Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Aimafix D.I." тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Вуймо, Татьяна Алексеевна

• Вуймо, Татьяна Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вуймо, Татьяна Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Использование различных типов переносчиков для адресной доставки и создания пролонгировнных форм препаратов

1.1.1. Адъюванты

1.1.2. Моноклональные антитела ■

1.1.3. Макромолекулярные переносчики

1.1.4. Липосомы и другие микрокапсулы

1.1.5. Липосомалъная форма митоксантрона

1.1.6. Изменение концентрации митоксантрона в плазме после введения липосомального или свободного митоксантрона in vivo

1.1.7. Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов

1.1.8. Примеры использования эритроцитов в качестве переносчиков лекарственных репаратов

1.2. Способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами

1.3. Сведения о лекарственных препаратах, использованных в данной работе

1.3.1. Митоксантрон

1.3.2. Фактор IXсистемы свертывания крови 26 ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Получение эритроцитов нагруженных митоксантроном

2.2.2. Приготовление лизатов эритроцитов

2.2.3. Приготовление хлороформных экстрактов проб

2.2.4. Измерение концентрации свободного гемоглобина

2.2.5. Измерение выхода митоксантрона из загруженных эритроцитов

2.2.6. Измерение распределения эритроцитов по плотностям в суспензиях с различной концентрацией митоксантрона

2.2.7. Биотинилирование препарата фактора IX

2.2.8. Определение степени биотинипирования фактора IX

2.2.9. Включение биотинилированного фактора IXв эритроциты

2.2.10. Изучение фармакокинетики биотинилированного препарата фактора IX 37 2.2.11. Измерение концентрации биотинилированного препарата фактора IXв плазме и внутри эритроцитов

ГЛАВА 3. Результаты

3.1. Загрузка митоксантрона в эритроциты

3.2. Влияние температуры на кинетику загрузки эритроцитов митоксантроном

3.3. Влияние гематокрита суспензии на эффективность загрузки митоксантрона в эритроциты

3.4. Выход депонированного митоксантрона из эритроцитов

3.5. Влияние присутствия митоксантрона на сохранность эритроцитов

3.5.1. Влияние температуры инкубации и концентрации митоксантрона на скорость гемолиза нагруженных эритроцитов

3.5.2. Влияние митоксантрона на распределение эритроцитов по плотностям

3.6. Включение биотинилированного фактора IX в эритроциты

3.7. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, введенного внутривенно в виде раствора

3.8. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, включенного в эритроциты

3.9. Расчет времени полувыведения фактора IXbiot, включенного в эритроциты

ГЛАВА 4. Обсуждение

4.1. Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей

4.2. Антигемофильный фактор IX, включенный в эритроциты 56 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58 ВЫВОДЫ 59 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Aimafix D.I."»

В современной фармакологии все более отчетливо проявляются две ведущие тенденции: 1- создание методов направленной («адресной») доставки фармакологических препаратов; 2 - разработка новых лекарственных форм для создания в организме человека депо фармакологических препаратов, обеспечивающих постепенное высвобождение препарата, получение пролонгированного эффекта, повышение терапевтической эффективности препарата, а также снижение его токсичности.

Определяющую роль в решении этих задач играют переносчики лекарственных средств. Они позволяют не только создать депонированную форму введенного соединения, но и защитить лекарство от преждевременного разрушения и инактивации ретикулоэндотелиальной системой организма; предотвратить или уменьшить иммунные и аллергические реакции организма на введенный препарат; осуществлять его направленный транспорт в органы и ткани-мишени.

Одной из важнейших предпосылок для успешного применения различных лекарственных препаратов, фармакологически или физиологически активных веществ (ФАВ) является специфичность их действия. Однако большая часть этих лекарственных соединений взаимодействует также и со значительным числом неспецифических мишеней. Это обстоятельство было наглядно продемонстрировано на примере химиотерапии онкологических заболеваний. Медленный прогресс в этой области является следствием неспособности практически всех цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки [2]. Низкая избирательность лекарственного препарата требует повышения дозы вводимого вещества, чтобы обеспечить его терапевтическую эффективность. Это приводит к усилению общего токсического действия препарата на организм и часто сопровождается развитием лекарственной устойчивости опухолевых или патологически измененных клеток к стандартным формам препарата. Включение лекарства в несущие микрокапсулы или аутологичные клетки-носители снижает пиковые концентрации свободного препарата в крови в момент введения, что понижает его токсическое действие, а также способствует снижению иммунного ответа организма на препарат, т.е. препятствует быстрому развитию устойчивости по отношению к введенному лекарству.

Переносчики лекарственных препаратов должны удовлетворять всем требованиям, которые предъявляются к любым веществам, вводимым в организм. Они должны быть нетоксичны, не иметь, или иметь минимальные побочные эффекты и быть способными к биодеградации - разложению и выведению продуктов переработки переносчика системами организма. В этом отношении одними из самых перспективных переносчиков являются собственные клетки организма, и, в первую очередь, эритроциты. Они легко могут быть выделены из крови, где присутствуют в больших количествах, обладают достаточно длительным временем жизни и, по мере старения, подвергаются в организме естественному процессу биодеградации. Таким образом, эритроциты являются перспективными носителями лекарственных препаратов, которые, в зависимости от поставленных задач, могут обеспечить пролонгированное действия лекарства, снижение его токсичности или иммунного ответа организма на введенный препарат. Все это делает задачу разработки новых лекарственных форм на основе эритроцитов-носителей очень перспективной и актуальной.

Цель работы

Цель работы - создание на основе эритроцитов-носителей новых лекарственных форм противоопухолевого антрациклинового антибиотика митоксантрона (Мтн), а также антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови.

Задачи исследования

1. Разработка оптимальных методов введения данных препаратов в эритроциты.

2. Изучение эффективности загрузки и скорости освобождения Мтн из эритроцитов-носителей (фармакоцитов).

3. Изучение повреждающего воздействия загрузки Мтн на эритроциты-носители.

4. Сравнительное исследование фармакокинетики препарата фактора IX, введенного в организм стандартным способом (в виде внутривенной инъекции раствора свободного фактора) и внутри эритроцитов-носителей.

Научная новизна

В результате работы впервые были созданы новые лекарственные формы двух, совершенно различных по химической природе препаратов - противоопухолевого антибиотика митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови. Оба препарата были успешно включены в эритроциты.

Разработаны методы, позволяющие в каждом из данных случаев получать фармакоциты, обладающие достаточно продолжительным временем жизни, которые освобождают лекарственный препарат в кровоток постепенно, обеспечивая, таким образом, его пролонгированное действие.

Исследование сравнительной фармакокинетики традиционной и новой лекарственных форм препарата фактора IX показало, что время циркуляции этого фактора в кровяном русле увеличивается при включении препарата в эритроциты в 5-10 раз.

В случае антибиотика митоксантрона в фармакоциты может быть включена доза лекарства, превышающая одноразовую дозу, которую вводят обычно при стандартном способе введения препарата. При этом фармакоциты обладают достаточным временем жизни, а препарат освобождается их клеток-носителей постепенно, удается не только получить пролонгированную форму лекарства, но и снизить его кардиотоксичность, которая возникает обычно за счет высокой пиковой концентрации препарата в момент введения [52].

Практическая ценность работы

Разработанные новые лекарственные формы синтетического антибиотика митоксантрона и антигемофильного фактора IX системы свертывания крови на основе эритроцитов-носителей позволяют сильно пролонгировать действие этих лекарственных препаратов по сравнению с введением аналогичной дозы стандартного лекарственного препарата. В случае митоксантрона возможно также повысить дозу вводимого вещества с одновременным снижением его кардиотоксичности. Это позволяет использовать данный препарат у пациентов с выраженными сердечными или почечными нарушениями, что невозможно для стандартной лекарственной формы препарата. Уменьшение количества и частоты инъекций, необходимых для поддержания терапевтического уровня концентраций лекарственного препарата в крови, снижает общий расход лекарства, необходимого для проведения курса терапии, и улучшает качество жизни пациентов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны методы включения в эритроциты синтетического аналога антибиотиков антрациклинового ряда - митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX.

2. Загруженный в эритроциты митоксантрон способен постепенно освобождаться из эритроцитов-носителей, что позволяет создать на их основе пролонгированную форму лекарства.

3. Включение терапевтической дозы митоксантрона в эритроциты практически не повреждает клетки-носители. При концентрациях препарата в клетках в 10 раз превышающих ту, что возникает при загрузке единичной терапевтической дозы, повреждающее воздействие антибиотика на клетки все еще остается достаточно слабым.

4. На основе изучения фармакокинетики свободной и загруженной в эритроциты формы биотинилированного фактора ГХ показано, что при включении препарата в эритроциты-носители срок его жизни в кровотоке увеличивается в 5-10 раз.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Вуймо, Татьяна Алексеевна

выводы

1. Разработана новая лекарственная форма противоопухолевого антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей. Определены оптимальные условия включения митоксантрона в эритроциты путем прямой инкубации клеток в среде с препаратом. Эффективность суммарной загрузки антибиотика в клетки максимальна при инкубации эритроцитарной суспензии с гематокритом 70% в среде с митоксантроном (в концентрации от 0.06 до 3.5 мг/мл суспензии) в течение 1 часа при 37°С.

2. Включение митоксантрона в эритроциты при внутриклеточных концентрациях препарата до 0.6 мг/мл клеток (что соответствует загрузке дозы препарата в 10 раз превышающей условную терапевтическую концентрацию) не повреждает клетки-носители существенным образом. Скорость гемолиза не превышает допустимую при переливании эритроцитов. Распределение загруженных клеток по плотностям сдвигается в сторону 10-15% увеличения объема клеток.

3. Установлено, что загруженный в эритроциты митоксантрон постепенно выходит из эритроцитов-носителей (равновесие между клетками и средой достигается примерно за 1 час, при этом концентрация митоксантрона в среде составляет 17.4-18% от суммарной концентрации препарата в суспензии). Это обеспечивает возможность пролонгированного действия лекарства и снижает максимальную концентрацию антибиотика в плазме в момент введения, что понижает его кардио- и нефротоксичность.

4. Впервые разработана новая лекарственная форма антигемофильного препарата фактора IX на основе эритроцитов-носителей, одним из преимуществ которой является снижение иммунного ответа организма на введенный белок. Включение фактора в клетки осуществлено методом мягкого ступенчатого диализа.

5. Проведено изучение фармакокинетики свободной и загруженной в эритроциты форм биотинилированного фактора IX. Среднее время полувыведения из кровотока для инкапсулированного белка более чем в 8 раз превышаете время полувыведения его свободной формы (74 и 9 часов, соответственно).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработаны две новые лекарственные формы на основе эритроцитов-носителей. Низкомолекулярный синтетический аналог антрациклиновых антибиотиков — митоксантрон, был включен в эритроциты методом прямой инкубации суспензии клеток в среде, содержащей препарат. Для включения белкового препарата антигемофильного фактора IX использовали метод ступенчатого диализа. В обоих случаях препараты были успешно включены в эритроциты. Созданные лекарственные формы обладают рядом преимуществ перед используемыми в клинике стандартными способами введения данных лекарств.

В случае противоопухолевого антибиотика Мтн появляется возможность создания пролонгированной формы и существенного повышения дозы введенного препарата без увеличения его токсичности. Это очень важно для клинического применения данного лекарства, т.к., несмотря на его высокую противоопухолевую активность, применять его в достаточно высоких дозах невозможно из-за сильной кардио- и нефротоксичности.

Инкапсуляция антигемофильного фактора IX в эритроциты также, позволяет создать пролонгированную форму лекарства. Время жизни этого препарата в крови при введении его в эритроцитах-носителях увеличивается примерно в 5-10 раз. При этом большую часть времени препарат находится внутри собственных клеток хозяина, т.е. не вызывает сильного иммунного ответа организма на введение постороннего белка. Можно надеяться, что данная форма лекарства не будет сильно провоцировать, появление ингибиторов к вводимому фактору.

Для успешного клинического использования разработанных форм препаратов необходимы дополнительные исследования. Однако уже полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что новые лекарственные формы разных по природе фармакологических препаратов на основе эритроцитов-носителей, безусловно, являются очень перспективными с точки зрения возможности повышения вводимых доз препаратов, создания их депонированных форм, защиты препаратов от разрушения и вывода иммунной системой организма, увеличения сроков жизни препарата. Все это позволит улучшить терапевтический эффект вводимого препарата, уменьшить количество необходимых для введения инъекции и, таким образом, улучшить качество жизни пациентов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вуймо, Татьяна Алексеевна, 2008 год

1. Атауллаханов ФИ, Баташева ТВ, Витвицкий ВМ. Влияние температуры, концентрации даунорубицина и гематокрита суспензии на связывание даунорубицина эритроцитами человека. Антибиотики и химиотерапия, Москва, 1994, №39: 9-10.

2. Гаузе ГФ, Дудник ЮВ. Противоопухолевые антибиотики, М., "Медицина", 1987, стр.53-78.

3. Дранов AJI, Дудниченко АС, Мезин ИА, Мензелеев РФ, Краснопольский ЮМ, Швец ВИ. Эффективность липосомальных форм цитостатиков Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Москва,1996, № 1: 85-89.

4. Жибурт ЕБ. Трансфузиология. Санкт-Петербург, 2002, с.348-357.

5. Каледин ВИ, Ильницкая СИ. Эффективность свободных и липосомальных форм платины и антрациклиновых антибиотиков в отношении метастазов в печени опухолей GA-1 и Р-388 у мышей. Вопросы онкологии, 1996, 42(3): 64-6.

6. Каплун АП, Ле Банг Шон, Краснопольский ЮМ, Швец ВИ. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопросы медицинской химии, Москва, 1999, № 4(1): 3-12.

7. Краснопольский ЮМ, Дранов АЛ, Степанов АЕ, Швец ВИ. Липосомальные формы цитостатиков в онкологии. Вестник Российской Академии медицинских наук, Москва, 1998, № 5: 35-40.

8. Куликова ЕВ, Витвицкий ВМ, Кохно АВ, Исаев ВГ, Паровичникова ЕН, Савченко ВГ, Атауллаханов ФИ: Введение эритроцитов, нагруженных доксорубиципом, больным с лимфопролиферативными заболеваниями. Гематология и трансфузиология, 1998, 43 (4): 26-29

9. Основы физиологии человека. Под. ред. Ткаченко БИ. Санкт-Петербург: Международный фонд истории науки, 1994. Т. 1.

10. Сарбаш В.И, Тихонова АГ, Вуймо ТА. и др.; Эритроциты носители лекарственных препаратов; Ж. Рос.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева, 2007, T.L1, №1:143-149.

11. Семенов ФМ, Андреев ЮН, Плющ ОП, Иванова BJI, Вдовин ВВ. Информационное письмо Правительства Москвы Департамента Здравоохранения №31-211 инф. От 23.09.2004 г.

12. Синауридзе ЕИ. Способ получения эритроцитов, заполненных лекарственным веществом. Авторское свидетельство СССР, № 1469609, 1 декабря 1988 г.

13. Справочник Видаль 2000. Лекарственные прапараты в России. Изд. АстраФармСервис, издание 5, Москва, 1999, стр.155

14. Шальков ЮЛ, Дудниченко АС, Краснопольский ЮМ. Опыт и перспективы использования липосомальной формы противоопухолевых препаратов в клинической онкологии. Клиническая хирургия, Москва, 1995, № 5: 21—23.

15. Швец ВИ, Краснопольский ЮМ. Липиды в лекарственных препаратах Вестник АМН СССР, Москва, 1990, № 6: 19-28.

16. Alpar НО, Lewis DA. Therapeutic efficacy of asparaginase encapsulated in intact erythrocytes. Biochem Pharmacol, 1985, Jan 15, 34(2):257-61.

17. Ataullakhanov F.I., Kulikova E.V., Vitvitsky B.M. Doxorubicin Binding by Human Erythrocytes. Advances in the Biosciences, 1994, №92:163-168.

18. Bandak S, Goren D, Horowitz A, Tzemach D, Gabizon A. Pharmacological studies of cisplatin encapsulated in long-circulating liposomes in mouse tumor models. Anticancer Drugs, 1999, Nov;10(10):911-20

19. Beutler E, Dale GL, Guinto DE, Kuhl W. Enzyme replacement therapy in Gaucher's disease: preliminary clinical trial of a new enzyme preparation. Proc Natl Acad Sci USA.- 1977.- Oct;74( 10):4620-3.

20. Cannon EP, Leung P, Hawkins A, Petrikovics I, DeLoach J, Way J.L. Antagonism of cyanide intoxication with murine carrier erythrocytes containing bovine rhodanese and sodium thiosulfate. J Toxicol Environ Health, 1994, Mar;41(3):267-74.

21. Chiarantini L, Droleskey R, Magnani M, DeLoach J.R. In vitro targeting of erythrocytes to cytotoxic T-cells by coupling of Thy-1.2 monoclonal antibody. Biotechnol Appl Biochem, 1992, Apr;15(2):171-84.

22. Collette N., Auwera P., Mevinier F., Lambert C., Sculier I., Coune A. Tissue distribution and bioactivity of amphotericin В administered in liposomes to cancer patients. J of Antimicrobial Chemotherapy 1991; 27: 535-548.

23. Cornu G., Michaux J.L., Sokal G., Trouet A. Daunorubicin-DNA: further clinical trials in acute non-lymphoblastic leukemia. Eur J Cancer, 1974, Nov;10(l l):695-700.

24. Cortes J, O'Brien S, Estey E, Giles F, Keating M, Kantarjian H. Phase I study of liposomal daunorubicin in patients with acute leukemia. Invest New Drugs, 1999, 17(l):81-7

25. Danon, D., Marikovsky, Y. 1964. Determination of density distribution of red cell population. J. Lab. Clin. Med. 64:668-674.

26. Dass C. R., Walker T. L., Burton M. A., Decruz E. E. Enhanced anticancer therapy mediated by specialized liposomes. J Pharm. Pharmacol, 1997; 49(10): 972-975.

27. DeLoach J, Ihler G.A. Dialysis procedure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochim Biophys Acta, 1977, Jan 24;496(1): 136-45.

28. Deloach JR, Corrier DE, Wagner GG Effect of carrier erythrocytes containing inositol hexaphosphate on Babesia microti infection. Res. Yet. Sci., 1988 Sep;45(2):262-3

29. DeLoach JR, Tangner CH, Barton C. Hepatic pharmacokinetics of glutaraldehyde-treated methotrexate-loaded carrier erythrocytes in dogs. Res. Exp. Med. (Berl), 1983,183(3): 167-75.

30. Determine reactivity of NHS ester biotinilation and cross-linking reagents. Technical resource of Pierce Biotechnology Inc., 10/2002, USA.

31. Diaz A., Alfonso M., Alonso R. et al. Immune responses in breast cancer patients immunized with an anti-idiotype antibody mimicking NeuGc-containing gangliosides. Clin Immunol., 2003; 107 (2): 80-9

32. Fazi A, Mancini U, Mangani F, Accorsi A, Piatti E, Rossi L, Magnani M. In vitro and in vivo methanol degradation by alcohol oxidase-loaded erythrocytes. Advances In The Bioscience, 1994.-92:93-101.37.