Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Гольдфарб, Ольга Эдуардовна
- Специальность ВАК РФ02.00.02
- Количество страниц 146
Оглавление диссертации кандидат химических наук Гольдфарб, Ольга Эдуардовна
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ДНК-СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ (Литературный обзор).
1.1. ДНК как элемент биохимического распознавания.
1.2. Методы иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности сенсоров.
1.3. Применение ДНК-сенсоров для определения низкомолекулярных соединений.
1.3.1. Определение лекарственных препаратов.
1.3.2. Определение ДНК-повреждающих факторов и загрязнителей окружающей среды.
1.3.3. Определение производных фенотиазина и феноксазина.
1.3.4. Применение ферментов в составе ДНК-сенсоров.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и реагенты.
2.2. Приборы и оборудование.
2.3. Методы исследования.
2.3.1. Изготовление биосенсоров.
2.3.2. Электрохимические измерения.
2.3.3. Измерение сигнала биосенсоров.
3. ВЫБОР УСЛОВИЙ ИЗМЕРЕНИЯ СИГНАЛА ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.
3.1. Обоснование выбора электрохимического маркера и способа регистрации сигнала.
3.2. Электрохимическое поведение метиленового синего и метиленового зеленого на стеклоуглеродном электроде.
3.3. Окисление фенотиазиновых красителей на пероксидазном сенсоре.
3.4. Влияние ДНК на пероксидазное окисление маркеров.
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.
4.1. Определение сульфаниламидных препаратов.
4.1.1. Определение сульфаниламидов с МС в качестве маркера.
4.1.2. Оценка правильности определения сульфаметоксазола.
4.1.3. Определение сульфаниламидов с МЗ в качестве маркера.
4.2. Определение других лекарственных препаратов.
5. ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.
5.1. Определение модельных токсикантов.
5.2. Изучение повреждающего действия гидроксилъных радикалов.
ЗФКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А -аденин Г - гуанин денДНК - денатурированная дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
МЗ - метиленовый зеленый
МС - метиленовый синий
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ПНА -пептидная нуклеиновая кислота
ПЦР- полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
Т-тимин
У -урацил
Ц - цитозин
С - концентрация, мкМ и мМ
Cjjm - предел обнаружения, М или мг/л i - катодный или анодный ток, мкА
NADH - никотинамидаденин динуклеотид
SAM - self-organized monolayers / самоорганизующиеся слои
SDZ - сульфадиазин
SG - сульфагуанидин
SMX - сульфаметоксазол
SMZ - сульфаметазин
ST - сульфатиазол
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Аналитическая химия», 02.00.02 шифр ВАК
Электрохимические ДНК-сенсоры на основе электрополимеризованных материалов2008 год, кандидат химических наук Порфирьева, Анна Вениаминовна
Биоаффинный метод на основе ДНК для изучения функционирования, взаимодействия с эффекторами и определения в многокомпонентных системах биологически активных веществ2005 год, доктор химических наук Бабкина, Софья Сауловна
Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды2003 год, кандидат химических наук Габсабирова, Регина Расимовна
Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител1998 год, доктор химических наук Решетилов, Анатолий Николаевич
Пероксидазные и холинэстеразные сенсоры на основе модифицированных графитовых электродов2004 год, кандидат химических наук Супрун, Елена Владимировна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала»
Актуальность проблемы. Взаимодействия низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами лежат в основе самых разнообразных биохимических процессов, играющих фундаментальную роль в передаче генетической информации, биосинтезе белка и ряде других биохимических процессов. Изучение таких реакций современными инструментальными методами во многом предопределило прорыв в нашем понимании фундаментальных закономерностей молекулярной биологии и генетики. Составной частью таких исследований является использование биосенсорных технологий, основанных на изучении аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности преобразователя сигнала с помощью оптических, масс-селективных и электрохимических методов анализа. Несмотря на то, что условия взаимодействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными регуляторами и эффекторами различной природы отличаются от таковых в живой клетке, биосенсоры с ДНК в качестве элемента распознавания дают ценную информацию о специфичности связывания, молекулярных механизмах и биохимических реакциях организма в целом. Исследования в области ДНК-сенсоров активно стимулируются также исследованиями в области ранней диагностики и химиотерапии онкологических заболеваний. Здесь основной задачей является оценка доз противораковых препаратов и их концентраций в биологических жидкостях и лекарственных формах. ДНК-сенсоры активно применяются для скрининга новых потенциальных лекарств противоракового действия и в исследовании их фармакокинетики.
Перспективы биосенсорных технологий в решении фундаментальных и прикладных задач биохимии нуклеиновых кислот, токсикологии и фармакологии не в последнюю роль определяются совершенствованием принципов регистрации аналитического сигнала. В отличие от обнаружения определенных последовательностей олигонуклеотидов в диагностике генетического материала, взаимодействие аффинных реагентов с нуклеиновыми кислотами на поверхности преобразователя сигнала не приводят к существенным изменениям свойств поверхности. Это затрудняет применение масс-селективных детекторов, определяющих изменение массы поверхностного слоя, либо оптических методов, основанных на контроле характеристик самих нуклеиновых кислот. Как и в иммунохимических методах анализа, при разработке ДНК-сенсоров основной упор делают на использовании меток - низкомолекулярных соединений или фрагментов, включаемых в состав биологических мишеней. Изменение их сигнала в результате биохимического распознавания сенсоров позволяет установить присутствие определяемого вещества в растворе и оценить параметры его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В качестве таких меток применяют комплексы переходных металлов, некоторые органические медиаторы электронного переноса (ферроцены, витаминоподобные вещества, замещенные ароматические спирты и амины). Принципиальным недостатком такого подхода является необходимость в предварительном синтезе «меченых» последовательностей олигонуклеотидов или низкомолекулярных компонентов реакции, а также a priori невысокая чувствительность определения, связанная с конкурентным характером реакции.
Поэтому в последнее время большое внимание уделяется применению диффузионно свободных (растворимых) меток, называемых также маркерами. Их внедрение в поверхностный слой биосенсора происходит за счет электростатических взаимодействий либо специфического связывания с ДНК (интеркалирования). Несмотря на то, что использование маркеров усложняет процедуру измерения, достигаемые за счет этого преимущества в чувствительности и селективности определения заставляют совершенствовать структуру и способ измерения маркеров в зависимости от характера их взаимодействия с ДНК.
Применительно к электрохимическим способам регистрации сигнала, характеристики определения маркеров не в последнюю очередь зависят от характера их электрохимических превращений на электроде. Многие соединения, будучи эффективными интеркаляторами, окисляются на электродах с большим перенапряжением, необратимо, иногда с образованием нерастворимых продуктов олигомеризации и/или хемосорбции. Это не только затрудняет регенерацию биосенсора после измерения, но и осложняет интерпретацию сигнала, поскольку параллельно взаимодействию с ДНК происходит изменение условий пассивного диффузионного переноса маркеров к поверхности сенсора.
В этой связи, большой потенциал имеет включение в генерирование сигнала ДНК-сенсора дополнительных стадий каталитического превращения маркера, "отодвигающих" реакцию от поверхности и повышающую эффективность определения концентрации и окислительно-восстановительного статуса как индикатора аффинных взаимодействий с ДНК.
В этой связи, целью данной работы явилась разработка нового ДНК-сенсора, включающего для усиления сигнала маркеров (производных фенотиазина) индикаторный фермент (пероксидаза), обеспечивающий каталитическую регенерацию активной формы маркера в электродной реакции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- определить условия взаимодействия фенотиазиновых маркеров (метиленового синего и метиленового зеленого) с компонентами биочувствительного слоя (ДНК и пероксидаза), необходимые для регенерации активной формы индикатора и регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности сенсора;
- найти рабочие условия иммобилизации пероксидазы и нативной ДНК в поверхностном слое, обеспечивающие воспроизводимый сигнал ДНК-пероксидазного сенсора и высокую чувствительность определения низкомолекулярных соединений - участников аффинных взаимодействий;
- изучить механизм взаимодействия фенотиазиновых маркеров, лекарственных препаратов, загрязняющих веществ с ДНК и установить механизм влияния природы маркеров, определяемых соединений и условий измерения на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, его аналитические и операционные характеристики; разработать высокочувствительные методы определения указанных соединений и предложить способы контроля селективности отклика биосенсора путем варьирования природы медиатора и условий измерения сигнала.
Научная новизна работы заключаются в том, что: предложен и реализован на примере определения различных низкомолекулярных соединений биологического значения новый способ регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК, основанный на вовлечении электрохимически активного маркера -производного фенотиазйна - в сопряженную реакцию ферментативного окисления с электрохимической регенерацией активной формы маркера; обосновано использование в составе ДНК-пероксидазных сенсоров для регистрации аффинных взаимодействий двух маркеров - метиленового синего и метиленового зеленого, обеспечивающих дифференциацию сигнала в зависимости от природы определяемого соединения; установлен механизм генерирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора для соединений, различным образом реагирующих с ДНК, и предложены способы направленного изменения чувствительности сигнала ДНК-пероксидазного в отношении определяемых соединений - сульфаниламидов, антрациклинов, загрязняющих веществ; показана возможность использования ДНК-пероксидазного сенсора для регистрации повреждающего действия на ДНК радикалов гидроксида и защитного действия антиок-сидантов.
Практическая значимость работы состоит в том, что: предложены простые и удобные в использовании способы модификации стеклоуглерод-ных электродов нативной и денатурированной ДНК и пероксидазой, обеспечивающие возможность каталитической регенерации маркера в сопряженной электрохимической и биохимической реакции;
- разработаны методики определения сульфаниламидных препаратов, рубомицина, док-сорубицина, промазина, цефтазидима в нано- и микромолярном диапазоне их концентраций;
- предложены подходы к оценке генотоксических свойств загрязнителей окружающей среды по их влиянию на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора.
На защиту выносятся:
- результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых маркеров на стек-лоуглеродном электроде, модифицированном ДНК, пероксидазой и их смесью и вывод о механизме взаимодействия маркеров с компонентами биочувствительного слоя и его влиянии на сигнал биосенсора;
- новый способ регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений с нативной ДНК по току восстановления маркеров - метиленового синего и метиленово-го зеленого - в присутствии определяемых соединений, отражающему скорость каталитической регенерации маркера в каталитическом цикле;
- результаты изучения влияния лекарственных соединений на сигнал ДНК-перокидазного сенсора и вывод о влиянии механизма их взаимодействия с ДНК на характеристики их определения в зависимости от природы маркера и условий измерения сигнала;
- оценка влияния ДНК-повреждающих факторов (на примере гидроксильных радикалов) и загрязняющих веществ на поведение ДНК-пероксидазного сенсора и вывод о возможности его использования для предварительного скрининга уровня загрязнения окружающей среды.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме по биокатализу «Biocatalysis-2002. Fundamentals and Applications» (Москва,
2002), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12
Дортмунд, Германия, 2002), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), Международном симпозиуме по ДНК-сенсорам «New trends in nucleic acid based biosensors» (Флоренция, Италия, 2003), . VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы анализа» (Саратов, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (Екатеринбург, 2005), Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004» (Москва), III научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ. «Материалы и технологии XXI века», Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2003).
Основные результаты изложены в 3 статьях и 7 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 44 рисунка и 14 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Похожие диссертационные работы по специальности «Аналитическая химия», 02.00.02 шифр ВАК
Оптические биосенсоры для определения фенольных соединений и органических пероксидов2013 год, кандидат химических наук Малинина, Любовь Игоревна
Иммобилизованная ДНК как реагент для вольтамперометрического определения низко- и высокомолекулярных эффекторов2000 год, кандидат химических наук Зявкина, Юлия Игоревна
Биосенсорные системы для целей химической и биологической безопасности2003 год, доктор химических наук Курочкин, Илья Николаевич
Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения биологически активных веществ и клинической диагностики2007 год, доктор химических наук Калмыкова, Елена Николаевна
Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса2013 год, кандидат наук Степанова, Вероника Борисовна
Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Гольдфарб, Ольга Эдуардовна
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение ферментов для усиления сигнала биохимического распознавания связано, в первую очередь, с высокой эффективностью каталитического превращения низкомолекулярных субстратов. Это позволяет повысить чувствительность определения и за счет специфичности ферментативного процесса обеспечить селективность измеряемого сигнала, в том числе, в матрицах сложного состава (почвенные экстракты, биологические жидкости). Данный прием находит активное применение в традиционных областях иммунохимического анализа, где фермент включают в качестве метки в один из иммунореагентов, а образующийся комплекс выделяют на твердом субстрате (ELISA). Предлагаемые в данной работе подходы к определению биоаффинных взаимодействий с участием ДНК отличаются от методов иммуноферментного анализа, прежде всего, тем, что фермент и элемент биораспознавания (ДНК) не связаны между собой, а находятся в составе одного биочувствительного слоя на поверхности сенсора. Регистрируемый сигнал определяется конкурентным взаимодействием низкомолекулярного маркера, способного удерживаться в составе комплекса с ДНК и параллельно участвовать в пероксидазной реакции восстановления гидроксида водорода в качестве медиатора переноса электрона. Высокая подвижность субстратного цикла с участием MC и МЗ приводят к тому, что даже слабые взаимодействия с участием ДНК и конкурирующих лекарственных препаратов и загрязняющих веществ приводят к изменениям сигнала биосенсора. Реализация представленного механизма формирования сигнала требует выполнения следующих условий:
- состав поверхностного слоя должен обеспечивать доступность потенциальных центров связывания ДНК и пероксидазы для взаимодействия с субстратом;
- относительная прочность связывания маркеров и обратимость их взаимодействия с ДНК должна обеспечивать необходимый перенос MC и МЗ к активным центрам пероксидазы;
- электрохимические превращения маркеров на поверхности электрода - преобразователя сигнала - должны быть обратимы для обеспечения замкнутого цикла превращения маркеров непосредственно в биочувствительном слое.
Достижение указанных условий было обеспечено путем подбора состава компонентов биочувствительного слоя и рабочий условий измерения сигнала. Селективность регистрации различных определяемых веществ, как и для других биоаффинных методов, определяется аффинностью соответствующих взаимодействий. С определенными оговорками, на нее можно повлиять путем подбора продолжительности инкубирования , концентрация маркера и его природы. Так, совместное рассмотрение сигналов МС и МЗ позволяет установить специфичность связывания определяемых веществ с ДНК на фоне присутствия других субстратов пероксидазы, находящися в объекте контроля.
Самостоятельное значение имеет область применения ДНК-пероксидазных сенсоров, связанная с групповой оценкой состава по показателям качества - например, по антиоксидантной активности или повреждающему действию на ДНК. Такие биосенсоры могут найти применение в биомедицинской практике при оценке эффективности лекарственной терапии и выборе индивидуальных доз лекарственных препаратов, а также в контроле уровня загрязнения и потенциальной опасности суммы загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.