Эндофитные бактерии растений гороха как активный компонент бобово-ризобиальной симбиотической системы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Гарифуллина, Динара Вакилевна

• Гарифуллина, Динара Вакилевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гарифуллина, Динара Вакилевна

Введение.

Обзор литературы.

1. Глава 1. Экологическая роль симбиоза эндофитных бактерий с растением.

1.1 Эндофитные бактерии и их экологические ниши.

1.2 Методы выявления эндофитных бактерий.

1.3 Биоразнообразие и численность эндофитых бактерий в тканях ^ сельскохозяйственных растений.

1.4 Пути проникновения эндофитных бактерий в растение и их вклад ^ в формирование мутуалистических взаимоотношений.

1.5 Бактериальные эндофиты бобовых культур как перспективная ^ основа экологически безопасных препаратов для растениеводства

Собственные исследования.

2 Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Микробиологические среды.

2.3 Скрининг эндофитных бактерий с комплексной биологической ^ активностью.

2.4 Выделение эндофитных бактерий из растений, выросших в ^ тепличных условиях.

2.5 Выделение чистых культур бактерий рода ЯЫгоЫит.

2.6 Идентификация штаммов по биохимическим свойствам.

2.7 Оценка антагонистической активности.

2.8 Оценка ростстимулирующего эффекта у бактериальных изолятов

2.9 Определение видовой принадлежности бактерий методом секвенирования гена 16S рРНК.

2.10 Трансформация штамма Serratia sp.

2.11 Изучение динамики колонизации тканей и поверхности корня растения гороха трансформированным штаммом Serratia sp. с 39 помощью конфокального и флуоресцентного микроскопа.

2.12 Методика полевых экспериментов.

2.13 Агрометеорологические условия вегетации гороха.

2.14 Статистическая обработка результатов.

3 Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Комплексная биологическая активность бактерий Rh. leguminosarum bv. viceae из клубеньков гороха.

3.2 Характеристика бактериальных эндофитов корней гороха и их ^ влияние на бобово-ризобиальную симбиотическую систему.

3.2.1 Характеристика свойств эндофитных бактерий in vitro.

3.2.2 Влияние предпосевной инокуляции семян изолятами эндофитных бактерий на симбиотический аппарат и продуктивность растений 54 гороха.

3.3 Эндофитные бактерии в клубеньках гороха и их свойства.

3.3.1 Характеристика неризобиальных бактерий, выделенных из клубеньков.

3.3.2 Идентификация бактерий методом секвенирования гена 16S рРНК

3.3.3 Доказательство эндофитной природы штамма Entl6 с помощью ^ трансформации вектором, несущим ген gfp.

3.3.4 Взаимоотношения изолятов ассоциации клубенька и эндофитов

Влияние инокуляции эндофитными штаммами бактериальной ассоциации клубенька корней гороха на рост, развитие и 83 продуктивность растений.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эндофитные бактерии растений гороха как активный компонент бобово-ризобиальной симбиотической системы»

Актуальность темы.

Напряженность проблем продовольственной и экологической безопасности, энерго- и ресурсосбережения вызывает необходимость широкого внедрения в сельскохозяйственное производство методов, дружественных окружающей среде. Одним из важных условий создания экологически сбалансированных систем растениеводства является восстановление утраченных в результате искусственного отбора и длительного окультуривания почв симбиотических связей между главными компонентами агроэкосистемы - растениями и микроорганизмами. Раскрытие механизмов функционирования этих взаимоотношений позволило бы сформировать цельную стратегию экологически устойчивого растениеводства, основанную на замене агрохимикатов (азотных удобрений, пестицидов) микробными препаратами комплексного действия, способными снизить значительные вложения энергии в агроэкосистему за счет большей пластичности растений к неблагоприятным факторам окружающей среды [Жученко, 2008].

Растительный организм представляет собой своеобразную субсистему, организующую целостное сообщество микроорганизмов, выполняющих множество значимых для хозяина функций. Поддерживая на поверхности своих органов, в тканях и клетках микробный консорциум, отдавая ему часть своих ресурсов, растения дополняют свое свойство автотрофно связывать углерод способностью симбиотрофно фиксировать молекулярный азот. Благодаря микроорганизмам растения иммобилизуют труднодоступные источники минерального питания, защищаются от болезней, фитофагов и абиотических стрессов. Стратегия симбиотических (кооперативных) адаптаций является не менее, а может быть даже более распространенной в живой природе, чем стратегия индивидуальных (автобиотических) адаптаций [Тихонович, Проворов, 2009].

В настоящее время детально на молекулярном и биохимическом уровне исследованы взаимоотношения между партнерами бобово-ризобиального симбиоза, эндо- и экзомикоризы, а также экологическая роль ассоциативных бактерий, обитающих в ризосфере и ризоплане растения. Менее изученным является симбиоз неклубенькообразующих эндофитных бактерий. Если наличие мутуалистической эндомикрофлоры кишечника животных является для всех привычным явлением, то существование таких эндофитных бактерий долгое время рассматривалось только с позиций явного или латентного паразитизма. Позже было дано определение эндофитов как бактерий, которые населяют внутренние ткани растений без нанесения вреда хозяину [Hallmann J. et al., 1997]. Лишь в последнее десятилетие активное изучение этого симбиоза выявило огромное разнообразие бактерий, многие из которых можно отнести к мутулистическим. К 2006 г. список известных бактерий-эндофитов включал 219 видов, относящихся к 71 роду [Hallmann J., Berg G., 2006]. Выяснилось, что многие эндофитные бактерии обеспечивают защиту растения от болезней [Cho C.J. et al., 2003; Недорезков B.B., 2003; Ziedan E.H.E., 2006; Berg G. et al., 2008; Chen X.-H. et al., 2009], способны к азотфиксации [Reinhold-Hurek В. and Hurek T. 1998; Gyaneshwar P. et al., 2001; Kuklinski-Sorbal J. et al., 2004], продукции фитогормон-подобных соединений [Long H.H. et al., 2008; Широких A.A. и др., 2008; Jha P., Kumar A., 2009; Palaniappan P. at al., 2010], стимулированию клубенькообразования на корнях растений [Bai Y. et al., 2003; Lee K.D. et al., 2005].

Все перечисленные свойства эндофитных бактерий рассматриваются в контексте перспективы разработки на их основе биопрепаратов для повышения продуктивности и устойчивости растений. Уже широко применяются микробные средства биофунгицидного действия: например,

Интеграл, Фитоспорин на основе Bacillus subtilis [Широких A.A., 2008],

RhizoStarR на основе Serratia plymuthica [Berg G., 2008]. Вместе с тем вопросы о совместимости эндофитных бактерий с ризобиями мало изучены, 6 хотя объединение свойств азотфиксирующей, рострегулирующей и биоконтрольной функций микробного сообщества эндофитных бактерий является ценным с хозяйственной точки зрения. Кроме того, понимание механизмов этих взаимоотношений и их экологической роли является важным для развития наших знаний о микробно-растительных симбиозах. Цель исследования:

- в бобово-ризобиальной симбиотической системе оценить роль эндофитных бактерий из корней гороха {Pisum sativum L.) как потенциальной основы микробиологических препаратов для растениеводства. Задачи исследования.

1 Выделить бактериальные эндофиты из внутренних тканей корней гороха и оценить их фунгистатическую активность по отношению к основным грибным фитопатогенам, вызывающим корневые гнили, а также способность регулировать рост растений.

2 Определить характер взаимоотношений эндофитов с бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae in vitro.

3 Получить штамм эндофитной бактерии с репортерным геном gfp и изучить возможные пути проникновения эндофитов в ткани корня гороха.

4 Выявить штаммы эндофитов, перспективные в качестве основы препаратов для повышения продуктивности растений гороха и их устойчивости к корневым гнилям.

5 Оценить эффективность применения экспериментальных препаратов для повышения семенной продуктивности гороха и защиты растений от корневых гнилей.

Научная новизна.

Установлено, что бактериальные эндофиты корня гороха являются широко распространенными компонентами растительно-микробного сообщества, способными активно влиять на формирование бобоворизобиального симбиоза, устойчивость макросимбионта к корневым гнилям и его продуктивность. Показано, что такими свойствами обладают как отдельные бактериальные штаммы, так и их ассоциации, населяющие клубеньки, а также другие органы растений гороха. С помощью рекомбинантного штамма Serratia sp. с геном зеленого флуоресцирующего белка выявлены способность этой бактерии заселять внутренние ткани корня растения гороха и её локализация в них. Выделены и охарактеризованы новые эндофитные штаммы бактерий Rh. leguminosarum bv. viceae, а также родов Pseudomonas и Serratia с хозяйственно полезными свойствами. Практическая значимость работы.

Полученные результаты расширяют представления о составе симбиотических сообществ гороха с бактериальными эндофитами и процессах их формирования, что повышает эффективность поиска новых штаммов бактерий в качестве основы микробиологических препаратов для растениеводства. Выделены новые штаммы Rh. leguminosarum bv. viceae B2, Rhl6, Serratia sp. Entl6, эффективно повышающие урожайность растений гороха, а также их устойчивость к корневым гнилям. Выделен новый штамм Serratia sp. Entl6, который по совокупности свойств является перспективным в качестве основы биопрепарата для растениеводства. Получен его трансформированный мутант с геном зеленого флуоресцирующего белка, пригодный для изучения мутуалистических взаимоотношения этих бактерий с растениями гороха. Положения, выносимые на защиту:

1 Во внутренних тканях растений гороха распространены эндофитные штаммы бактерий с комплексной биологической активностью по отношению к бобово-ризобиальной симбиотической системе.

2 В клубеньках корней гороха встречаются многовидовые бактериальные ассоциации, способные мутуалистически сосуществовать с бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae.

3 Штамм Serratia sp. Entl6 является эндофитным и способен позитивно влиять на рост и развитие растения-хозяина, стимулировать формирование симбиотической системы гороха с ризобиями и повышать продуктивность растений.

4 Новые штаммы Rh. leguminosarum bv. viceae. Rh 16 и Serratia sp. Entl6 могут служить основой для производства микробиологических препаратов с целью повышения урожайности зерна гороха.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены и доложены на: Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов,

2007); IV молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа,

2008); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых 4 статьи - в журналах, указанных в перечне ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), собственных исследований (2-х глав), выводов, списка литературы (299 источников, из них 66 отечественных и 231 зарубежных). Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 22 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Гарифуллина, Динара Вакилевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение взаимоотношений между растениями и микроорганимами -одно из активно развивающихся направлений современной биологии. Эти вопросы объединяют предмет и методы исследований разных отраслей биологии - микробиологии, экологии, физиологии и биохимии растений, генетики, эволюционного учения и др. Есть мнение, что данная область знания может быть вычленена в самостоятельную биологическую науку — симбиологию [Seckbach D., 2002], в которой уже сформировалось отдельное направление - симбиогенетика [Тихонович И.А., Проворов H.A., 2009].

Эндофитные бактерии, активно изучаемые в настоящее время, привлекают внимание ученых не только перспективой их хозяйственного использования в практике экологически чистых биотехнологий растениеводства. Раскрывая роль эндофитных бактерий в эволюционном и экологическом континууме микробно-растительных отношений широкой и узкой специализации, а также разной степени факультативности и облигатности, познавая механизмы взаимодействия макро- и микросимбионтов, мы расширяем наши представления о вариантах коадаптации различных видов в сообществах, что имеет важное фундаментальное значение.

Хорошо изученными эндофитами являются клубенькообразующие азотфиксаторы бобовых растений, для гороха - это представители Rhizobium leguminosarum bv. viceae. Однако в последнее десятилетие в качестве мутуалистических не образующих клубеньки внутренних обитателей бобовых растений выявлено более 200 видов бактерий, описанных ранее как поверхностные ризосферные микроорганизмы [Hallmann J., Berg G., 2006]. Одновременно выяснилось, что ризобии являются эндофитами не только бобовых, но и других видов растений, выполняя функции ростстимулирующих ризобактерий без образования клубеньков [Guiterries

В свете новых представлений о бобово-ризобиальном симбиозе и потребностей активизации полезных симбиотических связей в селькохозяйственных экосистемах нами была поставлена цель - изучить экологическую роль эндофитных бактерий в симбиозе с растениями гороха. И первым этапом исследований была оценка у Rhizobium leguminosarum bv. viceae общих с ростстимулирующими ризосферными бактериями свойств -способности активировать рост корней и подавлять развитие грибных патогенов in vitro. Выяснилось, что из 8-и выделенных из местных почв штаммов ризобий 6 штаммов проявили антагонизм к разным фитопатогенным грибам, 3 штамма - ростимулирующий эффект и один штамм сочетал эти свойства. Обнаруженные свойства ризобий согласуются с другими исследованиями [Vargas Р.A. et al., 2009]. Однако, в системе ш planta в полевых условиях это свойство, по-видимому, не имело селективного преимущества и соответственно, не коррелировало с продуктивностью растений. Это еще раз свидетельствует о том, что основной вклад в продуктивность бобовых растений при инокуляции ризобиями обеспечивается за счет их способности к биологической азотфиксации. Следовательно, дополнительные микробные эффекты, влияющие на устойчивость и рострегуляцию растений, могут быть достигнуты путем создания разновидовых бактериальных комбинаций в консорции с растением-хозяином.

При инокуляции клубеньковыми бактериями местной селекции был найден перспективный штамм RhB2, который в различных экологических условиях способствовал увеличению клубенькообразования, снижению заболеваний корневыми гнилями и повышению семенной продуктивности растений гороха (на 25 % в оптимальных по влагообеспеченности условиях и на 12 % при сильном водном стрессе) по сравнению неинокулированным

90 контролем и эталонным штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 1078. Однако в поисках бактерий для мультифункционального биопрепарата наше внимание было обращено к выяснению экологической роли сообщества неризобиальных эндофитов корня гороха.

Среди псевдомонадной группы бактерий, обитающих в зоне корня, обнаружено множество потенциальных антагонистов фитопатогенов с выраженной способностью усиливать рост корней, что косвенно указывает на продукцию этими бактериями фитогормон-подобных веществ. В корневой шейке отмечено наибольшее видовое разнообразие бактерий, оцененное по количеству мофотипов клеток и колоний. Это вызывает предположение о преимущественном обитании эндофитов группы псевдомонад в сосудах растения и ограничении хозяином распространения бактерий по другим тканям. При изучении путей проникновения эндофитного штамма Entl6 это предположение было подтверждено визиуализацией в сосудах меченых зеленым флуоресцирующим белком GFP бактерий под конфокальным микроскопом.

Лучшие по ростстимулирующим свойствам и фунгицидной активности штаммы псевдомонадной группы испытывали в полевых условиях. В экологических условиях крайнего дефицита влаги четыре коллекционных штамма стимулировали клубенькообразование аборигенными ризобиями, практически все обработки привели к снижению распространения корневых гнилей, но только один штамм 6Ш способствовал увеличению семенной продуктивности. Возможно, по причине неблагоприятного абиотического фактора вклад коллекционных эндофитных бактерий группы псевдомонад оказался недооцененным. Но причиной не выраженного мутуалистического эффекта мог служить и биотический фактор - отсутствие в бактериальном инокулюме ризобиального компонента, как это было показано в других исследованих [Sturz A.V. et al., 1997], играющего, по-видимому важную сигнальную и регулирующую роль для реализации мутуалистического влияния эндофитных бактерий. В этой связи нам представлялся перспективным поиск природных бактериальных сообществ ризобий с их естественными спутниками, попавшими в клубенек в природных условиях агроценоза.

Из растений гороха, выросших в поле, было протестировано 120 изолятов клубеньков и выявлено, что каждый третий изолят проявлял невысокую фунгистатическую и ростстимулирующю активность, каждый пятый - стимулировал рост тест-растений рапса. Но изоляты клубеньков представляли собой многовидовые сообщества бактерий, которые при пересевах и хранении на средах меняли свой состав. В отсутствие растения-хозяина в результате конкурентного исключения из сообществ были элиминированы ризобии и преобладали преимущественно спорообразующие бактерии с высокой антагонистической активностью. Одна из ассоциаций 416, сохранившая исходный состав и свойства, была изучена более детально.

Методами физиолого-биохимических и генетических исследований был определен видовой состав ассоциации: Rhizobium leguminosarum bv. viciae, Pseudomonas sp., Serratia sp., Bacillus sp. Пространственная экологическая ниша эндофитного штамма Serratia sp. Entl6 была изучена с помощью RAPD-анализа реинокулянтов клубеньков растений, обработанных исходным штаммом, а также с помощью визуализации на конфокальном микроскопе трансгеномного деривата штамма Entl6, снабженного репортерным геном GFP. Внедряясь через примордия боковых корней, штамм Entl6-gfp, оказывался в сосудах растения гороха. Предполагается, что в клубенек этот штамм проникал по апопласту, а излишки численности этих бактерий, возможно, удалялись растением-хозяином через сосуды.

В результате изучения взаимных антагонистических отношений было выяснено, что штамм Serratia sp. Entl6 в слабой степени подавлял рост Rhizobium leguminosarum bv. viciae Rh 16, что не мешало сохраниться обоим штаммам в ассоциации при хранении и проявлять мутуалистические свойства в системе in planta при инокуляции. После оценки безопасности штамма Entl6 и подбора оптимальной ростстимулирующей численности бактерий для внесения на семена, комбинированный биопрепарат из штаммов Rhl6+Entl6 испытывали в полевых условиях. Три вегетационных сезона в различных почвенно-экологических условиях указанный препарат способствовал повышению урожая семян на 15-23 % по сравнению с необработанным контролем. Положительный эффект на продуктивность растений сопровождался увеличением количества клубеньков и снижением заболеваемости корневыми гнилями. Эффективность биопрепарата была подтверждена в производственных испытаниях 2009 г. в Илишевском районе Республики Башкортостан.

Таким образом, наши исследования показали перспективность использования эндофитных бактерий в качестве основы биопрепарата для повышения продуктивности и устойчивости гороха.