Экспрессия клонированного гена поверхностного антигена вируса гепатита в человеке в Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Козловская, Татьяна Минаевна

• Козловская, Татьяна Минаевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козловская, Татьяна Минаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Вирус гепатита В, его место в группе

HBV-подобиых вирусов (гепаднавирусов)

2. Структура HBV.II

2.1. Вирусные антигены .II

2.2. Структура геномной ДНК HBV.

3. Генноинженерный этап в изучении HBV.

3.1. Клонирование^, вирусной ДНК в бактериальных векторах

3.2. Первичная структура генома HBV.

4. Экспрессия гена HBsAg в бактериальных клетках

4.1. Структура HBsAg.

4.2. Иммунологические свойства HBsAg

4.3. Синтез HBsAg в бактериальных клетках

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Бактерии, плазмидные и фаговые вектора

2. Ферменты

3. Электрофорез ДНК.

4. Препаративное выделение плазмид

5. Отбор клонов, содержащих рекомбинантные ДНК

6. Скрининг рекомбинантных плазмид

7. Секвенирование ДНК.

8. Клонирование ДНК hbv.

8.1. Выделение частиц Дейна.

8.2. Получение ДНК hbv.

8.3. Клонирование ДНК hbv и отбор рекомбинантных клонов

9. Конструирование рекомбинантных плазмид

9.1. Рестрикция ДНК и выделение фрагментов

9.2. Выравнивание "липких" концов ДНК

9.3. Лигирование

9.4. Коннекторный способ конструирования рекомбинантных плазмид . ^

10. Определение бактериальных HBsAg-полипептидов методом конкурентной иммунопреципитации

11. Определение молекулярной массы бактериальных HBsAg-полипептидов иммунопреципитацией белка, меченого in vivo s-метионином

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование генома hbv.

2. Конструирование плазмид для экспрессии гена HBsAg в E.coli.

2.1. Конструирование вектора рТК

2.2. Конструирование плазмиды рСМ8, несущей гибридный ген cat-HBsAg

2.3. Конструирование плазмиды рСМ217, несущей Гибридный ген cat-HBsAg

2.4. Подстановка гибридных генов cat-HBsAg и cat-HBsAg204 под промотор триптофанового оперона E.coli

2.5. Конструирование плазмиды рКМЮ, несущей гибридный ген kan-HBsAg

2.6. Подстановка гибридного гена kan-HBsAg под промотор триптофанового оперона

E.coli 2.7. Конструирование плазмиды pLH12, несущей гибридный ген bla-HBsAg

2.8. Конструирование плазмид для прямой экспрессии гена HBsAg.

3. Иммунологическое определение синтеза

HBsAg в E.coli.

3.1. Определение экспрессии гена HBsAg в E.coli методом конкурентной иммунопреципитации

3.2. Определение экспрессии гена HBsAg в E.coli иммунопреципитацией меченого белка

3.3. Эффективность синтеза химерных белков, содержащих HBsAg

3.4. Эффективность прямой экспрессии гена

HBsAg в E.coli.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия клонированного гена поверхностного антигена вируса гепатита в человеке в Escherichia coli»

Гепатит В - тяжелое инфекционное заболевание человека. Этиологическим агентом, вызывающим его, является вирус гепатита В (HBV). Опасность инфекции усугубляется тем, что, помимо острого течения заболевания, не исключена возможность его перехода в хроническую форму с тяжелыми поражениями печени вплоть до цирроза. Кроме того, имеются данные, указывающие на наличие причинно-следственной связи между вирусной инфекцией и первичным раком печени (гепатоцеллюлярной карциномой).Распространенность этого заболевания, характеризующегося длительным периодом вирусоносительства, достаточно широка. Общее число вирусоносителей в мире достигает 170 млн. [l]. Основная роль в передаче гепатита В принадлежит различным парентеральным вмешательствам при проведении лечебно-диагностических процедур, что обусловлено спецификой распространения вируса, циркулирующего в крови больных и носителей. Помимо этого, серьезную опасность представляет также возможность вертикальной передачи вируса от матери к детям. В странах Западной Европы и Северной Америки число вирусоносителей на сегодняшний день составляет 0,1-1% населения. В СССР особенно неблагополучными в отношении гепатита В являются Казахстан, Средняя Азия и Закавказье, где число вирусоносителей колеблется от 3,8 до 6% населения [2].Не решена проблема гепатита В и в Латвийской ССР, в которой вирусоносительство оценивается в 1% общего числа жителей [З].Своевременное выявление больных и вирусоносителей, а также надежный контроль медицинских препаратов на основе крови - обязательные условия для успешной борьбы с HBV инфекцией, поэтому - 7 - • проблема диагностики гепатита В до сих пор является крайне актуальной, Надежным средством, полностью предотвращающим возможность заболевания, является вакцинирование, что показано на примере экспериментальных вакцин, созданных во Франции и США [4,5] .Основная трудность, как при разработке диагностикумов, так и в производстве вакцины, состоит в том, что единственным источником вируса была и остается плазма крови вирусоносителеи, поскольку пермиссивная система для эффективной репликации HBV до сих пор не найдена. По этой же причине до недавнего времени не было достаточных сведений о структуре вирусного генома, а репликация вируса и в настоящее время остается практически не изученной.Положение резко изменилось в связи с привлечением методов генетической инженерии к исследованиям круга проблем, связанных с вирусом гепатита В, Клонирование и секвенирование ДНК HBV привело к локализации^ генов известных к тому времени вирусных антигенов и, в первую очередь, гена поверхностного антигена (HBsAg) основного белка оболочки, ответственного за антигенные свойства вирусной частицы. Это позволило надеяться на создание массового источника HBsAg в результате высокоэффективной экспрессии гена HBsAg в гетерологичных системах - бактериях и дрожжах. В это время успешно решались проблемы экспрессии клонированных эукариотных генов в клетках прокариотов, в результате чего были созданы предпосылки для бактериального производства таких белков как инсулин, интерферон, гормон роста человека [б-9]. Однако, при экспрессии оболочечных генов вирусов в бактериях возникли существенные затруднения, связанные, вероятнее всего, со структурной организацией этих белков, отличающихся гидрофобностью и об- 8 разующих сложные мультимерные комплексы. Специальные приемы позволили, тем не менее, добиться высоких выходов белка оболочки вируса ящура [loj и гемагглютинина гриппа [lij • Очевидно, синтез подобных белков токсичен для Escherichia coli, ЧТО И стало причиной относительных неудач при экспрессии гена HBsAg в бактериальных клетках.Целью настоящей работы является подробное и систематическое исследование возможностей экспрессии гена HBsAg в бактериях.Для этого предпринято клонирование генома HBV с локализацией гена HBsAg и конструирование целого ряда плазмид для экспрессии последнего в E.coli. Экспрессия гена HBsAg осуществлялась, вопервых, путем создания гибридных генов: а) с полным геном HBsAg, но с различными по длине N-концевыми бактериальными участками ; б) с неполным, лишенным гидрофобной N-концевой части геном HBsAg, также с N-концевыми бактериальными участками различной длины.Во-вторых, сконструирована серия плазмид, отличающихся структурой участка инициации трансляции, для прямой экспрессии гена HBsAg. Выбор оптимальной конструкции как для прямой экспрессии гена, так и среди гибридных генов, помещенных под контроль различных по силе промоторов, производился с помощью специально разработанного радиоиммунологического метода, позволяющего количественно оценить синтез HBsAg-полипептидов бактериальной клеткой. Полученные результаты указывают на принципиальную осуществимость бактериального синтеза иммунологически активных вариантов HBsAg, которые могут быть использованы как в теоретическом плане - для изучения антигенной структуры белка, так и в прикладном - для иммунодиагностических целей и, возможно, для создания противогепатитной вакцины нового типа, ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР - 10

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Козловская, Татьяна Минаевна

выводы

1. Клонирован полный геном hbv, сходный с клонированной ранее ДНК hbv субтипа ayw, но не идентичный ей. Локализован ген HBsAg и разработана стратегия для его экспрессии в бактериях: прямой и в составе гибридных генов.

2. Осуществлена прямая экспрессия полной аминокислотной последовательности гена HBsAg в E.coli под контролем промотора триптофанового оперона (Ptrp) с образованием иммунологичес-ки активного продукта, соответствующего по молекулярной массе полипептиду Pi природного HBsAg.

Наиболее эффективный синтез HBsAg - 60000 молекул на клетку - обеспечивается конструкциями, в которых расстояние между последовательностью Шайна-Далгарно и инициирующим кодоном ATG составляет 12-14 нуклеотидов.

3. Осуществлена экспрессия гена HBsAg в составе гибридных генов: хлорамфениколацетилтрансфераза - HBsAg (cat-HBsAg

О Г\/ и cat-HBsAg ), аминоглюкозид-3'-фосфотрансфераза -HBsAg (kan-HBsAg226), В-лактамаза - HBsAg (bla-HBsAg204), отличающихся протяженностью бактериальной составляющей и наличием или отсутствием 22 аминокислот N-концевой последовательности HBsAg.

4. Максимальный уровень синтеза HBsAg-полипептидов - более 100 ООО молекул белка на клетку - показан в случае гена cat-HBsAg204 под контролем промотора триптофанового оперона. В целом по эффективности экспрессии рекомбинантные гены располагаются следующим образом: cat-HBsAg204 (Ptrp) >

HBsAg (Ptrp);>kan-HBsAg226 (Ptrp) > kan-HBsAg226 (Pkan) = = cat-HBsAg204 (Peat) = cat-HBsAg226 (Ptrp) > bla-HBsAg204 (Pbla) > cat-HBsAg226 (Peat).

5. Разработан простой количественный метод для определения HBsAg в бактериях и проведена сравнительная оценка уровня его синтеза, обеспечиваемого рекомбинантными генами под контролем различных бактериальных промоторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козловская, Татьяна Минаевна, 1984 год

1. Дейнхардт Ф., Гаст Н.Д. Вирусный гепатит. Бюлл. ВОЗ, 1982, № 5, 18-44.

2. Блюгер А.Ф. Вирусный гепатит. Рига: Звайгзне, 1978, с.41.

3. Голосова Т.В., Сомова А.В., Марголина А.Н., Власихина Е.М., Побединская И.Н. Современные аспекты профилактики постт-ранфузионного гепатита. В сб.: Вирусные гепатиты типов

4. А и В. Рига: Зинатне, 1983, с.49-59.

5. Vyas G.N. Molecular Immunology of the hepatitis В surface antigen (HBsAg). In: "Hepatitis В vaccine. Proc. Int. Symp., Paris, 8-9 Dec., 1980". Amsterdam e.a., 1981, 227-237.

6. Goeddel D.V., Heyneker H.L., Hozumi Т., Arentzen R., Itakura K., Yansura D.G., Ross M.J., Miozzari G., Crea R., Seeburg P.H. Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone. Nature, 1979, 281, 544-548.

7. Goeddel D.V., Kleid D.G., Bolivar F., Heyneker H.L., Yansura D.G., Crea R., Hirose Т., Kraszewski A., Itakura K., Riggs A. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc.Nat. Acad.Sci. USA, 1979, 76, 106-110.

8. Goeddel D.V., Sheppard H.M., Yelverton E., Leung D., Crea R. Synthesis of human fibroblast interferon by E.coli. Nucl.Acids.Res., 1980, 18, 4057-4073.

9. Kleid D.G., Yansura D., Small В., Dowbenko D., Moore D.M., Grubman M.J., McKercher P.D., Morgan D.0., Robertson B.H., Bachrach H.L. Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: responses in cattle and swine. -Science, 1981, 214, 1125-1129.

10. Davis A.R., Bos Т., Ueda M., Nayak D.P., Dowbenko D., Compans R.W. Immune response to human influenza virus hemagglutinin expressed in Escherichia coli. Gene, 1983, 21, 273-284.

11. Dane D.S., Cameron C.H., Briggs M. Virus-like particules in serum of patients with Australia antigen - associated hepatitis. - Lancet, 1970, 1, 695-698.

12. Marion P., Oshiro L.S., Regnery D.C., Scullard G.H., Robinson W.S. A virus of Beechey ground squirrels that is related to hepatitis B. virus of humans. Proc.Nat. Acad.Sci. USA, 1980, 77, 2941-2945.

13. Siddiqui A., Marion P.L., Robinson W.S. Ground squirrel hepatitis virus DNA: molecular cloning and comparisonwith hepatitis В virus DNA. J.Virol., 1981, 38, 393-397.

14. Gerlich W.H., Feitelson M.A., Marion P.L., Robinson W.S. Structural relationships between the surface antigens of ground squirrel hepatitis virus and human hepatitis В virus. J.Virol., 1980, 36, 787-795.

15. Summers J., Smolec J.M., Snyder R. A virus similar to hepatitis В virus associated with hepatitis and hepatoma in woodchucks. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1978, 75, 45334537.

16. Werner B.G., Smolec J.M., Snyder R., Summers J. Serological relationships of woodchuck hepatitis virus to human hepatitis В virus. J.Virol., 1979, 32, 314-322.

17. Mason W.S., Seal G., Summers J. Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis В virus. J.Virol., 1980, 36, 829-836.

18. Romet-Lemonne J.-L., McLane M.F., Elfassi E., Haseltine W.A. , Azocar J., Essex M. Hepatitis В virus infection in cultured human lymphoblastoid cells. Science, 1983, 221, 667-669.

19. Mason W.S., Aldrich C., Summers J., Taylor J.M. Asymmetric replication of duck hepatitis В virus DNA in liver cells: free minus-strand DNA. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1982, 79, 3997-4001.

20. Summers J.C., Mason W.S. Replication of the genome of a hepatitis B-like virus by reverse transcription of an RNA intermediate. Cell, 1982, 29, 403-415.

21. Toh H., Hayashida н., Miyata Т. Sequence homology between retroviral reverse transcriptase and putative polymerases of hepatitis В virus and cauliflower mosaic virus. Nature, 1983, 305, 827-829.

22. Siddiqui A. Hepatitis В virus DNA in Kaposi sarcoma. -Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1983, 80, 4861-4864.

23. McDonald M.I., Hamilton J.D., Durack D.T. Hapatitis В surface antigen could harbour the infective agent of AIDS. The Lancet, 1983, 2, 882-885.

24. Dreesman G.R., Hollinger F.B., Suriano J.R., Fujioka R.S., Brunschwig J.P., Helnick J.L. Biophysical and biochemical heterogeneity of purified hepatitis В antigen. J.Virol., 1972, 10, 469-476.

25. Soulier J., Courouce-Pauty A.M. New determinants of hepatitis В antigen (An оt HB Antigen). Vox Sang., 1973, 25, 212-234.

26. Courouce-Pauty A.M., Holland P.V., Muller J.Y., Soulier J.P. Bibl.Hematol., 1976, 42, 158.

27. Almeida J., Waterson A. Immune complexes in hepatitis. -Lancet, 1969, 2, 983-986.

28. Tiollais P., Charnay P., Vyas G.N. Biology of hepatitis В virus. Science, 1981, 213, 406-411.

29. Almeida J.D., Rubenstein D., Stott R.J. New antigen antibody system in Australia antigen positive hepatitis. -Lancet, 1971, 2, 1225-1227.

30. Budkowska A., Shih J.W., Gerin J.L. Immunochemistry and polypeptide composition of hepatitis В core antigen

31. HBcAg). J.Immunol., 1977, 118, 1300-1305.

32. Neurath A.R., Huang A.M., Strick N. Some properties of hepatitis В core antigen isolated from serum of infected humans. J.Gen.Virol., 1978, 39, 91-101.

33. Hruska J.F., Robinson W.S. The proteins of hepatitis В Dane particle cores. J.Med.Virol., 1977, 1, 119-131.

34. Magnius L.O., Espmark J.A. New specifities in Australia antigen positive sera distinct from LeBouvier determinants. -J.Immunol., 1972, 109, 1017-1021.

35. Takahashi K., Akahane Y., Gotanda Т., Mishiro Т., Imai M., Miyakawa Y., Mayumi M. Demonstration of hepatitis e antigen in the core of Dane particles. J.Immunol., 1979, 122, 275-279.

36. MacKay P., Lees J., Murray K. The conversion of hepatitis В core antigen synthesized in E.coli into e antigen.

37. J.Med.Virol., 1981, 8, 237-243.

38. Summers J., 0'Connell A., Millman I. Genome of hepatitis В virus: Restriction enzyme cleavage and structure of DNA extracted from Dane particles. Proc.Nat.Acad. Sci. USA, 1975, 72, 4597-4601.

39. Lutwick L.I., Robinson W.S. DNA synthesized in the hepatitis В Dane particle DNA polymerase reaction. -J.Virol., 1977, 21, 96-104.

40. Hruska J.F., Clayton D.A., Rubenstein J.L.R., Robinson W.S. Structure of hepatitis В Dane particle DNA before and after the Dane particle DNA polymerase reaction. J.Virol., 1977, 21, 666-672.- 115

41. Landers Т.A., Greenberg H.B., Robinson W.S. Structure of hepatitis В Dane particle DNAand nature of the endogenous DNA polymerase reaction. -J.Virol., 1977, 23, 368-376.

42. Delius H., Gough N.M., Cameron C.H., Murray K. Structure of the hepatitis В virus genome. J.Virol., 1983, 47, 337-343.

43. Kaplan P.M., Greenman R.L., Gerin J.L., Purcell R.H., Robinson W.S. DNA polymerase associated with human hepatitis В antigen. J.Virol., 1973, 12, 995-1005.

44. Robinson W.S., Greenman R.L. DNA polymerase in the core of the human hepatitis В virus candidate. J.Virol., 1974, 13, 1231-1236.

45. Robinson W.S., Clayton D.A., Greenman R.L. DNA of a human hepatitis В virus candidate. J.Virol., 1974, 14, 384-391.

46. Sattler F., Robinson W.S. Hepatitis В viral DNA molecules have cohesive ends. J.Virol., 1979, 32, 226-233.

47. Gerlich W.H., Robinson W.S. Hepatitis В virus contains protein attached to the 5'-terminus of its complete DNA strand. Cell, 1980, 21, 801-809.

48. Molnar-Kimber K.L., Summers J., Taylor J.M., Mason W.S. Protein covalently bound to minus-strand DNA intermediates of duck hepatitis В virus. J.Virol., 1983, 45, 165172.

49. Will H., Cattaneo R., Koch H.-G., Darai G., Schaller H., Schellekens A., van Eerdt P.M.C.A., Deinhardt F. Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees. Nature, 1982, 299, 740-742.

50. Siddiqui A., Sattler F., Robinson W.S. Restriction endonuclease cleavage map and location of unique features of the DNA of hepatitis В virus, subtype adv^. Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 1979, 76, 4664-4668.

51. Fritsch A., Pourcel C., Charnay P., Tiollais P., Clonage du genome du virus de 1'hepatite В dans E.coli. C.r. hebd.Seanc.Acad.Sci., Paris, Ser D, 1978, 287, 1453-1456.

52. Charnay P., Pourcel C., Loise A., Tiollais P. Cloning in E.coli and physical structure of hepatitis В virion DNA. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1979, 76, 2222-2226.

53. Price P., Hirschman S.Z., Garfinkel E. DNA cloned from the ayw subtype of hepatitis В virus. J.Med.Virol.,1980, 6, 139-145.

54. Пумпен П.П., Грен Э.Я., Кукайн Р.А. Генетическая инженерия и вирусный гепатит типа В. Изв.АН ЛатвССР,1981, № 8, I07-118.

55. Дрынов И.Д., Вязов G.O., Носиков В.В., Урываев JI.B., Ананьев В.А., Жданов В.М. Клонирование и рестрикцион-ный анализ генома вируса гепатита Б. Докл.АН СССР,1982, 262, 229-232.

56. Sninsky J.J., Siddiqui A., Robinson W.S., Cohen S.N. Cloning and endonuclease mapping of the hepatitis В viral Genome. Nature, 1979, 279, 346-348.

57. Valenzuela P., Gray P., Quiroga M., Zaldivar J., Goodman H.M., Rutter W.J. Nucleotide sequence of the gene coding for the major protein of the hepatitis В virus surface antigen. Nature, 1979, 280, 815-819.

58. Народицкий Б.С., Гольдберг Е.З., Лунин В.Г., Михайлов М.И., Калинин В.И., Кетиладзе Е.С., Тихоненко Т.И., Клонирование гена поверхностного антигена вируса гепатита В. Молекул.генет.микробиол. и вирусол., 1983,1. 27-29.

59. Koike К., Kobayashi М., Yaginuma К., Taira М., Takahashi Т., Goto Y. Surface antigen gene of hepatitis В virus (subtype adr) cloned in E.coli. Proc.Japan.Acad., 1982, 58, Ser.B, 140-144.

60. Худяков Ю.Е., Скрипкин E.A., Лунин В.Г., Смирнов В.Д., Тихоненко Т.И. Последовательность нуклеотидов гена белка оболочки вируса гепатита В человека. Молекул, генет.микробиол. и вирусол., 1983, 4, 37-42.

61. Pasek М., Goto Т., Golbert W., Zink В., Schaller Н., МасКау Р., Leadbetter G., Murray К. Hepatitis В virus genes and their expression in E.coli. Nature, 1979, 282, 575-579.

62. Peterson D.L., Roberts I.M., Vyas G.N. Partial amino acid sequence of two major component polypeptides of hepatitis В surface antigen. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1977, 74, 1530-1534.

63. Galibert F., Mandart E., Fittoussi P., Tiollais P., Charnay P. Nucleotide sequence of the hepatitis В virus genome (subtype ayw) cloned in E.coli. Nature, 1979, 281, 646-650.

64. Valenzuela P., Quiroqa M., Zaldivar F., Gray P., Rutter W.F. Hepatitis scientific memoranda, 1980, Memo - H -1803 / 1.

65. Ono Y., Onda H., Sasada R., Igarashi K., Sugino Y., Ni-shioka K. The complete nucleotide sequence of the cloned hepatitis В virus DNA, subtype adr and adw. Nucl. Acids Res., 1983, 11, 1747-1755.

66. Fujiyama Т., Ohtomo N., Matsubara K. Cloning and structural analyses of hepatitis В virus DNAs, subtype adr. -Nucl.Acids Res., 1983, 11, 4601-4611.

67. Gough N.M. Core and E antigen synthesis in rodent cells transformed with hepatitis В virus DNA is associated with greater than genome length viral messenger RNAs. -J.Mol.Biol., 1983, 165, 683-699.

68. Hopp T.P. A synthetic peptide with hepatitis В surface antigen reactivity. Molec.Immunol., 1981, 18, 869-872.

69. Hopp T.P., Woods K.R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc.Nat.Acad. Sci. USA, 1981, 78, 3824-3828.

70. Prince A.M., Ikram H., Hopp T.P. Hepatitis В virus -vaccine: Identification of HBsAg/a and HBsAg/y subtype antigenic determinants on a synthetic immunogenic peptide. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1982, 79, 579-582.

71. Dreesman G.R., Sanchez Y. , Ionescu-Matiu I., Sparrow J.T. ,

72. Six H.R. , Peterson D.L., Hollinger F.B., Melnick J.L. Production of antibody to hepatitis В surface antigen by single inoculation of uncoupled synthetic HBsAg peptides. Nature, 1982, 295, 158-160.

73. Sanchez Y., Ionescu-Matiu I., Sparrow J.T., Melnick J.L., Dreesman G.R. Immunogenicity of conjugates and micelles of synthetic hepatitis В surface antigen peptides. -Intervirology, 1982, 18, 209-213.

74. Bhatnagar P.K., Papas E., Blum H.E., Milich D.R., Nitec-ki D., Karels M.J., Vyas G.N. Immune responce to synthetic peptide analogues of hepatitis В surface antigen specific for the a determinant. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1982, 79, 4400-4404.

75. Neurath A.R., Kent S.B.H., Strick N. Specifity of antibodies elicited by a synthetic peptide having a sequence in common with a fragment of a virus protein, the hepatitis В surface antigen. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1982, 79, 7871-7875.

76. Dreesman G.R. , Hollinger F.B., Melnick J.L. Biophysical and biochemical properties of purified preparations of hepatitis В surface antigen (HBsAg). Amer.J.Med.Sci., 1975, 270, 123-129.

77. Shih J.W.-K., Gerin J.L. Proteins of hepatitis В surface antigen. J.Virol., 1977, 21, 347-357.

78. Neurath A.R., Strick N., Huang C.Y. Properties of deli-pidated hepatitis В surface antigen (HBsAg) and preparation of its proteolytic cleavage fragments carrying HBsAg specific antigenic determinants. - Intervirology, 1978, 10, 265-275.

79. Cabral G.A., Marciano-Cabral F., Funk G.A., Sanchez Y., Hollinger F.B., Melnick J.L., Dreesman G.R. Cellular and humoral immunity in guinea pigs to two major polypeptides derived from hepatitis В surface antigen. J.Gen.Virol., 1978, 38, 339-350.

80. Marion P.L., Salazar F.H., Alexander J.J., Robinson W.S. Polypeptides of hepatitis В virus surface antigen produced by a hepatoma cell line. J.Virol., 1979, 32, 796802.

81. Skelly J., Howard C.R., Zuckerman A.J. Analysis of hepatitis В surface antigen components solubilized with Triton X-100. J.Gen.Virol., 1979, 44, 679-689.

82. Koistinen V.U. Hepatitis В surface antigen polypeptides: artifactual bands in sodium dodecyl sulfate polyacryl-amide gel electrophoresis caused by aggregation. - J.Virol. , 1980, 35, 20-23.

83. Peterson D.L. Isolation and characterization of the major protein and glycoprotein of hepatitis В surface antigen. J.Biol.Chem., 198.1, 256, 6975-6983.

84. Mishiro S., Imai M., Takahashi K., Machida A., Gotanda Т., Micakawa Y., Mayumi M. A 49.000 dalton polypeptide bearing all antigenic determinants and full immunogenicity of 22 nm hepatitis В surface antigen particles. J.Immunol., 1980, 124, 1589-1593.

85. Shiraishi H., Shiraishi R., Akiyama K., Ishida N. Glyco-peptide composition of hepatitis В surface antigen.

86. J.Gen.Virol., 1980, 48, 31-38.

87. Burrell C.J. Host components in hepatitis В antigen. -J.Gen.Virol., 1975, 27, 117-126.

88. Shih J.W.-K., Tan P.L., Gerin J.L. Relationship of large hepatitis В surface antigen polypeptide to human serum albumin. Infect.Immunol., 1980, 28, 459-463.

89. Feitelson M.A., Marion P.L., Robinson W.S. The nature of polypeptides larger in size than the major surface antigen components of hepatitis В and like viruses in ground squirrels, woodchucks, and ducks. Virology, 1983, 130, 76-90.

90. Gerber M.A., Aoki N., Christman J., Price P., Thung S.N., Acs G. HBsAg production by fibroblasts transfected with hepatitis В virus DNA. Versh.Detsch.Ges.Pathol., 1982, .66, 447.

91. Dubois M.-F., Pourcel C., Rousset S., Chany C., Tiol-lais P. Excretion of hepatitis В surface antigen particles from mouse cells transformed with cloned viral DNA. -Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1980, 77, 4549-4553.

92. Hirschman S.Z., Price P., Garfinkel E., Christman J., Acs G. Expression of cloned hepatitis В virus DNA in human cell cultures. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1980, 77, 5507-5511.

93. Moriarty A.M., Hoyer B.H., Shih J.W.-K., Gerin J.L., Hamer D.H. Expression of the hepatitis В virus surface antigen gene in cell culture by using simian virus 40 vector. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1981, 78, 2606-2610.

94. Gough N.M., Murray K. Expression of the hepatitis В virus surface core and E antigen genes by stable rat and mouse cell lines. J.Mol.Biol., 1982, 162, 43-67.

95. Crowby C.W., Lin C.-C., Levinson A.D. Plasmid-directed synthesis of hepatitis В surface antigen in monkey cells. -Mol.Cell.Biol., 1983, 3, 44-55.

96. Valenzuela P., Medina A., Rutter W.J., Ammerer G., Hall B.D. Synthesis and assembly of hepatitis В virus surfaceantigen particles in yeast. Nature, 1982, 298, 347-350.

97. Miyanohara A., Toh-e A., Nozaki C., Hamada F., Ohtomo N., Matsubara K. Expression of hepatitis В surface antigen gene in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1983, 80, 1-5.

98. Hitzeman R.A., Chen. C.Y., Hagie F.E., Patzer E.J., Lin C.-C., Estell D.A., Miller J.V., Yaffe A., Kleud D.G., Levinson A.D., Oppermann H. Expression of hepatitis В virus surface antigen in yeast. Nucl.Acids Res., 1983, 11, 2745-2763.

99. Edman J.C., Hallewell R.A., Valenzuela P., Goodman H.M., Rutter W.J. Synthesis of hepatitis В surface and core antigens in E.coli. Nature, 1981, 291, 503-506.

100. Charnay P., Gervais M., Louise A., Galibert F., Tiollais P. Biosynthesis of hepatitis В virus surface antigen in Escherichia coli. Nature, 1980, 286, 893-895.

101. MacKay P., Pasek M., Magazin M., Kovacic R.T., Allet В., Stahl S., Gilbert W., Schaller H., Bruce S.A., Murray K. Production of immunologically active surface antigens of hepatitis В virus by E.coli. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1981, 78, 4510-4514.

102. Fujisawa Y., Ito I., Sasada R., Ono Y., Igarashi K., Marumoto R., Kikuchi M., Sugino Y. Direct expression of hepatitis В surface antigen gene in E.coli. Nucl.Acids Res., 1983, 11, 3581-3591.

103. Dagert M. , Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of E.coli cells. -Gene, 1979, 6, 23-28.

104. Guerry P., LeBlanc D.J., Falkow S. General method for the isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. J.Bac-teriol., 1973, 116, 1064-1066.

105. Clewell D.B. Nature of Col El plasmid replication in Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. -J.Bact., 1972, 110, 667-676.

106. Colman A., Byers M.J., Primrose S.B., Lyons A. Rapid purification of plasmid DNAs by hydroxyapatite chromatography. Eur.J.Biochem., 1978, 91, 303-310.

107. Rigby P.W.J., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P. Labelling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J.Mol.Biol., 1977, 113, 237-251.

108. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res., 1979, 7, 1513-1523.

109. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467.

110. Landers T.A., Greenberg H.B., Robinson W.S. Structure of hepatitis В Dane particle DNA and nature of the endogenous DNA polymerase reaction. J.Virol., 1977, 23,368.376.

111. Wieslander К. A simple method to recover intact high molecular weight RNA and DNA after electrophoretic separation in low gelling temperature agarose gels. Anal. Biochem., 1979, 98, 305-309.

112. Dretzen G., Bellard M., Sassone-Corsi P., Chambon P.

113. A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal.Biochem., 1981, 112, 295-298.

114. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook L. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 117.

115. Chard T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques. Amsterdam N.Y. - Oxford, 1978, 359.

116. Kessler S.W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphilococcal protein A-antibody absorbent. -J.Immunol., 1975, 115, 1617-1624.

117. LaemmliU.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.

118. Пумпен П.П., Козловская Т.М., Дишлер А.В., Бычко В.В., Калис Я.В., Пудова Н.В., Грен Э.Я., Ривкина М.Б., Ку-кайн Р.А. Сравнительное картирование вирионной ДНК и клонированной ДНК вируса гепатита В. Мол.биол., 1982, 16, I3I4-I32I.

119. Bichko V.V., Kozlovskaya Т.М., Dishler A., Pumpen P., Janulaitis A., Gren E.J. Restriction map of the hepatitis В virus DNA cloned in E.coli. Gene, 1982, 20, 481-484.

120. Bolivar F. Construction and characterization of new cloning vehicles. III. Derivatives of plasmid pBR322 carrying unique EcoRl sites for selection of EcoRl generated recombinant DNA molecules. Gene, 1977, 2, 95-113.

121. Alton N.K., Vapnek D. Nucleotide sequence analysis of the chloramphenicol resistance transposon Tn9. Nature, 1979, 282, 864-869.

122. Marcoli R., Iida S., Bickle T.A. The DNA sequence of an ISl-flanked transposon coding for resistance to chloramphenicol and fusidic acid. FEBS Letters, 1980, 110, 11-14.

123. Bishop J.O. A DNA sequence cleaved by restriction endo-nuclease R. EcoRl in only one strand. J.Mol.Biol., 1979, 128, 545-559.

124. Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene, 1977, 2, 95113.

125. Prentki P., Karch F., Iida S., Meyer J. The plasmid cloning vector pBR325 contains a 482 base-pair-long inverted duplication. Gene, 1981, 14, 289-299.

126. Ока А., Sugisaki Н., Takanarai М. Nucleotide sequence of the kanamycin resistance transposon Tn903. J.Mol.Biol., 1981, 147, 217-226.

127. Gouy M., Gautier C. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity. Nucl.Acids Res., 1982, 10, 7055-7074.

128. Hallewell R.A., Emtage S. Plasmid vectors containing the tryptophan operon promoter suitable for efficient regulated expression of foreign genes. Gene, 1980, 9, 27-47.

129. Gren E.J. Recognition of messenger RNA during transla-tional initiation in Escherichia coli. Bioch£mie, 1984, 66, 1-29.

130. Грен Э.Я. Узнавание матричных РНК при инициации трансляции у прокариот. Мол.биол., 1981, 15, 725-752.

131. Kurokawa Т., Seno М., Sasada R., Ono X., Onda Н., Igara-shi К., Kikuchi М., Honjo Т. Expression of human immunoglobulin E S chain cDNA in E.coli. Nucl.Acids Res., 1983, 11, 3077-3085.

132. Seeburg P.H., Sias S., Adelman J., de Boer H.A., Hayf-lick J., Ihurani P., Goeddel D.V., Heyneker H.L. Efficient bacterial expression of bovine and porcine growth hormones. DNA, 1983, 2, 37-45.

133. Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., De-grave W., Tavernier J., Remaut E., Fiers W. Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E.coli. Nucl.Acids Res., 1983, 11, 4307-4323.

134. Lee F., Bertrand K., Bennett G., Yanofsky C. Comparison of the nucleotide sequences of the transcribed regions of the tryptophan operons of Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J.Mol.Biol., 1978, 121, 193-217.

135. Ninio J. Prediction of pairing schemes in RNA molecules loop contributions and energy of wobble and non-wobble pairs. Biochimie, 1979, 61, 1133-1150.

136. Wain-Hobson S., Pourcel C. , Tiollais P. The hepatitis В virus. Genetic maps, 1982, 2, 58.

137. Itoh S., Mizukami Т., Matsumoto Т., Saito A., Oka Т., Furuya A., Takaoka C., Taniguchi T. Efficient expression in Escherichia coli of a mature and a modified human interferon Вт. - DNA, 1984, 3, 157-165.