Эволюция генов иммунной системы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук в форме науч. доклада Таранин, Александр Владимирович

• Таранин, Александр Владимирович
• доктор биологических наук в форме науч. доклада
• 2006

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. доклада Таранин, Александр Владимирович

Гены ТСС Fugu rubripes. Анализ опубликованных в 2002 г. геномных последовательностей фугу был проведен в несколько этапов. На первом этапе с помощью программы TBLASTN проводили поиск экзонов, кодирующих полипептиды структурно сходные с трансмембранными участками различных ТСС. Затем, используя уникальное свойство генома фугу, компактность генов, визуально определяли в скаффолдах-кандидатах экзоны, которые могли бы кодировать цитоплазматические области, содержащие ITAM мотивы. На последнем этапе для оценки консервативности групп сцепления сравнивали гены, тесно сцепленные с генами ТСС у фугу и человека. Следует отметить, что этот подход оказался значительно более эффективным, чем компьтерное предсказание структуры генов. В то время как использование программ предсказания выявило лишь два гена, наш анализ позволил определить у этого вида присутствие 8 генов ТСС.

Полученные результаты впервые показали, что момента отделения от рыб в линии наземных позвоночных произошло только однобытие ~~ дупликация предкового CD3y/5, приведшего к возникновению CD3y и CD35. Основной набор ТСС возник на более ранних этапах филогенеза позвоночных.

Важно отметить, что в результате проведенного анализа было установлена консервативность синтении коротких участков ДНЕ, содержащих гены ТСС (Рис. 6). Сравнение геномов человека и фугу показало сохранение сцепления каждого из генов ТСС с как минимум одним соседним геном. CD3 локус сцеплен с EYA1-геном, DAP локус -с геном TA-NFKB. У обоих видов рядом с генами CD79a, CD79b, FcRy и TCR¿¡ располагаются, соответственно, гены ARHGEF1, SCN4A, CREG и NDUFS2. Субъединицы CD79a и CD79b рассматривались ранее как структурно несвязанные гены. Внеклеточные домены CD79a и CD79b относили, соответственно к V и С2 типам ИГ-подобных доменов. Однако, внеклеточный домен предсказанного CD79a фугу имеет основной признак домена V-типа - .присутствие мотива, подобного J-сегменту. Это обстоятельство позволяет предполагать, что CD79a и CD79b, также как и другие три пары ТСС, возникли в результате дупликации общего предшественника.

Присутствие основного набора ТСС у представителя костистых рыб указывает на то, что эволюционные корни этих молекул следует искать у более примитивных позвоночных. Обнаруженная консервативность сцепления генов ТСС с соседними генами может быть полезной в таких исследованиях. Не исключено, что эти генные пары сохранились и у хрящевых рыб или даже круглоротых. Как минимум четыре из сцепленных генов (GREG, NDUFS2, ARHGEF1 и SCN4A) являются достаточно консервативными, чтобы их можно было использовать в качестве зондов для клонирования соответствующих участков геномной ДНК.

10 kb

CD79b

EVA-l CD3b Q9BxK6 CD3y/5 CM^CMS NM

CD79a

176 kb

SCN4a CI)79b SCN4a

ARHGEF1 CD79a

GREG TcRi

DAP10/DAP12 FcRy

Ж Ä F

DAP12 DAP10 TA-NFKBL NDUFS2 FcRy

Рис. 6. Схематичное изображение содержащих гены ТСС участков генома человека и фугу. Одни и тс же гены сцеплены с генами ТСС у обоих видов. Прямоугольниками обозначены транскрибируемые участки генов. Стрелки обозначают ориентацию транскрипции. Н - человек; Р - фугу.

Клонирование и анализ генов СРЗе стерляди. Использование ПЦР с вырожденными праймерами позволило идентифицировать фрагмент ДНК, кодирующий СОЗе субъединицу Т-рецепторного комплекса стерляди. Этот фрагмент был использован в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди. В результате двух раундов скрининга клонировано 7 кДНК, из которых 3 были полноразмерными и 4 - имели усеченную 5' область. Анализ структуры кДНК показал наличие двух основных вариантов, кодирующих разные формы и обозначенных СВЗе1 и СОЗе2,. СБЗе2 кодировал короткий белок, в котором отсутствовала вторая половина ИГ-подобного домена. Различия в области лидерного и соединительного пептидов указывали на то, что две формы представляют скорее продукты разных генов, чем результат альтернативного сплайсинга.

Нозерн блот-анализ показал наличие одного мажорного транскрипта в поли (А)+-РНК селезенки, печени, кишечника и лейкоцитов периферической крови стерляди, при отсутствии экспрессии в мозге и семенниках.

Несоответствие между различными длинами кДНК и одной мажорной полосой можно объснить только невысокой частотой встречаемости короткого (СОЗе2) варианта, возникающего в результате альтернативного сплайсинга. Для проверки этого предположения был проведен ПЦР-анализ библиотеки кДНК с использованием вариант-специфичных примеров, соответствующих участку вставки или делеции (соответственно) двух кодонов в во внеклеточном домене. В случае СОЗе1 была обнаружена только длинная форма, в то время как СОЗе2 был представлен как длинной, так и короткой формами. Различия в длинах ПЦР-фрагментов у каждой формы отражают существование дополнительного разнообразия, как СРЗе1, так и СВЗе2, по длине внеклеточного домена.

Рис.7. Гетерогенность СЭЗе транскриптов стерляди, обнаруживаемая методом ОТ-ПЦР. "Ь" обозначает библиотеку кДНК. Позиции маркеров молекулярного веса (в п.н.) указаны справа.

Поскольку библиотека кДНК была сконструирована с использованием лейкоцитарной РНК 20 особей, разнообразие клонированных кДНК могло быть результатом популяционного полиморфизма. Для анализа экспрессии СБЗе] и СВЗе2 в популяции стерляди из селезенок 12 особей была выделена суммарная РНК и проанализирована методом ОТ-ПЦР с использованием вариант-специфичных праймеров (Рис. 7).

Обе основные формы экспрессировались у всех особей. Однако наблюдался высокий полиморфизм по длине и количеству индивидуально экспрессирующихся вариантов. Данные Саузерн блот-анализа согласуются с данными Щ-РСК и позволяют утверждать, что у стерляди имеется по крайней мере два СОЗб-подобных гена, причем наблюдается высокий внутрипопуляционный полиморфизм по длине гибридизационных фрагментов (Рис. 8).

Рис. 8.Саузерн блот-анализ индивидуальных образцов геномной ДНК стерляди с использованием СОЗе-спе-цифичного зонда. Позиции маркеров молекулярного веса ( в т.п.н.) указаны справа.

Сравнение CD3e стерляди с гомологами высших позвоночных показывает, что имеются достаточно слабые эволюционные ограничения на структуру внеклеточного ИГ подобного домена. Гомология в области внеклеточного ИГ домена выражена слабо и не превышает 30%. В то же время, соединительный, трансмембранный и, в особенности, цитоплазматический районы очень консервативны. В соединительном пептиде можно выделить консервативный VCXXCXE мотив, который предположительно отвечает за взаимодействие между б-5 и в-у субъединицами. Наличие этого мотива позволяет предположить, что CD3s стерляди экспрессируется в виде гомо- или гетеродимера. Трансмембранный район CD3e стерляди, как и его аналог у млекопитающих, содержит отрицательно заряженный остаток аспарагиновой кислоты (Asp), предположительно ответственный за правильную сборку TCR-комплекса. Еще один участок высокого сходства - последовательность VYYW в С-концевом районе трансмембранного района. Поскольку трансмембранный домен поверхностных клеточных рецепторов принимает форму а-спирали (Diesenhofer and Michel 1989), VYYW основания расположены в различных местах а-спирали. Таким образом, мотив может взаимодействовать с различными компонентами ТСЛ-комплекса. Очевидно, не случайно, что и другие субъединицы ТСЫ-комплекса также высококонсервативны в С-концевой части их трансмембранных доменов. Возможно, этот район является необходимым для правильной сигнальной трансдукции. Наиболее консервативным является цитоплазматический участок СБЗе. УххЬЛ (УЕР1 и У80Ь) повторы [ТАМ-ов СОЗе стерляди идентичны таковым у человека и мыши. Также наблюдалось высокое сходство в участке между мотивами. Принимая это во внимание, а также консервативность 1ТАМ-ов СОЗ у/8, можно заключить, что структура различных 1ТАМ мотивов ТСБ1 остается неизменной в течение последних 400-450 млн. лет. Полученные данные указывают также, что "х" остатки в УххЬЯ повторах ГГАМ мотивов разных субъединиц Т-оеточного рецепторного комплекса не являются вырожденными и, соответственно, разные 1ТАМ мотивы функционально специализированы. Помимо 1ТАМ мотива, консервативность которого вполне естественна в связи с его критическим значением для функции Т-рецепторного комплекса, особый интерес представляет пролин-богатый РРУР^ФБ мотив, расположенный непосредственно перед первым Ухх1 повтором 1ТАМ. Подобный мотив не обнаружен нами ни в одном другом белке Т-рецепторного комплекса. Консервативность ЮСРРУРЫРВ последовательности СЭЗе стерляди, курицы и млекопитающих, также как и отсутствие этого мотива в СБЗу, <5 и ц субъединицах говорит в пользу его участия в выполнении СОЗе-специфичных сигнальных функций, к настоящему времени еще неизвестных. Вполне возможно,что пролин-богатый мотив, наряду с ГГАМ-мотивами, может быть еще одним функциональным районом, ответственным за сигнальную функцию СЮЗа

В целом, полученные данные дают основание утверждать, что множественность СОЗ субъединиц в составе Г-клеточного рецепторного комплекса позвоночных не является избыточной, что роль 1ТАМ мотивов не сводится к количественной амплификации сигнала и что цитоплазматические домены разных субъединиц выполняют качественно различные функции.

Идентификация РсК-подобнмх генов человека и мыши

Классические РсИ. представляют собой типичное семейство лейкоцитарных поверхностных белков, объединенных общим происхождением и разделяемых на активирующие и ингибирующие формы. Среди РсИ выделяют четыре основных класса: РсуЮ, РсуМ1, РсуЮП и РсеМ. Благодаря своей способности связывать константную область иммуноглобулинов G (IgG) и Е (IgE), FcR являются связующим звеном между гуморальным и клеточным иммунитетом (Ravetch and Bolland, 2002). Эти белки принимают участие в фагоцитозе, антитело-зависимой клеточной цитогоксичносги, реакциях гиперчувствительности немедленного типа, а также регуляции продукции иммуноглобулинов. Внеклеточные области FcR состоят из двух (FcyR.II, FcyRIII и FcsRI) или трех (FcyRI) Ig-подобных доменов, которые можно отнести к трем структурным подтипам - DI, D2 и D3.

У человека FcR кодируются семью функциональными генами. Имеется по одному гену для FcyRI и FcsRI, три - для рецепторов FcyRII класса (FcyRJla, FcyRIIb и FcyRIIc) и два-для рецепторов Fey RIII класса (FcyRIIIa и FcyRIIIb). FcyRIIb является ингибярующим рецептором, он содержит в цитоплазматической области ITIM мотив. Остальные относятся к активирующим. FcyRI, FcsRI и FcyRIIIa экспрессируются на поверхности в комплексе с IFAM-содержащимк FcRy или TcR^ сигнальными субтьединицами. Гены активирующих и ингибируюгцих рецепторов отличаются способом кодирования цитогшазматнческих и трансмембранных участков. У ингибирующих рецепторов эли области кодируются разными экзонами, причем цитоплазматическая область кодируется, как правило, больше чем двумя экзонами. У генов активирующих рецепторов один и тот же экзон кодирует трансмембранный и цитоплазматический участки, причем последний, как правило, является очень коротким. Исключением из этого правила являются FcyRIla и FcyRIIc человека - они несут ITAM-мотивы непосредственно в своих цитоплазматических областях. FcyRIIIb не имеет типичного трансмембранного участка и заякорен на поверхностной мембране с помощью гяикозил-фосфатидил-инозитольного мостика (GPI). У мыши до последнего времени было известно четыре FcR гена, по одному для FcyRI, FcyRII, FcyRII] и FcsRI классов. Вероятнее всего, три дополнительных гена, кодирующих FcyRIla, FcyRIIc и FcyRIIIb человека, являются приобретением, характерным только для приматов. Несмотря на относительно неплохую изученность FcR семейства, вклад этих трех дополнительных рецепторов человека в видоспецифические особенности иммунитета не вполне ясен. Помимо различий в количестве генов, ряд других обстоятельств указывал на видоспецифичпую эволюцию этого семейства белков. Так, сравнительный анализ внеклеточных областей рецепторов мыши позволил предположить, что FcyRIII является результатом относительно недавней рекомбинации - его внеклеточная область имеет около 95% сходства с внеклеточной областью ингибирующего FcyRII и лишь 60% с внеклеточной областью FcyRIII человека.

В структурном отношении FcR семейство представляет собой отдельную группу IgSF и его взаимоотношения с другими членами надсемейства были неясны. Хотя наличие иммуноглобулин-связывающих белков было обнаружено на фенотилическом уровне у птиц, амфибий и рыб, оставалось неизвестным, какие гены кодируют эти белки. Более того, тот факт, что лиганды FcR, иммуноглобулины IgG и IgE, появились в эволюции позвоночных только у млекопитающих, давал основания предполагать, что FcR являются только частью некоего более обширного семейства белков, имеющих более «древние» функции.

Действительно, проведенный нами в 1998 г. анализ EST баз данных показал, что человек и мышь имеют гены, родственные генам FcR. В результате использования компьютерных методов анализа известных на тот момент фрагментов геномных последовательностей, а также экспериментальных подходов, таких как 5'- и З'-RACE анализ, нам удалось сначала предсказать, а в дальнейшем и подтвердить наличие в геномах человека и мыши, соответственно, восьми и семи ранее неизвестных функциональных FcR-подобных генов (Рис. 9). Обнаруженные гены можно разделить на две группы, одна из которых была названа FCRL (FcR-Hke), а другая - IFGP (IgSF, FcR gg42). В первую группу и у человека, и у мыши входит по два гена (FCRL и FCRL2). Гены этой группы кодируют четырех-доменные белки, лишенные трансмембранногых районов. Три N-концевых. домена FCRL белков принадлежат к IgSF и относятся к тем же трем гомологичным типам Ig-доменов (D1-D2-D3), которые встречаются в составе классических FcR. Четвертый С-концевой домен FCRL обогащен остатками Ser/Thr/Pro и, на этом основании, может быть отнесен к муцин-подобным. Особенностью концевого домена FCRL и FCRL2 является присутствие консервативного мотива из 22 аминокислотных остатков со свойствами амфипатической спирали.

Вторая группа FcR-подобных генов включает 4 гена мыши (mIFGPl-З и mIFGP6) и 6 генов человека (hIFGPl-6). IFGP гены кодируют трансмембранные рецепторы I типа, внеклеточные области которых состоят из 2-9 ИГ-доменов. Среди ИГ-доменов IFGP можно выделить как уже упомянутые домены D1-D3 типа, так и два новых типа, которые мы обозначили D4 и D5. Корректность разделения доменов на 5 типов поддерживает топология ветвей филогенетических деревьев, построенных на основе нуклеотидных последовательностей отдельных доменов FcR и FcR-подобных генов (Рис, 10).

Особенностью рецепторов IFGP-группы является уникальное разнообразие доменного состава внеклеточных областей. Каждая из 10 молекул человека и мыши отличается от других по количеству и/или комбинации типов доменов. Особенностью hIFGP3 и hlFGPS является наличие, соответственно, двух и шести доменов типа D5. mIFGP2, помимо своей особой комбинации ИГ-доменов, выделяется отсутствием трансмембранного района и наличием на СООН-конце домена, принадлежащего к надсемейству скавенджер-рецепторов (Рис. 9С). Насколько нам известно, это первый пример мозаичного белка, объединяющего в своем составе домены ^БГ и скавенджер-рецепторов.

-01 ©-02 • -03 #и и. Е

Рис. 9. Схематичное изображение доменной архитектуры РсК-подобных белков человека (А) и мыши (С). Для сравнения показаны Р^Ш, FcgRII, gp42 и РЕСАМ-1 (В).

§-домены показаны кружками, С-концевые домены РСМ. -треугольниками, скавенжер домен -квадратом, трансме.мбранные районы зигзагом в цшгоплазматические - прямой линией. Различным подтипам 1д-доменов соответствуют различные варианты запивки.

- ЬРсе«1с*2 -ллРсЕ1Ч1<

- ЬРсдР?!с

- гпРсдГЧ1с!

• ЬРсд1=*11Ьса2 I-ПРСР

-тРСга

--ЬРСРЬс*

-тРСК1с

- т1 Р0Р302 ---¡РОРеог

- Ь1РОР-4с

- !"1|РОРЗс

- ИI Р<ЗР2.&

- т!РОР2с12 - Ы РОР

- 1"|1Р0Р т1РЗР

-тРСР юо I- ИРСР*Ц

-Ь1РОРЗЭ

• ЬРсдГЧНсИ плРсдРШсИ тС0162сИ

ИРсдРП 1с тРсдР1с11 -ИРсдРИсИ

ЬРсе«1с*1 - тРсеР1сИ

ЫРСРЗОЗ Ь1РОР5с13 И1Р0Р403 Г)1РОР1 ОЗ т! РСРЗОЗ т(Р0Р203 МР"0Р203 ьрсга^з тРсдгас<3 ЫРОРбРЗ ьрскьаз

-тРСЯисаЗ

----ГПРСР:!

Гоо1--ИРС^

--т1 РОРбОЗ

- Ь1РХЗР

-ЬIР0Р

----т1ГОР1 ОА

- т!РСР

--— т!РОР

- ЫРОРбОБ - т1РОРЗОБ

- Ь11РОР505.

- т! РЭР

--т! РйР 1Й

- ШРСР

- Ь1РОР505.

- Ь1РОР

Рис. 10. Филогенетический анализ ^-доменов РсЯ и РсК-подобных белков показывает их разделение на пять структурных подтипов

Сравнение БСШ! и П^Р молекул с другими белками а также компьютерный анализ хромосомной локализации этих генов показали, что ЫБвРб и т]ТОР6 являются ортологами

§р42 крысы, поверхностного рецептора МК клеток с неизвестной функцией, обнаруженного еще в 1989 г. Таким образом, вр42, близкие гомологи которого ранее были неизвестны, также является членом ^СР-группы и, соответственно, членом РсК семейства. Важно отметить, что по своей архитектуре gp42 отличается от других ШОР молекул. Он лишен цитоплазматического участка и связывается с клеточной мембраной через СРЕмостик. Кроме того, мы обнаружили домены 03-05 типов в составе РЕСАМ-1, рецептора тромбоцитов и эндотелиатьных клеток (Рис. 9). Этот факт свидетельствует об общих эволюционных корнях РсК-подобны.к белков и РЕСАМ-1.

Согласно результатам компьютерного анализа геномных последовательностей, РсЛ-подобные гены сцеплены с генами классических РсЯ. 1РОР1-1РОР5 гены человека располагаются на большом плече хромосомы 1 в районе полосы 21 (^21). Р'СШЛ и РСЯЕ2 гены располагаются в районе Ц23 в непосредственной близости от кластера генов низкоаффинных Рс-рецепторов ЕСЕХ гены мыши располагаются на первой хромосоме в непосредственной близости от генов лейкоцитарных РсК. Гены 1ЕСР, а также ген РсуКЛ мыши, находятся на третьей хромосоме.

Анализ экзон-иптронной структуры РсЛ-подобных генов человека и мыши позволил выявить следующие закономерности: лидерные пептиды ЕСИХ и 1РСР кодируются двумя экзонами, цитоплазматические районы 1Е0Р - чегырьмя-пятью экзонами, кроме того, каждый трансмембранный и внеклеточный ИГ-домен кодируются одним экзоном (Рис. 11),

Цитоплазматические участки всех идентифицированных иОР рецепторов обладают значительным сходством и содержат консервативные тирозиновые остатки. т1Е0Р1, ЫРОР2-4 рецепторы содержат ГГАМ-подобные мотивы вида <3/ЕххУххУх8УххУ/Е Кроме ГГАМ-подобных, ЫРОР2, ЫРОРЗ и ЫЕ0Р4 рецепторы содержат по одному "классическому" У/ГЛхУххУ/ЬЛ Г'ПМ мотиву, а ЫТОРЗ даже два таких мотива.

Помимо РсЛ-подобных генов, в результате проведенных исследований был также обнаружен ранее неизвестный геи мыши, названный СО 16-2. Ген кодирует белок, внеклеточная область которого, как и у большинства классических РсК, состоит из двух доменов подтипов 01 и П2. Сравнительный анализ показал, что этот ген является ортологом РсуМП человека. Внеклеточные домены СЭ16-2 имеют 65% общих остатков с внеклеточными доменами РсуМП человека и только 45% - с внеклеточными доменами РсуШП и FcyR.II мыши. Идентификация этого гена подтверждает ранее выдвинутые предположения о том, что ЕсуШИ мыши возник в результате межгенной рекомбинации, произошедшей у грызунов. ОТ-ПЦР и Е1озерн блот-гибридизация показали, что ген С016-2 экспрессируется в лимфоидных клетках, в частности, в макрофагах и В лимфоцитах. Этот факт, а также сохранение во внеклеточной области СО 16-2 аминокислотных мотивов, которые, как было ранее обнаружено, вовлечены в связывание иммуноглобулинов классическими Рс11, указывает, что кодируемый геном белок является настоящим Рс рецептором.

ГсуЕШЬ кь 1.1 1.2 01 02 03 ОМ З'ит \ РСИЬ

20 кЬ

РСИЬ II ■

L2 01 02 03 ОМ З'иТ

1РЭР6 ^вР 1 ¡РС Р4 ¡РвРЗ

-ШМ-&—и—и-и

11 12 03 04 05 Т С1

Р вР2 I РвР

И 12 01 02 03 ОА Т С1

И 1.2 01 02 03 04 05.1 05.2 Т С1

11 Ь2 02 03 04 05 Т

- И1РСР1 И1Р6Р

МРвРЗ -ЫР6Р

I II

И !2 0102 03 05.1 05.2 05.3 05.4 05.5 05.6 ТС1

I V I-1-НН-!

Н L2 02 йЗ 0^ТС1

Н-I III Ь!Г0Р

ЫРвРБ

Рис. 11. Взаимное расположение и иитрон-экзонная организация РСИЬ (А) и (В) генов человека. Вертикальными линиями и черными прямоугольниками показаны экзоны, белыми прямоугольниками псевдоэкзоны. серыми - транскрибируемые, но нетранслируемым (З'-иТБУ области. 1.1-2 - экзоны. кодирующие лидерный пептид, 01-05 - ^-подобные д омены, ОМ - муцин-подобный домен, Г - трансмембранный район, С1-5 -цитоплазматический участок. Оценка проведена на основе анализа последовательностей в геномных базах данных человека.

Экспрессия FcR-подобных генов

IFGP семейство. Выявление межклеточного распределения мРНК идентифицированных генов является одним из необходимых этапов изучения их функциональной роли. Анализ экспрессии генов [FGP человека и мыши проводили преимущественно с помощью ОТ-ПЦР в различных тканях, субпопуляциях лейкоцитов крови и трансформированных клеточных линиях различного проихождения. В некоторых случаях была дополнительно использовали Нозерн-блот гибридизация.

ОТ-ПЦР позволил обнаружить экспрессию 1FGP человека в миндалине и селезенке и отсутствие экспрессии в тимусе. Транскрипты всех hlFGP генов, за исключением MFGP2, были обнаружены также в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови (МПК). Было установлено, что два гена. hIFGP3 и hIFGP6 могут экспрессироваться в неллмфоидных тканях. Транскрипты hIFGP3 были обнаружены в коже, а транскрипты гена hIFGP6 в коже, печени и тонком кишечнике. Нозерн-блот гибридизация и/или дот-гибридизация с использованием коммерческих образцов поли(А+) РНК (Cionlech, США) подтвердила полученные с помощью ОТ-ПЦР результаты и продемонстрировала отсутствие экспрессии генов IFGP семейства человека в таких тканях как мозг, почки и сердце.

Изучение клеточных линий показало, что гены hlFGP) - hIFGP5 дифференциально экспрессируются в клетках В-лимфоцитарного происхождения, таких как Raji, BJAB, IM-9, CBMI и BL-2 (Рис.12), а также в промиелоцитарной линии HL-60. Транскрипты этих генов не были обнаружены в Т-клеточных лимфомах (MOLT-4 и Jurkat Е06). Ни одна из исследованных клеточных линий не экспрессировала I1IFGP6.

Для анализа экспрессии генов в негрансформированньтх клетках лейкоциты периферической крови человека были разделены сортировкой на магнитных частицах с помощью антител против ряда лейкоцитарных антигенов на макрофаги/моноциты (CD14+), В клетки (CDI9-T-) и Т клетки CD3+. Кроме того были выделены две основные субпопуляции Т лимфоцитов (CD4+ и CD8^) и NK клетки (CD3-, CD4-, CD 14-, C.D15-, CD 19-, CD36-, CD123- и гяикофорин А- , CD56+ , CD 16+). При анализе этих субпопуляций было обнаружено, что hlFGPl, 3, 4 и 5 гены экспрессируются только в CD 19+- клетках, т.е. в клетках В-клеточного происхождения. Транскрипты гена hIFGP2 в выделенных субпопуляциях (как и в суммарных лейкоцитах) не обнаружены. Транскрипты гена hIFGP6 были выявлены только в CD8+ Т клетках и NK-клетках. Таким образом, полученные результаты показали, что гены hIFGPl-hIFGP5 экспрессируются преимущественно в В лимфоцитах, в то время ген hIFGP6 активен только в цитотоксических клетках. а- оо

1 i s s

2 00 1 О

3 Ш ОС X ■=; hlFGPI' hlFGP hlFGP hlFGPS i ° 5 и t а о

З-з/тгли« + 1 О <£> (О т- Ю Ю

О О О о

СО in

О о ш

JC ь.

Рис. 12. 0Т-П1ДР анализ экспрессии генов ¡БОР человека в субпопуляциях клеток крови и трансформированных клеточных линиях.

Для определения характера экспрессии генов IFGP семейства мыши были исследованы восемь тканей и/или органов мыши, а именно мозг, скелетные мышцы, печень, почка, селезенка, тимус, тонкий и толстый кишечник. Проведенное исследование позволило обнаружить экспрессию mIFGPl гена в скелетных мышцах, печени, селезенке, и гонком кишечнике (Рис. 13 А). мРНК rnIFGP2 была обнаружена в мозге, скелетных мышцах, почках, тимусе, толстом и тонком кишечнике, но не в селезенке. Результаты ОТ-ПЦР для генов mIFGPl и mIFGP2 были в основном подтверждены с помощью РНК блот-гибридизации. Единственное существенное отличие заключалось в том, что блот-гибридизация, в отличие от ОТ-ПЦР, выявила экспрессию mIFGPl в мозге. В связи с последним, следует отметить присутствие нескольких кДНК mIFGPl среди EST гипоталамуса мыши. Не исключено, что ген экспрессируегся только в определенных участках головного мозга. В этом случае, результаты анализа мРНК могут зависеть от приготовления образца ткани. Транскрипты гена mIFGP3 были обнаружены только в селезенке, mIFGP6 - в селезенке и тонком кишечнике.

Помимо тканей был проведен анализ распределения мРНК генов IFGP мыши в некоторых клеточных линиях гемопоэтического происхождения, а именно миелом NS0 и NS1, линии L1210 (пре-В клетки), В-клеточных лимфом А20 и M12 (зрелые В клетки), Т-клеточной линии EL4 и макрофагальной J774 (Рис. 13В). Кроме того, была исследована меланоыа В 16. ОТ-ПЦР анализ выявил экспрессию о -я I s о s OS

I- t- a t- is:

ОТ Tz m

-J h-Ш

N ■«mlFGPI mIFGP mlFGP i mlFGP fi-актин

Рис. 13. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов 1РОР мыши в тканях (А) и трансформированных клеточных линиях (В). mlFGPI во всех линиях В-клеточного происхождения, mIFGP2 - в EL4 Т-клеточной и А20 В-клеточной лимфомах. mIFGP3 транскрипты были обнаружены в L1210, А20 и М12СЗ лимфомах В-клеточного происхождения, но не в миеломах, что может указывать на подавление активности гена в плазматических клетках. Экспрессия mIFGP6 не обнаружена ни в одной из исследуемых линий.

Полученные данные указывают, что в лимфоидных тканях гены mlFGPI и mIFGP3 экспрессируются В-клетками. Подобно генам hIFGPl-hIFGP5 человека, mIFGP3 можно отнести к генам, селективно экспрессируемым В-лимфоцитами. mlFGPI также экспрессируется В-клетками, однако, наши данные, а также широкое тканевое распределение EST mlFGPI (аорта, остеокласты, гипоталамус, молочная железа) указывает на то, что этот ген может активироваться и в пока неизвестных типах клеток, не относящихся к гемопоэтическому ряду. Для определения клеток, экспрессирующих mIFGP6, необходимы дополнительные исследования. Отдельно следует отметить mIFGP2.

Этот ген отличается от всех прочих членов семейства не только структурой кодируемого им белка, но и широтой спектра экспрессирующих его тканей. Присутствие транскриптов mIFGP2 в EL-4 и А20 лимфомах указывает на то, что ген может быть активным в лимфоцитах, однако очевидно, что его функция не ограничена иммунной системой.

Проведенный анализ продемонстрировал также, что разнообразие структуры кодируемых генами IFGP белков может увеличиваться за счет альтернативного сплайсинга. В частности, транскрипты генов IFGP1 обоих видов представлены в виде двух основных форм. Клонирование соответствующих кДНК человека показало, что одна из них кодирует трансмембранный белок, а вторая - белок, лишенный трансмембранного домена. Суще ствавание различных изоформ, отличающихся друг от друга либо структурой внеклеточной области, либо цитоплазматическим участком, было обнаружено нами и при клонировании кДНК hIFGP2 и hIFGP6.

Преимущественная экспрессия всех генов семейства, за исключением mIFGP2, в клетках иммунной системы позволяет предполагать, что кодируемые ими рецепторы принимают участие в механизмах контроля развития и/или функционального состояния трех; основных эффекторных типов лимфоцитов - В-, CD8+ Т- и NK-клеток. Благодаря дифференциальному характеру экспрессии, гены семейства и кодируемые ими рецепторы мог^т найти применение в качестве дополнительных маркеров для более точного разделения различных стадий и направлений созревания В лимфоцитов и цитотоксических клеток, а также для диагностики злокачественных новообразований клеток крови. Особый интерес представляют ярко-выраженные видовые особенности структуры и экспрессии генов семейства. В последние годы становится все более очевидным, что, несмотря на сходство основных принципов функционирования иммунной системы, механизмы тонкой регуляция иммунного ответа у разных видов млекопитающих отличаются. Во многом это связано с видоспецифичной эволюцией молекул иммунной системы (Mestas and Hughes, 2004). Дальнейшие исследования рецепторов IFGP семейства у человека и мыши могут иметь важное значение для понимания различий между иммунными системами двух видов и, соответственно, для более корректного использования мыши, как экспериментально модели иммунных реакций человека.

FCRL и FCRL2. Для анализа экспрессии FCRL и FCRL2 человека использовали Нозерн-блот гибридизацию, ОТ-ПЦР и дот-гибридизацию на коммерческих панелях кДНК, представляющих различные ткани человека, субпопуляции периферических лейкоцитов и клеточные линии. Полученные результаты показали, что ген FCRL специфично экспрессируется В-лимфоцигами и его транскрипты отсутствуют в других субпопуляциях клеток крови. Транскрипты гена были обнаружены в лимфоидных тканях и тканях, содержащих скопления лимфоидных клеток. В отличие от РСИЬ, экспрессию гена РСЯЬ2 среди нормальных тканей удалось обнаружить только в плаценте и только с помощью ОТ-ПЦР. В тоже время, было обнаружено что этот ген дифференциально экспрессируется в трансформированных клеточных линиях В-клеточного происхождения. Помимо В-клегочных лимфом, транскрипты гена были обнаружены также в меланоме в-Зб!. Особый интерес представляет тот факт, что экспрессия гена РСКЛ2 резко возрастает при злокачественной трансформации меланоцитов. Меланома относится к наиболее опасным неоплазиям и на конечной, метастазирующей стадии, как правило, вызывает летальный исход.

Рис. 14 Количественный анализ экспрессии гена РСК1.2 в различных типах мсланом. ММ -доброкачественные невусы; ММ -злокачественная меланома;

125 МММ - метастазирукмцая меланома

1.ЭС ' III.

0 75 0.50 0,

Наши результаты показывают, что присутствие мРНК РС11Ь2 является признаком злокачественной прогрессии и, вероятно, может быть использовано для своевременного диагноза этого типа рака. Кроме того, низкая активность гена РСЯЬ2 во всех нормальных тканях, за исключением плаценты, делает этот белок перспективным кандидатом на роль мишени для замедления роста или элиминации В-клеточных лимфом и злокачественной меланомы.

Характерной чертой экспрессии обоих генов является присутствие-множества альтернативных транскриптов. При изучении гена РСЯЬ человека было обнаружено шесть вариантов к ДНК. Кодируемые ими белки отличаются либо длиной лидерного пептида, либо доменным составом. В случае РСЛЬ2 мы выявили транскрипты, которые являются результатом интраэкзонного альтернативного сплайсинга, использующего два различных неканонических АО-динуклеотида в пятом экзоне гена. Белки, кодируемые альтернативными транскриптами, идентичны в области двух И-кондевых доменов, но имеют отличные друг от друга С-концевые аминокислотные последовательности.

Рис. 15. Иммуноблотгииг лизатов В-клеточных лимфом IM9 и BJAB, лизатов COS-7 и 293Т клеток, трансфщированных (TF) кДНК FCRL (А) и FCRL2 (В), а также среды, кондиционированной этими клетками, с помощью FCRL- и РСИЬ2-специфичных. антител

Отсутствие трансмембранных районов и наличие типичных лидерных пептидов в предсказанной аминокислотной последовательности FCRL и FCRL2 давало основание считать, что эти белки являются секретируемыми. Для определения характера продукции FCRL и FCRL2 были получены специфические поликлональные антитела. При получении антител использовали фрагменты белков, наработанные в бактериальной экспрессирующей системе. Исследование некоторых В-клеточных лимфом, а также эукариотических клеток линий COS-7 и 293Т, трансфицированных кДНК FCRL и FCRL2, показал, что оба белка являются внутриклеточными. Они отсутствовали как в кондиционированной трансфектантами и клетками лимфомы среде, так и на поверхности клеток (Рис.15.)

Следует отметить, что FCRL и FCRL2 являются наиболее консервативными членами семейства. Уровень сходства между белками человека и мыши составляет 70% в случае FCRL и 75% в случае FCRL2. Более того, D1 и D2 домены FCRL2 человека и мыши имеют 94% сходных остатков. Высокая консервативность, внутриклеточная экспрессия, а также присутствие необычного С-концевого домена, отсутствующего у других известных белков, указывает на то, что FCRL и FCRL2 выполняют уникальные функции, отличные от функций других членов семейства.

Эволюция Ее К семейства

Поразительное разнообразие доменной архитектуры белков РсК. семейства, а также ярко-выраженные различия между человеком и мышью по количеству и структуре этих белков вызывает целый ряд вопросов. Каковы механизмы генерации этого разнообразия? В какой степени этот процесс связан с возникновением новых функций? Характерны ли столь же высокие темпы эволюции для других

§8Р генов, кодирующих белки иммунной системы?

Для того, чтобы попытаться ответить на эти вопросы, мы использовали возможности, предоставляемые проектами секвенирования геномов различных фидов позвоночных. Был проведен сравнительный анализ генов РсЯ семейства в геномах таких позвоночных, как собака, опоссум, шимпанзе, курица и шпорцевая лягушка. С этой целью использовали ТВЬАЗ'Ш программу поиска нуклеотидных последовательностей, кодирующих отдельные домены, гомологичные доменам РсК и РсЯ-подобных белков, с последующим компьютерным и визуальным анализом структуры соответствующих генов, их взаимного расположения, а также сцепления другими генами. Опубликованные последовательности геномов, как правило, сопровождаются аннотациями о структуре предсказанных генов. Однако, в связи с многочисленными ошибками в этих предсказаниях, они не учитывались в нашем анализе. Аминокислотные последовательности белков, кодируемых предсказанными генами, а также последовательности отдельных доменов, подвергали сравнительному и филогененетическому анализу.

Результаты проведенного исследования суммированы в Рис 16 и 19. В геноме собаки было обнаружено 13 генов РсЯ семейства. Четыре гена кодируют классические РсЯ: РсуЮ, РсуШ1, РсуЮП и РсеИ. Еще два гена кодируют РСКХ и РС11Ь2. ШОР семейство собаки включает семь генов, пять из которых образуют кластер, в котором порядок генов соответствует их порядку в геноме человека. Прежде всего следует отметить, что собака имеет ген, гомологичный гену т!РОР2, который кодирует мозаичный белок с С-концевым скавенжер-доменом и который отсутствует у человека.

Рис. 16. Сравнение хромосомной локализации (В) генов РсЯ семейства и доменной архитектуры кодируемых ими белков (А) у человека, мыши, собаки, опоссума и курицы. Схема составлена на основании изучения геномных последовательностей, размещенных на сайгах вепВапк и ЕпзетЫ. Гены РсК-семейства показаны закрашенными прямоугольниками, сцепленные с ними гены - пустыми прямоугольниками. Для упрощения схемы масштаб не показан. Двойная косая линия обозначает отсутствие тесного сцепления. Разрыв линии обозначает либо локализацию гена на другой хромосоме, либо отсутствие данных о сцеплении.

Sditf Оaiia^d "" ■ oiia^d » ama^dW Vlllb^d m- -9VdSHÇ>vira^y*

- •qiittbd ф BliyAod Ф

ИЮО*----------IllütodMi я JW'AiT-ФJI^/MÇ

S33NÇ=>

8fMV1S4?

9d3dl4»cjdsna ---------------Ф - --------------Ф----------------фюф---------------Ф--.----------------Ф

M30d"

SdBdl* •■ SdSdl*--£dOJI«P--t-dSdl»--LdSdl»--isaoa

- :: labd».--i^od"

Sd9dl 4?

WOdi Ф

EdOdl ZdSd! ^ dDdl «

X® ziiPJ о®<м - -1яэ.н

03>»-aiiabd

СФ*- aiuabj О®» vmatoj ОФ»—viiatoj

•®$- 9dSdl

Xt>f IU33J exî«s®©se®i- sdodi see®|- JdSdl œm®®$- Edodi

- tdOdl

I isao naod

G©§- i-stao ©©j- mabd •©f- 9d0dl 0®t- lijraj

C»<| znaod

G®e<31 "Wd

2>|— llätod

3©f inatod

SdDdl

3©f- larad sia^d

3© -airatoj G®*— vna^d O'

Ф|- matad

•§- 9dOdl

0©f lidWj

•§- iabd HesOLfSh

J g ©Ge®J-zdOdi

I eee®|-fdOdl

- tdOdl в@©* WOdl nsao ami isao eeesas zdodi ®e®scis idodi

E«®S

§- sdSdi s#®f- wsdi ex2¿®©f- cdsdi ©©•®®jh zdOdi

•t- lytod чгшчкм

•f- IMtod

BJiegoo

WAOOOUO тят- dsdi o-- i епиаля

Короткохвостый опоссум (Monodelphis domestica) является представителем сумчатых млекопитающих. Считается, что плацентарные и сумчатые млекопитающие разделились приблизительно 130 млн. лет назад. Изучение генома опоссума показало, что у этого вида имеются все три группы генов FcR семейства: гены FCRL и FCRL2, пять генов IFGP, и четыре гена FcR. Примечательно, что мы не обнаружили у опоссума признаков гена, гомологичного генам FcyRl плацентарных млекопитающих. В настоящее время остается неизвестным, является ли это результатом ошибок в сборке опубликованных геномных последовательностей или этот ген возник позднее. Вместе с тем., было обнаружено, что белок с доменной архитектурой подобной архитектуре FcyRJ, кодируется геном IFGP6 опоссума. То, что 0IFGP6 является ортологом соответствующих генов плацентарных млекопитающих, следует как из его локализации, гак и из результатов филогенетического анализа. Взаимоотношения других представителей IFGP семейства опоссума с белками человека, мыши и собаки определить не удалось. Гены IFGP1-IFGP5 опоссума и кодируемые ими белки в структурном отношении более близки друг другу, чем белкам плацентарных млекопитающих. Этот факт может быть объяснен как гомогенизацией в ÍFGP семействе сумчатых, так и специфичными для этой филогенетической линии дупликациями. Интересно, что в геноме опоссума не был обнаружен гомолог mIFGP2/dIFGP7. На его месте присутствует ген, кодирующий типичный трансмембранный рецептор, включающий только Ig-домены.

Сравнение генов классических FcR опоссума показало, что два из них, обозначенные нами FcyRIIa и FcyRIIb являются результатом недавней дупликации - их гомология на уровне аминокислотных последовательностей составляет более 95%. Кроме того, внеклеточная область oFcyRIII достоверно ближе внеклеточным областям FcgRJIa и FcyRIIb, чем внеклеточным областям FcyRIII плацентарных млекопитающих. В тоже время, трансмембранный и цитоплазматический участки oFcyRIII гомологичны соответствующим участкам FcyRIII других видов. Этот указывает на то, что oFcyRIII в сто современном виде может быть результатом межгенной рекомбинации.

Использованные нами методы анализа геномных последовательностей позволяли выявлять не только предположительно функциональные экзоны для внеклеточных доменов, но и экзоны с различного рода нарушениями. Полученные результаты дают основания считать, что одним из механизмов генерации разнообразия доменной архитектуры IFGP белков является потеря отдельных экзонов за счет делегирующих мутаций (Рис. 17). Так, например, внеклеточная область ÍFGP1 человека состоит из доменов D3, D4 и D5. Вместе с тем, между 2-м и 3-м функциональными экзонами соответствующего гена присутствует два псевдоэкзона, содержащие стоп-кодоны и/или делеции, вызывающие смену рамки считывания. По своей последовательности эти экзоны гомологичны экзонам для 01 и 02 подтипов

§ доменов других ШвР белков. Аналогичная ситуация была обнаружена в случае генов [РвРЗ и 1БС;Р6 собаки. Первый из них имеет мутации в четырех экзонах и нарушенный сайт сплайсинга в пятом. В результате, несмотря на значительное сходство между генами ШОРЗ человека и собаки на нуклеотидном уровне, кодируемые ими белки имеют совершенно разный доменный состав. и 12 01 02 03 04 05 ТМ

-о—о—|—|—-1— шимпанзе

1.11-2 01 02 03 04 05 ТМ ЧН-0—О—В—I—I-1— человек

И 12 04 05 ТМ ЧН-1—1-1—мышь

11 12 БЗ 04 05 ТМ ЧН-1—1-1-1— собака

L1 L2 D2 D3 D5 ТМ ЧН——-Я—I—-1-О— человек

L1 L2 03 D5 ТМ

ЧН]-1-Я-1— МЬ|ШЬ

L1L2 02 Dî D5 ТМ ЧН-0—I-1-о—собака

L1 L2 D1 D2 D3 ТМ

3-8-1—|—|-41— опоссум

L1 L2 D1 02 D3 D4 05.1 DS.2 ТМ -H-1—I—В—I-1-1-1— человек

L1 L2 D1 D2 03 D4 05.1 D5.2 ТМ

IFGP3 ЧН)-D—I—D—0—D—I-1— собака

Рис. 17. Генерация разнообразия доменной архитектуры 1Р0Р белков за счет потери отдельных экзонов в результате делегирующих мутаций. Показана схема организации генов 1Р0Р1, 1Р0Р6 и ШйРЗ различных видов. Функциональные и аберрантные экзоны показаны, соответственно, темными и пустыми прямоугольниками.

Еще одним механизмом генерации разнообразия доменной архитектуры белков, вероятнее всего, являлись внутригенные и межгенные рекомбинации. Роль событий такого рода наиболее очевидна в случае т1РОР2/с11РСР7. Филогенетический анализ показывает, что донором для обнаруженного в этом гене экзона, кодирующего скавенжер-домен, послужил расположенный рядом ген СБЗЦРис. 18). Этот ген кодирует секретируемый белок, состоящий из грех скавенжер-доменов Рекомбинация произошла, вероятнее всего, у общего предка приматов, грызунов и хищных, но в дальнейшем этот ген был потерян высшими приматами в ходе их самостоятельной эволюции.

Полученные данные указывают также на то, что в процессе эволюции ИсЯ семейства происходила интенсивная перетасовка экзонов, кодирующих

§-домены. Помимо явных признаков таких событий в эволюции классических рсЛ, можно отмстить, что Г)4-домены <11РОР2 и с)1РСР7 имеют 96% сходства, в то время как, по остальным доменам, уровень сходства между этими белками варьирует в пределах 40-60%. Возможно, что результатом межгенной рекомбинации является также [РвРЗ мыши. В то время как лидерный пептид, трансмембранный и цитоплазматический участки, а также 01, В2 и ВЗ домены этого белка кластеризуются при филогенетическом анализе с соответствующими участками 1РОР5 человека и собаки, 04 и Б5 домены имеют большее сходство с соответствующими доменами 1ТОР4. Учитывая взаимное расположение генов И-вР семейства у человека, мыши и собаки, можно предположить также, что именно рекомбинация между предкозыми 1РСР4 и 1РОР5 привела не только к образованию одного нового гена вместо двух старых, но и к потере грызунами ортологов 1РСР2 и 1РСРЗ человека и собаки. mCD5l d dCDoL d3 hCD5L ri3 mCD5L d3 0CD5L d1ф diFGP7 dSR

Рис. 18. Филогенетическое дерево SRCR-доменов CD5L, mIFGP7 и dIFGP2. Дерево построено методом Neighbor Joining.

Важно отметить, что какими бы ни были молекулярные события в ходе эволюции FcR семейства, в разных филогенетических линиях они происходили по разному. Особенно явно видоспецифичность эволюции семейства иллюстрируют результаты изучения геномов курицы и шпорцевой лягушки (Xenopus tropicalis). Анализ имеющихся геномных и экспрессируемых нуклеотидных последовательностей курицы позволил обнаружить только один ген, кодирующий белок с доменной архитектурой, подобной IPGP2 человека (Рис. 16). Формально нельзя исключить, что, по какой-то причине, участки генома курицы, содержащие РсЛ-подобные гены, избежали секвенирования. Однако, такое объяснение выглядит маловероятным, поскольку мы обнаружили у этого вида ортологи фактически всех генов, тесно сцепленных с генами РсР. у млекопитающих. В геноме курицы было обнаружено значительно меньшее количество генов, чем у млекопитающих и даже рыб (приблизительно 23 тысячи генов (НПНег, 2004)). По этой причине, более приемлемым выгладит предположение, что большая часть генов РсЯ-семейства была потеряна у птиц или, как минимум, у представителей семейства Рка51атс1ае.

Другая крайность была обнаружена при компьютерном анализе геномных и экспрессируемых нуклеотидных последовательностей шпорцевой лягушки. В геноме этого вида мы выявили более 70 генов, кодирующих РсИ-подобные белки. По присутствию и характеру

Рис. 19. Разнообразие доменной архитектуры РсЯ-подобных белков X. и-орисА'к. предсказанное на основе анализа геномных и экспрессируемых. нуклеотидных последовательностей этого вида. Обозначения соответствуют обозначениям на Рис. 16. Дополнительный подтип домена показан серой заливкой. Звездочкой отмечены варианты архитектуры, отсутствующие среди белков млекопитающих трансмембранных участков, кодируемые этими генами белки можно предположительно разделить на три класса: секретируемые белки, а также активирующие и ингибирующие рецепторы. Предположительно активирующие рецепторы имеют кодируемые одним экзоном короткий цигоплазматический участок и лрансмембранный район с характерным ИххЯ мотивом, предполагающим возможность ассоциации с одной из обнаруженных у лягушки ТСС. В цитогшазматических областях предположительно ингибирующих. рецепторов обнаружены различные паттерны ITIM-иодобных мотивов. Кодируемые FcR-подобными генами лягушки белки отличаются исключительным разнообразием доменной архитектуры (Рис. 19). От белков млекопитающих их отличает две особенности: присутствие дополнительного шестого подтипа Ig-домена и экспансия домена подтипа D3. В то время как белки млекопитающих содержат не более одного домена D3, FcR-подобные белки лягушки могут иметь от одного до шести доменов этого подтипа. На основании предварительных данных филогенетического анализа можно предположить, что подавляющее большинство FcR-подобных генов лягушки возникло в результате специфичных для этой линии позвоночных дупликаций. Среди идентифицированных генов мы не обнаружили гомологов FCRL, FCRL2 и mIFGP2/dIFGP7.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Таранин, Александр Владимирович

выводы

1. С помощью экспериментальных методов и методов биоинформатики проведено исследование ряда семейств генов иммунной системы у различных представителей млекопитающих, а также представителей птиц, амфибий, костистых рыб, костно-хрящевых рыб и круглоротых.

2. Идентифицированы и выделены к- и А-типы легких цепей иммуноглобулинов американской норки. Количественное соотношение к и Я цепей в сыворотке крови составляет в среднем 46:54. Обнаружен генетический полиморфизм К-цепей, выявляемый в виде пяти аллотипов 1Л-Ь5. Наследование аллотипов осуществляется: в виде четырех аллогрупп, передающихся как аллельные моногенные признаки. Генетический анализ аллотипов указывает на присутствие в Х-локусе норки как минимум трех функциональных С-генов.

3. Молекулярно-генетический анализ к-, Х- и у-генов иммуноглобулинов норки показал, что геном этого вида содержит 6-7 Сл,-генов, 1 Ск-ген и от 4 до 6 Су-генов. Высокий уровень сходства между клонированными СХ-генами, а также между Су-генами указывает, что дупликации генов в обоих локусах происходили таксон-специфично.

4. Хемокины, как факторы хемоаттракции лейкоцитов возникли и начали дивергировать до разделения бесчелюстных и челюстных позвоночных.

5. Сигнальные ГТАМ-содержащие трансмембранные субъединицы лейкоцитарных рецепторных комплексов, С.иЗе, С03у/5, СО79а, СБ79Ь, ТСШ^, РсТ1у, ВАРЮ и ОАР12 относятся к наиболее консервативным элементам иммунной системы и возникли до выхода позвоночных на сушу. Гены субъединиц и сцепленные с ними гены образуют синтенные группы, сохранившиеся с момента разделения рыб и наземных позвоночных. У алнотетраплоидных видов дупляцированные копии генов субъединиц могут сохраняться.

6. У человека и мыши идентифицированы, соответственно, 8 и 7 ранее неизвестных генов, структурно родственных генам лейкоцитарных Рс-рецепторов. РсК-подобные гены разделены на две группы, названные ШОР и РС.Ш1. ШСгР группа представлена шестью генами у человека и четырьмя генами у мыши. За исключением 1РвР2 мыши, все обнаруженные 1ЕОР гены кодируют трансмембранные рецепторы I типа с различной доменной архитектурой. Цитоплазматические участки 1РОР рецепторов содержат тирозин-основанные 1Т1М- и 1ТАМ-подобные сигнальные мотивы. FCR.iL и РСЫЬ2 являются мозаичными белками, содержащими уникальный С-концевой муцин-подобный домен. Один из обнаруженных генов мыши, получивший обозначение СШ6-2, относится к подсемейству классических Рс рецепторов и является ортологом РсдЯШ человека.

7. За исключением mIFGP2, гены IFGP семейства экспрессируются преимущественно в клетках лимфоидных тканей. Экспрессия IFGP1-IFGP5 человека и IFGP3 мыши обнаружена только в В-лимфоцитах. IFGP6 человека экспрессируется исключительно цитотоксическими CD8 Т и NK клетками. CD16-2, как и гены классических Fc рецепторов, экспрессируется в различных типах лейкоцитов.

8. Гены FCRL и FCRL2 человека кодируют внутриклеточные белки с молекулярной массой, соответственно, 44 и 57 кДа. FCRL экпрессируется преимущественно В лимфоцитами. Наибольший уровень экспрессии обнаружен в В клетках зародышевых центров вторичных лимфоидных органов. Анализ распределения мРНК FCRL2 в нормальных тканях позволил обнаружить экспрессию гена только в плаценте. Гранскрипгы гена были выявлены в некоторых трансформированных линиях В клеточного происхождение, но не обнаружены в В лимфоцитах периферической крови человека. Экспрессия гена FCRL2 может являться признаком злокачественной трансформации меланоцитов.

9. Разнообразие доменной архитектуры FcR-лодобных белков генерировалось в ходе эволюции с помощью двух основных механизмов: дифференциальной потери отдельных экзонов за счет накопления делетирующих мутаций, а также в результате межгенных и/или внутригенных рекомбинаций, приводящих к перетасовке экзонов.

10. Наследуемое разнообразие доменной архитектуры кодируемых FcR-подобными генами белков может увеличиваться за счет межэкзонного или внутриэкзонного альтернативного сплайсинга мРНК. Внутриэкзонный альтернативный сплайсинг мРНК FCRL2 приводит к экспрессии транскриптов, использующих три разные рамки считывания для С-концевой аминокислотной последовательности белка.

11. В разных филогенетических линиях дупликации и рекомбинации генов FcR семейства происходили видоспецифичным образом. Результатом этого процесса является чрезвычайно широкая межвидовая вариабельность как по количеству генов (от 1-2 у курицы - до 70 у шпорцевой лягушки), так и по доменной архитектуре кодируемых этими генами белков (в общей сложности, не менее 30-ти вариантов). Отдельные члены семейства при сравнении не имеют сходных структурных элементов.

12. Видослецифичвость процессов сокращения-распространения в эволюции части семейств генов иммунной системы, а также значительный вклад рекомбинационного процесса позволяют объяснить, во-первых, отсутствие сколько-нибудь очевидной филогенетической связи между белками IgSF беспозвоночных и белками иммунной системы позвоночных и, во-вторых, высокие темпы генерации функциональных нововведений в ходе развития иммунной системы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Ершова С.А., Наякшин A.M., Мечетина Л.В., Пекло М.М., Шевелев А.Я., Власик Т.Н., Чикаев Н.А., Таранин А.В.Сравнительный анализ экспрессии семейства генов IFGP у человека и мыши // Молекулярная биология. 2005. Т. 39. № 5. 1-10.

2. Chikaev N.A., Bykova Е.А., Najakshin A.M., Mechetina L. V., Volkova O.Y., Peklo M.M., Shevelev A.Y., Ylasik T.N., Roesch A., Vogt T, Taranin A. V. Cloning and characterization of the human FCRL2 gene // Genomics. 2005 v.85. p. 264-272.

3. Guselnikov SV, Najakshin AM, Taranin AV. Fugu rubripes possesses genes for the entire set of the ITAM-bearing transmembrane signal subunits // Immunogenetics. 2003. v.55. p. 472-479.

4. Guselnikov S. V., Bell A., Najakshin A.M., Robert J., Taranin A. V. Signaling FcRgamma and TCRzeta subunit homologs in the amphibian Xenopus laevis // Dev Comp Immunol. 2003. v. 27. p. 727-733.

5. Mechetina L.V., Najakshin A.M., Alabyev B.Y., Chikaev N.A., Taranin A. V. Identification of CD 16-2, a novel mouse receptor homologous to CD16/Fc gamma RIII //Immunogenetics. 2002. v. 54p. 463-468.

6. Guselnikov S.V., Ershova S.A., Mechetina L.V., Najakshin A.M., Volkova O.Y., Alabyev B.Y., Taranin A.V. A family of highly diverse human and mouse genes structurally links leukocyte FcR, gp42 and PECAM-1 // Immunogenetics. 2002. v.54. p. 87-95.

7. Mechetina L. V., Najakshin A.M., Volkova O.Y., Guseinikov S.V., Faizulin R.Z., Alabyev B.Y., Chikaev N.A., Vinogradova M.S., Taranin A.V. FCRL, a novel member of the leukocyte Fc receptor family possesses unique structural features // Eur J Immunol. 2002. v.32. p. 87-96.

8. Alabyev B.Y., Guselnikov S.V., Najakshin A.M., Mechetina L.V., Taranin A.V. CD3epsilon homologues in the chondrostean fish Acipenser ruthenus /I Immunogenetics. 2000. v.51.p. 1012-1020.

9. Alabyev B.Y., Najakshin A.M., Mechetina L.V., Taranin A.V. Cloning of a CXCR4 homolog in chondrostean fish and characterization of the CXCR4-speeific structural features//Dev Comp Immunol. 2000. v. 24. p. 765-770.

10. Najakshin A.M., Mechetina L.V., Alabyev B.Y., Taranin A.V. Identification of an IL-8 homolog in lamprey (Lampetra fluviatilis): early evolutionary divergence of chemokines // Eur J Immunol. 1999. v.29. p. 375382.

11. Najakshin A.M., Belousov E.S., Alabyev B.Y., Christensen J., Storgaard Т., Aasted В., Taranin A.V. Structure of mink immunoglobulin gamma chain cDNA // Dev Comp Immunol. 1996. v. 20. p. 231-240."

12. Najakshin A.M., Belousov J.S., Alabyev B.Y., Bogachev S.S., Taranin A.V. cDNA clones encoding mink immunoglobulin lambda chains // Mol Immunol. 1993. v.30. p. 1205-1212.

13. Bovkun L.A., Peremislov V.V., Nayakshin A.M., Belousov E.S., Mechetina L.V., Aasted В., Taranin A.V. Expression of immunoglobulin kappa and lambda chains in mink // Eur J Immunol. 1993. v.23. p. 1929-1934.

14. Peremislov V.V., Mechetina L.V., Taranin A.V. Monoclonal antibodies against heavy and light chains of domestic mink IgG // Hybridoma. 1992. v. 11. p. 629-638.

15. Najakshin A.M., Belousov J.S., Alabyev B.Y., Bovkun L.A., Peremislov V. V., Aasted В., Taranin A.V. Molecular cloning of mink immunoglobulin y, X and к-chain cDNA. 1992. Norvegian Journal of Agricultural sciences. 1992. Supplement 9: p. 196-200.

16. Peremislov V.V., Mechetina L.V., Taranin A.V. Mouse monoclonal antibodies detect epitopes of immunoglobulin у, X and к-chains common to several fur animal species. Norvegian Journal of Agricultural sciences. 1992. Supplement 9: p. 180-184.

17. Наякшин A.M., Белоусов E.G., Алябьев Б.Ю., Таранин A.B. Гены лямбда-цепей иммуноглобулинов норки (Mustela visori) // ДАН СССР 1991. Т. 319. №6. С. 1477-1479.

18. Фомичева И.И., Таранин А.В., Баранов O.K. Генетика и эволюция иммуноглобулинов норки (Mustela vison). В сб: Проблемы генетики и эволюции, Новосибирск, Наука, 1991

19. Наякшин A.M., Белоусов Е.С., Таранин А.В., Богачев С.С., Рогозин И.Б., Баранов O.K. Клонирование и анализ первичной последовательности кДНК лямбда-цепей иммуноглобулинов американской норки норки (Mustela vison) Н Генетика. 1990. Т. 26. № 8. С. 1527-1531.

20. Volkova O.Y., Fomicheva I.I., Taranin A.V., Belousov E.S., Baranov O.K. Genetic polymorphism of IgG in the mink. V. Two new genetic markers of the lambda light chains of mink immunoglobulins, L4 and L5 // Exp Clin Immunogenet. 1989. v.6. p. 258-268.

21: Volkova O.Y., Fomicheva 1.1., Taranin A.V., Baranov O.K., Belyaev D.K. Genetic polymorphism of IgG in the mink. IV. Identification and genetic control of L3 allotype of the light chains // Exp Clin Immunogenet. 1987. v. 4. p. 81-88.

22. Баранов O.K., Беляев Д.К., Волкова О.Ю., Фомичева И.И. Таранин А.В. Иммукогенетика иммуноглобулинов американской норки. Сообщение IV. Идентификация и генетический контроль аллотипа LIB легких цепей // Генетика. 1984. Т. 20., №5. С.826-834.

Избранные тезисы докладов

1. Alabyev B.Y., Najakshin A.M., Denisov S.G., Mechetina L.V., Taranin A. V. Diversity of expressed kappa-like immunoglobulin light chain genes in sterlet (Acipenser ruthenns). The 4th Nordic Simposium on Fish Immunology, Hirtshals, Denmark, 26-30 May 1998, P. C6.

2. Taranin A.V., Rogozin I.B. Searching for the immunoglobulin superfamily genes in C.elegans. Proceedings of the I International conference on bioinformatics of genome regulation and structure (BGR.S). 1998, August 2431, Novosibirsk, v. 2, p. 333-335.

3. Taranin A.V., Najakshin A.M., Guselnikov S.V., Mechetina L.V., Ershova S, Alabyev B.Y. Evolution of the leukocyte FcR family. Proceedings of the

11th International congress of Immunology. Stockholm, 22-28 July 2001, Scand J Immunol, v.54, Supplement 1, Fri 8

4. Guselnikov S, Mechetina L, Ershova S, Najakshin A, Alabyev B, Volkova 0, Taranin A. (2001) Extending a family of genes structurally related to the leukocyte Fc-receptors. Proceedings of the 11 th International congress of Immunology. Stockholm, 22-28 July 2001, Scand J Immunol, v.54, Supplement l,Thu36

5. Ershova S.A., Guselnikov S.V., Mechetina L.V., Najakshin A.M., Volkova O.Y.and Taranin A.V.Identification of a novel family of В cell receptors containing tyrosine-based motifs in their cytoplasmic tails. Proceedings of the International symposium on Intracelular Signalling in Plant and Animal Systems. Kiev, Ukraine, 9-14 September, 2001, p 58.

6. Гусельников С.В., Ершова С.А., Мечегина JI.B,, Волкова О.Ю., Файзулин Р.З., Наякшин A.M., Алябьев Б.Ю., Таранин А.В. Молекулярная эволюция FcR-подобных генов позвоночных. Материалы II Международного симпозиума "Эволюция жизни на земле" 2001, Томск, с. 101-103.

7. Taranin A.V., Najakshin A.M., Guselnikov S.V., Ershova S.A., Mechetina L.V., Volkova O.Y. and Robert J. Extensive species-specific exon-shuffling in the evolution of the FcR family. Proceedings of the 9th International Congress of ISDCI. St. Andrews, Scotland, 29 June - 4 July, 2003, p.123.

8. Guselnikov S.V., ErilovaA.Y., Najakshin A.M., Cohen N., Robert J., Taranin A.V. FcR-like genes in the Amphibian Xenopus: species-specific expansion, structural diversity, and developmental expression. Clin Invest Med. Proceedings of the 12lh International Congress of Immunology, July 1823, 2004, Montreal, Canada, 2004 v. 27. p. 82C

9. Ershova S.A., Peklo M.M., Shevelev A.Y., Najakshin A.M., Mechetina L.V., Volkova O.Y., Chikaev N.A., Vlasik T.N., Taranin A.V. IFGP6: a novel human member of the IFGP/IRTA/FcRH family that is selectively expressed by CD 8 T and NK cells. Clin Invest Med. Proceedings of the 12th International Congress of Immunology, July 18-23,2004, Montreal, Canada, 2004. v. 27. p.lOC.

10. Guselnikov S. V., Erilova A. Yu., Najakshin A. M. and Taranin A. V. Inhibitory and activating receptors of leukocytes: an evolutionary view. Proceedings of the 1st International Conference on Basic and Clinical Immunogenomics. Oct. 3-7, 2004, Budapest, Hungary. Tissue Antigens. 2004. v.64. p. 363.

Подписано к печати 27.02.2006 г.

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 3,3. Уч.изд. л. 2,7

Тираж 110 экз. Заказ 12

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10