Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Зайцев, Максим Геннадьевич

• Зайцев, Максим Геннадьевич
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Зайцев, Максим Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Методы определения содержания низших спиртов.

1.2. Общая концепция биосенсоров.

1.3. Метилотрофные дрожжи как биокатализаторы окисления спиртов

1.4. Биосенсоры на основе микробных клеток для определения спиртов.

1.5. Ферментативные методы анализа метанола и этанола.

1.5.1. Биохимические методы определения спиртов.

1.5.2. Ферментные биосенсоры с электрохимическим принципом детекции.

1.5.3. Биосенсоры с оптическим принципом регистрации сигнала.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Дрожжевые штаммы.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Индукция дрожжей на метаноле.

2.4. Изучение роста метилотрофных дрожжей.

2.5. Выделение фермента АО из метилотрофных дрожжей.

2.5.1. Разрушение клеток.

2.5.2. Ступенчатое высаливание.

2.5.3. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе.

2.5.4. Концентрирование АО.

2.6. Активность алкогольоксидазы.

2.7. Концентрация белка.

2.8. Иммобилизация биоматериала.

2.8.1. Иммобилизация АО с использованием бензохинона.

2.8.2. Иммобилизация АО с использованием ДЭАЭ-декстрана.

2.8.3. Иммобилизация дрожжевых клеток адсорбцией на стекловолоконные фильтры ОБ/А.

2.8.4. Иммобилизация микроорганизмов с использованием ДЭАЭ-декстрана на нитроцеллюлозной мембране.

2.9. Биосенсорный анализ.

2.9.1. Кюветный формат проведения биосенсорного анализа.

2.9.2. Проточно - инжекционный формат проведения биосенсорного анализа.

2.10. Хроматографическое определение содержания спиртов.

2.11. Моделирование процесса спиртового брожения.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Биотехнологические аспекты получения биомассы метилотрофных дрожжей для выделения алкогольоксидазы.

3.1.1. Выделение алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей.

3.1.1.1. Очистка препарата АО с использованием ионообменной хроматографии.

3.2. Выбор способа иммобилизации алкогольоксидазы при разработке биораспознающих элементов биосенсора.

3.3. Аналитические и метрологические характеристики биосенсоров на основе алкогольоксидазы.

3.3.1. Характеристики биосенсора на основе алкогольоксидазы в проточно-инжекционном формате анализа.

3.3.1.1. рН рабочего буферного раствора.

3.3.1.2. Операционная стабильность биорецепторных элементов биосенсора проточно-инжекционного типа.

3.3.1.3. Долговременная стабильность биорецептора.

3.3.1.4. Градуировочные зависимости биосенсора с биорецептором на основе алкогольоксидазы.

3.3.2. Сравнительный анализ функционирования биорецепторных элементов на основе выделенных дрожжевых алкоголъоксидаз коммерчески доступных препаратов.

3.3.3. Влияние формата проведения анализа на селективность биосенсорного определения низкомолекулярных спиртов.

3.4. Характеристики биосенсора на основе иммобилизованных метилотрофных дрожжей.

3.4.1. Выбор штамма метилотрофных дрожжей для разработки микробного биосенсора.

3.4.2. Аналитические характеристики биосенсора с рецепторным элементом на основе метилотрофных дрожжей, адсорбированных на стекловолоконном фильтре.

3.4.3. Биосенсор с рецепторным элементом на основе метилотрофных дрожжей, иммобилизованных с использованием ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллюлозной мембране.

3.4.4. Иммобилизация с использованием ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллюлозной мембране.

3.4.5. Субстратная специфичность метилотрофных дрожжей, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.

3.4.6. Градуировочные зависимости сенсора для определения содержания метанола и этанола.

3.4.7. Долговременная стабильность биорецептора на основе клеток, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.

3.5. Определение содержания этилового спирта в коммерческих образцах алкогольной продукции, с использованием разработанных биосенсорных систем.

3.6. определение содержания этилового спирта в полупродуктах процесса спиртового брожения.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов»

Экспресс-анализ содержания спиртов в спиртосодержащих жидкостях и ферментационных средах необходим при производстве и хранении вин, пива, осуществлении контроля биотехнологических процессов. Традиционно этанол в пищевой и водочной продукции определяют низкоселективными ареометрическим, пикнометрическим и рефрактометрическим методами. Для детекции микроколичеств спирта наиболее распространенными являются методы газо-жидкостной и газовой хроматографии, которые, несмотря на низкие пределы обнаружения, характеризуются сложностью оборудования, в некоторых случаях - пробоподготовки, а также длительность анализа.

Альтернативой хроматографическим, являются успешно применяемые ферментативные методы, имеющие высокую чувствительность и селективность. При разработке экспрессных методов биоанализа перспективным является использование биосенсоров, которые характеризуются доступностью, простотой аппаратурного и методического оформления, удовлетворительными уровнями чувствительности и избирательности, экспрессностью и экономичностью, а также возможностью миниатюризации. В последние годы разработке ферментных биосенсоров для экспресс-определения содержания спиртов посвящено значительное число публикаций, что свидетельствует об актуальности данного направления биоаналитической химии. Наибольшее развитие получили электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованного фермента алкогольоксидазы (АО) (КФ 1.1.3.13), принцип работы которых заключается в измерении концентрации кислорода или образующегося пероксида водорода в приэлектродном пространстве. Проводимые исследования направлены на разработку портативных биоаналитических устройств, совершенствование аналитических параметров биосенсоров.

Основным источником АО являются метилотрофные дрожжи, содержание фермента в которых может достигать 30-40 % от общего количества белков в клетке. В связи с этим, наряду с АО в качестве биокатализаторов при создании амперометрических биосенсоров возможно применение целых клетки микроорганизмов. Их использование имеет ряд преимуществ, к которым относятся технологически простая процедура изготовления биораспознающих элементов для биосенсора и существенное сокращение стоимости анализа.

Одной из важных проблем является мониторинг сточных вод спиртовых производств, которые характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, приводящих к гибели естественных экосистем вокруг таких предприятий. Для экспресс6 анализа сточных вод спиртовых производств целесообразно использовать целоклеточные биосенсоры, которые позволяют определять суммарное содержание легко утилизируемых соединений. Следует отметить, что биосенсоры,, предназначенные для экологического контроля стоков спиртовых заводов, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Поэтому создание биосенсорного анализатора со сменными биораспознающими элементами является актуальной задачей для данной технологической отрасли.

Несмотря на интенсивное развитие исследований в данной области существует необходимость решать некоторые научные и научно-технические проблемы, чтобы упростить и удешевить процедуру определения спиртов без потери точности и специфичности метода, а также обеспечить возможность их постоянного мониторинга в реальных объектах. Актуальными задачами при разработке биосенсоров для определения содержания низших спиртов, в частности, этилового, являются увеличение времени функционирования иммобилизованного биокатализатора в распознающих элементах биосенсора, повышение чувствительности и стабильности работы биосенсора, что, определяются стабильностью биорецепторного элемента. Решение описанных проблем может осуществляться, с одной стороны, выбором наиболее эффективных биокатализаторов - штаммов микроорганизмов или выделенных из них алкогольоксидаз, с другой стороны - разработкой новых методик иммобилизации биоматериала, обеспечивающих длительное время функционирование биосенсора при сохранении высокой активности биокатализатора.

Цель работы:

Разработка биотехнологических и химико-аналитических основ создания электрохимических биосенсоров на основе целых клеток метилотрофных дрожжей и выделенной из них алкогольоксидазы для определения содержания низших спиртов.

В рамках указанной цели решались следующие задачи:

1. На основе содержания белка и удельной активности алкогольоксидазы в биомассе метилотрофных дрожжей различных штаммов провести выбор наиболее эффективного источника для получения целевого фермента.

2. Получить биочувствительные элементы для модификации электрода электрохимических биосенсоров на основе иммобилизованных дрожжевой алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей.

3. Провести сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз.

4. Сравнить эксплуатационные и аналитические характеристики биосенсоров для определения содержания этанола в кюветном и проточно-инжекционном форматах анализа

5. Апробировать разработанные макеты электрохимических биосенсоров на спиртосодержащих образцах в сравнении с референтными методами.

Научная новизна

Разработаны способы получения чувствительных биораспознающих элементов сенсоров для определения содержания спиртов путем иммобилизации фермента алкогольоксидазы на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной бензохиноном или бензохиноном с ДЭАЭ-декстраном. Взаимодействие фермента с поверхностью обусловлено, в первом случае, образованием ковалентных связей между функциональными группами на поверхности белка, и, во втором случае, электростатическим взаимодействием отрицательно заряженной белковой молекулы фермента с положительно заряженной поверхностью мембраны

Впервые установлено, что возможно взаимодействие между положительно заряженной мембраной, модифицированной ДЭАЭ-декстраном, и поверхностью клеток метилотрофных дрожжей. Время функционирования полученных на основе такого взаимодействия гетерогенных биокатализаторов составляет 14 суток.

Впервые выполнен сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз. Выделенная из Н. ро1утогрИа ЫСУС 495 1п алкогольоксидаза характеризуется наибольшей удельной активностью (50 Е/мг), а биосенсор на ее основе характеризуется лучшими аналитическими параметрами. Выявлено, что чувствительность биораспознающих элементов, полученных иммобилизацией фермента на положительно заряженной мембране, в первую очередь, зависит от активности используемой алкогольоксидазы.

Сравнительный анализ эксплуатационных и аналитических характеристик биосенсорного определения содержания этанола двумя способами с применением кюветного и проточно-инжекционного макетов биосенсора показал, что проточно-инжекционный формат анализа позволяет повысить селективность, расширить линейный диапазон определения и снизить время единичного анализа.

Практическая значимость

Отработанная методика лабораторного выделения дрожжевой алкогольоксидазы с использованием полуавтоматической хроматографической установки может использоваться как основа при производстве дрожжевой алкогольоксидазы Н. ро1утогр/га КСУС 495 1п.

Разработанная методика иммобилизации биокатализатора (фермента алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей) на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной ДЭАЭ-декстраном, позволяет получать стабильные биочувствительные поверхности, которые можно использовать для тиражирования стандартных биораспознающих элементов сенсоров.

Разработаны и апробированы макеты биосенсора кюветного и проточно-инжекционного типа для определения содержания низших спиртов - метанола и этанола в водных средах. Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсора характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью и позволяет проводить мониторинг содержания спирта в процессе брожения, его остатков в барде, и выполнять анализы не только в специализированных лабораториях, что особенно важно при очистке сточных вод ферментационных производств.

Работа вносит практический вклад в разработку быстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяют в перспективе производить недорогие и эффективные анализаторы. Макеты биосенсоров могут быть использованы в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототипы опытных образцов приборов для серийного выпуска на базе гальванопотенциостатов, внесенных в Государственный реестр средств измерений.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Зайцев, Максим Геннадьевич

выводы

• Сравнительный анализ содержания белка и активности алкогольоксидазы в биомассе метилотрофных дрожжей: С. boidinii Y-2356, Р. augusta Y-2518, P.angusta Y-1397, Р. augusta Y-2559, H. polymorpha NCYC 495 ln. показал, что наиболее подходящим источником фермента являются дрожжи Н. polymorpha NCYC 4951п. Отработанная методика лабораторного выделения дрожжевой алкогольоксидазы с использованием полуавтоматической хроматографической установки может использоваться как основа при увеличении масштабов производства дрожжевой алкогольоксидазы Н. polymorpha NCYC 495 ln, необходимой для изготовления расходных материалов биосенсоров.

• Разработаны способы получения отличающихся высокой стабильностью и воспроизводимостью биочувствительных элементов сенсоров для определения содержания спиртов путем иммобилизации алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной бензохиноном и ДЭАЭ-декстраном. Установлено, что взаимодействие между модифицированной ДЭАЭ-декстраном положительно заряженной мембраной и поверхностью позволяет существенно увеличить время функционирования микробного сенсора.

• Выполнен сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз. Выделенная в работе из Н. polymorpha NCYC 495 ln алкогольоксидаза характеризуется наибольшей удельной активностью (50 Е/мг), а биораспознающий элемент на ее основе характеризуется наилучшими аналитическими параметрами.

• Разработаны и апробированы макеты биосенсора кюветного и проточно-инжекционного типа для определения содержания метанола и этанола в водных средах. Сравнение эксплуатационных и аналитических характеристик биосенсоров показало, что при проточно-инжекционном формате проведения анализа повышается селективность, расширяется линейный диапазон определения и снижается время единичного анализа.

• Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсоров характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью и позволяет проводить мониторинг содержания спирта в процессе брожения, а также его остатков в барде. Для определения содержания этилового спирта в спиртовой продукции целесообразно использовать ферментные и целоклеточные биораспознающие элементы, при этом селективность ферментных биосенсоров существенно выше.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Зайцев, Максим Геннадьевич, 2013 год

1. Patel, N.G. Screenprinted biosensors using different alcohol oxidases / N.G Patel,., S Meier,., K. Cammann, G.C. Chemnitius // Sensor Actuat. B:Chem. 2001. - V.75. -P.101-110

2. Сибирный, B.A. Современные методы анализа формальдегида, метанола и этанола с использованием микробных и ферментных систем. / В.А. Сибирный, М.В. Гончар, О. Б. Рябова, М.М. Майдан // Микробиол. журн. 2005. - Т. 67 - , С.85-110.

3. Решетилов, А.Н. Фоточувствительная ионселективная мембрана рецепторный элемент хемо- и биосенсора на основе полевого транзистора / А.Н. Решетилов, Н.Ф. Казанская, М.А. Маненкова // Доклады Академии Наук. - 1995. - Т. 341. -N 4. - С. 495-498.

4. Мизгунова, У. М. Ферментативные методы определения алифатических спиртов. / У. М. Мизгунова, Т. Н. Шеховцова, И. Ф. Долманова // Журнал аналитической химии. 1998. - Т. 53. - № 10. - С. 1014-1029.

5. Jain, N.C. Analysis of alcohol. II. A review of gas chromatographic methods. / N.C. Jain, R.H. Cravey//J. Chromatogr. Sci. 1972. - T. 10. - P. 263-267.

6. Tangerman, A. Highly sensitive gas chromatographic analysis of ethanol in whole blood, serum, urine, and fecal supernatants by the direct injection method. / A. Tangerman.//Clin. Chem. 1997.-V.43. - P. 1003-1009.

7. McCarver-May, D.G. An accurate, automated, simultaneous gas chromatographic headspace measurement of whole blood ethanol and acetaldehyde for human in vivo studies. / D.G. McCarver-May, L. Durisin // J. Anal. Toxicol. 1997. -V.21. PI 34141.

8. Apers, S. Quality control of liquid herbal drug preparations: ethanol content and test on methanol and 2-propanol. / S. Apers, E.V. Meenen, L. Pieters, A. Vlietinck // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. - V.33. - P.529-537.

9. Mendes, L.S. Determination of ethanol in fuel ethanol and beverages by Fourier transform (FT)-near infrared and FT-Raman spectrometries. / L.S. Mendes, F.C.C. Oliveira, P.A.Z. Suarez, J.C. Rubim. // Anal. Chim. Acta. 2003. -V.493. - P.219-231.

10. Tipparat, P. Determination of ethanol in liquor by near-infrared spectrophotometry with flow injection. / P. Tipparat, S. Lapanantnoppakhun, J. Jakmunee, K. Grudpan. // Talanta. -2001. -V.53. P. 1199-1204.

11. Tarnowski, D.J. Amperometric detection with membrane-based sampling for percentlevel determinations of ethanol. / D.J. Tarnowski, C. Korzeniewski. // Anal. Chim. Acta. 1996. -V.332. -P.l 11-121.

12. Mataix, E. Simultaneous determination of ethanol and glycerol in wines by a flow injection-pervaporation approach with in parallel photometric and fluorimetric• detection. / E. Mataix, M.D. Luque de Castro. // Talanta. 2000. - V.51. - P.489-496.

13. Солдатенков А.Т. Методы определения алкоголя в биологических жидкостях организма / А.Т. Солдатенков, И.А. Сытинский // Лаб. дело. 1994. - № 11. - С. 663-669.

14. Мясоедов Б.Ф. Химические сенсоры: возможности и перспективы / Б.Ф. Мясоедов, А.В. Давыдов // журн. аналит. химии. 1990. - №45. - С. 1259-1278.

15. Bonting S.L. Chemical sensors for space applications / S.L. Bonting // Adv. Space Biol. Med. 1992. - V.2. - P. 263-293.

16. Mandenius C.F. Electronic noses for bioreactor monitoring / C.F. Mandenius // Adv. Biochem. and Eng. Biotechnol. 2000. - V.66. - P. 65-82.

17. Belkin S. Microbial whole-cell sensing systems ofenvironmental pollutants / S. Belkin // Current Opinion in Microbiology. 2003. -V.6. - P.206-212.

18. Lei Y. Microbial biosensors. / Y. Lei, W. Chen, A. Mulchandani // Anal Chim Acta. -2006. -V.24. P.200-210.

19. Wilson G.S. Biosensors for real-time in vivo measurements. / G.S. Wilson, R. Gifford // Biosens Bioelectron. 2005. -V.20. - P.2388-2403.

20. Понаморева, O.H. Биосенсоры. Принципы функционирования и практическое применение / О.Н. Понаморева, А.Н. Решетилов, В.А. Алферов. Тула: Изд-во ТулГУ, 2007. - 255 с.

21. Byfield, М.Р. Biochemical aspects of biosensors. / M.P. Byfield, R. A. Abuknesha // Biosens Bioelectron. 1994. - V.9. - P.373-400.

22. Wilson, J.S. // Sensor Technology Handbook. / J.S. Wilson. Amsterdam/Boston: Elsevier, 2005. - 702p.

23. Amine, A. Enzyme inhibition-based biosensors for food safety and environmental monitoring. / A. Amine, H. Mohammadi, I. Bourais, G. Palleschi. // Biosens Bioelectron. -2006. -V.21. P. 1405-1428.

24. Kissinger, P.T. Biosensors-a perspective. / P.T. Kissinger. // Biosens Bioelectron. -2005. -V.20. -P.2512-2518.

25. Lazcka, O. Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors. / O. Lazcka, F.J. Del Campo, F. X. Munoz // Biosens Bioelectron. 2007. -V.22 -P.1205-17.

26. Patolsky, F. // Nanowire-based biosensors. / F. Patolsky, G. Zheng, C.M. Lieber // Anal Chem. 2006. - V.78 -. P.4260-4269.

27. D'Souza, S.F. Microbial biosensors. / S.F. D'Souza // Biosens Bioelectron. 2001. -V.16.-P.337-353.

28. Paul, D. Accessing microbial diversity for bioremediation and environmental restoration. / D. Paul, G. Pandey, J. Pandey, R.K. Jain // Trends Biotechnol. 2005. -V.23.- P.135-142.

29. Urgun-Demirtas, M. Use of genetically engineered microorganisms (GEMs) for the bioremediation of contaminants. / M. Urgun-Demirtas, B. Stark, K. Pagilla // Crit Rev Biotechnol. 2006,- V.26. - P.145-164.

30. Liang, S. Microbial biosensors: A review. / S. Liang, J. Wenzhao, H. Changjun, L.Yu // Biosensors and Bioelectronics. 2011. - V.26. -P.1788-1799.

31. Jones, J.G. Methanol oxidation and assimilation in Hansenula polymorpha. / J.G Jones, E. Bellion // Biochem. J. 1991. - V. 280. - P. 475-481.

32. Bystrykh, L. V. Alcohol oxidase of methylotrophic thermo- and acidotolant yeast Hansenula sp. / L. V. Bystrykh, J. Dvorakova, O. Volfova //Folia Microbol. 1989. -V.34. - №1. - P.233-237.

33. Павлишко, Г.Н. Алкогольоксидаза и ее биоаналитическое применение / Г.Н. Павлишко, Г.З. Гайда, М.В. Гончар // Вестник. Львов УН-ТУ. Биологическая серия. 2004. - Т. 35. - С.3-22.

34. Suiter, G. Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts / G. Suiter, W. Harder, M. Veenhuis // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 11. - P. 285296.

35. Тернер, Э. Биосенсоры: основы и приложения. / Э.Тернер, И. Карубе, Д. Уилсон Москва: Изд-во Мир, 1992. - 614 с.

36. Ашин, В. В. // Образование и распределение модифицированного FAD между изоформами алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. / В. В. Ашин, Ю. А. Троценко //Биохимия. 1998. - №12. -С. 1654 - 1661.

37. Троценко, Ю.А. Аэробные метилотрофы -перспективные объекты современной биотехнологии / Ю.А. Троценко, М.Л. Торгонская // Journal of Siberian Federal University. Biology. 2012. V.5. -P: 243-279.

38. Bjerketorp, J. Advances in preservation methods: keeping biosensor microorganisms alive and active. / J. Bjerketorp, S. Hakansson, S. Belkin, J.K. Jansson. // Curr Opin Biotechnol. 2006. - V.17. - P.43-49.

39. D'Souza, S F. Immobilization and stabilization of biomaterials for biosensor applications. / S. F. D'Souza // Appl Biochem Biotechnol. 2001. -V.96. - P.225-238.

40. Ding, L. Trends in cell-based electrochemical biosensors. / L. Ding, D. Du, X. Zhang, H. Ju// Curr Med Chem. 2008. -У.15. - P.3160-3170.

41. Eggins, B.R. Chemical Sensors and Biosensors. / B.R. Eggins Chichester: John Wiley and sons, ltd, 2002. - 300p.

42. Xu, Z. Electrochemical biosensors based on advanced bioimmobilization matrices. / Z. Xu, X. Chen, S. Dong // TrAC Trends Anal Chem. 2006. -V.25. - P.899-908

43. Song, S. H. Novel hybrid immobilization of microorganisms and its applications to biological denitrification. / S. H. Song, S. S. Choi, K. Park, Y. Je. Yoo // Enzyme and Microbial Technology. -2005. -V.37. P. 567-573

44. Yu, D. Aqueous sol-gel encapsulation of genetically engineered Moraxella spp. cells for the detection of organophosphates. / D. Yu, J. Volponi, S. Chhabra, C.J. Brinker, A. Mulchandani, A.K. Singh // Biosens Bioelectron. 2005. - V.20. - P. 1433-1437.

45. Сафронова, О.Г. Тканевые и клеточные биосенсоры. Возможности клинического применения (обзор). / О.Г. Сафронова, В.И. Химченко, М.Б. Штарк // Медицинская техника. 1995. - № 6. - С. 39-46.

46. Coradin, Т. Sol-gel chemistry in medicinal science. / Т. Coradin, M. Boissiere, J. Livage. // Curr Med Chem. 2006. - V.13. - P.99-108.

47. Ahuja, T. Biomolecular immobilization on conducting polymers for biosensing applications. / T. Ahuja, LA. Mir, D. Kumar, Rajesh. // Biomaterials. 2007. - V.28. -P.791-805.

48. Malhotra, B.D. Prospects of conducting polymers in biosensors. / B.D. Malhotra, A. Chaubey, S.P. Singh. // Anal Chim Acta. 2006. -V.578. - P.59-74.

49. Aller, A.J. Live bacterial cells as analytical tools for speciation analysis: Hypothetical or practical?. / A.J. Aller, M.A. Castro // TrAC Trends Anal. Chem. 2006. - V.25. -P.887-898.

50. Borisov, S.M. Optical biosensors. / S.M. Borisov, O.S. Wolfbeis. // Chem Rev. -2008. -V.108. P:423-461.

51. Du, Z. A state of the art review on microbial fuel cells: A promising technology for wastewater treatment and bioenergy. / Z. Du, H. Li, T. Gu // Biotechnol Adv. 2007. -V.25. - P. 464-482.

52. Galluzzi, L. Whole cell strategies based on lux genes for high throughput applications toward new antimicrobials. / L. Galluzzi, M. Karp // Comb Chem High Throughput Screen. 2006. -V.9. - P.501-514.

53. Karube, I. Microbial sensor. /I. Karube // J Biotechnol. 1990. -V.l 5. - P.255-265.

54. Nakamura, H. Current research activity in biosensors. / H. Nakamura, I. Karube // Anal Bioanal Chem. 2003. - V.377. - P.446-468.

55. Rogers, K.R. Recent advances in biosensor techniques for environmental monitoring. / K.R. Rogers // Anal Chim Acta. 2006. -V.568. - P:222-231.

56. Ашин, В. В. Образование и распределение модифицированного FAD между изоформами алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. / В. В. Ашин, Ю.А. Троценко // Биохимия. 1998. - Т63. 12. -С.1654 - 1661.

57. Hikuma, M. Amperometric determination of acetic acid with immobilized Trichosporon brassicae. / M. Hikuma, T. Kubo, T. Yasuda // Analytica Chimica Acta. 1979. - V.109.-P. 33-38

58. Alkasrawi, M. A microbial biosensor based on Yarrowia lipolytica for the off-line determination of middle-chain alkanes. / M. Alkasrawi, R. Nandakumar, R. Margesin, F. Schinner, B. Mattiasson. // Biosens Bioelectron. 1999. - V.14. - P. 723-727.

59. Akyilmaz, E. // An amperometric microbial biosensor development based on Candida tropicalis yeast cells for sensitive determination of ethanol. / E. Akyilmaz, E. Dinfkaya. // Biosensors and Bioelectronics. 2005. - V.20. - P. 1263-1269

60. Tkac, J. Monitoring of ethanol during fermentation using a microbial biosensor with enhanced selectivity. / J. Tkac, I. Vostiar, P. Gemeiner, E. Sturdik. // Bioelectrochemistry. -2002. V.56. P. 127-129.

61. Alvarez-Icaza, M. Mass production of biosensors. / M. Alvarez-Icaza, U. Bilitewski // Analytical Chemistry. 1993,- V.65. - P.525-533.

62. Boguslavskii, L. Thin film bienzyme amperometric biosensor based on polymetric redox mediators with electrostatic bipolar protecting layer. / L. Boguslavskii, H. Kalash, Z. Xu et al. // Analytica Chimica Acta. 1995. - V.311. - P. 15-21.

63. Akyilmaz, E. A mushroom (Agaricus bisporus) tissue homogenate based alcohol oxidase electrode for alcohol determination in serum. / E. Akyilmaz, E. Dinckaya // Talanta. 2000. -. V.53. - P.505-509.

64. Guilbault, G.C. Handbook of Enzymatic Methods of Analysis. / G.C. Guilbault. New York: Marcel Dekker. 1976. 752p.

65. Корпан, Ю.И. Микробные биосенсоры: достижения, проблемы и перспективы. / Ю.И. Корпан, А.В. Ельская // Биохимия. 1995. -Т.60. - С.1517-1524.

66. Sherry. Mechanism of Action of Methanol Oxidase, Reconstitution of Methanol Oxidase With 5-Deazaflavin, and Inactivation of Methanol Oxidase by Cyclopropanol. / Sherry and Abeles // Biochemistry. 1985. - V.24. -P.2594-2605.

67. Sakai, Y. Biotechnological application of cellular functions of the methylotrophic yeast. / Y. Sakai, Y. Tani, N. Kato // J. Mol. Catalysis В Enzymatic. 1999. - V.6. P. 161 - 173.

68. Johnson, M. Positive selection of novel peroxisome biogenesis-defective mutants of the yeast Pichia pastoris / M. Johnson, H. Waterham, G. Ksheminska et al. // Genetics. 1999.- V.151.- P.1379-1391.

69. Hopkins, T. Biochemistry of alcohol oxidase. Microbial growth on CI compounds. Hopkins, Т., Muller F. Proc. 5th Intern. Symp. / Eds. H. van Verseveld & J. Duine. Dordrecht et al.: Martinus Nijhoff Publishers, 1987. P. 150-157.

70. Giles, H.G. A color test for methanol. / H.G. Giles, M. Hirst, E. Hoffmann,B.M. Kapur. // Clin Chem. 1993. - V.39. -P.693.

71. Azevedo, A.M. Operation and performance of analytical packed-bed reactors with an immobilised alcohol oxidase. / A.M. Azevedo, J.M.S. Cabral, T.D. Gibson, L.P. Fonseca. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2004. - V.28. - P45-53

72. Azevedo, A.M. Thermal and operational stabilities of Hansenula polymorpha alcohol oxidase. / A.M. Azevedo, J.M.S. Cabral, D.M.F. Prazeres, T.D. Gibson, L.P. Fonseca. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2004. - V.27. P.37-45.

73. Kiralp, S. Alcohol determination via covalent enzyme immobilization on magnetic beads. / S. Kiralp, A. Topcu, G. Bayramoglu, M. Anca, Yakup, L. Toppare. // Sensors and Actuators B: Chemical. 2008. - V.128. - P.521-528.

74. Yildiz, H.B. Biosensing approach for alcohol determination using immobilized alcohol oxidase. / H.B. Yildiz, L. Toppare. // Biosensors and Bioelectronics. 2006. -V.21. - P.2306-2310

75. Гончар, M.B. Кшыасний фотометричний анал1з етанолу з використанням очищено!" алкогольоксидази та мутантних юптин метилотрофних др1жд>юв. / М.В. Гончар, ЮЛ. Корпан, А.А. Сиб1рний // Укр. 6ioxiM. журн. 1991. - V.63. -С. 62-67.

76. Karyakin, А.А. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis. / A.A. Karyakin, E.E. Karyakina, L. Gordon. // Talanta. 1996. V.43. -, P.1597-1606.

77. Gibson, T. Extended shelf life of enzyme based biosensors using a novel stabilization system. / T. Gibson, J. Hulbert, S. Parker et.al // Biosens. Bioelectron. 1992. - V.7. -P. 107-708.

78. Lubrano, G.J. Amperometric alcohol electrode with extended linearity and reduced interferences. / G.J. Lubrano, M.H. Faridnia, G. Palleschi, G.G. Guilbault //Anal. Biochem. 1991,-V. 198. - P.97-103.

79. Kunnecke, W. Development of a gas diffusion FIA system for on-line monitoring of ethanol. / W. Kunnecke, R.D. Schmid. //J Biotechnol. 1990,- V.14. - P.127-140.

80. Smutok, O. A reagentless bienzyme amperometric biosensor based on alcohol oxidase/peroxidase and an Os-complex modified electrodeposition paint. / O.

81. Smutok, B. Ngounou, H. Pavlishko, G. Gayda, M. Gonchar, W. Schuhmann, Sensors and Actuators B: Chemical. -2006. V.l 13,- P. 590-598.

82. Shkotova, L.V. Amperometric biosensor for ethanol analysis in wines and grape must during wine fermentation. / L.V. Shkotova, E.A. Slast'ia, T.A. Zhyliakova, , O.P. Soldatkin, W. Schuhmann, S.V. Dziadevych, UkrBiokhimZh. 2005. - V.77. - P.96-103

83. Wu, L. Amperometric sensor for ethanol based on one-step electropolymerization ofthion in e-carbon nanofiber nanocomposite containing alcohol oxidase. / L. Wu, M. Mcintosh, X. Zhang, H. Ju. // Talanta. -2007. V.74. - P.387-392.

84. Wu, L. Biofunctional nanocomposite of carbon nanofiber with water-solub leporphyrinforhighly sensitive ethanol biosensing. / L. Wu, J. Lei, X. Zhang, H. Ju. // Biosensors and Bioelectronics. 2008. - V.24. P.644-649

85. Wen, G.Application of a biosensor for monitoring of ethanol. / G. Wen, Y. Zhang, S. Shuang, C. Dong, M.M.F. Choi. // Biosensors and Bioelectronics. 2007. - V.23. P 121-129.

86. Guarna, M.M. On-line monitoring and control 'of methanol concentration in shake-flask cultures of Pichia pastoris. / M.M. Guarna, G.J. Lesnicki, B.M. Tarn et al. // Biotechnol. and Bioeng. 1997. - V.56. - P. 279-286.

87. Ramanavicius, A. Self-encapsulation of oxidases as a basic approach to tune the upper limit of amperometric biosensors. / A. Ramanavicius, A. Kausaite, A. Ramanaviciene. // Analyst. 2008. - V.133. - P.1083-1089.

88. Lapa, R.A.S. Development of a sequential injection analysis system for the simultaneous biosensing of glucose and ethanol in bioreactor fermentation. / R.A.S. Lapa, J.L.F.C. Lima, I.V.O.S. Pinto. // Food Chemistry. 2003. - V.81. - P.141-146.

89. Mitsubayashi, K. Optical bio-sniffer for ethanol vapor using an oxygen-sensitive optical fiber. / K. Mitsubayashi, T. Kon, Y. Hashimoto. // Biosensors and Bioelectronics. -2003. V.19.-P.193-198.

90. Mitsubayashi, K. Bioelectronic sniffers for ethanol and acetaldehyde in breath air after drinking. / K. Mitsubayashi, H. Matsunaga, G. Nishio, S. Toda, Y. Nakanishi. // Biosensors and Bioelectronics. -2005. V.20. - P.1573-1579.

91. Xie, X. A fluorescence-based fiber optic biosensor for the flow-injection analysis of penicillin. / X. Xie, A. A. Suleiman, G.G. Guilbault. // Biotechnol Bioeng. 1992. -V.39. -P.l 147-1150.

92. Гончар, M. В. Оксидазно-пероксидазный метод определения алкоголя с помощью отечественного набора "Алкотест" / М. В. Гончар. // Лабор. диагностика. 1999. -№.2. - С. 55-58.

93. Wu, X.J. On-line monitoring of methanol in n-hexane by an organic-phase alcohol biosensor. / X.J. Wu, M.M.F. Choi, C.S. Chen, X.M. Wu. // Biosensors and Bioelectronics. 2007. - V.22. - P.1337-1344.

94. Salm, H., Alcoholoxidase from Candida boidinii. / H. Salm, H. Schutte, M.R. Kula // Meth. Enzymol. 1992. - V.89. - P.424-428

95. Sekine Y., Suzuki M., Takeuchi Т., Tamiya E., Karube I. //Anal. chim. acta. 1993. V. 280. №2. P. 179-184.

96. Verma, // A sensitive spectrophotometric method for the determination of methyl alcohol in air and water. / P. Verma, V.K. Gupta.//Talanta. 1984,- V.31.- P.394-396.

97. Maguieira A., Luque de Castro M.D., Valcarcel M. // Microchem. J. 1987. V. 36. № 3. P. 309-315.

98. Mizgunova, U.M. Enzymic method for determination of ethanol and methanol with spectrophotometric detection of the rate of the process. / U.M. Mizgunova, G.A. Zolotova, I.F. Dolmanova//Analyst. 1996,- V.121. - P.431-433.

99. Gruzman, M.B. Multiple molecular forms of alcohol oxidase from the methylotrophic yeast Pichia methanolica. / M.B. Gruzman, V.I. Titorenko, V.V. Ashin, K.A. Lusta, and Y.A. Trotsenko. // Biochemistry (Moscow). 1996. - V.61. -P.1537-1544.

100. Справочник биохимика: Пер.с англ./Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991.

101. Яровенко, В.А. Технология спирта / B.JI. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов и др.; Под ред. проф. В. J1. Яровенко. -М.: Колос, «Колос Пресс», 2002. -580с.

102. Gvozdev, A.R. Purification and properties of alcohol oxidase from Pichia putida. / A.R. Gvozdev , I.A. Tukhvatullin, R.I. Gvozdev. // Biochemistry (Mosc). -2010. -V.75. -P.242-248.

103. Brandt, J. Covalent attachment of proteins to polysaccharide carriers by means of benzoquinone / J.Brandt, L.-O. Andersson, J.Porath //Biochim. Biophys. Acta. -1975. V.386. -P. 196-202

104. Akin, M. Alcohol biosensing by polyamidoamine (PAMAM)/cysteamine/alcohol oxidase-modified gold electrode. / M. Akin, M. Yuksel, C. Geyik, D. Odaci, A. at al // Biotechnol Prog. 2010. - V.26. -P.896-906.

105. Hasunuma, T. Real-time quantification of methanol in plants using a hybrid alcohol oxidase-peroxidase biosensor. / T. Hasunuma, S. Kuwabata, E. Fukusaki, A. Kobayashi. // Anal Chem. 2004. - V.76. -P. 1500-1506.

106. Гармаш, А.В. Метрологические основы аналитической химии. / А.В. Гармаш, Н.М. Сорокина. Москва: Московский государственный университет, 2005. - 34 с.

107. Azevedo, A. M. Ethanol biosensors based on alcohol oxidase. / A. M. Azevedo, D. Miguel, F. Prazeres, M.S. Soaquim, Cabral, L. P. Fonseca.// Biosensors and Bioelectronics.- 2005. -V.21. P. 235-247.

108. Kurganov B.I. Criterion for Hill equation validity for description of biosensor calibration curves. / B.I. Kurganov, A.V. Lobanov, I.A. Borisov, A.N. Reshetilov. // Analitica Chimica Acta. 2001. -V.427. P. 11-19.

109. Kato, N. Alcohol oxidases of Kloeckera sp. and Hansenula polymorpha catalytic properties and subunit structures /Kato, N., Omori, Y., Tani, Y., and Ogata, KJ/Eur. J.Biochem. -1976. V.64. -P.341-350.

110. Hnaien, M. A rapid and sensitive alcohol oxidase/catalase conductometric biosensor for alcohol determination. / M.Hnaien, F. Lagarde, N. Jaffrezic-Renault.// Talanta. 2010 V.81. -P.222-227.

111. Mltsubayashi, K. Gas-Phase Biosensor for Ethanol. / K. Mltsubayashi, K. Yokoyama, T. Takeuchl, and I. Karub.//Anal. Chem. 1994. -V.66. -P. 3291-3302

112. Калебина, T.C. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей / Т.С. Калебина, И.С. Кулаев И.С. // Успехи биологической химии. 2001. - т. 41. - с. 105—130.1. БЛАГОДАРНОСТИ

113. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям к.х.н., доц. Понаморевой Ольге Николаевне, к.х.н., проф. Алферову Валерию Анатольевичу и д.х.н., проф. Решетилову Анатолию Николаевичу.