Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат технических наук Рутковская, Татьяна Ростиславовна

• Рутковская, Татьяна Ростиславовна
• кандидат технических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат технических наук Рутковская, Татьяна Ростиславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробные инулиназы: получение, физико-химические свойства, строение и практическое применение

1.1.1. Характеристика инулина и продуктов его гидролиза

1.1.2. Микроорганизмы - продуценты инулиназ

1.1.3. Микробный синтез инулиназ

1.1.4. Получение инулиназ и исследование их физико-химических свойств ^

1.1.5. Практическое применение инулиназ

1.2. Олигофруктозиды - распространение в природе, строение, свойства, биологическая роль и применение

1.3. Пребиотики: характеристика, способы получения и роль в поддержании нормальной микрофлоры ^

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследований

2.2. Культивирование дрожжей сеге\ч$1ае ВГШ

2.3. Выделение и очистка эндо-инулиназы

2.4. Определение молекулярной массы белка методом электрофореза

2.5. Определение активности (3-фруктофуранозидазы

2.6. Определения инулиназной активности

2.7. Общие биохимические и микробиологические методы исследования

2.8. Аминокислотный анализ

2.9. Оценка пребиотических свойств фруктоолигосахаридов

2.10. Исследование продуктов гидролиза инулина методами хроматографии и ЯМР-спектроскопии

2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. БИОСИНТЕЗ ЭНДО-ИНУЛИНАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ФЕРМЕНТА

3.1. Характеристика культуры дрожжей сегеушя*? ВГШ

3.2. Изучение локализации гликозидаз, синтезируемых

3.3. Исследование влияния различных источников углерода и азота на биосинтез эндо-инулиназы ^

3.3.1. Влияние источников углерода

3.3.2. Роль источников азота

3.4. Влияние некоторых факторов на биосинтез инулиназы

3.4.1. Оптимизация условий биосинтеза эндо-инулиназы дрожжами ¿■.сегеуг^ше ВГШ-2 ^

3.5. Получение очищенного ферментного препарата эндо-инулиназы и исследование его физико-химических свойств

3.5.1. Очистка эндо-инулиназы Я. cerevisiae ВГШ

3.5.2. Определение аминокислотного состава очищенной инулиназы З.сегелпз1ае ВГШ-2 дд

3.5.3. Исследование некоторых физико-химических свойств инулиназы

3.5.4. Кислотная и термическая инактивация эндо-инулиназы

3.5.5. Специфичность действия эндо-инулиназы

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ФРУКТООЛИГОСАХАРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ ИНУЛИНА ЭНДО

ИНУЛИНАЗОИ

4.1. Исследование характера действия инулиназы на инулин

4.2. Выбор оптимальных условий ферментативного гидролиза инулина эндо-инулиназой

4.2.1. Влияние дозировки ферментного препарата

4.2.2. Влияние концентрации субстрата на ферментативный гидролиз инулина

4.2.3. Влияние температуры на ферментативный гидролиз инулина

4.2.4. Влияние рН на ферментативный гидролиз инулина

4.3. Исследование пребиотических свойств фруктоолигосахаридов 116 4.3.1. Исследование бифидогенной активности углеводов in vitro

4.3.2. Определение влияния фруктоолигосахаридов на выживаемость клеток пробиотиков на фоне антибиотика

4.3.3. Изучение типа взаимодействий Bifidobacterium bifidum с Escherichia coli

4.3.4. Исследование регуляции нормобиоза кишечника в присутствии фруктоолигосахаридов ^

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков»

Актуальность работы. В последние годы биокаталитические технологии становятся все более востребованными, так как количество I ферментов, эффективно используемых в различных областях промышленности, растет очень быстро. Гликозидгидролазы (гликозидазы), катализирующие расщепление гликозидных связей в олиго- и полисахаридах, - одна из самых широко изучаемых групп ферментов. Представителями I гликозидаз являются инулиназы - ферменты, гидролизующие фруктозосодержащие олигосахариды и полимеры (фруктаны) до фруктозы и фруктоолигосахаридов различной степени полимеризации. Инулиназы привлекают к себе внимание вследствие их востребованности в пищевой промышленности, фармакологии, сельском хозяйстве и других областях. I

Интерес к эндо-инулиназам вызван тем, что образующиеся в результате их каталитического действия фруктоолигосахариды обладают пребиотическими свойствами. Доказано, что инулин и олигофрутозиды избирательно стимулируют рост и метаболическую активность бифидо- и I лактобактерий, не влияя на рост других культур и подавляя развитие I потенциально патогенных бактерий. Производимые в настоящее время короткие олиго фруктозиды получают из сахарозы с помощью фрукозилтрансферазы, синтезируемой из Aspergillus niger. Этот метод оказался крайне дорогим и многостадийным, в результате чего цена конечного продукта очень высокая (Granger, 2000).

Альтернативным подходом к получению фруктоолигосахаридов является ферментативный гидролиз природных полифруктанов посредством комплексного действия эндо- и экзо-инулиназ, тем более, что инулинсодержащее сырье является легко доступным и недорогим.

Инулиназы, синтезируемые многими микроорганизмами, включая грибы, дрожжи и бактерии, довольно подробно изучены (Onodera et al., 1992; Pessoni et al., 1999; Gupta et al., 1994; Ettalibi et al., 1990, Arand et al., 2004, Pandey et al, 2001, Синицин А.П., 2006, Абелян B.A., 1996). На основе гомологии аминокислотных последовательностей и сходного механизма действия инулиназы отнесены к 32-ому семейству гликозидгидролаз (Coutinho and Henrissat, 1999). Это семейство также включает инвертазы, леваназы и два типа 1-фруктозилтрансфераз. Несмотря на многочисленные исследования инулиназ, вопрос о специфичности эндо-инулиназ до сих пор актуален, данные по исследованию пребиотической способности образующихся в результате их каталитического действия олигофруктозидов немногочисленны. В связи с этим получение высокоактивных ферментных препаратов для гидролиза инулинсодержащего сырья до фруктоолигосахаридов, являющихся пребиотиками и способствующих поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, является актуальной задачей биотехнологии. Расширение спектра пребиотических препаратов имеет значение не только для медицинской практики, но и для пищевой промышленности.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение высокоактивного ферментного препарата эндо-инулиназы, исследование его некоторых физико-химических свойств и субстратной специфичности, а также получение фруктоолигосахаридов и определение их пребиотической способности.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

- изучение некоторых культуральных, морфологических признаков и биосинтетической способности дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2;

- оптимизация условий биосинтеза эндо-инулиназы дрожжами S. cerevisiae ВГШ-2;

- разработка эффективного способа выделения и очистки ферментного препарата;

- определение физико-химических свойств, субстратной специфичности и кинетических закономерностей процесса кислотной и термической инактивации эндо-инулиназы;

- получение фруктоолигосахаридов путем ферментативного гидролиза инулинсодержащего сырья;

- исследование пребиотических свойств олигофруктозидов в опытах in vitro и in vivo;

- обоснование целесообразности использования эндо-инулиназы для получения пребиотиков.

Научная новизна. Впервые получен ферментный препарат эндо-инулиназы из дрожжей S. cerevisiae ВГШ-2, эффективно гидролизующий инулин до олигофруктозидов.

Проведены комплексные исследования физико-химических свойств фермента, его субстратной специфичности. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Установлено, что эндо-инулиназа гидролизует как (3-2,1-, так и (3-2,6-фруктозидные связи в субстратах.

Установлены способность фруктоолигосахаридов увеличивать резистентность бифидобактерий в присутствии антибиотика и проявление мутуализма к нормальной микрофлоре ЖКТ, в частности у Е. coli, что указывает на положительное воздействие этого углевода на нормобиоз кишечника.

Практическая значимость. Результаты настоящего исследования дают возможность получать олигофруктозиды пребиотического действия, способствующие поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Это позволит расширить спектр пребиотических препаратов, имеющих значение как в медицинской практике, так и в пищевой промышленности.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА за 2005-2008 г, на 3 и 4-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство» (Воронеж, 2008), III международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009), международном симпозиуме «Ökologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Рутковская, Татьяна Ростиславовна

выводы

1. Дрожжи S.cerevisiae ВГШ-2 синтезируют внутриклеточную эндо-инулиназу. Оптимальными параметрами культивирования дрожжей, обеспечивающими максимальный синтез фермента, являются: состав питательной среды, %: дрожжевой экстракт - 2; NH4H2PO4 - 0,8, фруктоза -3; начальное значение pH среды 5,0; температура 30°С, продолжительность культивирования 30 ч.

2. Оптимальными параметрами каталитической активности инулиназы следует считать: pH 4,5-4,7; температуру 45-47°С.

3. Анализ кинетических параметров Кт и Vmax показал, что эндо-инулиназа проявляла химическое сродство как к ß-2,1-, так и к Р-2,6-фруктозидной связи в представленных субстратах, однако наибольшее сродство фермента проявлялось к инулину.

4. Оптимизация условий ферментативного гидролиза инулина позволила установить, что рациональными параметрами процесса гидролиза являются: дозировка эндо-инулиназы 10 ед/г субстрата, температура 45 °С, продолжительность 3-3,5 часа. При таких условиях степень гидролиза инулина достигала 78-80 %;

5. Выявленная тенденция положительного влияния различной концентрации олигофруктозидов на рост бифидобактерий В. Bifidum in vitro свидетельствует о пребиотическом действии олигофруктозидов.

6. Результаты проведенных исследований по коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, с помощью фруктоолигосахаридов указывают на то, что фруктоолигосахариды способствуют восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры теплокровных животных, проявляя тем самым пребиотическую активность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Преобладание фруктоолигосахаридов в продуктах гидролиза инулина эндо-инулиназой S. cerevisiae ВГШ-2, определенное хроматографическими методами анализа и методом ЯМР спектроскопии, свидетельствуют о том, что исследуемая инулиназа является ферментом эндо-действия.

Максимальная степень гидролиза инулина (78-80 %) эндо-инулиназой S. cerevisiae обеспечивается при следующих условиях: концентрации субстрата 10 %, дозировке ферментного препарата 10 ед/г субстрата, температуре 45 °С, pH 6,0-7,0, продолжительности 3-3,5 часа.

Результаты проведенных исследований по коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, с помощью фруктоолигосахаридов свидетельствуют о том, что фруктоолигосахариды способствуют восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры мышей, проявляя тем самым пребиотическую активность.

Установлена бифидогенная и лактогенная активность фруктоолигосахаридов в опытах in vivo. Показано, что эффект применения фруктоолигосахаридов аналогичен лечебным препаратам «Лактобактерин» и

Бифидумбактерин». Сочетанное использование пробиотиков с ФОС не усиливало их лечебного эффекта.

В результате изучения влияния различных доз фруктоолигосахаридов в качестве монопрепарата на коррекцию экспериментального дисбиоза определена оптимальная концентрация фруктоолигосахаридов (2 мг/мышь), достаточная для коррекции дисбиоза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Рутковская, Татьяна Ростиславовна, 2011 год

1. Marcel В. Roberfroid Caloric Value of Inulin and Oligofructose //Journal Nutr. 1999. - №129. - P.1436-1437.

2. Pandey A. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications/ A. Pandey, C.R. Soccol, P. Selvakumar, V.T. Soccol, N. Krieger, J.D. Fontana //Appl. Biochem. Biotechnol.- 1999. №81. - P.35-52.

3. Kelly G. Inulin-type prebiotics~a review: part 1//Altem Med Rev. 2008 Dec. -13(4). - P. 315-29.

4. Akimoto Hidetoshi Molecular Cloning and Sequence Analysis of an Endoinulinase Gene from Penicillium sp.Strain TN-88 / Akimoto Hidetoshi,

5. Kiyota Naoyuki, Kushima Takayuki, Nakamura Toyohiko and Ohta Kazuyoshi. //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. - №64.- P. 2328-2335.

6. Rouwenhorst R.J. Localization of inulinase and invertase in Kluyveromyces species/ RJ Rouwenhorst, WS Ritmeester, WA Scheffers, JP Van Dijken II Appl Environ Microbiol. 1990 Nov. - 56(11). - P. 3329-36.

7. Workman W.E. The cell wall-associated inulinase of Kluyveromyces fragilis/ WE Workman,DF Day // Antonie Van Leeuwenhoek. 1984. -50(4).-P. 349-53.

8. Kim K.Y. Catalytic mechanism of inulinase from Arthrobacter sp. S37 / KY Kim , AS Nascimento, AM Golubev, I Polikarpov, CS Kim ,SI Kang , SI Kim //Biochem Biophys Res Commun.- 2008 Jul 11. 371(4). - P. 600-5.

9. Viswanathan P. Enhancement of inulinase production by Aspergillus niger / P Viswanathan , PR Kulkarni // J Appl Bacteriol.- 1995 Apr. 78(4). - P .384-6.

10. Mutanda T. Controlled production of fructose by an exoinulinase from Aspergillus ficuum/ T. Mutanda, B. Wilhelmi, C.G. Whiteley // Appl Biochem Biotechnol. 2009 Oct. - 159(1). - P. 5-77.

11. Jing W. Separation and dentification of exo- and endoinulinase from Aspergillus fucuum.Xueming XIW Jing, J Zhengyu, J Bo //Curr Microbiol. 2003 Aug. -47(2). -P. 109-12.

12. Gill P.K. Comparative"analysis of thermostability of extracellular inulinase activity from Aspergillus fumigatus with commercially available (Novozyme) inulinase/ PK Gill , RK Manhas , P Singh // Bioresour Technol.- 2006 Jan. 97(2). - P . 355-8.

13. Chi Z . Inulinase-expressing microorganisms and applications of inulinases/ Z Chi, T Zhang ,G Liu, L Yue //J Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Feb. -82(2).-P. 211-20.

14. Gupta A.K. Production, thermal stability and immobilisation of inulinase from Fusarium oxysporum/ AK Gupta, P. Rathore, N Kaur, R Singh // Chem Technol Biotechnol.- 1990. 47(3). - P. 245-57.

15. Brevnova E.E. Inulase-secreting strain of Saccharomyces cerevisiae produces fructose/ E.E. Brevnova, D.G. Kozlov, B.D. Efremov , S.V Benevolensky // Biotechnol Bioeng. 1998 Nov 20. - 60(4). - P. 492-7

16. Rouwenhorst R.J. Localization of inulinase and invertase in Kluyveromyces species/ RJ Rouwenhorst, WS Ritmeester, WA Scheffers, JP Van Dijken // Appl Environ Microbiol.- 1990 Nov. 56(11). - P. 3329-36.

17. Workman W.E. The cell wall-associated inulinase of Kluyveromyces fragilis/ WE Workman , DF Day // Antonie Van Leeuwenhoek.- 1984. -50(4).-P. 349-53.

18. Guiraud J.P. Inulinase of Debaryomyces cantarellii/ JP Guiraud ,C Bernit ,P Galzy // Folia Microbiol (Praha).- 1982. 27(1). - P. 19-24.

19. Bender J.P. Inulinase production by Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 using solid state fermentation/ JP Bender, MA Mazutti, D Oliveira, H Treichel, M Di Luccio //Appl Biochem Biotech. 2006. - 32. - P. 951-958

20. Cazetta M.L. Polymnia sanchifolia extract as a substrate to produce inulinase by Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus / ML Cazetta , PMM Martins, R Monti, Contiero J Yacon.//J. Food Eng. 2005. - №66. - P. 301-305.

21. Santisteban-Silva BOY Agitation, aeration and shear stress as key factors in inulinase production by Kluyveromyces marxianus/ BOY Santisteban-Silva, F. Maugeri //Enzyme Microb Tech. 2005. - №36. - P. 717-724.

22. Workman W.E. The cell wall-associated inulinase of Kluyveromyces fragilis/ W.E. Workman , D.F. Day// Van Leeuwenhoek.- 1984. 50(4).' - P. 349-53.

23. Guiraud J.P. Isolation of a respiratory-deficient Kluyveromyces fragilis mutant for the production of ethanol from Jerusalem artichoke/ J.P. Guiraud, J. Bourgi, M. Stervinou , M. Claisse , Galzy //Biotechnol Bioeng. 1987 May.-29(7).-P. 850-8.

24. Allais J.J. Isolation and characterization of thermophilic bacterial strainswith inulinase activity/ J.J. Allais, G. Hoyos-Lopez, S. Kammoun, J.C.

25. Baratti // Appl Environ Microbiol. 1987 May. - 53(5). - P. 942-5.t

26. Allais J.J. Isolation and characterization of bacterial strains with inulinase activity/ J.J. Allais, S. Kammoun, P. Blanc, C. Girard, J.C. Baratti // Appl

27. Environ Microbiol. 1986 Nov. - 52(5). - P. 1086-90.

28. Kawamura M. Formation of a cycloinulo-oligosaccharide from inulin by an extracellular enzyme of Bacillus circulans OKUMZ 31B/ M. Kawamura , T. Uchiyama, T. Kuramoto,Y. Tamura, K. Mizutani// Carbohydr Res. 1989 Oct23.-192.-P. 83-90.

29. Yun J.W. Continuous production of inulo-oligosaccharides from chicory juice by immobilized endoinulinase / J.W. Yun, J.P. Park, C.Y. Song, C.Y.1.e, J.H. Kim, and S.K. Song //Bioprocess Engineering. 2000. - №22. -P. 189-194.

30. Vullo D.L. Characteristics of an inulinase produced by Bacillus subtilis 430A, a strain isolated from the rhizosphere of Vernonia herbacea (Veil Rusby)/ D.L. Vullo , C.E. Coto, F. Siñeriz // Appl Environ Microbiol. -1991 Aug. 57(8). - P. 2392-4.

31. Haraguchi K. Purification and properties of a heat-stable inulin fructotransferase from Arthrobacter ureafaciens / K. Haraguchi, M. Yoshida , K. Ohtsubo //Biotechnol Lett. 2003. - №53. - P. 1049.

32. Gill P.K. Effect of media supplements and culture conditions on inulinase production by an actinomycete strain/ P.K. Gill, A.D. Sharma, R.K. Harchand , P. Singh // Bioresour Technol. 2003 May. - 87(3). - P. 359-62.

33. Kalil S.J. Optimization of inulinase production by Kluyveromyces marxianus using factorial design/ S.J. Kalil, R. Suzan, F. Maugeri, M.I. Rodrigues//Appl Biochem Biotechnol. 2001 Jun. - 94(3).- P. 257-64.

34. Stevens C.V. Chemical modification of inulin, a valuable renewable resource, and its industrial applications / C.V. Stevens, A. Meriggi, K. Booten //Biomacromolecules. 2001, Spring. - №2(1).-P. 1-16.

35. Santisteban-Silva B.O.Y. Agitation, aeration andshear stress as key factors in inulinase production by Kluyveromyces marxianus / BOY Santisteban-Silva, F. Maugeri //Enzyme Microb Tech. 2005. - №36. - P. 717-724.

36. Rouwenhorst R.J, Production and localization of beta-fructosidase in asynchronous and synchronous chemostat cultures of yeasts/ R.J. Rouwenhorst, A.A van der Baan, W.A. Scheffers, J.P. Van Dijken // Appl

37. Environ Microbiol. 1991 Feb. - 57(2). - P. 557-62.

38. Skowronek M. Purification and properties of extracellular endoinulinase from Aspergillus niger 20 OSM Food / M. Skowronek, J. Fiedurek //Technology and Biotechnology. 2006. - №44. - P .53-58.

39. Ohta K. Purification and properties of an extracellular inulinase from Rhizopus sp. strain TN-96/ K. Ohta, N. Suetsugu, T. Nakamura // J Biosci Bioeng. -2002. 94(1). - P. 78-80.

40. Gill P.K. Comparative analysis of thermostability of extracellular inulinase activity from Aspergillus fumigatus with commercially available (Novozyme) inulinase/ P.K. Gill, R.K. Manhas , P. Singh // Bioresour Technol. 2006 Jan. - 97(2). - P.355-8.

41. Finkelman M.A. Yeast strain development for extracellular enzyme production/ Bioprocess Technol. 1990. - 8. - P. 185-223.

42. Park J.P. Utilization of chicory roots for microbial endoinulinase production/ J.P. Park, J.W. Yun//Lett ApplMicrobiol. 2001 Sep. - №33. -P. 183-7

43. Wang Jing Separation and Identification of Exo- and Endoinulinase from Aspergillus ficuum / Wang Jing, Jin Zhengvu. Jiang B. and Xu Xueming. //Current Microbiology. 2003. - №2. - P. 109-112.

44. Zhang L. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / L. Zhang, C. Zhao, D. Zhu, Y.

45. Ohta, Y. Wanga //Protein Expr Purif. 2004. - №35. - P. 272-275.

46. Finkelman M.A. Yeast strain development for extracellular enzyme production//Bioprocess Technol. 1990. - 8. - P. 185-223.

47. Johnson R. Production of High Fructose Syrup from Cassava and Sweet Potato Flours and their Blends with Cereal Flours/ R. Johnson, S.N. Moorthy, G. Padmaja // Ann N Y Food Sci Technol Int. 2010 Jun. - 16(3). -P. 251-8.

48. Stanhope K.L. Fructose consumption: recent results and their potential implications/ K.L. Stanhope, P.J. Havel // Acad Sci. 2010 Mar. - 1190. -P. 15-24.

49. Singh R.S. Production of high fructose syrup from Asparagus inulin using immobilized exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1/ R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J Ind Microbiol Biotechnol. 2007 Oct. -34(10). -P. 649-55.

50. Bajón A.M. Isolation of an inulinase derepressed mutant of Pichia polymorpha for the production of fructose/ A.M. Bajón, J.P. Guiraud, P. Galzy II Biotechnol Bioeng. 1984 Feb. - 26(2). - P. 128-33.

51. Zhang T. Bioethanol production from hydrolysates of inulin and the tuber meal of Jerusalem artichoke by Saccharomyces sp. WO / T. Zhang, Z. Chi, C.H. Zhao, Z. M. Chi, F. Gong // Bioresour Technol. 2010 Nov. -101(21). -P. 8166-70.

52. Guío F. Recent trends in fructooligosaccharides production/ F. Guío, M.A. Rodríguez, C.J. Alméciga-Diaz, O.F. Sánchez// Recent Pat Food Nutr Agrie. 2009 Nov. - 1(3). -P.221-30.

53. Chien C.S. Immobilization of A. japonicus byentrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides / C.S. Chien, W.S. Lee, T.J. Lin//Enzyme Microb Technol; 200L - № 29; - P.252^-257- :

54. Cho Y.J. Production of inu-looligosaccharides from inulin by a dual endoinulinases system / YJ. Clio, J. Sinha, J.P. Park, J.W. Yun //Enzyme Microb Technol. 2001. - №29. - P. 428-133.

55. Cho Y.J. Production of inulo-oligosaccharides from chicory extract by endoinulinase from Xanthomonas oryzae No.5 / Y.J.Cho, J. Sinha, J.P. Park, J.W. Yun//Enzyme Microb Technol. 2001. - №8.-28(4-5). - P. 439-445.

56. Cuervo R. Production of fractooligosaccharidës by P-fructofuranosidase from Aspergillus sp 27H / R. Cuervo, B. Guilarte, A. Juarez, J. Martinez //J.Chem Technol Biotechnol: 2004. - №79. - P. 268-272.

57. Kim D.M. Continuous production of gluconic acid and sorbitol from Jerusalem artichoke and glucose using an oxidoreductase of Zymomonas mobilis and inulinase/ D.M. Kim, H.S. Kim // Bio technol Bioeng. 1992 Feb 5.-39(3).-P. 336-42. •

58. Singh R-S. Production of high fructose syrup from Asparagus inulin using immobilized exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1/ R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J Ind Microbiol BiotechnoL 2007 Oct. -34(10). - P. 649-55. Epub 2007 Jul 31.

59. Bajon A.M. Isolation of an inulinase derepressed mutant of Pichia polymorpha for the production of fructose / A.M. Bajon', J.P. Guiraud, P. Galzy// BiotechnolfBioeng. 1984 Feb. - 26(2). - P. 128-33.

60. Stanhope K.L. Fructose consumption: recent results and their potential implications/ K.L. Stanhope, P.J. Havel // Ann N Y Acad Sci. 2010 Mar. -1190.-P. 15-24.

61. Figueroa-Gonzâlez L Probiotics and prebiotics-perspectives and challenges/ I. Figueroa-Gonzâlez, G. Quijano, G. Ramirez, A. Cruz-Guerrero // J Sci

62. Food Agric. 2011 Mar 28. - doi: 10.1002/jsfa.4367.

63. Grizard D. Non-digestible oligosaccharides used as prebiotic agents: mode of production and beneficial effects on animal and human health / D. Grizard, G. Barthomeuf //Reprod. Nutr. 1999. - dev.39. - P.563-588.

64. Gourbeyre P. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: impact on the gut immune system and allergic reactions / P. Gourbeyre, S. Denery, M. Bodinier // J Leukoc Biol. 2011 Jan 13.

65. Delzenne N.M. Effects of fractans-type prebiotics on lipid' metabolism / N.M. Delzenne, N. Kok //Am J Clin Nutr/ 2001/ - №73/ - P. 456-458.

66. Kelly Inulin-type prebiotics: a review. (Part 2) // Altern Med Rev. 2009 Mar.-14(1).-P. 36-55.

67. Meyer D. The bifidogenic effect of inulin and oligofructose and its consequences for gut health / D. Meyer, M. Stasse-Wolthuis // Eur J Clin Nutr. 2009 Nov. - 63(11). - P. 1277-89. Epub 2009 Aug 19.

68. Martin B.R. Fructo-oligosaccharides and calcium absorption and retention in adolescent girls/ B.R. Martin, M.M. Braun, K. Wigertz, R. Bryant, Y. Zhao, W. Lee , A. Kempa-Steczko, C. M. Weaver // J Am Coll Nutr.- 2010 Aug. -29(4).-P. 382-6.

69. Stoyano va. S. The food additives inulin; and stevioside counteract oxidative stress/ S. Stoyanova, J. Geuns, E. Hideg, W. Van Den Ende // Int J Food Sci Nutr. 2011 May. - V. 62(3). - P. 207-14. Epub 2010 Nov 2.

70. Venuto C. Alternative therapies for Clostridium difficile infections / C. Venuto, M; Butler, E.D. Ashley // Brown Pharmacotherapy.- 2010 Dec. -V. 30(12).-P. 1266-78.

71. Hummelen R J. Altered host-microbe interaction in HIV: a target for intervention with pro- and prebiotics / R. Hummelen , A. P.Vos, van!t Land B, van Norren K, G: Reid //Int Rev Immunol. 2010 Oct. - 29(5). - P. 485513.

72. Menne E., Guggenbuhl N., Roberfroid M. 2000: Fn-type chicory inulin hydrolysate has a prebiotic effect in humans / J. Nutr. V. 130 - P. 11971199.

73. Трушина Э;Н. Иммуностимулирующее влияние перорального. введения бифидобактерий различных штаммов в эксперименте / Э.Н. Трушина и др. // Вопросы питания. 2006. - Т. 75. - № 5. - С. 70 - 74.

74. Somogyi M.J. Determination of reducing sugar// J. Biol. Chem. 1952. -V.195, №1-P. 19-28.

75. Williams R.S. Comparative properties of amplified external and internal invertase from the yeast SUC2 gene / R.S.Williams, R.J. Trumble, R. MacColl, R.B. Trimble, F. Maley // J. Biol.Chem. 1985. - V. 260. - P. 13334-13341.

76. Диксон M. Ферменты: В 3 т. / Диксон М., Уэбб Э. // Мир. 1982. - Т. 1, 2. -1118с.

77. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств // Легкая пром-ть. 1984. — 208 с.

78. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов // Пищ. пром-ть. -1979. 192 с.

79. Рузинов Л.П. Статистические методы оптимизации химико-технологических процессов // Химия. 1972. - 199 с.

80. Draper N.R. "Ridge analysis" of Response Surfaces // "Technometrics".100. 101. 102.103.104.105.106. 107.1963.-№4,5.-Р. 3-18.

81. Квасников Е.И. Дрожжи. Биология. Пути использования / Е.И. Квасников, И.Ф. Щелокова // Наукова думка. 1991. - 328 с. С. 25 Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов // Пищ. пром-ть. - 1979. - 192 с.

82. Рухлядева А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгина // Легкая и пищеваяпромышленность. 1981. - 288 с.

83. Draper N.R. "Ridge analysis" of Response Surfaces // "Technometrics". -1963.-№4,5.-P. 3-18.

84. Пищеков Г.Б. К оптимизации процесса роста и размножения дрожжевых клеток // Хранение и переработка сельхозсырья. 1999. -№ 12. - С.66-68.

85. Пищеков Г.Б. К методу математического моделирования процесса роста и размножения дрожжевых клеток в аппаратах периодического и непрерывного действия // Хранение и переработка сельхозсырья. -1999.-№8.-С.66-68.

86. Vitolo М. Effect of рН, aeration and sucrose feeding on the invertase activity of intact S. cerevisiae cells grown in sugarcane blackstrap molasses / M. Vitolo, M.A. Duranti, M.B. Pellegrini // J. Ind Microbiol. 1995 Aug. -V. 15, №2.-P. 75-79.

87. Шуваева Г.П. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВПИ-2 для бродильных производств /Т.П. Шуваева, Е.Л. Гармонова, О.Ю. Мальцева // Патент на изобретение №21470034, 2000.У