Экспрессия молекулярно-биологических маркеров при немелкоклеточном раке легкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Степанова, Евгения Владиславовна

• Степанова, Евгения Владиславовна
• кандидат медицинских наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Степанова, Евгения Владиславовна

Список сокращений

Введение

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Молекулярно-биологические маркеры: понятие, роль в канцерогенезе.

Глава 2. Экспрессия молекулярно-биологических маркеров при раке легкого. Часть О. Результаты собственных исследований и нх обсуждение

Глава 1. Материалы и методы исследования

Глава 2. Экспрессия молекулярно-биологических маркеров 55 при НМРЛ

Глава 3. Клиническое значение определения молекулярно- 82 биологических маркеров при НМРЛ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия молекулярно-биологических маркеров при немелкоклеточном раке легкого»

Актулльмость темы

Для злокачественных опухолей легкого характерна стремительная прогрессия, агрессивное течение заболевания и низкая выживаемость больных. Совокупная статистика данных многочисленных авторов показывает, что, несмотря на совершенствование хирургического метода, 5-летний срок в целом переживают 20-30% радикально оперированных больных, и заметной тенденции к улучшению данных результатов не наблюдается. Общепризнанно, что основными факторами, влияющими на продолжительность жизни онкологических больных, являются распространенность опухоли и ее гистологическая структура. Однако, используя традиционные факторы прогноза, часто невозможно предсказать вероятность и сроки появления метастазов в каждом конкретном случае.

За последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, пути передачи сигнала от рецепторов в ядро и т.д. Оказалось, что изменения некоторых белков, участвующих в этих процессах, может приводить к трансформации клеток. Такие структурные и функциональные особенности, определяемые в опухолевой ткани, получили название молекулярно-биологических (молекулярных) маркеров опухолевого роста [Коган Е.А., 1992, 1997].

Одним из современных путей совершенствования прогнозирования течения рака легкого и оптимизации лечебной тактики является изучение присутствия молекулярно-биологических маркеров в ткани опухоли. Наличие/отсутствие в опухолевых клетках определенных маркеров может приводить к тому, что опухоли, сравнимые по распространенности (по классификации TNM), различаются по агрессивности течения заболевания.

Наиболее ранними событиями в процессах канцерогенеза и прогрессировании опухолей, являются нарушение механизмов пролиферации и апоптоза (программированной клеточной гибели) в опухолевых клетках.

Одним из методов определения пролиферативной активности (ПА) опухоли служит индекс Ki-67-положительных клеток. Ki-67 является негистонным белком, который обнаруживается в ядрах во время поздней Gi, S, G2, и М, но не в G0 фазе клеточного цикла [GerdesJ., 1984].

Ключевыми белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства Вс1-2 и супрессор опухолевого роста Р53.

Супрессор опухолевого роста, р53, известен как один из главных белков, регулирующий прохождение клеткой клеточного цикла. Активность р53 требуется для активации некоторых форм апоптоза, и его мутации могут быть ассоциированы с агрессивностью течения заболевания и устойчивостью опухолевых клеток к хнмио- или лучевой терапии. Мутации гена р53 - одни из самых распространенных нарушений, которые находят во всех типах опухолей человека [Greenblatt M.S., 1994].

Имеются данные, что трансмембранный белок HER2/neu с молекулярной массой 185 кД, являющийся аналогом рецептора фактора роста эпидермиса и обладающий тирозинкиназной активностью определяет прогноз, по крайней мере, в опухолях молочной железы и яичников.

Многие противоопухолевые агенты, включая цитотоксические препараты (ингибиторы топоизомераз 1 и 11 типа, ДНК-активные препараты, такие, как цисплатин), действуют, индуцируя апоптоз в клетках-мишенях [Dive С., 1991]. Было показано, что индукция апоптоза химиопрепаратами происходит через CD9S (Fas/APO-1) рецептор-лигандную систему [Friesen С., 1997]. Нарушение экспрессии CD9S рецептора в опухолевых клетках может приводить к их ускользанию от иммунологического ответа и блокированию запуска апоптоза, индуцированного химиотерапией.

Неоангиогенез или формирование новых микрососудов на основе уже существующей в ткани сети сосудов, является необходимым для роста опухоли и развития метастазов [Folkman J , 1997]. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, vascular endothelial growth factor), является главным фактором, индуцирующим образование новых сосудов в опухоли путем стимулирования деления и миграции эндотелиальных клеток близлежащих сосудов [Ferrara N., 1997]. Экспрессия VEGF в злокачественных опухолях ассоциирована с увеличением метастазирования, и укорочением безрецидивной выживаемости.

Однако до сих пор идентификация маркеров для более точного прогноза течения заболевания и определения адекватной терапии является еще открытой проблемой для больных раком легкого. Исследование прогностических маркеров в комплексе со всеми подходами, которые обычно доступны в клинической практике, в будущем поможет выбрать наиболее эффективные методы лекарственной терапии индивидуально для каждого больного.

Цель работы

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии некоторых молекулярно-биологических маркеров (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕ112/пеи, СШ5Ь и УЕОИ) при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и оценка возможности их индивидуального или комплексного использования для прогнозирования течения злокачественного процесса.

Задачи исследования

1. Исследовать экспрессию молекулярно-биологических маркеров (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕЯ2/пеи, С095Ь и УЕОР) в клетках НМРЛ различных гистологических типов с помощью иммуногистохимического метода.

2. Сопоставить результаты тестирования с традиционными клиническими и морфологическими характеристиками опухоли с целью оценки возможного влияния молекулярно-биологических маркеров на биологическое поведение опухоли.

3. Оценить возможную прогностическую значимость экспрессии молекулярно-биологических маркеров при НМРЛ.

Научная новизна

Была исследована панель молекулярно-биологических маркеров, связанных с пролиферацией, апоптозом и ангиогенезом (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕЯ2/пеи, СЭ95Ь и УЕвЕ), при НМРЛ. Изучены особенности экспрессии и взаимного влияния маркеров на прогрессию плоскоклеточного и аденогенного рака легкого. Проведен анализ наиболее информативных критериев прогноза течения заболевания и риска появления метастазов при НМРЛ различных типов. Впервые установлено, что совместная экспрессия р53 и УЕвР в опухолевой ткани имеет высокую прогностическую значимость для 5-летней безрецидивной выживаемости больных НМРЛ.

Научно-практическая значимость

Использование в патологоанатомической практике определения молекулярно-биологических маркеров позволит прогнозировать течение немелкоклеточного рака легкого при хирургическом лечении и химиотерапии. Оценка совместной экспрессии р53 и УЕвР при НМРЛ 1-И стадии имеет важное прогностическое значение для выделения группы повышенного риска метастазирования.

Разработаны и внедрены в медицинскую практику новые прогностические факторы НМРЛ, что содействует рациональному лечению больных.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Степанова, Евгения Владиславовна

выводы

1. Ядерное окрашивание антителами к р53 выявлено в 57% случаев НМРЛ и коррелировало с ухудшением 5-летней безрецидивной выживаемость больных. Локализация опухоли и степень ее дифференцировки не коррелируют с экспрессией р53.

2. Экспрессия Вс1-2 была обнаружена чаще при плоскоклеточном раке - 31 %, чем при аденокарциноме - 8 % случаев. Экспрессия Вах определена в 58% случаев аденокарциномы и в 22 % случаев плоскоклеточного рака легкого. Дисбаланс про- и антиапоптотических факторов в аденокарциноме и плоскоклеточном раком лекгого может свидетельствовать о различной роли Вс1-2 и Вах в патогенезе этих опухолей.

3. Пролиферативная активность плоскоклеточного рака была значительно выше, чем аденокарциномы (р<0,000001). Выявлен различный уровень регуляции пролиферативной активности при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого. При плоскоклеточном раке индекс Кь67 прямо коррелировал с экспрессией Вс1-2, а при аденокарциноме - с присутствием р53 и С095Ь.

4. Больные, имеющие метастазы в перибронхиальные лимфоузлы, имеют высокую частоту экспрессии УН С) К и СР95Ь в первичной опухоли по сравнению с больными, не имеющими метастазы в регионарные лимфоузлы.

5. Определение экспрессии р53 и VEGF может давать прогностическую при ранних стадиях (MI) немелкоклеточного рака легкого. Совместная экспрессия р53 и VEGF в опухолевой ткани является прогностическим критерием для 5-летней безрецидивной выживаемости больных HMPJI Г—II стадии. Группу повышенного риска метастазирования составляют p53+VEGF+ и низкого риска метастазирования - p53"VEGF" больные.

6. При плоскоклеточном раке легкого 1Б стадии больные с фенотипом p53*VEGF"Bcl-2+ имеют наиболее благоприятный прогноз (5-летняя безрецидивная выживаемость составила 100 %), группа p53VEGF+Bcl-2" имеет плохой прогноз (5-летняя безрецидивная выживаемость - 0 %).

7. Экспрессия Вах при Illa стадии аденокарциномы легкого предсказывала более благоприятный прогноз, чем при отсутствии экспрессии этого белка (медиана безрецидивной выживаемости составила 6 месяцев у Вах' и 36 месяцев у Вах+ больных; р<0,005).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для исследования возможной роли молекулярно-биологических маркеров в патогенезе НМРЛ и прогнозировании течения злокачественного процесса методами иммуногистохимии была изучена экспрессия р53, Bcl-2, Вах, CD95L, HER2/neu, VEGFa и пролиферативной активности (Ki-67 индекс). Исследование проводилось на парафиновых блоках плоскоклеточного РЛ T2N0M0 и аденокарциномы различной степени злокачественности (I-Illa стадии). Все больные были прослежены в течение 5 лет или до появления метастазов.

При исследовании выявлено окрашивание опухолевых ядер антителами к р53 в 57,4% случаев, тогда как нормальные клетки стромы и инфильтрирующие опухоль лимфоциты не окрашивались антителами к р53. Экспрессия р53 не ассоциировалась с какими-либо клинико-патологическими характеристиками опухоли (стадией, поражением лимфоузлов дифференцировкой, гистологическим типов опухоли, полом). Экспрессия р53 была не достоверно ниже при Ша стадии аденокарциномы, что может косвенно говорить о накоплении «нулевых» мутаций р53. Таким образом, оценка статуса р53 с помощью ИГХ может давать информацию о биологическом поведении опухоли только на ранних стадиях туморогенеза (стадии 1-Й).

Экспрессия Вс1-2 нами была обнаружена в 19% НМРЛ, значительно чаще при плоскоклеточном раке, чем при аденокарциноме (р=0,007). Экспрессия проапоптотического белка этого семейства - Вах определялась в 41% случаев НМРЛ, и была значительно выше в аденокарциномах, чем при эпидермоидном раке (р= 0,0002). Такой дисбаланс про- и антиапоптотических факторов в аденокарциноме и плоскоклеточном РЛ может свидетельствовать о различной роли Вс1-2 и Вах в патогенезе этих опухолей.

Экспрессия УЕОК - одного из основных стимуляторов ангиогенеза, была найдена в цитоплазме опухолевых клеток в 47% случаев НМРЛ. Экспрессия У!:ОР наблюдалась также на эндотелиальных клетках сосудов опухолевой ткани в 63% аденокарциномы и обратно коррелировала с присутствием УЕСП; на опухолевых клетках (р=0,04).

Повышенная экспрессия НЕК2/пеи на мембране опухолевых клеток выявлена в 21% случаев аденокарциномы и ассоциировалась с присутствием р53, с количеством р53 положительных клеток и интенсивностью окраски антителами к р53.

Синтез С0951, может использоваться опухолью для ускользания от иммунного ответа и способствовать метастазированию и лимфоузлы. Однако экспрессия СР95Ь опухолевыми клетками не является единственным и достаточным механизмом для ингибирования опухолью инфильтрирующих лимфоцитов.

Исследование показало, что пролиферативная активность плоскоклеточного рака была значительно выше, чем аденокарциномы (37% и 4,2%, соответственно). Статистический анализ выявил, что пролиферативная активность аденокарциномы и плоскоклеточного рака зависит от разных молекулярных маркеров. Так, ПА плоскоклеточного рака коррелировала с экспрессией Вс1-2 в опухолевой ткани, а в аденокарциноме - с присутствием р53 и CD95L (р=0,069).

Таким образом, подводя итог первой части исследования, нами была обнаружены различные нарушения экспрессии молекулярно-биологических маркеров при HMPJ1, и показано возможное участие Вс1-2 в прогрессировании плоскоклеточного рака легкого, а р53 и Вах - при аденокарциноме легкого.

Исследование прогностического значения маркеров при HMPJ1 показал, что экспрессии VEGF и р53 в опухолевой ткани может быть независимыми признаками укорочения безрецидивной выживаемости наряду с поражением регионарных лимфоузлов.

Многофакторный пропорциональный анализ Кокса показал, что VEGF и р53 являются независимыми маркерами БВ в группе больных I стадии. Другие показатели: пол, дифференцировка, кл инико-анатом ическая форма, распространенность опухоли, гистологическое строение, экспрессия Вс1-2, Вах и пролиферативная активность не оказывали значимого влияния на развитие отдаленных метастазов в нашем исследовании.

Экспрессия VEGF наблюдалась в 24% в группе без метастазов и в 68% в группе с метастазами. Медиана БВ в группе VEGF+ составила 18 месяцев, а в группе VEGF' больных медиана достигнута не была.

Экспрессию р53 также находят чаще в группе больных с появлением метастазов (р=0,007). Медиана БВ в группе без накопления р53 также не была достигнута, а в группе с накоплением р53 составила 21 месяц (р=0,01).

При плоскоклеточном раке легкого экспрессия Вс1-2 имеет сильную тенденцию к ассоциации с лучшим прогнозом (медиана не была достигнута в группе Вс1-2+, и составила 20,5 месяцев в группе Вс1-2; р=0,12), чего нельзя сказать об общей группе HMPJ1 и аденокарциноме.

При анализе группы больных аденокарциномой ШД стадии обнаружено, что больные с экспрессией Вах имеют лучший прогноз, чем без нее (р<0,001). Так, медиана БВ в группе Вах+ составила 36 месяцев, а в группе Вах - 6 месяцев.

Таким образом, опредление молекулярно-биологических маркеров при немелкоклеточном раке легкого может быть использовано для выделения группы больных с повышенным риском метастазирования (р53+УЕОР+ больные), которым показано назначение адъювантной химиотерапии даже при I стадии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Степанова, Евгения Владиславовна, 2002 год

1. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый ростобзор). //Биохимия 2000,65: 127-138.

2. Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е. Рак легкого. //Москва, «Радикс» 1994.

3. Зборовская И.Г., Татосян А.Г. Молекулярно-генетические маркерыпри раке легкого: онкогены и гены супрессоры. //Новое в терапии рака легкого. Под ред. Н.И.Переводчиковой.

4. Коган Е. Межклеточные взаимодействия при опухолевом росте. Вкн. «Межклеточные взаимодествия». //Москва, «Медицина», 1995. 127-189.

5. Коган Е.А., Жак Г., Кайзер У., Шилли М., Виттен А., Шурман М.,

6. Шерер А., Хавеманн К Иммуногистохимия биомолекулярных маркеров рака легкого. // Архив патологии 1997, 6: 23-30.

7. Коган Е.А., Мазуренко Н.Н., Юшков П.В. Тришкина Н.В., Киселев

8. Ф.Л. //Иммуногистохимия клеточных онкогенов при предраке и раке легкого. Архив патологии 1990, 3-11.

9. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевыхсупрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза (обзор). //Биохимия 2000, 65: 5-33.

10. Нормантович В.А. Рак легкого: тенденции в диагностики и лечении.

11. Русский медецинский жернал 1998, 6 №10: 635-642.

12. Павлов А.С., Пирогов А.И., Трахтенберг А.Х. //Лечение ракалегкого. Москва 1979.

13. Полоцкий Б.Е. Рак легкого. //Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Москва, 1995.

14. Руководство по иммуногистохимической даигностике опухолей человека. Под редакцией С.В.Петрова, Н^Г.Райхлина. //Казань, 2000.

15. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. //Биохимия 2000, 65: 112-126.

16. Трахтенберг А.Х., Самоходский Е.В. //Диагностика и лечение начального центрального рака легкого. Хирургия 1987,9: 54-59.

17. Харченко В.П., Кузьмин И В. Рак легкого. //М., Медицина, 1994.

18. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью (обзор). //Биохимия 2000, 65: 34-47.

19. Abu-Jawdeh GM., Faix JD., NilofT J., et al. Strong expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in ovarian borderline and malignant neoplasms. //Lab invest 1996, 74. 1105-1115.

20. Allred DC., Harvey JM„ Berardo M„ Clark GM. //Mod Pathol 1998 11: 155-168.

21. Anseletti CA„ Lucchi M., G.Fontanini, A.Mussi, A.Chella, A.Ribechini,

22. S.Vignati, G.Bevilacqua. Prognostic significance of tumoral angiogenesis in completely resected late stage lung carcinoma (stage IIIA-N2). //Cancer 78 (1996) 409-415

23. Apolinario R.M., P.van der Valk, J.S.de Jong, W.Deville, J.van Ark

24. Ashkenazi A., Dixit V.M. Apoptosis control by death and decoy receptors. //Curr Opin Cell Biol 1999, 11: 255-260.

25. Ashkenazi A., Dixit VM. Death receptors: Signaling and modulation. //Science 1998, 281: 1305-1308.

26. Ben-Ezra JM., Komstein MJ., Grimes MM., (Crystal G. Small cell carcinomas of the lung express the Bcl-2 protein. //Am J Pathol 1994 5: 1036-1040.

27. Bouck N. Stellmach V., Hsu SC. How tumors become angiogenic. //Adv Cancer Res 1996,69: 135-174.

28. Brambilla E . Gazzeri S., Moro D., et al. Immunohistochemical study of p53 in human lung carcinomas. //Am J Pathol 1993 143: 199-220.

29. Brambilla E., Nagoescu A., S.Gazzeri, S.Lantuejoul, D.Moro,

30. C.Brambilla, J-L Coll. Apoptosis-related factors p53, Bcl-2, and Bax in neuroendocrine lung tumors. //Am. J. Pathol. 149(1996) 1941-1952)

31. Brown LF., Gaudi AJ., Schnitt SJ., et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and vascular stroma formation in neoplasia: insights from in situ hibridisation studies. //J Histochem Cytochem 1998,46: 569-575.

32. Bull HA., Brickell PM., Dowd PM. Scr-related protein tyrosine kinases are physically associated with the surface antigen CD36 in human dermal microvascular endothelial cells. //FEBS Lett 1994, 351: 41-44.

33. Caamano J., Ruggeri B., Momiki S., Sickler A., Zhang SY., Klein-Szanto AJP. Detection of p53 in primaty lung tumors and non-small-cell lung carcinoma cell lines. //Amer J Pathol 1991, 139: 839-845.

34. Chambers AF., Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. //J Natl Cancer Inst 1997, 89: 12601270.

35. Chen Y, Sato M., Fujimura S., et al. Expression of Bcl-2, Bax and p53 proteins in cancerogenesis of squamous cell lung cancer. //Anticancer Res 1999,19: 1351-1356.

36. Cheng E.H.-Y., Kirsch D.G., R.J.Clem, R.Ravi, M.B.Kastan, S.Bedi,

37. K.Ucno, J. M. Hard wick Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases. //Science 278 (1997) 1966-1968.

38. Chinnaiyan AM., Prasad U., Shankar S., Hamstra DA.,Shanaiah M., Chenevert TL., Ross BD., Rehemtulla A. //Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:1754-1759.

39. Costa A., R.Silvestrini, C.Mochen, C.Lequagle, P.Borrachi, A.Faranda, G.Vessecchia, G.Ravasi. P53 expression, DNA ploidy and S-phase cell fraction in operaleble loccally advanced non-small-cell lung cancer. //Br.J. Cancer. 73 (1996) 914-919

40. Coussens LM., Werb Z. Matrix metalloproteinases and the development of cancer. //Chem Biol 1996, 3: 895-904

41. Craft PS., AL.Harris. Clinical prognostic significance of tumourangiogenesis. //Ann.Oncol.5 (1994) 305-311.

42. Dameron K., O.Volpert, M.Tainski, N.Bouck. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-l. //Science 265 (1994) 1582-1584.

43. Dameron KM., Volpert OV., Tainsky MA., Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-l. //Science 1994, 265: 1582-1584.

44. Dive C., Hickman JA. Drug-target interactions: only the first step in the commitment to a programmed cell death? //Br. J. Cancer 1991, 64: 192-196.

45. Dive C., Hickman JA. Drug-target interactions: only the first step in thecommitment to a programmed cell death? //Br. J. Cancer 64, 192-196 (1991).

46. Elstein K. H., et al. Factors affecting flow cytometric detection of apoptotic nuclei by DNA analysis. //Cytometry 21. 170-176 (1995)

47. Evan GE., Brown L„ Whyte M„ Harrington E. //Curr Opin Cell Biol 1995, 7. 825-834.

48. Fadok V. A., et al. Exposure of phosphotidylserin on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. //J. Immunol. 148. 2201-2216 (1992)

49. Fedi P., Tronick SR., Aaronson SA. Growth factors. In Cancer Medicine, JF. Holland, RC.Bast, DL.Morton, E.Frei, DW.Kufe, RR.Weichselbaum, eds. //(Baltimore, MD: Williams and Wilkins). 1997:41-65.

50. Finlay CA. P53 loss of function implications for the processes of immortalization and tumorigenesis VBioessays 1992, 14:557-560.

51. Foley KP, Eisenman RN. Two MAD tails: what the recent knockouts of Madl and Mxl tell us about the MYC/MAX/MAD network. //Biochem Biophys Acta 1999, 1423: M37-47.

52. Folkman J. Tumor angiogenesis. In Cancer Medicine, JF. Holland, RC.Bast, DL.Morton, E.Frei, DW.Kufe, RR.Weichselbaum, eds. //(Baltimore, MD: Williams and Wilkins). 1997: 181-204.

53. Fontanini G., D.Bigini, S.Vignati, F.Basolo, A.Mussi, M.Lucchi,

54. S.Chine, CA.Angeleti, AL.Harris, G.Bevilacqua. Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. //J. Pathol. 177(1995)57-63.

55. Fontanini G., S.Vignati, D.Vigini, A.Mussi, M.Lucchi, C.A.Angeletti,

56. F.Basolo, G.Bevilacqua. Bcl-2 protein: a prognostic factor inversely correlated to p53 in non-small-cell lung cancer. //Br. J. Cancer 71 (1995) 1003-1007.

57. Fontanini G.,Vignati S., Lucchi M , et al. Neoangiogenesis and p53 protein in lung cancer: their prognostic role and their relation with vascular endothelial growth factor (VEGF) expression. //Br J Cancer 1997, 75: 1295-1301.

58. Fraizier W., C.Prater, D.Jaye, M. Kösfeld. Interactions of thrombospondin with cells. Thrombospondins: biological function for structural motifs. In: J.Lahav (ed.), //Thrombospondin. CRC Press, Boca Raton, FL pp. 91-109 (1993)

59. Fukushige S., K.Matsubara, M-C.Yoshida et al. Localization of a novel v-erbB related gene, c-erbB-2, on human chromosome 17 and its amplification in a gastric cancer cell line. //Mol.Cell. Biol. 6 (1986) 955-958.

60. Fulda S.,et al. The CD95 (APO-l/Fas) system mediates drug-induced apoptosis in neuroblastoma cells. //Cancer Res. 57, 3823-3829 (1997)

61. G.Casey, M.E.Lopez, J.C.Ramos, S.J.Plummer, M.J.Arboleda,

62. M.Shaughnessy, B.Karl an, D.J.Slamon. DNA sequence analysis of exons 2 through 11 and immunohistochemical staining are required tod iect all known p53 alterations in human malignancies. //Oncogene 13 (1996) 1971-1981.

63. Gasparini G., Pozza F , Harris AL. Evaluating the usefulness of new prognostic and predictive indicators in node-negative breast cancer patients. Hi Natl Cancer Inst 1993, 85: 1206-1219.

64. Gazzeri S., Brambilla E., Caron de Fromentel C., Gouyer V., Moro D., Perron P., Berger F., Brambilla C. p53 genetic abnormalities and myc activation in human lung carcinoma. //Int J Cancer 1994, 58: 24-32.

65. Giatromanolaki A., M.Kuokuorakis, K.O'Byme, S.Fox, R.Whitehouse,

66. D.Talbot, AL.Harris, KC.Gatter. Angiogenesis is a significant prognostic marker in operable non-small cell lung cancer. //J. Pathol. 179(1995) 80-88.

67. Gibson SB., Oyer R., Spalding AC., Anderson SM., Johnson GL. //Mol Cell Biol 2000, 20: 205-212.

68. Golstein P. //Curr. Biol. 1997. 7: 27-59

69. Gorczyca W. et al. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. //Cancer Res. 53.3186-3192 (1993)

70. Graziano S. Non-small cell lung cancer: clinical value of new biologicalpredictors. //Lung Cancer 17 (1997) 37-58.

71. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. //Science 1998, 281:1309-1312.

72. Greenblatt M S., W.P.Bennett, MK.Hollstein, C.C.Harris. Mutations inthe p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. //Cancer Res. 54 (1994)4855-4878.

73. Hayflick L. Mortality and immortality at the cellular level. A review. //Biochemistry 1997, 62: 1180-1190.

74. Higashiyama M., O.Doi, K.kodama, H.Yokouchi, S.Nakamori,

75. R.Tateishi. bcl-2 oncoprotein in surgically resected nonsmall cell cancer: possibly favorable prognostic factor in association with low incidence of distant metastasis. //J.Surg.Oncol. 64 (1997) 48-54.

76. Hiyoshi H., Matsuno y., Kato H., Shimasato Y., Hirohashi S. Clinicopathological significance of nuclear accumulation of tumor-suppressor gene p53 product in primary lung cancer. //Jap J Cancer Res 1992, 83: 101-106.

77. Iggo R., Gatter K., Bartek J., Lane D., Harris AL. Increased expression o mutant forms of p53 oncogene in phimary lung cancer. //Lancet 1990, 335: 657-659.

78. Itoh N. et al. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis. //Cell 66, 233-243 (1991)

79. Itoh N„ Nagata S. A novel protein domain required for apoptosis: mutational analysis of human Fas antigen. Hi. Biol. Chem. 268, 10932-10937(1993)

80. Jiang S.X., T.Kameya, Y.Sato, N.Yanase, H.Yoshimura, T.Kodama.

81. Bcl-2 protein expression in lung cancer and close correlation with neuroendocrine differentiation. //Am.J.Pathol. 148 (1996) 837-846.

82. Jiang S.X., Y.Sato, S.Kuwao, T.Kameya. Expression of bcl-2 oncogeneprotein is prevalent in small cell carcinomas. //J Pathol 177 (1995) 135-138.

83. Johnson JP. Cell adhesion molecules of the immunoglobin supergene family and their role in malignant transformation and progression of metastatic disease. //Cancer Metastasis Rev 1991, 10: 11-22.

84. Kaiser U., M.Schilli, U.Haag, K.Neumann, H.Kreipe, E.Kogan,

85. K.Havemann. Expression of bcl-2-protein in small cell lung cancer. //Lung Cancer 15 (1996) 31-40.

86. Kalra R., AM.Jones, J.Kirk, GE.Adams, U.Stratford. The effect ofhipoxia on acquired drug resistance and response to epidermal growth factor in Chinese lung fibroblasts and human breast cancer cells in vivo. //Int J. Cancer 54 (1993) 650-655.

87. Kawai T., M.Suzuci, S.Kono, N.Shinomiya, M.,Rocutanda, K.Takagi, T.Ogata, S.Tamai. Proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in lung carcinoma. //Cancer 74 (1994) 2468-2475.

88. Kawai T., Suzuki M., Kono S., Shinomiya N., Rokutana m., Takagi K, Ogata T., Tamai S. Proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in lung carcinoma. Correlation with DNA flow cytometric analysis. //Cancer 1994, 74. 2468-2475.

89. Kawasaki M., Y.Nakanishi, J.Yatsunami, K.Takayama, S.Ochiai, P.Xinhai, K.Kuwano, N.Hara. p53 immunostaining predictive chemosensitivity in non-small cell lung cancer: a preliminary report. //Cancer J. Sci. Am. 4 (1996) 217.

90. Kawasaki M., Y.Nakanishi, J.Yatsunami, K.Takayama, S.Ochiai, P.Xinhai, K.Kuwano, N.Hara. p53 immunostaining predictive chemosensitivity in non-small cell lung cancer: a preliminary report. //Cancer J. Sci. Am. 4 (1996) 217.

91. Kawasaki M., Y.Nakanishi, K.Kuwano, K.Takayama, C.Kiyohara, N.Hara. Immunohistohemically detected p53 and P-glycoprotein predict the response to chemotherapy in lung cancer. //Eur.J.Cancer 9 (1998) 1352-1357.

92. Kern J A., R J.C.Slebos, B.Top, S.Rodenhuis, D.Ladger, R.A.Robinson,

93. D.Weiner, D.A.Schwartz. C-erbB-2 expression and codon 12 K-ras mutations both prdict shortened survival for patients with pulmonary adenocarcinomas. //J.Clin.Invest. 93 (1994) 516-520.

94. Keurbitz SJ., BS.Plunkett, WV.Walsh, MB.Kastan. Wild-type p53 is a cell cycle check-point determinant following irradiation. //Proc. Natl.Acad. Sei. USA 89 (1992) 7492-7496.

95. Kischkel F., et al. Cytotoxicity-dependent APO-l(Fas/CD95)-associated proteins from a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. //EMBO J. 14, 5579-5588 (1995)

96. Kishimoto Y., Murakami Y., Shiraishi M., Hayashi K., Sekiya T. Aberrations of the p53 tumor-suppressor gene in human non-small-cell carcinomas of the lung. //Cancer Res 1992, 53 : 4799-4804.

97. Kitagawa Y., F.Wong, P.Lo, M.Elliott, L.M.Verbürgt, J.C.Hogg, M.Daya. Overexpression of Bcl-2 and mutations in p53 and K-ras in resected human non-small cell lung cancers. //Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 15 (1996) 45-54.

98. Koomagi R., Volm M. Expression of Fas (CD95/APO-1) and Fas ligand in lung cancer, its prognostic and predictive relevance. //Int J Cancer 1999, 84(3): 239-243.

99. Koopman G., et al. AnnexinV for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression of B cell undergoing apoptosis. //Blood. 84. 1415-1420(1994)

100. Kubota Y„ RE.Petras, KA.Easley, TW.Bauer, RR.Tubbs, VW.Fazio. Ki-67-determined growth fraction versus standard staining and grading parameters in colorectal carcinoma: a multivariate analysis. //Cancer 70(1992) 2602-2609.

101. Lanny J., S.Lowe, E.Licitra, J.Liu, T.Jacks. p53-independent apoptosis induced by paclitaxel through an indirect mechanism. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 9679-9683.

102. Leech SH., Olie RA., Gautschi O , et al. Induction of apoptosis in lung-cancer cells following bcl-xL antisense treatment. //Int J Cancer 2000, 15:570-576.

103. Leedy DA., DR.Trune, JD. Kronz, N.Weidner, JI. Cohen. Tumorangiogenesis< the p53 antigen and cervical metastasis in squamous carcinoma. //Otolaringol. Head Neck Surg. 111 (1994) 417-422.

104. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. //Cell88(1997) 323-331.

105. Lotem J., Sachs L. Control of apoptosis in hematopoiesis and leukemia by cytokines, tumor suppressor and oncogenes. //Leukemia 1996, 10: 925-931.

106. Macchiarini P., G.Fontanini, MJ.Hardin, F.Squartini, CA.Angeletti.

107. Relation of neovascularisation to metastasis of small cell lung cancer. //Lancet 340(1992) 145-146.

108. Maclusky M, Baillie R, Chandrachud LM., Pendelton N., Schor AM. High levels of apoprosis are associated with impruved survival in non-small cell lung cancer. //Anticancer Res. 2000, 20: 2123-2128.

109. Mattern J., Koomagi R., Volm M. Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma. //Br.J.Cancer 73 (1996) 931-934.

110. Mattern J., Koomagi R., Volm M. Coexpression of VEGF and bFGF in human epidermoid lung carcinoma is associated with increase vessel density. //Anticancer Res. 17 (1997) 2249-2252.

111. McLaren R., Kuzu I., Dunnill M., Harris A., Lane D., Gatter KC. The relationship of p53 immunostaining to survival in carcinoma of the lung. //Br J Cancer 1992,66. 735-738.

112. Mekori Y. A., et al. IL-3 dependent murine mast cells undergo apoptosis on removal of 11-3. Prevention of apoptosis by c-kit ligand //J. Immunol. 151. 3775-3784(1993)

113. Micheau O., E.Solary, A.Hammann, F.Martin, M.T.Dimanche-Boitrel. Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs to fas-mediated cytotoxicity. //J.Natl.Cancer Inst. 89/11 (1997) 783-789

114. Micheau O., Solary E., Hammann A., Martin F., Dimanche-Boitrel M.T. Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs to fasmediated cytotoxicity. //J.Natl.Cancer Inst. 1997, 89/11: 783-789.

115. Mitsudomi T., Oyama T., Kusano T., Nakanishi R., Shirakusa T. Mutations of the p53 gene as predictor of poor prognosis in patients with non-small-cell lung cancer. Hi Natl Cancer Inst 1993, 85: 20182023.

116. Ohta Y., Y.Watanabe, S.Murakami, M.Oda, Y.Hayashi, A.Nonomura, Y.Endo, T.Sasaki. Vascular endothelial growth factor and lymph node metastisis in primary lung cancer. //Br.J.Cancer 76 (1997) 1041-1045.

117. Oshika Y., M.Nakamura, T.Tokunaga, Y.Fukushima, Y.Abe, Y.Ozeki, H.Tamaoki, Y.Ueyama. Multidrug resistance-associated protein and mutant p53 protein expression in non-small cell lung cancer. //Mod.Pathol. 11 (1998) 1059-1063.

118. Passlick B., Izbicki JR., Riethmuller G., et al. P53 in non-small cell lung cancer. //J Natl Cancer Inst 1994 86: 801-802.

119. Pepper MS., N.Ferrara, L.Orci, R.Montesano. Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro. //Biochem.Biophys.Res. Commun. 189 (1992) 824-831.

120. Perdomo JA., Y.Naomoto, M.Haisa, T.Fujiwara, M.Hamada, Y.Yasuoka, N.Tanaka. In vivo influence of p53 status on proliferation and chemoradiosensitivity in non-small-cell lung cancer. //J. Cancer Res. Clin. Oncol. 124 (1998) 10-18.

121. Pezzella F., H.Turley, I.Kuzu, M.F.Tungekar, M.S.Dunnil, C.B.Pierce, A.Harris, K.C.Gatter, D.Y.Mason, bcl-2 protein in non-small-cell lung carcinoma. //New Engl.J.Med. 329 (1993) 690-694.

122. Pittu RM., Marsters SA., Ruppert S., Donahue CJ., Moore A., Ashkenazi A. //J Biol Chem 1996, 271: 12687-12690.

123. Quinlan DC., Davidson AG., Summers CL„ Warden HE., Doshi HM. Accumulation of p53 protein correpates with a poor prognosis in human lung cancer. //Cancer Res 1992, 52. 4828-4831.

124. Rachwal W.J., P.F.Bongiomo, M.B.Orringer, R.l.Whyte, S P Ethier, D.G.Beer. Expression and activation of erbB-2 and epidermal growth factor receptor in lung adenocarcinomas. //Br.J.Cancer 72 (1995) 5664.

125. Rice GC., V.Ling, RT.Schimke. Frequencies of independent and simultaneous selection of Chines hamster cells for methotrexate and doxorubicin (adriamicin) resistance. //Proc. Natl. Acad Sci. USA 84 (1987) 9261-9264.

126. Scheurle D., Jahanzeb M., Aronsohn RS., Narayanan R. Her-2/neu expression in archival cell lung carcinomas using FDA-approved HercepTest. //Anticancer Res 2000, 20:3B 2091-2096.

127. Schneider P.M., M.-C.Hung, S.M.Chiocca, J.Manning, X.Zhao, K.Fang, J.A.Roth. Differential expression of the c-erb B-2 gene in human small cell and non-small cell lung cancer. //Cancer Res. 49 (1989) 4968-4971

128. Schwarting R. Little missed markers and Ki-67. //Lab. Invest. 68 (1993) 597-599.

129. Shi D„ He G„ Cao S„ Pan W„ H.Z.Zhang, D.Yu, M.C.Hung. Overexpression of the c-erb B-2/neu-encoded p 185 protein in primary lung cancer. //Mol.Carcinogen. 5 (1992) 213-218.

130. Shimasato Y. Pathology : Revised classification of epithelial tumors of the lung (WHO/IASLC). //In: Textbook of Lung Cancer. H.H.Hansen, ed. London, England, Martin Dunnitz, 2000, 125-140.

131. Simony J., J-L. Pujol, M.Radal, E.Ursule, F-B.Michel, H.Pujol. In situ evaluation of growth fraction determined by monoclonal antibody Ki-67 and ploidy in surgically resected non-small cell lung cancers. //Cancer Res. 30 (1990) 4382-4387.

132. Simony J., Pujol J-L., M.Radal, E.Ursule, F-B.Michel, H.Pujol. In situ evaluation of growth fraction determined by monoclonal antibody Ki-67 and ploidy in surgically resected non-small cell lung cancers. //Cancer Res. 50 (1990) 4382-4387.

133. Solary E., Micheau O., Dimanche-Boitrel M.T. Role of the Fas/Fas-L system in the immune response to tumors and the resistance to cytotoxic drugs. //Bulletin du Cancer 1998, 85/8: 685-694.

134. Sporm MB. The war on cancer.// Lancet 1996, 347: 1377-1381.

135. Suzuki H., Takahashi T., Kurioshi T., Suyama M., Ariyoshi Y., Ueda R. p53 mutations in non-small-call lung cancer in Japan: association between mutations and smoking. //Cancer Res 1992, 52: 734-736.

136. Takahashi T. et al. Swapping between Fas and G-CSF receptor. Hi. Biol. Chem., in press.

137. Takanami 1., T.lmamura, T.Hashizume, K.Kikachi, Y.Yamamoto, T.Yamamoto, S.Kodaira. //Immunohistochemical detection of basic fibroblast growth factor as prognostic indicator in pulmonary adenocarcinoma. Jpn.J.Clin.Oncol. 26 (1997) 293-297.

138. Tanaka F., Kawano Y., Li M., et al. Prognostic significance of apoptotic index in completely resected non-small cell lung cancer. //J Clin Oncol 1999, 17: 2728-2736.

139. Tateishi M., T.Ishida, T.Mitsudomi, S.Kaneko, K.Sugimachi. Prognostic value of c-erb B-2 protein expression in human lungadenocarcinoma and squamous cell carcinoma. //Eur.J.Cancer 27 (1991) 1372-1375.

140. Teitz T., Wei T., Valentine MB., Vanin EF., Grenet J., Valentine VA., Behm FG„ Look AT., Lahti AT., Kidd VJ. //Nature Med 2000, 6: 529535.

141. Tolsma S., O.Volpert, D.Good, W.Frazier, P.Polverini, N.Bouck. Peptides from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity. //J. Cell Biol. 122 (1993)497-511.

142. Top B., Mooi WJ, klaver SG„ Boerrigter L., Wisman P., Elbers H., Visser S., Rodenhuis S. Comparative analysis of p53 gene mutations and protein accumulation in human non-small-call lung cancer, //lnt J Cancer 1995, 64: 83-91.

143. Tugekar MF, KC.Gatter, MS.Dunnill, DY Mason. Ki-67 immunostaining and survival in operable lung cancer. //Histopathology 19(1991)545-550.

144. Volm M , Koomagi R. Relevance of proliferative and pro-apoptotic factors in non-small-cell lung cancer for patients survival. //Br J Cancer 2000, 82(10): 1747-1754.

145. Volm M., Koomagi R. The implication of proliferation and apoptosis for lung cancer metastasis. //Oncol rep 1999, 6(2). 373-376.

146. Volm M., R.Koomagi, J.Mattern, G.Stammler. Prognostic value basic fibroblast growth factor and its receptor (FGFR-1) in patients with non-small cell lung carcinomas. //Eur. I. Cancer 33 (1997) 691-693.

147. Volm M., R.Koomagi, J.Mattern. Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Fit-1 in squamous cell lung cancer. //Int.J.Cancer 74 (1997) 64-68.

148. Volm M., R.Koomagi. The implication of proliferation and apoptosis for lung cancer metastsisis. //Oncol. Rep. 2 (1999) 373-376

149. Walczak H„ Miller RE., Ariail K„ Gliniak B„ Griffith TS , Kubin M„ Chin W., Jones J., et al. //Nature Med 1999, 5: 157-163.

150. Walker C., Robertson L., Myskow M., Dixon G. Expression of the Bcl-2 protein in normal and displastic bronchial epitelium and lung carcinomas. //Br J Cancer 1995 1: 164- 169.

151. Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. //Am. J. Pathol. 147 (1995) 9-19.

152. Weidner N. Tumour angiogenesis: review of current applications in tumour prognostication. //Semin. Diagn. Pathol. 10 (1993) 302-313.

153. Weiner D.B., Nordberg J., Robinson R„ Nowell P C., A.Gazdar, M.I.Greene, W.V.Williams, J.A.Cohen, J.A.Kern. Expression of the neu gene-encoded protein (PISS1™) in human non-small cell carcinomas of the lung. //Cancer Res. 50 (1990) 421-425.

154. Yamaziki K., S.Abe, H.Takekawa, N.Sukoh, N.Watanabe, S.Ogura, I.Nakajima, H.Isobe, K.Inoue, Y Kawakami Tumor angiogenesis in human lung carcinoma. //Cancer 74 (1994) 2245-2250.

155. Yu D , Wang S.-S., Dulski K M., Tsai C.-M., G.L.Nicolson, M.-C.Hung. c-erbB-2/neu overexpression enhances metastatic potential of human lung cancer cells by induction of metastasis-associated properties. //Cancer Res.54 (1994) 3260-3266.

156. Zabrenetzky V., C.Harris, P.Steeg, D.Roberts. Expression of the extracellular matrix molecule thrombospondin inversely correlates with malignant progression in melanoma, lung and breast carcinoma cell lines. //Int.J.Cancer 59 (1994) 191-195.0