспечивают оптимальную конфигурацию процессов отбора на повышение общей продуктивности системы и, по-видимому, поддерживаются в ней благодаря групповым формам отбора.

Представленные результаты могут и должны быть использованы в генетико-селекционных программах создания сортов растений и комплементарных им бактериальных штаммов, сочетание которых обеспечивает высокую эффективность мутуализма в условиях конкуренции высокоэффективных производственных штаммов ризобий с неэффективными местными штаммами. При организации этой работы необходимо исходить из того, что в системах симбиоза обычно устанавливается равновесие между генотипами микросимбионтов, различающихся по характеру взаимодействия с хозяином ("истинные мутуалисты" и "симбионты-обманщики" в системах трофического симбиоза; патогенные и биоконтрольные организмы в системах защитного симбиоза). Однако положение этого равновесия может быть существенно изменено в пользу полезных для хозяина форм благодаря отбору, происходящему в его популяциях и определяемого положительными обратными связями партнеров. В природных условиях установление этого равновесия является результатом длительного коэволюционного процесса, который в условиях агро-ценоза может быть существенно ускорен благодаря использованшо методов селекции, генной инженерии и биотехнологии. Очевидно, что для "искусственной эволюции" симбиоза необходим синтез знаний о генетике, молекулярной биологии, морфо-физиологической организации и экологии симбиоза, который не представляется возможным без использования эволюционных подходов.

Поддержание в бобово-ризобиальных системах равновесия различных типов симбионтов показывает, что в популяциях партнеров действуют селективные факторы, направленные как на повышение, так и на снижение азотфиксирующей активности (Foster, Kokko, 2006), и следовательно в геномах бактерий должны существовать гены, функционирование которых обеспечивает как высокую, так и низкую интенсивность азотфиксации. Выявление генов обеих групп представляет большой интерес для конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, которое может быть связано как с усилением активности генов первой категории, так и элиминацией генов второй категории. Генетические модификации обоих типов описаны в литературе (Bosworth et al., 1992; Shary-pova et al., 1998), и в сочетании с формированием оптимальной генетической структуры симбиосистемы эти модификации могут обеспечить существенное возрастание агрономической эффективности микробно-растительных симбиозов. Использование метода факторного анализа может оказаться полезным для оценки фенотипического проявления созданных генетических конструкций, которая затруднена влиянием растительного генотипа и неконтролируемых факторов среды на экспрессию бактериальных генов (разд. 2.1.2).

Другой практически значимый аспект предложенной модели заключается в оценке эколого-генетических последствий интродукции в агро-ценозы генетически модифицированных растительных симбионтов. Распространение новых конструкций, содержащих гены симбиоза, среди местных бактерий создает риск возникновения рекомбинантов с непредсказуемыми инфекционными свойствами (Dresing et al., 1998; Selbitzska et al., 2006), для снижения которого предлагалось вводить в модифицированные штаммы ризобий факторы, подавляющие либо их рекомбинаци-онную активность, либо выживаемость в почве. Анализ нашей модели показал, что эти меры будут эффективными лишь на фоне низкого давления ЧЗО, который вызывает размножение редких, в том числе и реком-бинантных генотипов (Проворов, Воробьев, 2003). Снижение давления ЧЗО может быть достигнуто путем селекции растений-хозяев, генотипы которых существенно влияют на параметр "а" нелинейной модели конкуренции, определяющий давление ЧЗО (формула 3) Еще более радикальный подход для снижения нежелательных эффектов ЧЗО заключается в регуляции циклической микроэволюции бактерий, например, в использовании севооборотов, "разрывающих" этот процесс

Завершая анализ представленных данных, отметим, что он подводит нас к необходимости изучения мутуалистического симбиоза как генетически интегрированной системы, целостность которой проявляется не только на организменном уровне (координация биохимических и онтогенетических процессов, осуществляемых партнерами под действием перекрестно передаваемых сигналов, регулирующих активность "симбиоти-ческих" генов), но и на популяционном уровне (сопряженное действие в популяциях партнеров ключевых микроэволюционных факторов, в первую очередь, специфичных для симбиоза форм отбора). Наибольшая эффективность симбиоза достигается при поддержании в нем различных типов бактерий-мутуалистов, вне зависимости от их индивидуальной селективной ценности. Изучение генетико-эволюционной целостности мутуалистических симбиозов является важным условием для выяснения механизмов природной ко-эволюции партнеров, а также для использования полученных знаний в селекционной, генно-инженерной и биотехнологической практике.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Проворов, Николай Александрович, 2009 год

1. Вавилов Н.И. Селекция как наука // Теоретич. основы селекции. Т 1. Общая селекция растений M.;JT,1935 С. 1-14.

2. Дарвин Ч. Происхождение видов путем естественного отбора. СПб. Наука, 1991 539 с

3. Доросинский JI.M Клубеньковые бактерии и нитрагин JI.: Колос, 1970 191 с

4. Доспехов Б.А. Планирование полевого опыта и статистическая обработка его данных. М.: Колос, 1972 336 с

5. Дубров A.M., Мхитарян B.C., Трошин Л.И. Многомерные статистические методы. М : Финансы и статистика, 1998. 352 с.

6. Жуковский П.М. Культурные растения и их дикие сородичи. М.: Советская Наука, 1950 595 с

7. Иванов А.И. Люцерна. М.: Колос, 1980. 349 с.

8. Инге-Вечтомов С.Г. Экологическая генетика: теория и практика // Исследования по генетике. 1999. Вып. 12. С. 3-10.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия М. Высшая школа. 1990. 352 с.

10. Меттлер Л., Грегг Т. Генетика популяций и эволюция. М Мир, 1972. 323 с.

11. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М : Наука, 1973. 240 с.

12. Овцына А О., Тихонович И.А. Структура, функции и возможность практического применения сигнальных молекул, инициирующих развитие бобово-ризобиального симбиоза // Эколог, генетика. 2004. Т. 2. №3. С. 14-24.

13. Синская Е.Н Пажитник Tngonella L. // Культурная флора СССР. Т 13 Вып. 1,М., Л., 1950. С 503-516.

14. Сосков Ю.Д, Байрамов С.С. Подвиды пажитника сенного // На-учно-технич бюлл ВИР. 1990. Вып 198. С. 23-26.

15. Тихонович И.А. Генетический контроль симбиотической азот-фиксации у гороха. Автореф. дис. докт. биол. наук. Л.: ВНИИСХМ, 1991.36 с.

16. Тихонович И.А., Алисова С.М, Четкова С.А., Берестецкий О.А. Повышение эффективности азотфиксации путем отбора линий гороха по an ивности нитрогеназы // С.-х. биология. 1987. №2. С 29-34

17. Федоров С.Н., Симаров Б.В. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами у Rhizobium meliloti под действием УФ-лучей// С.-х. биология. 1987. № 9. с. 44-49.

18. Федоров С.Н., Фокина И.Г. Симаров Б.В. Оценка симбиотических свойств клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) в лабораторных условиях// С.-х. биология. 1986. № 1. С. 112-118.

19. Amarger N., Lobreau J.P. Quantitative study of nodulation competitiveness in Rhizobium strains // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. P. 583588.

20. Bever J.D., Simms E.L. Evolution of nitrogen fixation in spatially structured populations of Rhizobium U Heredity. 2000. V. 85. P. 366-372.

21. Brewin N.J. Plant cell wall remodeling in the Rhizobium-legume symbiosis // Crit. Rev. Plant. Sci. 2004. V. 23. P. 1-24.23. de Bary A. Die Erscheinung der Symbiose. Strassburg: Verlag Von Karl TrUbner. 1879. 30 p.

22. Douglas A.E. Symbiotic Interactions. Oxford; New York; Toronto: Oxford Univ. Press, 1994. 194 p.

23. Doyle J.J. Phylogenetic perspectives on nodulation: evolving views of plants and symbiotic bacteria// Trends in Plant Sci. 1998. V. 2. P. 473-478.

24. Dresing U., Hagen M., Selbitschka W., Puhler A., Keller M. Reduced survival of RecA-deficient Sinorhizobium meliloti strain in sterile and non-sterile soil during heat stress // FEMS Microb. Ecol. 1998. V. 27. P. 327-338.

25. Engelke Т., Jording D., Kapp D., Piihler A. Identification and sequence analysis of the Rhizobium meliloti dctA gene encoding the C4-dicarboxylate carrier//J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 5551-5560.

26. Foster K.R., Kokko H. Cheating can stabilize cooperation in mutualisms // Proc. Roy. Soc. B. 2006. V. 273. P. 2233-2239.

27. Frank S.A. Genetics of mutualism: the evolution of altruism between specie //. Theor. Biol. 1994. V. 170. P. 393-400.

28. Frank S.A. Host-symbiont conflict over the mixing of symbiotic lineages // Proc. Roy. Soc. Lond. B. 1996. V. 263. P. 339-344.

29. Fred E.B., Baldwin I.L., McCoy E. Root Nodule Bacteria and Leguminous Plants. Madison. Wisconsin: Univ. Wisconsin Stud. Sci., 1932. 350 p.

30. Gibson A.H. Genetic variation in the effectiveness of nodulation of lucerne varieties // Austral. J. Agric. Res. 1962. V. 13. P. 388-399.

31. Hardy R.W.F., Holsten R.D., Jackson E., Burns R.S. C2H2-C2H4 assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation // Plant Physiol. 1968. V. 43 (suppl.). P. 9-13.

32. Janzen D.H. When is it coevolution? // Evolution. 1980. V. 34. N 3. P. 611-612.

33. Jimenez J., Casadesus J. An altruistic model of RhizobiumAegume association // J. Heredity. 1989. V. 80. P. 335-337.

34. Jones K.M., Kobayashi H., Davies B.W., Taga M.E., Walker G.C. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model // Nature Rev. 2007. V. 5. P. 619-633.

35. Jording D., Uhde C., Schmidt R., Piihler A. The C4-dicarboxylate transport system of Rhizobium meliloti and its role in nitrogen fixation during symbiosis with alfalfa {Medicago sativa) // Experientia. 1994. V. 5. N 10. P. 874-883.

36. Kiers E.T., Rousseau R.A., West S.A., Denison R.F. Host sanctions and the legume-Rhizobium mutualism//Nature. 2003. V. 425. P. 78-81.

37. Law R., Lewis D.H. Biotic environments and the maintenance of sex -some evidence from mutualistic symbioses // Biol. J. Linn. Soc. 1983. V. 20. P. 249-276.

38. Lesins K.A., Lesins L. Genus Medicago (Leguminosae). Hague: Dr. W. Junk, 1979. 150 p.

39. Maynard Smith J. Generating novelty by symbiosis // Nature. 1989. V. 341. N 6240. P. 284-285.

40. Mode C.J. A mathematical model for the co-evolution of obligate parasites and their hosts // Evolution. 1958. V. 12. P. 158-165.

41. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. V. 89. P. 583-590.

42. OJivieri I., Frank S.A. The evolution of nodulation in Rhizobium: altruism in the rhizosphere // J. Heredity. 1994. V. 85. P. 46-47.

43. Pellmur O., Huth C.J. Evolutionary stability of mutualism between yuccas and yucca moths //Nature. 1994. V. 372. P. 257-260.

44. Raig H., Nommsalu H., Meripold H., Metlitskaja J. Fodder Galega. Estonian Res. Inst. Agricult., 2001. 141 pp.

45. Schardl C.L., Craven K.D., Speakman S., Stromberg A., Lindstrom A., Yoshida R. A novel test for host-symbiont codivergence indicates ancient origin of fungal endophytes in grasses // System. Biol. 2008. V. 57. P. 483-498.

46. Sinuns E.L., Bever J.D. Evolutionary dynamics of rhizopine within spatially structured Rhizobium populations // Proc. Roy. Soc. Lond. B. 1998. V. 265. P. 1713-1719.

47. Simms E.L., Taylor D.L. Partner choice in nitrogen-fixing mutualisms of legumes and rhizobia // Integrat. Comparat. Biol. 2002. V. 42. P. 369-380.

48. Spaink H.P. The molecular basis of infection and nodulation by rhizobia: the ins and outs of sympathogenesis // Annu. Rev. Phytopathol. 1995. V. 33. P. 345-368.

49. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. (eds.). The Rhizobiaceae. Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Acad. Publ., 1998. 566 p.

50. Sprent J.I. Nodulation in Legumes. Cromwell Press Ltd, Kew, 2001. 110 p.

51. Sprent J.I. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a taxonomic perspective on the ocun ence of nodulation // New Phytol. 2007. V. 174. P. 11-25.

52. West S.A., Kiers E.T., Pen I., Denison R.F. Sanctions and mutualism stability: when should less beneficial mutualists be tolerated? // J. Evol. Biol. 2001. V. 15. P. 830-837.

53. West S.A., Kiers E.T., Simms E.L., Denison R.F. Sanctions and mutualism stability: why do rhizobia fix nitrogen? // Proc. Roy. Soc. B. 2002. V. 269. P. 685-694.

54. Wilson J.K. Over five hundred reasons for abandoning the cross-inoculation groups of legumes // Soil Sci. 1944. V. 58. P. 61-69.

55. Young J.P.W. Molecular population genetics and evolution of rhizobia // The Nitrogen Fixation and its Research in China / Hong G.F. (ed.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1992. P. 366-381.