Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Гольдфарб, Ольга Эдуардовна

  • Гольдфарб, Ольга Эдуардовна
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2005, Казань
  • Специальность ВАК РФ02.00.02
  • Количество страниц 146
Гольдфарб, Ольга Эдуардовна. Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала: дис. кандидат химических наук: 02.00.02 - Аналитическая химия. Казань. 2005. 146 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гольдфарб, Ольга Эдуардовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ДНК-СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ (Литературный обзор).

1.1. ДНК как элемент биохимического распознавания.

1.2. Методы иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности сенсоров.

1.3. Применение ДНК-сенсоров для определения низкомолекулярных соединений.

1.3.1. Определение лекарственных препаратов.

1.3.2. Определение ДНК-повреждающих факторов и загрязнителей окружающей среды.

1.3.3. Определение производных фенотиазина и феноксазина.

1.3.4. Применение ферментов в составе ДНК-сенсоров.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Приборы и оборудование.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Изготовление биосенсоров.

2.3.2. Электрохимические измерения.

2.3.3. Измерение сигнала биосенсоров.

3. ВЫБОР УСЛОВИЙ ИЗМЕРЕНИЯ СИГНАЛА ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.

3.1. Обоснование выбора электрохимического маркера и способа регистрации сигнала.

3.2. Электрохимическое поведение метиленового синего и метиленового зеленого на стеклоуглеродном электроде.

3.3. Окисление фенотиазиновых красителей на пероксидазном сенсоре.

3.4. Влияние ДНК на пероксидазное окисление маркеров.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.

4.1. Определение сульфаниламидных препаратов.

4.1.1. Определение сульфаниламидов с МС в качестве маркера.

4.1.2. Оценка правильности определения сульфаметоксазола.

4.1.3. Определение сульфаниламидов с МЗ в качестве маркера.

4.2. Определение других лекарственных препаратов.

5. ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.

5.1. Определение модельных токсикантов.

5.2. Изучение повреждающего действия гидроксилъных радикалов.

ЗФКЛЮЧЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

А -аденин Г - гуанин денДНК - денатурированная дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МЗ - метиленовый зеленый

МС - метиленовый синий

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПНА -пептидная нуклеиновая кислота

ПЦР- полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

Т-тимин

У -урацил

Ц - цитозин

С - концентрация, мкМ и мМ

Cjjm - предел обнаружения, М или мг/л i - катодный или анодный ток, мкА

NADH - никотинамидаденин динуклеотид

SAM - self-organized monolayers / самоорганизующиеся слои

SDZ - сульфадиазин

SG - сульфагуанидин

SMX - сульфаметоксазол

SMZ - сульфаметазин

ST - сульфатиазол

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Аналитическая химия», 02.00.02 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала»

Актуальность проблемы. Взаимодействия низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами лежат в основе самых разнообразных биохимических процессов, играющих фундаментальную роль в передаче генетической информации, биосинтезе белка и ряде других биохимических процессов. Изучение таких реакций современными инструментальными методами во многом предопределило прорыв в нашем понимании фундаментальных закономерностей молекулярной биологии и генетики. Составной частью таких исследований является использование биосенсорных технологий, основанных на изучении аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности преобразователя сигнала с помощью оптических, масс-селективных и электрохимических методов анализа. Несмотря на то, что условия взаимодействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными регуляторами и эффекторами различной природы отличаются от таковых в живой клетке, биосенсоры с ДНК в качестве элемента распознавания дают ценную информацию о специфичности связывания, молекулярных механизмах и биохимических реакциях организма в целом. Исследования в области ДНК-сенсоров активно стимулируются также исследованиями в области ранней диагностики и химиотерапии онкологических заболеваний. Здесь основной задачей является оценка доз противораковых препаратов и их концентраций в биологических жидкостях и лекарственных формах. ДНК-сенсоры активно применяются для скрининга новых потенциальных лекарств противоракового действия и в исследовании их фармакокинетики.

Перспективы биосенсорных технологий в решении фундаментальных и прикладных задач биохимии нуклеиновых кислот, токсикологии и фармакологии не в последнюю роль определяются совершенствованием принципов регистрации аналитического сигнала. В отличие от обнаружения определенных последовательностей олигонуклеотидов в диагностике генетического материала, взаимодействие аффинных реагентов с нуклеиновыми кислотами на поверхности преобразователя сигнала не приводят к существенным изменениям свойств поверхности. Это затрудняет применение масс-селективных детекторов, определяющих изменение массы поверхностного слоя, либо оптических методов, основанных на контроле характеристик самих нуклеиновых кислот. Как и в иммунохимических методах анализа, при разработке ДНК-сенсоров основной упор делают на использовании меток - низкомолекулярных соединений или фрагментов, включаемых в состав биологических мишеней. Изменение их сигнала в результате биохимического распознавания сенсоров позволяет установить присутствие определяемого вещества в растворе и оценить параметры его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В качестве таких меток применяют комплексы переходных металлов, некоторые органические медиаторы электронного переноса (ферроцены, витаминоподобные вещества, замещенные ароматические спирты и амины). Принципиальным недостатком такого подхода является необходимость в предварительном синтезе «меченых» последовательностей олигонуклеотидов или низкомолекулярных компонентов реакции, а также a priori невысокая чувствительность определения, связанная с конкурентным характером реакции.

Поэтому в последнее время большое внимание уделяется применению диффузионно свободных (растворимых) меток, называемых также маркерами. Их внедрение в поверхностный слой биосенсора происходит за счет электростатических взаимодействий либо специфического связывания с ДНК (интеркалирования). Несмотря на то, что использование маркеров усложняет процедуру измерения, достигаемые за счет этого преимущества в чувствительности и селективности определения заставляют совершенствовать структуру и способ измерения маркеров в зависимости от характера их взаимодействия с ДНК.

Применительно к электрохимическим способам регистрации сигнала, характеристики определения маркеров не в последнюю очередь зависят от характера их электрохимических превращений на электроде. Многие соединения, будучи эффективными интеркаляторами, окисляются на электродах с большим перенапряжением, необратимо, иногда с образованием нерастворимых продуктов олигомеризации и/или хемосорбции. Это не только затрудняет регенерацию биосенсора после измерения, но и осложняет интерпретацию сигнала, поскольку параллельно взаимодействию с ДНК происходит изменение условий пассивного диффузионного переноса маркеров к поверхности сенсора.

В этой связи, большой потенциал имеет включение в генерирование сигнала ДНК-сенсора дополнительных стадий каталитического превращения маркера, "отодвигающих" реакцию от поверхности и повышающую эффективность определения концентрации и окислительно-восстановительного статуса как индикатора аффинных взаимодействий с ДНК.

В этой связи, целью данной работы явилась разработка нового ДНК-сенсора, включающего для усиления сигнала маркеров (производных фенотиазина) индикаторный фермент (пероксидаза), обеспечивающий каталитическую регенерацию активной формы маркера в электродной реакции.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- определить условия взаимодействия фенотиазиновых маркеров (метиленового синего и метиленового зеленого) с компонентами биочувствительного слоя (ДНК и пероксидаза), необходимые для регенерации активной формы индикатора и регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности сенсора;

- найти рабочие условия иммобилизации пероксидазы и нативной ДНК в поверхностном слое, обеспечивающие воспроизводимый сигнал ДНК-пероксидазного сенсора и высокую чувствительность определения низкомолекулярных соединений - участников аффинных взаимодействий;

- изучить механизм взаимодействия фенотиазиновых маркеров, лекарственных препаратов, загрязняющих веществ с ДНК и установить механизм влияния природы маркеров, определяемых соединений и условий измерения на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, его аналитические и операционные характеристики; разработать высокочувствительные методы определения указанных соединений и предложить способы контроля селективности отклика биосенсора путем варьирования природы медиатора и условий измерения сигнала.

Научная новизна работы заключаются в том, что: предложен и реализован на примере определения различных низкомолекулярных соединений биологического значения новый способ регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК, основанный на вовлечении электрохимически активного маркера -производного фенотиазйна - в сопряженную реакцию ферментативного окисления с электрохимической регенерацией активной формы маркера; обосновано использование в составе ДНК-пероксидазных сенсоров для регистрации аффинных взаимодействий двух маркеров - метиленового синего и метиленового зеленого, обеспечивающих дифференциацию сигнала в зависимости от природы определяемого соединения; установлен механизм генерирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора для соединений, различным образом реагирующих с ДНК, и предложены способы направленного изменения чувствительности сигнала ДНК-пероксидазного в отношении определяемых соединений - сульфаниламидов, антрациклинов, загрязняющих веществ; показана возможность использования ДНК-пероксидазного сенсора для регистрации повреждающего действия на ДНК радикалов гидроксида и защитного действия антиок-сидантов.

Практическая значимость работы состоит в том, что: предложены простые и удобные в использовании способы модификации стеклоуглерод-ных электродов нативной и денатурированной ДНК и пероксидазой, обеспечивающие возможность каталитической регенерации маркера в сопряженной электрохимической и биохимической реакции;

- разработаны методики определения сульфаниламидных препаратов, рубомицина, док-сорубицина, промазина, цефтазидима в нано- и микромолярном диапазоне их концентраций;

- предложены подходы к оценке генотоксических свойств загрязнителей окружающей среды по их влиянию на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора.

На защиту выносятся:

- результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых маркеров на стек-лоуглеродном электроде, модифицированном ДНК, пероксидазой и их смесью и вывод о механизме взаимодействия маркеров с компонентами биочувствительного слоя и его влиянии на сигнал биосенсора;

- новый способ регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений с нативной ДНК по току восстановления маркеров - метиленового синего и метиленово-го зеленого - в присутствии определяемых соединений, отражающему скорость каталитической регенерации маркера в каталитическом цикле;

- результаты изучения влияния лекарственных соединений на сигнал ДНК-перокидазного сенсора и вывод о влиянии механизма их взаимодействия с ДНК на характеристики их определения в зависимости от природы маркера и условий измерения сигнала;

- оценка влияния ДНК-повреждающих факторов (на примере гидроксильных радикалов) и загрязняющих веществ на поведение ДНК-пероксидазного сенсора и вывод о возможности его использования для предварительного скрининга уровня загрязнения окружающей среды.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме по биокатализу «Biocatalysis-2002. Fundamentals and Applications» (Москва,

2002), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12

Дортмунд, Германия, 2002), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), Международном симпозиуме по ДНК-сенсорам «New trends in nucleic acid based biosensors» (Флоренция, Италия, 2003), . VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы анализа» (Саратов, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (Екатеринбург, 2005), Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004» (Москва), III научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ. «Материалы и технологии XXI века», Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2003).

Основные результаты изложены в 3 статьях и 7 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 44 рисунка и 14 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

Похожие диссертационные работы по специальности «Аналитическая химия», 02.00.02 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Гольдфарб, Ольга Эдуардовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение ферментов для усиления сигнала биохимического распознавания связано, в первую очередь, с высокой эффективностью каталитического превращения низкомолекулярных субстратов. Это позволяет повысить чувствительность определения и за счет специфичности ферментативного процесса обеспечить селективность измеряемого сигнала, в том числе, в матрицах сложного состава (почвенные экстракты, биологические жидкости). Данный прием находит активное применение в традиционных областях иммунохимического анализа, где фермент включают в качестве метки в один из иммунореагентов, а образующийся комплекс выделяют на твердом субстрате (ELISA). Предлагаемые в данной работе подходы к определению биоаффинных взаимодействий с участием ДНК отличаются от методов иммуноферментного анализа, прежде всего, тем, что фермент и элемент биораспознавания (ДНК) не связаны между собой, а находятся в составе одного биочувствительного слоя на поверхности сенсора. Регистрируемый сигнал определяется конкурентным взаимодействием низкомолекулярного маркера, способного удерживаться в составе комплекса с ДНК и параллельно участвовать в пероксидазной реакции восстановления гидроксида водорода в качестве медиатора переноса электрона. Высокая подвижность субстратного цикла с участием MC и МЗ приводят к тому, что даже слабые взаимодействия с участием ДНК и конкурирующих лекарственных препаратов и загрязняющих веществ приводят к изменениям сигнала биосенсора. Реализация представленного механизма формирования сигнала требует выполнения следующих условий:

- состав поверхностного слоя должен обеспечивать доступность потенциальных центров связывания ДНК и пероксидазы для взаимодействия с субстратом;

- относительная прочность связывания маркеров и обратимость их взаимодействия с ДНК должна обеспечивать необходимый перенос MC и МЗ к активным центрам пероксидазы;

- электрохимические превращения маркеров на поверхности электрода - преобразователя сигнала - должны быть обратимы для обеспечения замкнутого цикла превращения маркеров непосредственно в биочувствительном слое.

Достижение указанных условий было обеспечено путем подбора состава компонентов биочувствительного слоя и рабочий условий измерения сигнала. Селективность регистрации различных определяемых веществ, как и для других биоаффинных методов, определяется аффинностью соответствующих взаимодействий. С определенными оговорками, на нее можно повлиять путем подбора продолжительности инкубирования , концентрация маркера и его природы. Так, совместное рассмотрение сигналов МС и МЗ позволяет установить специфичность связывания определяемых веществ с ДНК на фоне присутствия других субстратов пероксидазы, находящися в объекте контроля.

Самостоятельное значение имеет область применения ДНК-пероксидазных сенсоров, связанная с групповой оценкой состава по показателям качества - например, по антиоксидантной активности или повреждающему действию на ДНК. Такие биосенсоры могут найти применение в биомедицинской практике при оценке эффективности лекарственной терапии и выборе индивидуальных доз лекарственных препаратов, а также в контроле уровня загрязнения и потенциальной опасности суммы загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.