Электрохимические реакции пероксидазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.05, кандидат химических наук Фридман, Вадим Анатольевич

• Фридман, Вадим Анатольевич
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Фридман, Вадим Анатольевич

Оглавление

Введение

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биоэлектрокаталитические и окислительно-восстановительные реакции ферментов на углеродных материалах

1.1. Общие представления о структуре и свойствах ферментов

1.2. Способы иммобилизации ферментов в электрохимических системах

2. Биоэлектрокаталитические реакции в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром фермента (реакции прямого биоэлектрокатализа)

3. Пероксидаза и её функции в электрокатализе

3.1. Строение и краткая характеристика физико-химических и ферментативных свойств пероксидазы

3.2. Биоэлектрокатализ пероксидазой на твердых электродах

3.3. Окислительно-восстановительные превращения пероксидазы на электродах

4. Механизм биоэлектрокатализа

Заключение

ЧАСТЬ 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы электрохимических измерений

2. Электроды и электродные материалы

3. Реагенты и рабочие растворы

4. Иммобилизация ферментов

ЧАСТЬ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Редокс-превращения гемсодержащих соединений

1. Редокс-превращения пероксидазы

2. Редокс-превращения микропероксидазы МП-11

Глава 2. Электрокатализ иммобилизованной пероксидазой

1 .Биоэлектрокаталитическое восстановление Н202 пероксидазой, иммобилизованной на углеродном электроде

1.1. Влияние концентрации пероксида водорода, скорости вращения электрода и рН раствора на скорость электрокаталитической реакции

1.2. Влияние ингибиторов и активаторов фермента на скорость

электровосстановления Н2О2

1.1. Анализ кинетической схемы реакции

2. Электрокаталитическое восстановление кислорода пероксидазой, иммобилизованной на сажевом электроде

1. Биоэлектрокатализ пероксидазой, соиммобилизованной с >1-метилпирролом

2. Электровосстановление пероксида водорода пероксидазой,

иммобилизованной в Нафион

Выводы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Электрохимические реакции пероксидазы»

Введение

Перспективы использования ферментов в электрохимии обусловлены высокой каталитической активностью белковых макромолекул и высокой специфичностью их действия. Разработанные методы сопряжения ферментативных и электрохимических реакций позволяют использовать ферменты в электрохимических процессах. Прежде всего, это возможность осуществлять с высокими скоростями такие важные в практическом отношении реакции, как электровосстановление пероксида водорода и молекулярного кислорода. В этом плане наиболее интересны обнаруженные в конце 70-х годов реакции прямого биоэлектрокатализа, протекающие в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром белкового катализатора. Перечень ферментов, в присутствии которых наблюдаются подобные реакции, заметно пополняется в последние годы, однако механизм реакции остаётся предметом дискуссий.

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей био-электрокаталитических реакций в системе электрод - активный центр фермента - субстрат для гемсодержащего фермента пероксидазы, адсорбированного на углеродных электродах (сажа, пирографит) и встроенного в полимерные плёнки.

Непосредственный перенос электрона между электродом и активным центром фермента (в отсутствие субстрата) является, по-видимому, необходимым условием для реализации прямого биоэлектрокатализа. В этом случае на циклических вольтамперных кривых (ЦВА) должна наблюдаться характерная картина редокс-превращения простетических групп белковых катализаторов. Первая глава экспериментальной части настоящей работы по-

священа изучению редокс-превращений пероксидазы и её модели микро-пероксидазы на углеродных электродах.

Механизму самой реакции пероксидазного электрокатализа (чрезвычайно важной в практическом отношении) посвящена вторая глава. Подробно анализируется влияние различных экспериментальных факторов на скорость восстановления пероксида водорода и кислорода пероксидазой, адсорбированной на углеродном электроде, на основе чего предлагается возможная схема реакции и механизм переноса электрона между электродом, активным центром пероксидазы и субстратом.

Эффективность функционирования ферментных электродов повышается во многих случаях в результате иммобилизации белковых катализаторов в полимерные плёнки. По этой причине следующий этап диссертационной работы заключался в исследовании реакции восстановления пероксида водорода пероксидазой, соиммобилизованной с электропроводным (полиметил-пиррол) и неэлектропроводным (Нафион) полимерами.

Часть I. Обзор литературы.

1. Биоэлектрокаталитические и окислительно-восстановительные реакции ферментов на углеродных материалах.

Основной задачей электрокатализа является интенсификация электрохимических реакций в условиях, максимально приближенных к равновесным. Значительная эффективность в этом направлении достигнута с использованием ферментов - катализаторов белковой природы. Данная область научных исследований получила название биоэлектрокатализа.

Углеродные материалы широко используются в качестве электропроводящей подложки для иммобилизации (привязывания) ферментов [1,66]. Это обусловлено такими свойствами углеродных электродов, как широкий спектр состава поверхностных групп (хиноновые, карбоксильные, лактоно-вые), по которым происходит адсорбция белков, а также гидрофобно-гидрофильных характеристик электродной поверхности [2]. Привлекательность физико-химических свойств различных углеродных материалов открывает перспективы для применения их в качестве основы ферментных электродов (в особенности одноразовых) для анализа различных субстратов [5]. Углеродные электроды широко используются и в фундаментальных работах, посвященных исследованию электрохимических превращений белков и ферментов, что позволяет получить более детальную информацию о кинетике ферментативных окислительно-восстановительных реакций [1,3,6]. Небольшие по размеру редокс-протеины можно рассматривать как модельные белки для некоторых ферментных молекул, электрохимические реакции которых во многих случаях затруднены [84,86,87,90]. Однако в некоторых ра-

ботах удалось непосредственно зафиксировать редокс-превращения ряда ферментов на циклических вольтамперных кривых (ЦВА), о чем будет сказано далее.

Многие ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (их называют оксидоредуктазы) [4,6] ускоряют биэлектрохи-мические реакции окисления (восстановления) с участием медиаторов (низкомолекулярных переносчиков электронов между электродом и активным центром белкового катализатора).

Как удалось установить в 70 ~ 90-е годы, некоторые из подобных ферментов катализируют электрохимические реакции соответствующих субстратов и в отсутствие медиаторов. Было высказано предположение, что в данных реакциях, которые называют реакциями безмедиаторного электронного переноса между электродом, активным центром фермента и субстратом (реакциями прямого биоэлектрокатализа), электрод непосредственно обменивается электронами с активным центром фермента. Впервые эти реакции были исследованы именно на углеродных электродах [1,3,11-15].

Авторы некоторых публикаций полагают, что прямой электронный перенос возможен в том случае, когда в результате взаимодействия фермента с поверхностью электрода формируется комплекс, подобный по своему строению промежуточному комплексу белкового катализатора и одного из субстратов ферментативного катализа. В этом случае возможно электрохимическое восстановление (окисление) второго субстрата [1,3,4]. Данное условие как раз реализуется на углеродной поверхности. Функциональные кислородсодержащие группы углеродного электрода обеспечивают не только адсорбционное привязывание ферментов, но и ,по-видимому, необходимое для реализации прямого электронного переноса микроокружение ферментной глобулы. [1,3-5,31].

1.1. Общие представления о структуре и свойствах ферментов.

Ферменты представляют собой катализаторы белковой природы [1]. Белки - это высокомолекулярные соединения, состоящие из а - аминокислот, связанных пептидными связями. Полипептидная цепь определяет первичную структуру белка. Помимо первичной, белки имеют вторичную, третичную и иногда четвертичную структуру. Вторичная структура определяется специфической укладкой локальных участков полимерной цепи в пространстве. Наиболее характерной для белков является а - спираль, которая поддерживается за счёт образования водородных связей. Третичная структура определяется свёртыванием полипептидной цепи в компактную сферическую глобулу. Полипептидные цепи стремятся свернуться таким образом, чтобы во внутренней части молекулы находилось как можно больше гидрофобных боковых цепей аминокислот, что предохраняет их от термодинамически невыгодного контакта с водной средой. В больших белковых молекулах имеется в ряде случаев не одна, а несколько полипептидных цепей, которые в результате взаимодействия укладываются в четвертичную структуру.

Помимо белковой глобулы (апофермента), ферменты содержат небелковую часть - простетическую группу, состоящую из ионов металлов или низкомолекулярных органических редокс-соединений. Из простетической группы и фрагментов полипептидной цепи формируется активный центр белка. Перенос электрона в белковых молекулах протекает с окислением или восстановлением активных центров. Простетическая группа гемсодержащих белков (цитохром С, пероксидаза, каталаза) представляет собой порфирин железа [72]. Большая группа флавопротеинов содержит в активном центре флавинадениндинуклеотид (ФАД).

1.2. Способы иммобилизации ферментов в электрохимических системах.

Под иммобилизацией понимают способ "привязывания" ферментов к носителю (в данном случае к электроду). Иммобилизация за счет сил физической и химической адсорбции представляет собой наиболее простой метод, широко используемый в случае углеродных электродов. Однако данный способ имеет тот недостаток, что в процессе работы часть белка десорбиру-ется с поверхности, особенно если проводить исследования с вращающимися электродами или в проточном растворе. Для предотвращения вымывания с поверхности сорбента используют иммобилизацию белков в полимерные, в том числе электрохимическими методами осаждённые пленки. В условиях катодной поляризации (которая, как правило, не инактивирует фермент) применяют соосаждение фермента с гелем ПВС (поливинилового спирта) и с акриламидом [1,4]. Используют и другой способ - после обычной адсорбционной иммобилизации белки "сшивают" глутаровым альдегидом [1,4,5 ], покрывают поверхность электрода ионообменными мембранами или растворами ионообменных полимеров Naflon (Нафион - сополимер тетрафторэтиле-на и перфторалкилвинилового эфира) [77, 78] и Eastman AQ (полистер-сульфоновая кислота) [7,8,31].

Широко распространенным методом иммобилизации белков является привязывание к поверхности электрода через модификаторы. В качестве модифицирующих агентов используют дипиридил , пурин, метилвиологен [1]. Основные требования, которые предъявляют к модифицирующим агентам, заключаются в том, что они должны иметь две функциональные группы, одна из которых образует прочную связь с поверхностью электрода, а вторая взаимодействует с белковой глобулой. В последнее десятилетие широко используют водорастворимые производные карбодиимида для ковалентного привязывания амино- (или карбоксильных) групп белковых молекул к кар-

боксильным (или, соответственно, аминогруппам), предварительно синтезированным на поверхности электрода [49,52,60].

Опубликовано ряд работ, в которых использовали электрохимическую иммобилизацию ферментов в электропроводные полимерные пленки (полипиррол и его производные, полианилин, и т.д.) [9, 10, 39 -41, 82, 87, 88, 90, 91]. Варьируя параметры электрохимической полимеризации и применяя различные допирующие агенты, можно синтезировать непосредственно на электроде пленку определенной толщины и структуры, а путем соосаждения ферментов с мономерами, устойчивыми в нейтральной среде (пиррол и его производные), обеспечить эффективное встраивание белка в полимерную матрицу. В этом случае ферментная глобула как бы "обволакивается" со всех сторон цепями электропроводного полимера что, по мнению ряда авторов, способствует переносу заряда между электродом и активным центром включенного в полимер белка [26,40].

2. Биоэлектрокаталитические реакции в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром фермента (реакции прямого биоэлектрокатализа).

Еще в 1978 году было показано, что фермент лакказа (медьсодержащая п-фенолоксидаза), адсорбированная на сажевом электроде, катализирует электровосстановление молекулярного кислорода в отсутствие медиатора [11]. Позже на углеродном электроде были обнаружены и редокс-превращения ионов меди активного центра фермента [12]. Другой медьсодержащий фермент - тирозиназа также ускоряет реакцию восстановления кислорода. [13].

Цитохром b2 (фермент, содержащий флавинмононуклеотид и гем) ускоряет электроокисление лактата на оргметаллическом (электронпроводящее органическое соединение) и углеродном электродах [4,6].

В 1980 году опубликована статья [14], посвященная прямому электроокислению молекулярного водорода гидрогеназой - ферментом, содержащим в активном центре железосерный кластер.

Сажевый электрод с адсорбированной пероксидазой из хрена катализирует безмедиаторное электровосстановление пероксида водорода, что было впервые показано в 1979 году в работе [15]. Аналогичные результаты были получены в 1989 году с цитохром С пероксидазой, адсорбированной на пирографите [81].

В 1989 году [16] обнаружен эффект безмедиаторного переноса электрона между п-крезолметилгидроксилазой (ферментом, содержащем в активном центре гем и ФАД, и катализирующем процессы бактериального метаболизма п-крезола) и краевой плоскостью пирографитового электрода. Рост анодного тока окисления п-крезола наблюдается в присутствии промоторов - положительно заряженных катионов и органических молекул (полиаминов и аминогликозидов) в объеме раствора. Положительно заряженные ионы промотора концентрируются во внешней плоскости Гельм-гольца и уменьшают отталкивающее влияние электрода на отрицательно заряженную ферментную глобулу. В присутствии органических промоторов белок претерпевает на электроде квазиобратимые редокс-превращения вблизи окислительно-восстановительного потенциала гем-содержащей субьединицы (0,04 В), определенного в обьеме раствора потенциометриче-ским титрованием редокс-медиатором. (Здесь и далее потенциалы приведены по насыщенному хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl) при рН=7). К этой величине близок и потенциал полуволны Е ш окисления п-крезола

(0,03 В). Обобщив полученные экспериментальные данные, а также исходя из известной ранее схемы ферментативного катализа п-крезолметил-гидроксилазой, авторы [16] предложили механизм электрохимической реакции: субстрат вначале окисляется на флавинадениндинуклеотиде (ФАД), после чего происходит быстрая передача электрона на гем, который затем электрохимически окисляется на поверхности электрода. Аналогичные результаты получены этими же авторами на пирографите с другим флавогемо-вым ферментом - флавоцитохромом С552, который катализирует электроокисление гидросульфидов [17]. Здесь, как и в предыдущем случае, на электроде зафиксированы редокс-превращения, близкие к редокс-потенциалу гемсодержащей субьединицы и к потенциалу полуволны окисления субстрата.

В работе [18] описываются электрохимические свойства и электрокаталитическая активность другого фермента - метиламин дегидрогеназы, катализирующего электроокисление метиламина на пирографите и модифицированном золотом электроде. Кофактор фермента имеет хиноидную структуру , и его редокс-превращения (вблизи редокс-потенциала в обьеме раствора) зафиксированы на циклических вольтамперных кривых (ЦВА).

Электрокаталитические свойства фумарат редуктазы, содержащей в активном центре ФАД и железосерный кластер, описаны в работах [19-20]. Фермент, в адсорбированном на электроде состоянии, катализирует восстановление фумарата на краевой плоскости пирографитового электрода. На вольтамперной кривой ферментного электрода в отсутствие субстрата наблюдается пара окислительно-восстановительных превращений при потенциалах -0,028 В и -0,291 В. Первое значение близко к редокс-потенциалу ФАД содержащей (-0,035 В), а второе - гем-содержащей (-0,28 В) субьединицы в объеме раствора. При низкой концентрации фумарата на поляризационной кривой наблюдается одна волна, потенциал полуволны которой

Е1/2 - - 0,03 В близок к редокс-потенциалу флавинадениндинуклеотида (ФАД). По мнению авторов, восстановление субстрата в этой системе протекает только через ФАД. С ростом концентрации субстрата становится различимой вторая волна (Еуг = -0,29 В, что близко к редокс-потенциалу тема). При этом, предположительно, в биоэлектрохимическом процессе участвуют обе субъединицы.

Электрохимические свойства с1-фруктозодегидрогеназы (ФДГ) были описаны в 1991 году (простетическая группа фермента содержит пирроло-хинолин хинон (ПХХ) и гем) [21]. Фермент катализирует электроокисление ё - фруктозы [3]. На ЦВА платинового, золотого и графитового электродов с адсорбированным ферментом были зарегистрированы обратимые окислительно-восстановительные превращения, однако данных по редокс-потенциалам простетических групп в обьеме раствора не приводится.

В работе [22] были описаны биоэлектрокаталитические свойства алко-гольдегидрогеназы (фермента, имеющего такие же простетические группы, как и ФДГ). Эти же авторы обнаружили электрокаталитическую активность с1-глюконат-дегидрогеназы (фермента, содержащего ФАД, гем и железосер-ный кластер и ускоряющего электроокисление с1-глюконата) [75] . Прямое электроокисление, катализируемое алкогольдегидрогеназой (АДГ) и ё-глюконатдегидрогеназой (ГДГ) было исследовано на различных углеродных электродах, а также на модифицированном золоте, серебре и платине. Как и в работах [11,12,14-16] авторы сделали предположение о том, что превращение субстрата происходит на ПХХ (в случае АДГ) и на ФАД (в случае ГДГ), после чего происходит внутримолекулярный перенос электрона на гем с последующим окислением на электроде. Аналогичные данные получены с еще одним представителем дегидрогеназ - целлобиоздегидрогеназой, которая катализирует реакцию окисления целлобиозы на пирографите [23].

Табл. 1. Электрокаталитически активные ферменты и их редокс-потенциалы.

(рН=7)

Фермент Простети-ческая группа (группы) Реакция, катализируемая ферментом Электрод Егей/охз фермента на электроде В Е red/ox; фермента в объеме раствора, В Ссылки

Лакказа (голубая поли-фенолоксидаза) 4 иона меди (Си-8 кластер) Red о2 Углерод 0,175 (рН=5) 0,8 (рН=5) [11,12,69]

Пероксидаза Гем Red н2о2 Углерод Модиф. Золото Органич. Металлы 0,2 -0,48 -0,56 -0,47 [15,31-37] [44] [45] [46] [48] [38]

п-Крезолметил-гидроксилаза ФАД и гем Ох п-Крезола Углерод 0,04 0,025 (гемсодер-жащая субьединица) [16]

Метиламин дегидрогеназа Метоксан- тинподобный хинон Ох Метиламина Углерод Модиф. Золото -0,12 -0,12 -0,128 [18]

Флавоцитохром QS2 ФАД и 2 тема Ох s2- Углерод Модиф. Золото -0,19 -0,19 -0,188 (гемсодер-жащая субьединица) [17]

Фумарат редукта-за ФАД и железо-серный кластер Red Фумарата Углерод -0,028 (первая пара пиков на ЦВА) -0,291 (вторая пара пиков на ЦВА) -0,035 (ФАД содержащая субьединица) -0,280 (Fe-S содержащая субьединица) [20]

d-фруктозо-дегидрогеназа ПХХ и гем Ох Фруктозы Платина Золото Углерод 0,08 0,08 0,04 - [21]

Таким образом, в 90-е годы удалось существенно пополнить перечень ферментов, ускоряющих безмедиаторные электрокаталитические реакции, в

основном за счет белков, содержащих по две-три простетические группы (гем, ФАД, ПХХ, железосерный кластер).

Анализ экспериментальных данных позволяет авторам сделать вывод о том, что в этих ферментах каталитическое превращение субстрата и электрохимическая реакция протекают на разных центрах, следовательно, имеется участок белковой молекулы, через которую происходит перенос электрона между электродом и субстратом. Электрохимические свойства электроката-литически активных ферментов, претерпевающих редокс-превращения на электроде, приведены в таблице 1 (см. стр. 13).

Остается открытым вопрос о возможности прямого переноса электрона для ферментов, простетическая группа которых состоит из одной молекулы флавинадениндинуклеотида (ФАД) [3,6,24]. Особый интерес в этой связи проявляется к глюкозооксидазе, катализирующей окисление (З-Б-глюкозы молекулярным кислородом, в связи с большой практической значимостью аналитических систем на глюкозу [5]. В глюкозооксидазе ФАД связан с апо-белком нековалентной связью, и наблюдаемые в ряде работ редокс-превращения флавина могут относится к образовавшемуся при деструктивной адсорбции фермента свободному коферменту [6].

Многочисленные попытки реализовать безмедиаторное окисление глюкозы оказались поначалу безрезультатными [6]. Однако в работе [25] авторы полагают, что при малых концентрациях глюкозооксидазы (ГОД) в обьеме раствора (менее 20 мкМ) на поверхности электрода образуется форма белка, способная к переносу электрона при сохранении белковой глобулой нативной конформации.

Данное предположение обосновывается тем фактом, что, помимо ре-докс-превращений в отсутствие субстрата, в области потенциалов (-0,3) - (-0,4) В наблюдается увеличение анодного тока с ростом концентрации глюкозы в объеме раствора, т.е. безмедиаторное окисление. Тот же эф-

фект был зарегистрирован и в работе [26] на золотом электроде, покрытом композитной пленкой поли(Ы-метилпиррола) и глюкозооксидазы при потенциале -0,45 В и при температуре +50°С .

В [25], [27] указывается на заметные различия в редокс- потенциалах глюкозооксидазы (ГОД) (-0,3 В) и свободного ФАД (-0,44 В) на пирографи-товом электроде. Обратимость редокс-превращений фермента сохраняется в более широкой области изменения скорости наложения потенциала по сравнению со свободным ФАД, что, как считают авторы [27], указывает на большую скорость гетерогенного электронного транспорта в системе электрод -белковая глобула.

Тем не менее, по мнению ряда исследователей, реакция окисления глюкозы может протекать в данном случае по медиаторному механизму за счет переноса электрона между "свободными" молекулами ФАД, образовавшимися при денатурации белковой глобулы глюкозооксидазы, и электродом [3,6].

3. Пероксидаза и её функции в электрокатализе.

Огромная практическая значимость реакции пероксидазного катализа связана с возможностью её использования для определения компонентов крови (глюкозы, холестерина, креатинина, галактозы, аминокислот и т.д.) в биферментных системах пероксидаза-оксидаза. Пероксидаза катализирует восстановление пероксида водорода, который образуется при окислении субстрата соответствующей оксидазой (глюкозы-глюкозооксидазой, галак-тозы-галактозоксидазой и т.д.). Поэтому, обнаруженный в 1977 году эффект безмедиаторного электровосстановления Н2О2 иммобилизованной перокси-дазой открыл возможности для разработки амперометрических систем на пероксид водорода и указанные выше компоненты клинического анализа.

3.1 Строение и краткая характеристика физико-химических и ферментативных свойств пероксидазы.

Пероксидазы представляют собой обширный класс ферментов, катализирующих окисление различных соединений (аминов, фенолов, ферроциа-нида и т.д.) пероксидом водорода [28]. Наиболее исследована пероксидаза из хрена (HRP) представляющая собой глобулярный белок с молекулярной массой 40 ООО, содержащий одну простетическую группу - феррипротопор-фирин IX, нековалентно связанный с апобелком. Структура молекулы пероксидазы (рис.1) и простетической группы фермента (рис.2) представлена ниже.

рис.1. Структура молекулы пероксидазы.

рис.2а). Структура протогема IX.

К настоящему моменту выделено семь главных изоферментов перок-сидазы: Аь А2, А3 (кислые); В, С, Д, Е (щелочные), отличающиеся по аминокислотному составу и по изоэлектрической точке. Изоферментный состав пероксидазы характеризуется показателем Rz = А403/А278? где А - оптическая плотность при соответствующей длине волны. Препараты, имеющие Rz=0,3 содержат практически все изоферменты. Препараты с Rz>2 обычно содержат смесь щелочных изоферментов В и С и имеют изоэлектрическую точку при рН=9.

На основании физических исследований было сделано предположение о том, что нативная HRP имеет форму, близкую к сферической с радиусом 2,9 нм [28]. Недавно [76] размер молекулы HRP был уточнён методом STM (сканирующей туннельной микроскопии). Согласно данной работе, размер молекулы пероксидазы составляет 6,2 нМ х 4,ЗнМ х 1,2 нМ.

Из предложенных моделей ковалентной и стереоструктуры изофер-мента С пероксидазы хрена [29] можно сделать вывод о наличии двух ярко выраженных доменов в молекуле HRP и о нахождении гемина в полости между ними. Ориентацию гема в пероксидазе можно представить следующим образом [28]: гем находится в гидрофобной щели вблизи поверхности белка.

Редокс-потенциал пары ферро-ферригем (Ре+2/Ре+3) в пероксидазе значительно ниже, чем потенциалы других гемсодержащих белков и составляет

-0,49 В при рН = 7 (Определен в объеме раствора потенциометрическим титрованием дитионитом натрия). Столь низкое значение редокс-потенциала может объясняться стабилизацией окисленного состояния железа в геме за счет особенностей комплексообразования и подробно рассмотрено в [28].

При реакции пероксидазы с Н202 образуются спектрофотометрически различимые промежуточные соединения НЯР1 и НКРИ по схеме Чанса [28]

НКР + Н202 —^НЯР1 + Н20 (1)

нш>1 + ДН -^НКРИ + Д (2)

ШРП + ДН —+ д + н2о (3)

где ДН - донор водорода и электрона. Соединения НКР1 и НИРИ являются не фермент-субстратными комплексами, а продуктами окисления фермента Н202. Скорость реакции подавляющего большинства субстратов с соединением НЕРП существенно (в 50-100 раз) ниже, чем с соединением ЕЖР1. Соединение НЕРП содержит окислительный эквивалент на железе (железо Ре( I v)), находящийся в плоскости порфиринового кольца. Соединение 1ЖР1 содержит, помимо этого, еще один окислительный эквивалент, локализация которого не вполне ясна: в частности, высказано предположение о наличии в геме 71- катион радикала (из порфиринового цикла удален один 71-электрон).

Величины нормальных окислительно-восстановительных потенциалов Е0 для редокс - пар НКР1/НКРП и НИРП/НИР измерены из равновесных данных методом потенциометрического титрования в объеме раствора. При рН =6,53 величины Ео составляют 0,74 и 0,72 В для редокс-систем НКРИ/ШР и ШР1/НЯРП соответственно [28].

К настоящему моменту общепризнанно, что двухстадийное восстановление пероксидазы по вышеприведённой схеме справедливо для большинства реакций с участием органических, как правило ароматических донор-

ных субстратов (фенолы, хиноны, ароматические амины, анилины и т.д.). Некоторые неорганические субстраты (I" - ион, HSO3" - ион) способны восстанавливать промежуточное соединение HRPI до нативной HRP в одну двухэлектронную стадию.

Пероксидаза также обладает и оксидазной функцией, т.е. способна катализировать окисление некоторых соединений (к примеру, индолил-уксусная кислота, гормон роста растений) кислородом воздуха. В ходе реакции образуется промежуточное соединение HRPIII (комплекс ферроперокси-дазы с кислородом). Механизм оксидазной реакции, согласно [30], зависит от типа субстрата, соотношения концентраций фермента и субстрата и концентрации кислорода.

3.2. Биоэлектрокатализ пероксидазой на твердых электродах.

Как уже указывалось выше, эффект прямого (безмедиаторного) электровосстановления пероксида водорода пероксидазой, иммобилизованной на поверхности сажевого электрода был впервые описан в 1978 году в работе Ярополова с сотр. [15]. В присутствии Н202 на электроде устанавливался стационарный потенциал 0,7 В (рН=5). При добавлениии фенилгидразина (вещества, вызывающего необратимую инактивацию фермента) ток уменьшался почти на порядок.

Увеличение тока восстановления Н202 и органических перекисей было обнаружено также с пероксидазой из хрена, адсорбированной на спектрально чистом графите, пастовых углеродных электродах и углеродных микроэлектродах [31-34,81], с грибной пероксидазой на графите [35]. В последнем случае за счет более высокой активности пероксидазы из грибов стационарный потенциал на углеродном электроде достигал 0,975 В при рН=4,5 (оптимум ферментативной активности). Авторы данной работы отмечают, что полученная величина близка к редокс-потенциалу соединений

НЕШ/НКРП и ИКРИ/ГОР в объёме раствора. В работе [31] указывается на увеличение тока восстановления пероксида водорода на ферментном электроде после предварительной температурной предобработки углеродного носителя (предположительно, за счет увеличения концентрации поверхностных карбоксильных групп, по которым происходит привязывание молекул фермента).

При адсорбции пероксидазы на электроды из органических металлов (тетрацианохинодиметан и его аналоги) восстановление Н202 начинается при потенциалах отрицательнее 0,25 В [38]. Электрод действует в кинетическом режиме даже в области предельного тока, поскольку его величина не зависит от скорости вращения дискового электрода, а кажущаяся константа Миха-элиса близка к аналогичному параметру для гомогенного фермента.

Электрокаталитическая активность в реакции восстановления пероксида водорода была также обнаружена для пероксидазы, иммобилизованной в электропроводящие полимеры: поли(о-фени лен диамин) на Р1 электроде [39], полипиррол на 8пОг [40] , полианилин на Р1 и стеклоуглеродном электродах [41]. Также были исследованы так называемые "проводящие" системы, в которых фермент был ковалентно связан с редокс-гидрогелем (например, осмий поливинилпиридин) [42]. Однако во всех исследованных системах нельзя исключать вероятность медиаторного процесса, поскольку циклическая полисопряженная структура электропроводящих полимеров во многом подобна структуре органических субстратов-восстановителей перок-сидазного катализа (см.главу 1). В большинстве процитированных выше работ делается упор на аналитическом применении пероксидазных электродов, авторы выделяют область линейной зависимости тока от концентрации пероксида водорода, указывают предел обнаружения и исследуют стабильность (зависимость тока восстановления Н2О2 от времени). Совместная иммобилизация пероксидазы с соответствующими оксидазами позволяет опре-

делять глюкозу, этиловый спирт и холестерин [31 -32]. Механизм реакции для фермента исследован в меньшей мере [36].

В случае углеродных электродов также нельзя исключить вероятность протекания реакции по медиаторному механизму, поскольку поверхность углеродного электрода может содержать ароматические кислородсодержащие группы, подобные по структуре органическим субстратам-восстановителям в пероксидазном биокатализе. [2,3,31]. В этой связи следует упомянуть работу [43], где обнаружен выраженный эффект ускорения реакции восстановления пероксида водорода пероксидазой, соиммобилизован-ной с коллоидным золотом. Реакция подавлялась специфическим ингибитором фермента азидом натрия. Здесь электрод не содержит каких либо групп, которые могли бы выступать в качестве медиатора, и доказательство наличия прямого биоэлектрокатализа можно считать достаточно убедительным.

3.3 Окислительно-восстановительные превращения пероксидазы на

электродах.

После адсорбции пероксидазы на амальгамированном золотом электроде на ЦВА наблюдается окислительно-восстановительный процесс [44]. Идентичный редокс-переход на ртути обнаружен с адсорбированным апо-ферментом. Полученные результаты позволяют авторам сделать вывод о том, что наблюдаемые редокс-превращения относятся к соединениям типа (К8)2Щ, образовавшимся в результате взаимодействия серосодержащих аминокислот белковой части фермента с поверхностью ртути. На пирогра-фитовом электроде зафиксирована редокс-активность только в области кислых и щелочных рН, где происходит денатурация пероксидазы на гемин и апофермент. Однако в работе [45] авторы наблюдали окислительно-восстановительные превращения пероксидазы, адсорбированной на пиро-

графите вблизи потенциала 0,2 В; причем данные редокс-превращения подавлялись специфическим ингибитором фермента азидом натрия.

Электрохимическое восстановление пероксидазы на золотых электродах, модифицированных различными виологенами, было изучено в [46]. На вольтамперных кривых наблюдаются слабо выраженные максимумы при потенциалах -0,5 - (-0,7) В (рН=7). Во время электролиза деаэрированного раствора фермента происходит изменение спектральных характеристик; полученный спектр наиболее близок к спектру комплекса НКРШ, который образуется в реакции ферропероксидазы с кислородом (см.главу 1). Авторы предполагают, что первоначально происходит восстановление ферриперок-сидазы до ферроформы с некоторым перенапряжением (редокс-потенциал в объеме раствора -0,49 В, см.главу 1), а затем образование комплекса с примесным количеством кислорода ввиду его большого сродства к восстановленному ферменту.

В тонкослойной спектроэлектрохимической ячейке были изучены электрохимические реакции пероксидазы на платиновом электроде [47]. На основании полученных спектральных данных авторы сделали вывод о том, что в деаэрированом растворе пероксидаза восстанавливается до ферроформы (отрицательнее -0,5 В), но реакция протекает с очень низкой скоростью. В присутствии кислорода, в зависимости от потенциала электрода, удается спектрально зафиксировать образование соединений НИРШ, НИРП, и НЯР1.

В последние годы появилась целая серия работ, посвященная иммобилизации белков на поверхности золотого электрода, модифицированной тио-лами. Выраженные, обратимые окислительно-восстановительные максимумы на вольтамперных кривых получены в растворе пероксидазы на золотом электроде, модифицированном тиолвиологеном [48]. Редокс-потенциал на электроде составляет -0,56 В и отвечает, по мнению авторов, восстановлению железа в активном центре до ферроформы. В работе отмечается моно-

слойный характер заполнения электродной поверхности. На золоте, модифицированном меркаптопропионовой кислотой, были зафиксированы два отчетливых окислительно-восстановительных перехода с редокс-потенциалами 0,19 В и 0,53 В (рН=7) адсорбционного характера [49]. Наблюдаемые превращения авторы приписывают редокс-переходам НЯР1/НЯР11 и НИРП/НЕР. Однако причины столь сильного катодного перенапряжения (окислительно-восстановительные потенциалы этих соединений в объеме раствора составляют 0,72-0,74 В) остаются для авторов не вполне понятными и будут являться предметом их дальнейшего изучения.

Таким образом можно считать установленным, что пероксидаза претерпевает окислительно-восстановительные превращения на модифицированных электродах. Что касается углеродных электродов, то этот вопрос требует дальнейшего прояснения.

4. Механизм биоэлектрокатализа.

Сам термин "прямой биоэлектрокатализ" был предложен в первых публикациях, посвященных безмедиаторному ускорению электрохимических процессов [11-15]. Правомочность использования данного понятия обосновывалась прежде всего тем фактом, что в присутствии иммобилизованных ферментов на электродах устанавливался потенциал, близкий к равновесному потенциалу катализируемой реакции. Так, на сажевом электроде с необратимо адсорбированной лакказой в атмосфере кислорода устанавливался стационарный потенциал 1,207 В (относительно обратимого водородного электрода в том же растворе), близкий к равновесному потенциалу системы 02/Н20 [12], а иммобилизация гидрогеназы приводила к установлению в атмосфере водорода равновесного потенциала системы Н/Н2. [14]. Кинетический анализ поляризационных кривых, изучение влияния ингиби-

торов фермента при различных потенциалах электрода, позволило детально исследовать механизм процесса (в частности, природу лимитирующей стадии в области малых и больших поляризаций для реакций, катализируемых лакказой и гидрогеназой [11,14]).

В работах, выполненных в последние годы [16-23,31- 43], авторы, как правило, ограничивались лишь констатацией роста тока окисления (восстановления) субстрата на электродах с иммобилизованным ферментом, а также указывали на тот факт, что зависимость тока от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, характерным для ферментативной кинетики. Анализ поляризационных кривых и величин стационарных потенциалов (или же потенциалов полуволны) в присутствии фермента, а также влияния ингибиторов и активаторов проводился достаточно редко.

О редокс-превращениях активных центров ферментов, ускоряющих электрохимические реакции, поначалу не сообщалось [11,13-15]. Лишь позже были обнаружены окислительно-восстановительные превращения адсорбированной на углеродном электроде лакказы [12] . Нет данных по окислительно-восстановительным превращениям тирозиназы и гидрогеназы. Несмотря на выраженный электрокаталитический эффект, редокс-переходы на углеродных материалах с адсорбированной пероксидазой не удалось обнаружить в работах [31,44], однако им противоречат данные работы [45]. Из этого, в принципе, можно было бы сделать вывод об отсутствии прямой корреляции между окислительно-восстановительными превращениями и электрокаталитическими свойствами фермента. Однако следует отметить, что отсутствие максимумов на циклических вольтамперных кривых может быть связано с недостаточной чувствительностью: низким соотношением сигнал: фон из-за большого размера ферментной глобулы (что приводит к малому количеству молекул на единице площади), а также большой величины

емкости и псевдоемкости углеродного электрода. В некоторых случаях (относящихся, в частности, к пероксидазе [47]) на ЦВА не наблюдаются выраженные максимумы, однако редокс- превращения удается зафиксировать при помощи спектроэлектрохимических измерений. И, наконец, можно еще раз обратить внимание на работы [16-23] : с 1989 года практически в любой публикации, дополняющей список электрокаталитически активных ферментов, также приводились и данные, свидетельствующие о прямом переносе электрона между электродом (как правило, углеродным) и активным центром фермента в отсутствие субстрата.

Анализ результатов электрохимических превращений белков, проведенный в монографии [4], позволил сделать вывод о том, что при глубине залегания активных центров менее 1,5 нм белки и ферменты окисляются и восстанавливаются прямым способом. Именно на такие расстояния, по мнению авторов, осуществляется эффективный туннельный перенос электрона. Возможность туннельного переноса электрона при ферментативном катализе электродных процессов была проанализирована лишь в двух достаточно старых публикациях [50,51 ]. При исследовании зависимости скорости переноса электрона от расстояния между оргметаллическим электродом (тетрацианохинодиметан) и активным центром пероксидазы (которое варьировали с помощью прослойки холестерина, предварительно адсорбированной на электрод), был сделан вывод о том, что при расстоянии меньше 0,76 нм, скорость туннельного переноса электрона существенно превышает скорость ферментативной реакции [51]. При расстояниях, превышающих это значение, скорость туннелирования становится меньше скорости каталитической реакции, и эффективность переноса электрона экспоненциально уменьшается с увеличением расстояния.

5. Заключение

Как видно из представленного литературного обзора, перенос электрона между электродом и активным центром фермента (в отсутствие субстрата) является, по-видимому, необходимым условием для реализации прямого биоэлектрокатализа. Однако в большинстве случаев окислительно - восста-нови-тельные превращения редокс-ферментов на электроде (вблизи редокс-потенциала в объёме раствора) удаётся наблюдать для белков, содержащих по две-три простетические группы одновременно, и, как правило, для одной из этих групп. Для ферментов, содержащих одну простетическую группу, имеющиеся в литературе данные по электрохимическим реакциям на электродах немногочисленны.

Безмедиаторное восстановление (окисление) реализовано, как правило, на углеродных электродах, однако механизм этого процесса исследован детально только для реакции восстановления молекулярного кислорода лак-казой. Однако этого нельзя сказать в отношении чрезвычайно важной в практическом отношении реакции пероксидазного электрокатализа.

Также можно отметить всего несколько публикаций, авторы которых реализовали безмедиаторые электрокаталитические реакции для ферментов, встроенных в полимерные плёнки [26,39,40-41] и механизм процессов в таких композитных системах практически не изучен. Однако, как уже указывалось выше, данный метод иммобилизации окислительно-восстановительных ферментов может оказаться весьма перспективным.

Часть 2.

Объекты и методы экспериментального исследования.

Изучение электрохимических свойств пероксидазы и микроперо-ксидазы проводили на пирографитовом и сажевом (вращающемся и «плавающем» газодиффузионном) электродах. В работе были использованы метод циклической вольтамперометрии (ЦВА); потенциостатический и по-тенциодинамический методы регистрации поляризационных кривых. Выбор электродного материала и электрохимического метода предопределяла задача исследования. Абсорбционная спектрофотометрия на спектрофотометре 8РЕС(ЖЕ) ЦУ-У18 была использована для регистрации спектров пероксидазы и комплексов пероксидазы с пероксидом водорода, а также для определения адсорбционного заполнения пероксидазы (на поверхности сажи) по убыли концентрации фермента в объеме раствора.

1. Методы электрохимических измерений.

Метод циклической вольтамперометрии позволяет исследовать кинетику и механизм электрохимических превращений. Метод основан на непрерывном изменении потенциала Е по линейному закону от потенциала Е] до Е2 и обратно согласно простому уравнению: Е2 = Е1 ±у? , где V - скорость развертки потенциала, ? - время. Информацию о процессе получают, регистрируя зависимости I - Е, С2 - Е, 1-х, дМбх -Ее последующей их обработкой, где I - мгновенное значение тока, О1 - количество электричества, определяе-

Г2

мое как |Ит, где Т1 - время, соответствующее началу измерения Е, а т2 -

Г1

время, соответствующее текущему значению Е. Изменяя скорость наложе-

ния потенциала, амплитуду импульсов и другие экспериментальные условия можно получить необходимые сведения об электрохимическом процессе, протекающем на электроде. Количество электричества, пошедшее на окислительно-восстановительные превращения белковых молекул, определяли по площади под максимумами на ЦВА кривой.

Поляризационные кривые регистрировали в потенциодинамическом режиме (линейная развертка потенциала с низкой скоростью V = 0,5 - 1 мВ/с, при которой ток не зависит от скорости развёртки потенциала) или же в по-тенциостатическом режиме (скачкообразное изменение потенциала на 10-20 мВ с регистрацией тока через определенное время после спада тока заряжения); на стационарном или на вращающимся дисковом электроде, который использовали для создания контролируемых условий принудительной конвекции и преодоления диффузионных ограничений по подводу субстрата.

Установка для вращающегося дискового электрода была изготовлена в ИЭЛ РАН и позволяла регулировать скорость вращения электрода в диапазоне 650 - 3000 об/мин.

Установка для электрохимических исследований включала потенцио-стат ПИ-50-1 с программно-задающим устройством ПР-8, или же полярограф ПУ-1. Для регистрации медленных I, Е-кривых (у=1- 200 мВ/с) использовали двухкоординатный самопишущий потенциометр ПДА-1-А, быстрые кривые (у > 0,2 В/с) регистрировали на осциллографе С1 - 48Б.

2. Электроды и электродные материалы

В работе были использованы электроды из пирографита и сажи. Использовали пирографитовые электроды 3 видов:

1) Прямоугольная пластинка размером 1 х 0,5 см. Токоотводом служила платиновая проволока, поверхность которой изолировали парафином. Перед из-

мерением пирографитовые электроды кипятили в концентрированной щелочи, а затем многократно в бидистиллированной воде;

2) Пирографитовый стержень, впрессованный в тефлоновую втулку, с пружинным латунным токоподводом, соединенный с установкой для вращения электрода (диаметр электрода 5 мм) или же пирографитовый стержень, вставленный в стеклянную трубку и закреплённый с помощью химически стойкой эпоксидной смолы (диаметр торца рабочей поверхности составлял 2 мм).

3) Стеклоуглеродный стержень, запрессованный в тефлоновую втулку с латунным токоподводом (диаметр 4 мм).

Перед каждым опытом пирографитовый и стеклоуглеродный электроды последовательно зачищали на шероховатом стекле, полировали на тонкой шлифовальной бумаге, после чего обмывали бидистиллированной водой и рабочим раствором. Для получения электрохимически окисленного пи-рографита, если это не оговорено особо, электрод обрабатывали 1 мин. при потенциале 1,9 В, а затем 5 мин. при потенциале (-0,8) В.

Для приготовления вращающегося сажевого электрода ацетиленовую детонационную сажу АД-100 с удельной поверхности 100 м /г , наносили на поверхность пирографитового дискового электрода диаметром 2 мм (с помощью связующего) в количестве не более 1 мг в виде очень тонкого слоя (подпрессовывая вручную стеклянным шпателем). При этом предварительные ёмкостные измерения (по току заряжения на ЦВА) показали, что площадью пирографитового токоподвода, по сравнению с площадью сажевого носителя, можно пренебречь. Диаметр видимой поверхности такого электрода составлял 7 мм. В качестве связующего была использована фторопластовая эмульсия ФП-4Д (электрохимически инертная ), которую разбавляли в 200 раз и добавляли в количестве не более 10 мкл на 1 мг сажи. В предварительных экспериментах было показано, что увеличение количества

эмульсии (в расчете на единицу навески сажи) в несколько раз не приводит к уменьшению емкости сажевого электрода (т.е. эффектом блокировки поверхности компонентами фторопластовой эмульсии можно пренебречь). Подобный электрод использовали для изучения кинетики восстановления пе-роксида водорода на саже с адсорбированной пероксидазой.

"Плавающий" газодиффузионный электрод, использованный для изучения кинетики восстановления кислорода на ферментном электроде, представлял собой тонкий слой катализатора (сажа АД-100,чистая, или же про-мотированная ферментом), нанесённого на пористую гидрофобную электропроводную подложку [72,74]. Подложка представляла собой гидрофобизи-рованную сажу, полученную при высокотемпературной обработке ацетиленовой сажи со фторопластовой эмульсией [74]. Из гидрофобизированной сажи на лабораторном прессе прессовали таблетки, одновременно впрессовывая в них никелевый токоотвод. На готовый электрод, имеющий геометрическую поверхность 1 см , наносили сажу АД-100 - чистую, или же с предварительно адсорбированным ферментом. В предварительных экспериментах было показано, что ёмкость гидрофобизированной подложки (определённая по величине тока заряжения) составляет не более 5% от величины ёмкости навески сажи АД-100. Электрод помещали в объём ячейки таким образом, что гидрофобная подложка находилась в газовой фазе (воздух), а активный слой был погружен в электролит.

В работе были использованы стандартные трехэлектродные ячейки, изготовленные из молибденового стекла или из стекла «Пирекс» с разделением анодного и катодного пространства стеклянным шлифом.

Кислород

V V V V V

Активный слой

^Гидрофобная подложка

Электролит

Рис.3 "Плавающий" газодиффузионный электрод в растворе

В качестве электрода сравнения был использован насыщенный хлорсе-ребряный электрод, относительно которого приведены все значения потенциалов (если не оговорено особо). Платиновая пластинка была использована в качестве вспомогательного электрода. Все исследования были выполнены при комнатой температуре в растворах, деаэрированных аргоном (содержание кислорода не более 0,01%). Аргон очищали, пропуская через фильтр Петрянова. Эксперименты на плавающем газодиффузионном электроде были выполнены в атмосфере воздуха. Перед проведением измерений ячейки обрабатывали смесью концентрированной серной кислоты и перок-сида водорода, промывали многократно бидистиллированной водой и, непосредственно перед опытом, ополаскивали рабочим раствором.

3. Реагенты и рабочие растворы

В работе использовалась пероксидаза фирмы «Reneal» с Rz=0.6 и фирмы «Sigma» с Rz=2.0, микропероксидаза фирмы «Sigma», которые дополнительной очистке не подвергали. Для иммобилизации пероксидазы в полимерные плёнки был использован N-метилпиррол (Aldrich), перегнанный

при пониженном давлении, и 5% раствор Нафиона в алифатических спиртах (Пика), который дополнительной очистке не подвергали.

Особо чистый пероксид водорода (30 % водный раствор), был синтезирован в Институте общей и неорганической химии РАН. Концентрацию Н202 периодически контролировали титрованием 0,1 М раствором КМп04. Для приготовления фосфатно-щелочного буферного раствора применяли од-нозамещенный фосфат калия (КН2Р04) марки «ч», дважды перекристаллизованный из бидистиллата, или же марки «х.ч.» без дополнительной очистки; №ОН квалификации о.с.ч. Цианистый калий и фосфат аммония имели квалификацию «х.ч.». Бензотриазол был перекристаллизован из этилового спирта.

Все эксперименты, если это не оговорено особо, были выполнены в 0,1 М фосфатно-щелочном буферном растворе с рН=7. Меньшие или большие значения рН раствора регулировались добавлением необходимого количества Н3Р04 или №ОН соответственно. В опытах с электродом, покрытым пленкой электропропроводящего полимера полиметилпиррола или же композитной плёнкой полиметилпирол + пероксидаза, использовался буферный раствор, содержащий 0,1 М КаС104 (х.ч.).

4. Иммобилизация пероксидазы

Иммобилизацию пероксидазы на поверхности пирографитового и сажевого дискового электрода со связующим осуществляли адсорбционным способом. Фермент адсорбировали из раствора с концентрацией 4 мг/мл (10"4 М) в течение 1 часа. (В предварительных экспериментах было показано, что при этих условиях обеспечивается максимальная электрокаталитическая активность в реакции восстановления пероксида водорода). После адсорбции электроды тщательно обмывали рабочим раствором (фосфатно-

щелочной буферный раствор с рН=7). В экспериментах с микропероксидазой концентрация МП-11 в объеме раствора составляла 2,4* 10"4 М.

Катализатор для "плавающего" газодиффузионного электрода с различным заполнением адсорбированным ферментом, готовили выдерживая 10 мг сажи в 5 мл буферного раствора с концентрацией фермента

в течение суток при температуре 4° С. После адсорбции фермент отфильтровывали, осадок промывали (для удаления слабо адсорбированного белка), а затем высушивали на фильтре (при 4° С). Величину адсорбции прочно адсорбированным ферментом определяли спектрофотомет-рически по убыли фермента после иммобилизации из объёма раствора (с учётом промывных вод) при длине волны X = 403 нм.

Плёнку метилполипиррола и композитную плёнку метилполипиррол-пероксидаза синтезировали на поверхности полированного до зеркального блеска пирографитового электрода в условиях электрохимической полимеризации (в гальваностатическом режиме, если это не оговорено особо). Осаждение плёнки проводили из 0,1 М раствора N- метилпиррола в 0,1 М фосфатно-щелочном буферном растворе (рН=7), содержащем 0,1 М NaC104 (допирующий агент); при синтезе композитной плёнки раствор дополнительно содержал пероксидазу ( Sigma, Rz=2). Полимерное покрытие, если это не оговорено особо, осаждали анодным током 1=100 мкА в течение 2 мин (композитное покрытие осаждали из раствора с Chrp = 5*10"6 М). При анализе зависимости тока восстановления H202 от толщины композитной плёнки предполагали, что толщина плёнки пропорциональна количеству электричества, пропущенному при синтезе полимера. При определении толщины плёнки метилпиррола (не содержащей фермент) на основании литературных данных было принято [26], что при пропускании 1 Кл/см образуется плёнка толщиной 4 мкм.

Для приготовления композитной системы Нафион-пероксидаза к

80 мкл 10"4 М раствора пероксидазы в фосфатно-щелочном буферном растворе (рН=7) добавляли 20 мкл исходного 5% раствора Нафиона в алифатических спиртах, получая таким образом 1% эмульсию Нафиона в растворе фермента. Эмульсию перемешивали ультразвуковым генератором при частоте 8 кГц и мощности 15 Вт в течение 10 мин. Подобной же обработке подвергали в контрольных экспериментах 1% эмульсионный раствор Нафиона в буферном растворе, не содержащем пероксидазу и 10"4 М раствор фермента, не содержащий Нафион. После ультразвуковой обработки композитную смесь наносили на дисковый пирографитовый электрод диаметром 5 мм в количестве 2-20 мкл (после высыхания образовывалась полимерная плёнка). Плотность данного раствора полагали равной 1 г/см3 при расчёте количества Нафиона на электроде. Электрод после высыхания композита обмывали би-дистиллатом и погружали в ячейку.

Часть 3.

Экспериментальные результаты и их обсуждение.

Заключение диссертации по теме «Электрохимия», Фридман, Вадим Анатольевич

Выводы

1. Подробно изучены окислительно-восстановительные превращения пе-роксидазы и модели фермента - микропероксидазы (МП-11) на углеродном электроде. Редокс-переход пероксидазы вблизи потенциала 0,2 В (рН=-7), наблюдаемый также и для микропероксидазы, подавляется при инактивации фермента избытком Н2О2. На основании полученных результатов, а также анализа кинетики окислительно-восстановительных реакций , можно сделать вывод о том, что данные редокс-превращения относятся к активному центру пероксидазы.

2. Исследована реакция восстановления пероксида водорода пероксида-зой, адсорбированной на сажевом и пирографитовом электродах. На основании анализа зависимости скорости реакции от концентрации субстрата при различных потенциалах, скорости вращения электрода, рН раствора; влияния ингибиторов и активаторов фермента сделано предположение о том, что механизм пероксидазного электрокатализа на углеродном материале подобен механизму ферментативного катализа. При этом в электрохимической системе электрод выполняет ту роль, которую в биохимических реакциях выполняет органический субстрат-восстановитель.

3. Показана возможность аналитического определения Р" и ОЧ" ионов по игибированию, а бензотриазола по активации электрокаталитического восстановления Н202. Ускорение реакции азотсодержащими нуклеофилами позволяет выдвинуть следующую гипотезу : фермент, катализирующий катодную реакцию пероксида водорода ориентирован к поверхности электрода тем участком белковой глобулы, по которому происходит связывание ароматических субстратов в ферментативном катализе.

4. В данной работе впервые обнаружен эффект ускорения реакции электровосстановления кислорода адсорбированой на саже пероксидазой в отсутствие медиатора. Увеличение тока востановления 02 на "плавающем" газодиффузионном ферментном электроде более чем вдвое, по сравнению с аналогичным электродом без фермента (в области кинетического контроля реакции), является доказательством наличия электрокаталитической окси-дазной функции пероксидазы.

5. Показано, что соиммобилизация пероксидазы с электропроводным полимером 1Ч-метилпирролом приводит к существенному увеличению электрокаталитической активности на композитных фермент-полимерных плёнках. Независимость тока восстановления от толщины подслоя метилпиррола является убедительным аргументом в пользу наличия непосредственного обмена электронами между электропроводным полимером и молекулами фермента.

6. Установлена возможность увеличения электрокаталитической активности пероксидазы в реакции восстановления Н202 в результате соиммоби-лизации фермента с неэлектропроводным катионообменым полимером На-фион.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Фридман, Вадим Анатольевич, 1999 год

Список литературы

1. В.А. Богдановская, М.Р. Тарасевич. Успехи биоэлектрокатализа. - В сб. Итоги науки и техники. Сер. Электрохимия, т.27. М.: ВИНИТИ, 1988. с. 111-157.

2. Тарасевич М.Р. Электрохимия углеродных материалов. М.: Наука, 1984, 250 с.

3. Ghindilis A.L., Atanasov P., Wilkins E. Enzyme-catalyzed direct electron transfer: fundamentals and analytical applications. - Electroanalysis, 1997, vol.9, p.661-674.

4. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биокатализ в электрохимии органических соединений.- Вильнюс: Мокслас, 1983, 168 с.

5. Богдановская В.А., Тарасевич М.Р. Перспективы развития электрохимических биосенсоров для экологии и медицины - Сенсорные системы., 1997, т.11, стр.483-493

6. Кулис Ю.Ю. Разумас В.Й. Биоамперометрия.- Вильнюс:Мокслас, 1986, 215 с.

7. Andrieux С.P., Audebert P. at all. Kinetic behavior of an amperometric biosensor made of a enzymatic carbon paste and a Nafion gel investigated by rotating electrode studies.- J.Electroanal.Chem., 1995, v.394, p.141-148.

8. Wang J., Wui H. Highly selective biosensing of glucose utilizing a glucose oxidase + rhodium + Nafion biocatalytic - electrocatalytic- permselective surface microstructure. - J.Electroanal.Chem., 1995, v.395, p.287-291.

9. Schuhmann W., Kranz C. at all. Conducting polymer-based amperometric enzyme electrodes. Toward the development of miniaturized reagentless biosensors. - Synthetic Metals, 1993, vol.61, p.31-35.

10. Barlett P.N. and Birkin P.R. The application of conducting polymers in biosensors.- Synthetic Metals, 1993, vol.61, p. 15-21.

11. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов А.И. Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы. - Докл.АН СССР, 1978, т.240, с.616-618.

12. Ярополов А И., Гиндилис A.J1. Связь между электрохимическими превращениями простетической группы и каталитической активностью лакказы - Электрохимия, 1985, т.21, стр.982-983.

13. Богдановская В.А., Гаврилова Е.Ф., и др. Биоэлектрокатализ. Использование о-дифенолоксидазы для ускорения реакции электровосстановления кислорода. - Электрохимия, 1980, т. 16, с. 1596-1599.

14. Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д. и др. Биоэлектрокатализ. Активация водородной реакции иммобилизованной гидрогеназой. - Электрохимия, 1980, т. 16, с.763-767.

15. Ярополов А.И., Маловик В., Варфоломеев С.Д., Березин И.В. Электровосстановление перекиси водорода на электроде с иммобилизованной перок-сидазой. - Докл. АН СССР, 1979, т.249, № 6, с. 1399-1401

16. Guo L.H., Hill Н.А.О., Lawrance G.A. and Sanghera G.S. Direct un-mediated electrochemistry of enzyme/? - cresolmethilhydroxylase. - J.Electroanal.Chem., 1989, vol.266, p.379-396.

17. Guo L.H., Hill H.A.O., Hopper D.J. at all. Direct voltammetry of the chromatium vinosum enzyme, sulfide:cytochrome С oxidoreductase

(flavocytochrome C552). - J.BioI.Chem., 1990, vol.265,p. 1958-1963.

18. Burrows A.L., Hill H.A.O. at all. Direct electrochemistry of the enzyme, methylamine dehydrogenase, from bacterium W3A1. - Eur.J.Biochem., 1991, vol.199, p.73-78.

19. Hirst J., Sucheta A. Ackrell B.C.A. and Armstrong F.A. Electrocatalytic voltammetry of succinate dehydrogenase: direct quantification of the catalytic

properties of a complex electron - transport enzyme. - J.Am.Chem.Soc., 1996, vol.118, p.5031-5038.

20. Sucheta A., Cammack R., Weiner J., Armstrong F.A. Reversible electrochemistry of fumarate reductase immobilized on an electrode surface. Direct voltammetric observations of redox centers and their participation in rapid catalytic electron transport - Biochemistry, 1993, vol.32, p.5455-5465.

21. Khan G.F., Shinohara H., Ikariyama Y. and Aizawa M. Electrochemical behavior of monolayer quinoprotein adsorbed on the electrode surface. -J.Electroanal.Chem., 1991, vol.315, p.263-273.

22. Ikeda T., Kobayashi D.and Matsushita F. Bioelectrocatalysis at electrodes coated with alcohol dehydrogenase. - J.Electroanal.Chem., 1993, vol.361, p.221-228.

23. Larsson T., Elmgrem M. at all. Electron transfer between cellobiose dehydrogenase and graphite electrodes. - Analytica Chimica Acta, 1996, vol.331, p. 207-215.

24. Rodrigues С. G., Wedd A.G. Electrochemistry of xanthine oxidase at glassy carbon and mercury electrodes. - J.Electroanal.Chem., 1991, vol.312, p. 131140.

25. Szucs A., Hitchens G.D. and Bockris J.О M. - Electrochemical reactions of glucose oxidase at graphite electrodes.- Bioelectrochem. Bioenerg., 1989, vol.21, p.133- 141.

26. de Taxis du Poet P., Miyamoto Sh., at all.- Direct electron transfer with glucose oxidase immobilized in an electropolymerized poly(N-methylpyrrole) film on a gold microelectrode - Analytica Chimica Acta, 1990, vol.235, p.255-263.

27. Атанасов П., Богдановская В.А., Илиев И., Тарасевич М. Р., Воробьев В.Г.- Окислительно-восстановительные реакции глюкозооксидазы на углеродных материалах - Электрохимия, 1989, т.25, вып.11, стр.1480 - 1486.

28. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применения. М.:МГУ, 1981, 92 с.

29. Газарян И.Г. Молекулярная и генетическая структура пероксидаз - В сб. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, т.36, М.:ВИНИТИ, 1992, с.28-54.

30. Ким Б.Б. Механизм действия пероксидазы - В сб. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, М.:ВИНИТИ, 1992, с. 126-141.

31. Gorton L., Jonsson-Petterson G. at all. Amperometric biosensors based on an apparent direct electron transfer between electrodes and immobilized peroxidases. - Analyst, 1992, vol.117, p. 123 5-1240.

32. Gorton L., Csoregi E. at all. Selective detection in flow analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes. -Analytica Chimica Acta, 1991, vol.250, p.203-248.

33. Wollenberger U., Wang J., Ozsoz M., Gonzalez-Romero E. Bulk modified enzyme electrodes for reagentless detection of peroxides. - Bioelectrochem. Bioenerg., 1991, vol.26, p.287-296.

34. Csoregi E., Gorton L., at all. Peroxidase-modified carbon fiber microelectrodes in flow-through detection of hydrogen peroxide and organic peroxides. - Anal. Chemistry, 1994, vol.66, p.3604-3610.

35. Kulys J., Schmid R.D. Mediatorless peroxidase electrode and preparation of bienzyme sensors. - Bioelectrochem. Bioenerg., 1990, vol.24, p.305-311.

36. Ruzgas Т., Gorton L., Emneus J., Marko-Varga G. Kinetic models of horseradish peroxidase action on a graphite electrode. - J. Electroanal.Chem., 1995, vol.391, p.41-49.

37. Ruzgas Т., Emneus J., Gorton L., Marko-Varga G. The development of a peroxidase biosensor for monitoring phenol and related aromatic compound. -Analytica Chimica Acta, 1995, vol.311, p.245-253.

38. Kulys J.J., Samalius A.S., Svirmickas G.J.S. Electron exchange between the enzyme active center and organic metal. - FEBS Letters, 1980, vol.l 14, p.7 - 10.

39. Deng Q., Dong Sh. Mediatorless hydrogen peroxide electrode based on horseradish peroxidase entrapped in poly(o-phenylenediamine). -J.Electroanal.Chem., 1994, vol.377, p. 191-195.

40. Tatsuma Т., Godaira M., Watanabe T. Peroxidase-incorporated polypyrrole membrane electrodes. - Anal. Chemistry, 1992, vol.64, p. 1183-1187.

41. Yang Y, Shaolin Mu. Bioelectrochemical responses of the poly aniline horseradish peroxidase electrodes. - J. Electroanal.Chem., 1997, vol.432, p.71-78.

42. Yang L., Janle E. at all. Applications of "Wired" peroxidase electrodes for peroxide determination in liquid chromatography coupled to oxidase immobilized enzyme reactors. - Anal.Chem., 1995, vol.34, p. 1326-1331.

43. Zhao J., Henkens R.W., J.Stonehuerner at all. Direct electron transfer at horseradish peroxidase-colloidal gold modified electrodes. -J.Electroanal.Chem., 1992, vol.327, p.109-119.

44. Yaropolov A.I., Tarasevich M.R., Varfolomeev S.D. Electrochemical properties of peroxidase.- Bioelectrochem.Bioenerg., 1978, vol.5, p.18-24.

45. В.А.Богдановская, Е.Г.Хорозова, В.Г. Воробьев, М.Р.Тарасевич, Г.И.Щерев. Ферментативные и электрохимические реакции с участием пе-роксидазы. - Электрохимия, 1988 т.26, вып.5, стр.573-576.

46. Разумас В.Й., Гудавичюс А.В., Кулис Ю.Ю. Кинетика восстановления пе-роксидазы на модифицированных электродах. - Электрохимия, 1986 т.23, вып. 1, стр. 136-141.

47. Durliat Н., Courteix A., Comtat М. Reactions of horseradish peroxidase on a platinum cathode. - Bioelectrochem.Bioenerg., 1989, vol.22, p. 197-209.

48. Li J., Yan J., Deng Q., Cheng G., Dong Sh. Viologen-thiol self-assembled monolayers for immobilized horseradish peroxidase at gold electrode surface. -Electrochimica Acta, 1997, vol.42, p.961-967.

49. Li J., Dong Sh. The electrochemical study of oxidation-reduction properties of horseradish peroxidase. - J.Electroanal.Chem., 1997, vol.431, p.19-22.

50. Ярополов А.И., Сухомлин Т.К., и др. О возможности туннельного переноса электрона при ферментативном катализе электродных процессов.-Докл.АН СССР, 1981, т.260, стр. 1192-1195.

51. Kulys J.J., Samalius A.S. Dependence of the effiency of bioelectrocatalytic processes on the electrode surface state.- Bioelectrochem. Bioenerg., 1984, vol.13, p.163-169.

52. Шеллер Ф., Кирштайн Д., и др. Ферменты в электрохимических биосенсорах. - Электрохимия, 1993, т.29, №12, стр. 1522-1527.

53. Kuznetsov A.M., Bogdanovskaya V.A., Tarasevich M.R., Gavrilova E.F. -The mechanism of cathode reduction of oxygen in a carbon carrier - laccase system -FEBS Letters, 1987, vol.215, p.219-222.

54. Ksenzhek O.S., Petrova S.A. Redox properties of ferriprotoporphyrin IX in aqueous solutions. - Bioelectrochem. Bioenerg., 1978, vol.5, p.661-670.

55. Kadish К. M., Jordan J. Electrode kinetics of heme and electron-transfer mechanism of heme and hemoproteins. - J.Electrochem.Soc., 1978, vol.125, p.1250-1257.

56. Lotzbeyer Т., Schuhmann W., Ludwig-Scmidt H. Direct electrocatalytical H202 reduction with hemin covalently immobilized at a monolayer-modified gold electrode. -J.Electroanal.Chem., 1995, vol.395, p.341-344.

57. Santucci R., Reinhard H., and Brunori M. Direct electrochemistry of the undecapeptide from cytochrome С (microperoxidase) at a glassy carbon electrode.- J.American.Chem.Soc.,1988, vol.110, p.8536-8537.

58. Razumas V., Kazlauskaite J., Ruzgas T., and Kulys J. Bioelectrochemistry of microperoxidases. - Bioelectrochem. Bioenerg., 1992, v.28, p. 159-176.

59. Lotzbeyer T., Schuhmann W., Schmidt H.L. Minizymes. A new strategy for the development of reagentless amperometric biosensors based on direct electron-transfer processes. - Bioelectrochem.Bioenerg., 1997, vol.42, p.1-6.

60. Lotzbeyer T., Schuhmann W., at all. Direct electron transfer between the covalently immobilized enzyme microperoxidase MP-11 and a cystamine-modified gold electrode.- J.Electroanal.Chem., 1994, vol.377, p.291-294.

61. Reinhammar B. The coordination chemistry of metalloenzymes/ Ed. Reiclel D. -New York, Marcel Dekker, 1983, p. 177-200.

62. Дамаскин Б.Б., Петрий О.А. Введение в электрохимическую кинетику -М: Высшая школа, 1983, с.З - 400.

63. Келети Т. Основы ферментативной кинетики - М.: Мир, 1990, 348 с.

64. Laviron Е. Voltammetric methods for study of adsorbed species. - In: Electroanalytical Chemistry/Ed. A.J. Bard. New York: Marcel Dekker, 1982, vol.12, p.53-157.

65. Armstrong F.A., Hill H.A.O., et all. Direct electrochemistry of redox proteins at pyrolytic graphite electrodes. - J.American.Chem.Soc., 1984, vol.106, p. 921 -923.

66. Ksenzhek O.S., Petrova S.A. Electrochemical properties of flavins in aqueous solutions. - Bioelectrochem.Bioenerg., 1983, vol.11, p. 105-127.

67. Bartlett P.N., Whitaker R.G. Electrochemical immobilisation of enzymes. Part II. Glucose oxidase immobilized in poly-N-methylpyrrole - J. Electroanal. Chem., vol.224, (1987), p.37 - 48.

68. Belanger D., Nadreau J., Fortier G. J. Electrochemistry of the polypyrrole glucose oxidase electrode. - J. Electroanal.Chem., vol.274 (1989), p.143-155.

69. G. Dryhurst, K. Kadish, F. Scheller and R. Renneberg. Biological Electrochemistry, vol.1, Academic Press, New York, 1982.

70. Богдановская В.А., Кузнецова JI.H., Тарасевич М.Р. - Биоэлектрокаталнз иммобилизованной пероксидазой: влияние степени заполнения поверхности сажи ферментом и состава композита фермент-нафион на активность в реакции восстановления Н2Ог. - Электрохимия, 1997, т.ЗЗ, с. 1140-1146.

71. Yaropolov A.I., Varfolomeev S.D., Berezin I.V. et all. FEBS Lett., 1976. Vol.71, p.306-308

72. Тарасевич M.P., Радюшкина K.A., Богдановская B.A. Электрохимия пор-фиринов - М. :Мир, 1991,311с.

73. Тарасевич М.Р., Орлов С.Б., Школьников Е.И. и др. Электрохимия полимеров - М.:Наука, 1990, 236 с.

74. Штейнберг Г.В., Кукушкина И.А., Багоцкий B.C., Тарасевич М.Р. // Исследование кинетики восстановления кислорода на дисперсных углеродных материалах. - Электрохимия, 1979. Т. 15, №4, с.527 - 532.

75. Ikaeda Т., Miyaoka S., Miki К. J. Electroanal.Chem., 1993, vol.352, p.267

76. Zhang J., Chi Q., Dong Sh., Wang E. In situ electrochemical scanning tunnelling microscopy investigation of structure for horseradish peroxidase and its electrocatalytic property. - Bioelectrochem.Bioenerg., 1996, vol.39, p.267-274.

77. Weber J., Kavan L. and Sticka M. Electrodes, modified by perfluoro ionexchange polymeric films prepared from aqueous solutions of Nafion and Tosflex. - J. Electroanal.Chem., 1993, vol.353, p.

78. CRC Handbook of chemistry and Physics/Ed. D.R. Lide, Amsterdam, 1992.

79. Bianko P., Haladjan J. Electrochemical behavior of redox proteins entrapped in Nafion films - Electroanalysis, 1994, vol.6, p.415 - 422.

80. Paddock R.M. and Bowden E.F. Electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide via direct electron transfer from pyrolytic graphite electrodes to irreversibly adsorbed cytochrome С peroxidase - J. Electroanal. Chem., 1989, vol.260, p. 487 - 494.

81. Iliev I., Kaisheva A., Gamburra S., Atanasov P., Ghindilis A. Bifunctional hydrogen peroxide electrode as an amperometric transduser for biosensors. - Sensors and Actuators (B : Chemical), 1997, vol. 43, 1997.

82. Bartlett P., Cooper J. A review of the immobilization of enzymes in electro-polymerized films. J. Electroanal. Chem., 1993, vol.362, p. 1-12.

83. Szucs A., Novak M. Stable and reversible electrochemistry of cytochrome C on bare electrodes - J. Electroanal. Chem., 1995, vol.383, p. 75 - 86.

84. Armstrong F.A., Bond A. M., Hill H.A.O., Psalti I.S.M. - J. Phys. Chem., 1989, vol.93, p.6485

85. Armstrong F.A., Hill H.A.O. and Oliver B.N. - J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1984, vol.103, p.976.

86. Bucki F.N., Bond A.,M. Interpretetion of the electrochemistry of cytochrome C at macro an micro sized carbon electrodes using a microscopic model based on a partially blocked surfase - J. Electroanal. Chem., 1991, vol.314, p.191-206.

87. Atta N., Marawi I., Petticrew K., Zimmer H. Electrochemistry and detection of organic and biological molecules at conducting polymer electrodes. - J. Electroanal. Chem., 1996, p. 47-56.

88. Skimmer N., Hall E. Investigation of the origin of the glucose response in a glucose oxidase/polyaniline system. - J. Electroanal. Chem., 1997, vol.420, p.179 - 188.

89. Heering H.A., Hagen W. R. Complex electrochemistry of flavodoxin at carbon-based electrodes: results from a combination of direct electron transfer, flavin-mediated electron transfer and comproportionation. - J. Electroanal. Chem., 1996, p.249 - 260.

90. Xue H., Mu Sh. Bioelectrochemical response of the polypyrrole xantine oxidase electrode. - J. Electroanal. Chem., 1995, vol.396, p.241-247.

91. Shaodun M., Jinqing K., Jianbing Z. - Bioelectrochemical responses of the polyaniline uricase electrode. - J. Electroanal. Chem., 1992, vol.334, p. 121-132.