Экспрессия и очистка светочувствительных и сенсорных белков для биофизических исследований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Гончаров Иван Михайлович

• Гончаров Иван Михайлович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Гончаров Иван Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

Цель работы

Основные задачи исследования

Научная новизна

Положения, выносимые на защиту

Теоретическая и практическая значимость

Степень достоверности результатов работы

Степень апробации результатов работы

Объем и структура диссертации

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. 1 Экспрессия и очистка белков

1.2 Двухкомпонентные сигнальные системы

1.2.1 Структура гистидин киназ

1.2.2 Структура белка регулятора ответа

1.2.3 Фоторецепторные гистидин киназы

1.2.4 Применение ДКС

1.2.4.1 Потенциальные препараты

1.2.4.2 Проблемы резистентности

1.3 LOV домен содержащие флуоресцентные белки

1.3.1 Флуоресцентные инструменты

1.3.4.1 Флуоресцентные красители

1.3.4.2 Флуоресцентные белки

1.3.4.3 Мониторинг динамики белков

1.3.2 LOV рецепторы

1.3.3 Структура LOV доменов

1.3.4 Применение LOV доменов

1.3.4.1 Флуоресцентная микроскопия

1.3.4.2 Оптогенетические инструменты

1.3.4.3 LOV белки как объекты для исследования

1.4 Фотоферменты, фотодекарбоксилазы жирных кислот

1.4.1 Фотодекарбоксилазы жирных кислот (ФЖК)

1.4.2 Механизм работы ФЖК

1.4.3 Применение ФЖК

1.4.4 Особенности очистки ФЖК

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Бактериальные штаммы

2.1.3. Плазмидные векторы

2.1.4. Питательные среды

2.1.5. Детергенты и липиды

2.1.6. Лиганды

2.1.7. Субстраты

2.1.8. Хроматографические смолы и колонки

2.1.9. Материалы для вестерн-блоттинга

2.1.10. Концентраторы

2.1.11. Генетические конструкции

2.2. Методы

2.2.1. Конструирование плазмидной ДНК, содержащей ген целевого белка

2.2.2. Трис-трициновый электрофорез

2.2.3. Вестерн-блоттинг

2.2.4. Концентрирование образцов

2.2.5. Измерение концентрации образцов

2.2.6. Определение оптической плотности клеток

2.2.7. Трансформация

2.2.8. Экспрессия белков

2.2.9. Очистка белка методом металл-аффинной хроматографии

2.2.10. Очистка белка методом гель-фильтрации

2.2.11. Солюбилизация мембранных белков

2.2.12. Анализ термостабильности белка

2.2.13. Кристаллизация белков

2.2.14. Наблюдение за кристаллами

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Экспрессия, очистка и кристаллизация CisFbFP

3.2. Экспрессия, очистка и кристаллизация CsFAP и его различных вариантов

3.3. Экспрессия, очистка и кристаллизация CvFAP и его варианта с удаленной N концевой спиралью

3.4. Экспрессия, очистка и кристаллизация sFL-CvFAP и мутантного белка sFL-CvFAP-A158C

3.5. Аналитическая экспрессия белков TCS1, TCS2, TCS3

3.6. Экспрессия, очистка и кристаллизация TCS2

3.7. Экспрессия, очистка и кристаллизация TCS3

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Мембранные белки - это амфифильные макромолекулы, которые обычно располагаются в клеточной мембране [1]. У эукариот и прокариот мембранные белки составляют от 20% до 30% протеома [2]. Эти белки выполняют важнейшие функции - такие как транспорт ионов, поглощение питательных веществ, выработку энергии, запускают различные сигнальные каскады; отвечают за устойчивость к лекарственным препаратам, а также поддержание клеточных структур [3,4].

Различные дефекты или дисфункция мембранных белков могут быть причиной различных серьезных нарушений и заболеваний, например, таких, как нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера) и диабет. Более того, мембранные белки обеспечивают естественные точки входа и якоря для молекулярных агентов инфекционных заболеваний. Таким образом, мембранные белки являются важными мишенями как для уже существующих, так и для разрабатываемых лекарственных препаратов [5].

К примеру, рецепторы двухкомпонентных сигнальных систем (ДКС), которые могут быть как мембранными, так и водорастворимыми белками, отвечают за восприятие различных сигналов и отвечают за регуляцию огромного количества физиологических процессов в бактериях и археях, позволяющие им выживать в различных неблагоприятных условиях окружающей среды. Поскольку негативные эффекты от патогенных микроорганизмов часто обусловлены наличием белков ДКС, то белки ДКС (гистидин киназы и белки регуляторы ответа) являются перспективными мишенями для разработки новых противомикробных препаратов [6].

Для того, чтобы разобраться в принципах работы мембранных и растворимых белков, а также заняться их дизайном и вносить в них какие-либо изменения, значимые как с научной, так и с прикладной точки зрения, необходимо предварительно понимать тонкости и особенности структур этих белков. Одним из наиболее широко используемых методов структурных исследований является рентгеновская кристаллография. Для определения кристаллографической структуры белков, в первую очередь, необходимо произвести их экспрессию, затем очистку и, наконец, вырастить кристаллы и измерить картины дифракции.

Размеры и однородность кристаллов напрямую влияют на возможность пронаблюдать дифракцию, а затем ее проанализировать. Для получения качественных кристаллов требуются большое количество исключительно чистого белкового препарата, несмотря на то, что использование синхротронного излучения [7,8] и прогресс в развитии кристаллографии [9-11] привели к значительному уменьшению необходимого для измерений размера кристаллов.

Есть много факторов, которые влияют на кристаллизацию макромолекул белка. Эти факторы могут значительно влиять на вероятность и скорость образования зародышей кристаллов, а также конечные размеры и качество кристаллов. Одни из самых важных факторов — это pH буферного раствора и концентрации различных осадителей (преципитантов). Помимо этого, одним из самых важных факторов является концентрация самого белка, которая при кристаллизации обычно может варьироваться от 2 мг/мл до 100 мг/мл [12]. Для полноценного первичного скрининга обычно требуется концентрация более 20 мг/мл с минимальным объемом белкового образца 50 мкл. Получение исключительно чистых препаратов белка в таком количестве и в такой концентрации требует большого количества времени, а также специализированного подхода, так как каждый белок обладает своим исключительным особенностями, которые усложняют работу с ним на всех этапах от экспрессии до кристаллизации и анализа полученной дифракции на кристаллах.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия и очистка светочувствительных и сенсорных белков для биофизических исследований»

Цель работы

Целью проекта является разработка протоколов экспрессии, очистки и солюбилизации водорастворимых белков: LOV домен содержащего белка CisFbFP, природных ферментов ФЖК, а также мембранных, бактериальных гистидин киназ, с последующей пробоподготовкой для изучения их биофизических свойств и рентгеноструктурного анализа.

Основные задачи исследования

Для проведения различных биофизических исследований (измерения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции, кривых плавления), а также структурных исследований необходимо получить очищенные гомогенные, стабильные, функциональные образцы. Для этого необходимо разработать протоколы экспрессии с последующими протоколами выделения и очистки препарата. Например, такие мембранные белки, как TCS2 и TCS3, которые относятся к классу рецепторных гистидин киназ, обладают рядом гидрофобных доменов, которые склонны к агрегации и требуют поиска оптимальной мембранной среды, которая бы предохраняла их от агрегации.

Проделанная исследовательская работа направлена на получение стабильных, очищенных гомогенных препаратов белков, которые бы подходили для структурных и биофизических исследований. Именно поэтому данная задача была разделена на следующие подзадачи:

1. Разработка протоколов бактериальной экспрессии исследуемых белков, их экспрессия в необходимом количестве.

2. Разработка методов солюбилизации исследуемых мембранных белков.

3. Разработка протоколов выделения и очистки исследуемых белков, получение гомогенных препаратов.

4. В случае успешного получения очищенных гомогенных препаратов белков в необходимых количествах: разработка протоколов кристаллизации с целью последующего рентгеноструктурного анализа.

5. Определение температурных характеристик исследуемых белков, в частности определение кривых плавления.

6. Исследование спектральных свойств белков, в частности измерение спектров поглощения и эмиссии флуоресценции.

Научная новизна

В данной работе впервые были разработаны протоколы экспрессии и очистки таких белков, как CisFbFP, CsFAP, TCS2, TCS3. Проэкспрессирована фотодекарбоксилаза жирных кислот CvFAP из Chlorella variabilis, изучен ее мутант и показано влияние света и наличие добавочных агентов (на примере лауриновой кислоты) на стабильность фермента. Впервые были произведены гистидин киназы TCS2 и TCS3 и разработаны эффективные протоколы солюбилизации в детергентах DDM, OG, LMPG, LMPC. Наконец, впервые определена кристаллическая структура белка CisFbFP из термофильной бактерии Chloroflexus islandicus.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные протоколы экспрессии позволяют получить чистые образцы LOV домен-содержащего белка CisFbFP, мембранных белков TCS2 и TCS3, а также полноразмерных фотодекарбоксилаз жирных кислот из Coccomyxa subellipsoidea и Chlorella variabilis и их вариантов в количествах, достаточных для кристаллизации.

2. Разработанный метод солюбилизации гистидин киназ TCS2 и TCS3 в детергентах DDM, OG, LMPG, LMPC позволяет избежать агрегации этих белков и получить их образцы в количествах, необходимых для дальнейшей кристаллизации.

3. Белок CisFbFP может быть закристаллизован в присутствии преципитанта, в состав которого входят дигидрофосфат калия, ПЭГ 8000 и глицерин.

4. Разработанные протоколы экспрессии и очистки позволяют наработать достаточное количество белка CisFbFP и sFL-CvFAP для измерения кривых плавления и получения температур плавления, а также получения спектров поглощения и излучения.

5. Среди известных на данный момент природных LOV домен-содержащих белков, белок из Chloroflexus islandicus имеет наибольшее смещение спектра в красную область.

6. Белок CsFAP в условиях отсутствия дневного света и в присутствии лауриновой кислоты обладает большей стабильностью по сравнению с белком, который экспрессировался и очищался в отсутствии субстрата и в помещении освещенным дневным светом или лампой накаливания.

7. Точечная мутация аланина на цистеин в активном сайте CsFAP не изменяет свойств белка; точечная мутация аланина на цистеин в активном сайте CvFAP приводит к уменьшению уровня экспрессии белка.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные в данной диссертационной работе результаты могут быть применены в разработке новых биотехнологий, например, для создания новых флуоресцентных белков и новых технологий, позволяющих эффективно перерабатывать различные отходы в виде жирных кислот, получая из них углеводороды, которые можно применять в качестве источников энергии. Также важным аспектом является то, что результаты диссертации могут быть полезны для современной медицины, например при создании антибиотиков нового поколения.

Степень достоверности результатов работы

Данные, которые описаны в литературном обзоре, основываются на публикациях в международных журналах, которые индексируются базами данных Scopus и Web of Science. Данные в диссертационной работе были получены с использованием самых современных физических методов исследования биологических молекул, а также методов биофизики и молекулярной биологии. Достоверность полученных результатов, сформулированных в положениях и выводах данной диссертации, подтверждается фактом их публикации в рецензируемых международных изданиях.

Степень апробации результатов работы

На основе данных, полученных в диссертации, было опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, индексируемых базами данных Web of Sciences и Scopus. Также результаты научной работы были представлены на международной конференции Biomembranes 2018, 61-й научной конференции МФТИ, а также на 25-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и заключения.

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы ее цель и задачи, отражена научная новизна работы, а также описана ее практическая значимость.

Первая глава - литературный обзор, информирующий об общем состоянии исследований белков, которые изучались в данной диссертационной работе: флуоресцентные белки на основе LOV домен содержащих белков и способы их применения, также актуальная структурная информация касательно механизмов действия белков двухкомпонентных систем и, наконец, описание фотодекарбоксилаз жирных кислот и практических перспектив их применения.

Во второй главе описаны материалы и методы, которые были использованы в процессе выполнения различных экспериментов, описанных в данной диссертационной работе, а также информация об оборудовании, на котором проводилась работа. Описаны процедуры экспрессии, очистки, солюбилизации, кристаллизации белков, а также процесс получения дифракционной картины и ее расшифровке на полученных кристаллах.

В третьей главе представлены экспериментальные результаты исследований, полученных в ходе диссертационной работы над белками CisFbFP, TCS2, TCS3, CvFAP, CsFAP: процессы разработки протоколов экспрессии в бактериальной системе экспрессии, а также разработка протоколов очистки для каждого отдельного белка. Также представлены экспериментальные результаты исследования факторов влияющих на стабилизацию ФЖК белков.

В заключении диссертационной работы представлены основные выводы и приведен библиографический список цитируемой литературы.

Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 4 таблицы. Список использованных литературных источников насчитывает 209 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Экспрессия и очистка белков

Экспрессия белка является одной из самых основных задач, которую необходимо решить при изучении структур и функций различных белков. В любой клетке синтез белка регулируются различными клеточными процессами в зависимости от ее текущих потребностей. Вся необходимая информация про белок хранится в ДНК. Передача генетической информации из ДНК происходит путем транскрипции гена на информационную РНК (матричная РНК, мРНК), после чего запускается процесс трансляции, когда на мРНК синтезируется определенная последовательность аминокислот, которая в будущем и образует тот белок, который необходим клетке (рис. 1.1).

Рисунок 1.1. На рисунке изображена типичная схема синтеза белка в клетках эукариот. Иллюстрация из брошюры [13].

У прокариот процессы транскрипции и трансляции происходят одновременно: трансляция мРНК начинается еще до того, как сама мРНК будет полностью синтезирована. Такая одновременная транскрипция и трансляция гена называется сопряженной транскрипцией и трансляцией. У эукариот в свою очередь эти процессы, во-первых, происходят раздельно, а, во-вторых, локализованы в различных местах в клетке. Так, например, у эукариотических клеток транскрипция происходит в ядре, а трансляция происходит в цитоплазме. После того, как трансляция успешно завершена, белок может подвергаться дополнительным различным модификациям, так называемым посттрансляционным модификациям (это различные добавления или изменения химической структуры только что синтезированного белка, которые являются критическими характеристиками для общей биологии клетки). Это необходимо для

того, чтобы белок обладал функциональным фолдингом и был доставлен в конкретное место в клетке, в случае эукариотических клеток.

Исследование протеома клетки может включать в себя как структурные исследования отдельных белков, их функций или модификации, так и их клеточную локализацию и механизмы взаимодействия с другими белками. Для проведения подобных исследований необходимы различные специфические инструменты синтеза интересующих нас функциональных белков, так как больше размеры белков и их структурные особенности не позволяют произвести белок с использованием химического синтеза. Такими инструментами синтеза могут как раз выступать живые клетки или их клеточные механизмы (системы экспрессии). В отличие от самого белка, сконструировать ДНК in vitro, кодирующую определенную аминокислотную последовательность, значительно проще, с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов рекомбинантной ДНК. Таким образом, последовательности ДНК конкретных генов могут служить матрицами для последующей экспрессии белка. Белки, полученные из подобных сконструированных ДНК, называются рекомбинантными белками.

Одним из самых ключевых вопросов для начала исследования является выбор наиболее подходящей системы экспрессии для синтеза целевого рекомбинантного белка. Такие факторы, как стабильность белка, его функциональность, скорость очистки и количественный выход, являются основополагающими критериями в вопросе выбора экспрессионной системы. У каждой системы экспрессии есть как свои сильные, так и слабы стороны. На сегодняшний день наиболее популярными является следующие системы экспрессии: системы клеток млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий, водорослей и различные бесклеточные системы экспрессии (БСС) на основе как бактериальной клеточной машинерии, так и на основе машинерии клеток млекопитающих.

Системы экспрессии [13]:

1. Клетки млекопитающих:

Применяются для экспрессии белков для функциональных, структурных исследований, для производства антител и сложных белковых комплексов, а также для производства вирусов.

Основными преимуществами являются наличие посттрансляционных модификаций белка, а также возможность экспрессировать белок как какой-то короткий промежуток времени, так и довольно длительное время. Такие системы являются надежными в

плане синтеза белка в больших количествах за достаточно короткий промежуток времени.

К недостаткам можно отнести то, что наращивание значительной популяции клеток возможно только в специальных суспензионных культурах, а также наличие большого количества дополнительных условий для клеточного культивирования.

2. Клетки насекомых:

Применяются как для функциональных, так и для структурных исследований, экспрессии внутриклеточных белков, экспрессии белковых комплексов, производства вирусов.

К основным преимуществам можно отнести тот факт, что данные системы похожи на экспрессионные системы млекопитающих, а также могут использоваться как в устойчивой, так и суспензионной клеточной культуре.

К недостаткам можно отнести требовательность экспрессионной системы к условиям культивирования, причем более сложных чем у клеток млекопитающих, а производство рекомбинантных бакуловирусных векторов требует большого количества времени.

3. Клетки дрожжей:

Применяется как для структурного анализа, так и для функционального анализа белков, синтеза антител, изучения процессов взаимодействия белков.

К основным преимуществам можно отнести посттрансляционные модификации эукариотических белков, масштабируемость выхода белка. Достаточно простые требования по отношению к средам для культивирования.

К основным недостаткам можно отнести брожение, которое необходимо для достижения больших выходов белка, а также то, что для роста клеток может потребоваться оптимизация протоколов и условий.

4. Клетки бактерий:

Часто используются для структурных и функциональных исследований белков, для синтеза антител, изучения взаимодействия белков.

К основным преимуществам можно отнести масштабируемость, низкую стоимость использования, и очень простые условия культивации клеток.

К недостаткам можно отнести то, что при бактериальной экспрессии могут возникнуть определенные сложности в работе с некоторыми белками клеток млекопитающих. Например, для эукариотических белков иногда требуются определенные посттрансляционные модификации, или белок может оказаться токсичным для бактериальных клеток, что в свою очередь сильно повлияет на уровень экспрессии.

5. Клетки водорослей:

Используется для изучения процессов фотосинтеза, биологии растений, липидного обмена, а также производства биотоплива.

Основные преимущества — это наличие систем генетической модификации и экспрессии для фотосинтетических микроводорослей. А также возможность контролирования производства биотоплива, нутрицевтиков и специальной химии, оптимизированная система для надежного отбора и экспрессии.

К основным недостаткам можно отнести то, что это довольно новая система экспрессии и менее развиты по сравнению с другими инструментами синтеза белков.

6. Бесклеточные системы экспрессии:

Система экспрессии отлично подходит для синтеза токсичных белков, использования специальных меток, в том числе и радиоактивных, или каких-либо синтетических аминокислот. Отлично подходит для функциональных исследований и для исследования белок-белковых взаимодействий, а также для скрининга ингибиторов трансляции.

К основным преимуществам можно отнести возможность добавлять в реакцию в любое время самые различные компоненты реакции, в том числе и неестественные. Довольно быстрое время синтеза белка, а также относительно простой формат работы.

Является очень дорогим инструментом экспрессии, а также могут быть большие проблемы с уровнем выхода белка.

Среди всех перечисленных систем экспрессии для текущей диссертационной работы стоит отметить бактериальную систему экспрессии исходя из следующих соображений:

1. Работа проводится с бактериальными белками, за исключением фотодекарбоксилазы жирных кислот (ФЖК). Для использования ФЖК, возможно, лучше бы подошла система экспрессии из водорослей. Но использование подобной системы осложнялось тем, что на текущий момент эта система является новой и плохо исследованной, что значительно может повлиять на выход белка и удельную стоимость его синтеза. С учетом этих обстоятельств бактериальная система экспрессии выглядит более предпочтительной.

2. Бактериальная система дешева в использовании.

3. Длительность синтеза белка после индукции в среднем составляет от 4 до 6 часов. Такая короткая продолжительность экспрессии является определенным преимуществом, так как позволяет за относительно небольшой промежуток времени опробовать большое количество протоколов с различающимися параметрам (температура, способ индукции экспрессии, наличие дополнительных лигандов или субстратов и т.д.).

1.2 Двухкомпонентные сигнальные системы

Двухкомпонентные сигнальные системы (или двухкомпонентные системы) - это сигнальные системы, которые позволяют бактерии эффективно адаптироваться к изменчивым условиям внешней окружающей среды. Такие сигнальные системы довольно широко распространены среди бактерий, в том числе и в патогенных штаммах. В среднем, в бактерии насчитывается около 26 ДКС. Так, в 2007 году был проведен геномный анализ 457 полностью отсеквенированных бактерий, и в них было обнаружено 23966 генов ДКС [14].

Было замечено, что работа подобных сигнальных систем у бактерий связана с процессами формирования биопленок, а также ассоциирована с бактериальной вирулентностью [15]. В дополнение к этому, было опубликовано значительное количество сведений о том, что именно работа подобных сигнальных систем позволяет бактериям приобрести лекарственную устойчивость [16]. Некоторые ДКС необходимы бактериям для роста и выживания [17-21]. Учитывая, какую роль ДКС играют в жизни бактерий, характеризация подобных сигнальных систем представляет значительный научный интерес. А полученные знания могут быть использованы в решения прикладных задач, таких как разработка антибиотиков нового типа, а также в области создания новых биосенсоров.

ДКС состоит из двух белков, двух компонент, которые и дали называние подобным сигнальным системам. Одна компонента - рецепторный белок, которые еще называется

сенсорной киназой (SK - sensor kinase) или гистидин киназой (HK - histidine kinase). Гистидин киназа - это независимый белок, который способен фосфорилироваться в зависимости от внешнего стимула (изменения уровня питательных веществ, осмотическое давления, pH среды, антибиотики и т.д.). В таблице 1.2.1 приведены некоторые известные двухкомпонентные сигнальные системы и стимулы, на которые реагирует гистидин киназа. После того, как консервативный остаток гистидина фосфорилируется в сенсорной киназе, происходит перенос фосфатной группы уже на консервативный остаток аспартата второго белка ДКС, так называемого регулятора ответа (RR) [22]. У белка регулятора ответа может быть так называемый HTH (helix-tern-helix) домен, по которому происходит димеризация белка после переноса фосфатной группы. Подобный димерный комплекс способен взаимодействовать с целевой областью ДНК, смежной с промотором. Таким образом ДКС регулирует профиль экспрессии генов, модулируя активность промотора [23,24].

Таблица 1.2.1 - Примеры известных ДКС, реагирующих на различные стимулы. Таблица из статьи [25].

ДКС (SK/RR) СТИМУЛ

QseC/QseB АИ-3, адреналин, норадреналин [26]

NarQ/NarP нитраты и нитриты [27]

NarX/NarL нитраты и нитриты [28]

ArcB/ArcA хиноны [29,30]

KdpD/KdpE ионы калия [31 ]

CheA/CheY серин и аспартат [32]

FixL/FixG 02, СО, N0 [33]

NtrB/NtrC 2-кетоглуторат, глутамин [34]

LovK/LovR синий свет [35]

VanS/VanR ванкомицин [36]

DesR/DesK температура [37]

BvgS/BvgA температура, ионы сульфата, никотиновая кислота [38]

CitA/CitB цитраты [39,40]

LuxQ/LuxO АИ-2 [41]

TodS/TosT моноароматические соединения [42,43]

1.2.1 Структура гистидин киназ

Как уже было ранее сказано, существует огромное разнообразие белков рецепторов в ДКС, которое в том числе проявляется в структурных особенностях этих белков. Гистидин киназы можно разделить на те, которые ассоциированы с мембраной (около 83 % сенсорных киназ обладают трансмембранным регионом [14]), и те, которые находятся в цитозоле клетки. В свою очередь, гистидин киназы, ассоциированные с мембраной, можно разделить на те, которые имеют собственный сенсорный домен и те, которые его не имеют. Сенсорный домен в таких белках может располагаться как в цитоплазме, так и периплазме, а в некоторых случаях может быть ассоциирован с клеточной мембраной. Те белки, которые не имеют сенсорного домена, могут быть ассоциированы в свою очередь с хеморецептором или же с фоторецептором [44,45], а также, например, иметь несколько трансмембранных участков [46].

Сенсорные киназы обладают доменной структурной организацией, и очень часто в подобных белках можно встретить домены, которые дублируются несколько раз. В качестве примера можно привести TodS [42], который содержит два автокиназных домена, а также KinA [47], который содержит три сенсорных домена. Среди белков можно также найти те, которые обладают сенсорным доменом как в периплазме, так и в цитозоле бактериальной клетки (к примеру, CitA [48]) (рис. 1.2.1).

Также структурные и биохимические исследования свидетельствуют о том, что сенсорные гистидин киназы часто в функциональном состоянии представляют из себя гомодимер [49]. Единственными известными на сегодняшний день исключениями являются полученная структура гетеродимерного сенсорного белка GacRetS [50] и растворимая гистидин киназа EL346, структуру которой удалось получить в виде мономера [51].

На основе модульной организации гистидин киназы можно разделить на 3 основных класса (I-III). Подавляющее большинство гистидин киназ принадлежит к классу I, который организован следующим образом: а) сенсорный модуль (SEN), б) модуль передачи или так называемый модуль трансдукции (TRA) и наконец в) каталитический модуль (CAT) [52].

Сенсорный модуль (SEN) обычно расположен на N-конце белка и, как уже упоминалось, может нести сразу несколько сенсорных доменов. Следующий по порядку модуль - TRA. В гистидин киназах модуль трансдукции может состоять из нескольких трансмембранных сегментов (в случае трансмембранных гистидин киназ), а также может включать от одного до нескольких доменов, которые способны передавать сигнал, таких как HAMP домен (гистидин киназа, аденилил циклаза, метил-акцепторный белок хемотаксиса и фосфатаза), PAS домен

(содержащийся в белках Per-Arnt-Sim), или же GAF домен (cGMP-специфические фосфодиэстеразы, аденилил циклазы и FhlA) [53].

Рисунок 1.2.1. На рисунке изображены различные мембранные гистидин киназы с их доменной структурной организацией. Иллюстрация из статьи [52].

Каталитический модуль (CAT) представляет из себя общий структурный модуль для всех гистидин киназ, относящихся к I классу. CAT модуль включает в себя два домена: домен димеризации и гистидин фосфотрансферный домен (DHp) и каталитический домен (CA, он же АТФ-связывающий домен). DHp имеет удлиненную форму и представляет из себя шпильку из двух а-спиралей, которая и отвечает за гомодимеризацию. В процессе формирования димера, две последовательно идущие а-спиралей DHp домена расположенные антипараллельно друг другу (направления от N к С концу каждой спирали отличаются) формируют со направленную структуру .Сам по себе фосфорилируемый гистидин находится в консервативном мотиве а1 спираль (рис. 1.2.2.b) [54,55]. DHp также включает в себя АТФ-связывающий карман или же так называемую «складку Бержера» (ABD на рис. 1.2.2.b), представляющий из себя смешанную а/р вторичную структуру, которая состоит из расположенных с одной стороны трех а-спиралей с одной стороны и пятицепочечный Р-лист с другой стороны. «Складка Бержера» довольно широко распространена в супер семействе белков GHKL (ДНК гираза, HSP90, гистидин киназы и MutL),

которые проявляют медленную АТФазную активность [56]. ABD связывают комплекс АТФ-Мд2+, вовлекая в это консервативные аминокислотные остатки (N5 G1, F, G2, G3).

Рисунок 1.2.2. Схема передачи сигнала ДКС. (а) I путь: трансмембранный гистидин киназа взаимодействующая с белком регулятором ответа. II путь: фосфорилирование происходящее через белки-посредники. III путь: включает в себя более сложную архитектуру гистидин киназы. IV путь: предполагается растворимая гистидин киназа (обычно содержит LOV домен). (Ь) Каталитический модуль гистидин киназы (PDB 5ШМ). Два протомера внутри димера выделены различными цветами (зеленым и желтым). (с) Мономерный белок регулятор ответа (PDB 4GVP). Иллюстрация из статьи [57].

Помимо простой доменной архитектуры, состоящей из трех модулей SEN/TRA/CAT, существуют и более сложны структурные организации гистидин киназ. Некоторые гистидин киназы в своей структуре дополнительно содержат ЯЕС домен, который встречается в белках регуляторах ответа. Подобные белки, называются гибридными гистидин киназами (ННК) [58], [14], [59]. Гибридные гистидин киназы часто участвуют в сигнальном пути, которые отличается от сигнального пути обычных ДКС тем, что в нем участвуют дополнительные белки, которые могут быть двух типов: содержащие DHp домен, которые очень похоже на обычные гистидин киназы, или же белки, которые могут содержать домены гистидин фосфотрансфера (НР^. Эти

два типа белков структурно отличаются друг от друга, но при этом выполняют похожую функцию. Оба типа промежуточных фосфотрансфераз обладают фосфорилируемым гистидином, но не способны к автофосфорилированию [59], [60].

Аминокислотные последовательности гистидин киназ позволяют предположить в структуре наличие так называемых «coiled coil» структур, которые представляют из себя переплетающиеся а-спирали [61]. Подобная структура находится с N-концевой стороны DHp домена, который связан с coiled coils спиралью посредством так называемой Ja спиралью иди же S-спиралью [62]. Обычно S-спираль позиционируется как часть DHp домена в CAT модуле. В случае, когда в структуре гистидин киназы присутствуют более длинные TRA модули (соответствуют сигнальным путям I и III на рис. 1.2.2) дополнительные S-спирали являются своего рода соединительными элементами для промежуточных доменов [63], [64], [65]. Обычно S-спирали довольно склонны как определенным конформационным изменениям, в связи с тем, что они состоят из полярных аминокислотных остатков, которые снижают ее энергетическую стабильность. Также с помощью секвенирования не возможно обнаружить точное положение coiled coils спиралей, возможно это связано с тем, что точное положение подобных структур определяется функциональным состоянием белка, что было подтверждено экспериментально в структурах белков находящихся в нескольких состояниях [66,67].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гончаров Иван Михайлович, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zulauf M. Detergent phenomena in membrane protein crystallization // Crystallization of membrane proteins. 2018. С. 53-72.

2. Pogozheva I.D., Lomize A.L. Evolution and adaptation of single-pass transmembrane proteins // Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Biomembranes. Elsevier B.V, 2018. Т. 1860, № 2. С. 364-377.

3. Overduin M., Esmaili M. Memtein: the fundamental unit of membrane-protein structure and function // Chem. Phys. Lipids. Elsevier Ireland Ltd, 2019. Т. 218. С. 73-84.

4. Pollock N.L. и др. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer // Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Biomembranes. Elsevier B.V, 2018. Т. 1860, № 4. С. 809-817.

5. Kubicek J. и др. Expression and purification of membrane proteins // Methods Enzymol. 2014. Т. 541. С. 117-140.

6. Papon N., Stock A.M. Two-component systems // Curr. Biol. Elsevier, 2019. Т. 29, № 15. С. R724-R725.

7. Bingel-Erlenmeyer R. и др. SLS Crystallization Platform at Beamline X06DA - A Fully Automated Pipeline Enabling in Situ X-ray Diffraction Screening // Cryst. Growth Des. 2011. Т. 11, № 4. С. 916-923.

8. Helliwell J.R. Macromolecular crystallography with synchrotron radiation // Cambridge University Press. 2005.

9. Pflugrath J.W. Macromolecular cryocrystallography—methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures // Methods. 2004. Т. 34, № 3. С. 415-423.

10. Pflugrath J.W. Practical macromolecular cryocrystallography // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Commun. International Union of Crystallography, 2015. Т. 71, № 6. С. 622-642.

11. Garman E.F., Schneider T.R. Macromolecular Cryocrystallography // J. Appl. Crystallogr. International Union of Crystallography, 1997. Т. 30, № 3. С. 211-237.

12. McPherson A., Gavira J.A. Introduction to protein crystallization // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Commun. International Union of Crystallography, 2014. Т. 70, № 1. С. 2-20.

13. Basi A. и др. Protein expression handbook Recombinant protein expression and purification technologies. 2015. 1-112 с.

14. Cock P.J.A., Whitworth D.E. Evolution of Prokaryotic Two-Component System Signaling Pathways : Gene Fusions and Fissions // Mol. Biol. Evol. 2007. Т. 24, № 11. С. 2355-2357.

15. Gotoh Y. и др. Two-component signal transduction as potential drug targets in pathogenic bacteria // Curr. Opin. Microbiol. Elsevier Ltd, 2010. Т. 13, № 2. С. 232-239.

16. Tierney A.R., Rather P.N. Roles of two-component regulatory systems in antibiotic resistance // Future Microbiol. 2019. Т. 14, № 6. С. 533-552.

17. Fabret C., Hoch J.A. A Two-Component Signal Transduction System Essential for Growth of

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

Bacillus subtilis : Implications for Anti-Infective Therapy // J. Bacteriol. 1998. T. 180, № 23. C. 6375-6383.

Dubrac S., Msadek T. Identification of Genes Controlled by the Essential YycG / YycF Two-Component System of Staphylococcus aureus // J. Bacteriol. 2004. T. 186, № 4. C. 1175-1181.

Ng W. h gp. Constitutive expression of PcsB suppresses the requirement for the essential VicR ( YycF ) response regulator in Streptococcus pneumoniae R6 § // Mol. Microbiol. 2003. T. 50, № 5. C. 1647-1663.

Senadheera M.D. h gp. A VicRK Signal Transduction System in Streptococcus mutans Affects gtfBCD , gbpB , and ftf Expression , Biofilm Formation , and Genetic Competence Development // J. Bacteriol. 2005. T. 187, № 12. C. 4064-4076.

Hancock L., Perego M., V E.F.S. Two-Component Signal Transduction in Enterococcus faecalis // J. Bacteriol. 2002. T. 184, № 21. C. 5819-5825.

Gao R., Stock A.M. Biological Insights from Structures of Two-Component Proteins // Annu. Rev. Microbiol. 2009. T. 63, № 1. C. 133-154.

Kenney L.J. Structure / function relationships in OmpR and other winged-helix transcription factors // Curr. Opin. Microbiol. 2002. T. 5, № 2. C. 135-141.

Galperin M.Y., Galperin M.Y. Structural Classification of Bacterial Response Regulators : Diversity of Output Domains and Domain Combinations Structural Classification of Bacterial Response Regulators : Diversity of Output Domains and Domain Combinations // J. Bacteriol. 2006. T. 188, № 12. C. 4169-4182.

Krell T. h gp. Bacterial Sensor Kinases: Diversity in the Recognition of Environmental Signals // Annu. Rev. Microbiol. 2010. T. 64, № 1. C. 539-559.

Clarke M.B. h gp. The QseC sensor kinase: A bacterial adrenergic receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. T. 103, № 27. C. 10420-10425.

Gushchin I. h gp. Mechanism of transmembrane signaling by sensor histidine kinases // Science (80-. ). 2017. T. 356, № 642.

Lee A., Delgado N., Gunsalus R. Signal-Dependent Phosphorylation of the Membrane-Bound NarX Two-Component Sensor-Transmitter Protein of Escherichia coli : Nitrate Elicits a Superior Anion Ligand Response Compared to Nitrite // J. Bacteriol. 1999. T. 181, № 17. C. 5309-5316.

Malpica R. h gp. Identification of a quinone-sensitive redox switch in the ArcB sensor kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. T. 101, № 36. C. 13318-13323.

Georgellis D. h gp. Quinones as the Redox Signal for the Arc Two-Component System of Bacteria // Science (80-. ). 2001. T. 292, № 5525. C. 2314-2316.

Epstein W. The Roles and Regulation of Potassium in Bacteria // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2003. T. 75. C. 293-320.

Li M., Hazelbauer G.L. Cellular Stoichiometry of the Components of the Chemotaxis Signaling Complex // J. Bacteriol. 2004. T. 186, № 12. C. 3687-3694.

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

Gonzalez G. Heme-based sensors : defining characteristics , recent developments , and regulatory hypotheses // J. Inorg. Biochem. 2005. T. 99, № 1. C. 1-22.

Jiang P., Ninfa A.J. Regulation of Autophosphorylation of Escherichia coli Nitrogen Regulator II by the PII Signal Transduction Protein // J. Bacteriol. 1999. T. 181, № 6. C. 1906-1911.

Purcell E.B. h gp. A photosensory two-component system regulates bacterial cell attachment // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. T. 104, № 46. C. 18241-18246.

Hutchings M.I., Hong H., Buttner M.J. The vancomycin resistance VanRS two-component signal transduction system of Streptomyces coelicolor // Mol. Microbiol. 2006. T. 59, № 3. C. 923-935.

Aguilar P.S., Maro A., Cybulski L.E. Molecular basis of thermosensing : a two-component signal transduction thermometer in Bacillus subtilis // EMBO J. 2001. T. 20, № 7. C. 1681-1691.

Beier D., Gross R. Regulation of bacterial virulence by two-component systems // Curr. Opin. Microbiol. 2006. T. 9, № 2. C. 143-152.

Kaspar S. h gp. The periplasmic domain of the histidine autokinase CitA functions as a highly specific citrate receptor // Mol. Microbiol. 1999. T. 33, № 4. C. 858-872.

Bott M., Meyer M., Dimroth P. Regulation of anaerobic citrate metabolism in Klebsiella pneumoniae // Mol. Microbiol. 1995. T. 18, № 3. C. 533-546.

Neiditch M.B. h gp. Ligand-Induced Asymmetry in Histidine Sensor Kinase Complex Regulates Quorum Sensing // Cell. 2006. T. 126, № 6. C. 1095-1108.

Busch A. h gp. Bacterial sensor kinase TodS interacts with agonistic and antagonistic signals // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. T. 104, № 34. C. 13774-13779.

Lacal J. h gp. The TodS - TodT two-component regulatory system recognizes a wide range of effectors and works with DNA-bending proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. T. 103, № 21. C. 8191-8196.

Hazelbauer G.L., Falke J.J., Parkinson J.S. Bacterial chemoreceptors: high-performance signaling in networked arrays // Trends Biochem. Sci. 2008. T. 33, № 1. C. 9-19.

Parkinson J.S., Hazelbauer G.L., Falke J.J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update // Trends Microbiol. Elsevier Ltd, 2015. T. 23, № 5. C. 257-266.

Fabret C., Feher V.A., Hoch J.A. wo-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world // J. Bacteriol. 1999. T. 181, № 7. C. 1975-1983.

Stephenson K., Hoch J.A. PAS-A domain of phosphorelay sensor kinase A: A catalytic ATP-binding domain involved in the initiation of development in Bacillus subtilis // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. T. 98, № 26. C. 15251-15256.

Sperandio V. h gp. Bacteria-host communication: The language of hormones // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. T. 100, № 15. C. 8951-8956.

Capra E.J., Laub M.T. Evolution of two-component signal transduction systems // Annu. Rev. Microbiol. 2012. T. 66. C. 325-347.

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

Goodman A.L. u gp. Direct interaction between sensor kinase proteins mediates acute and chronic disease phenotypes in a bacterial pathogen // Genes Dev. 2009. T. 23, № 2. C. 249-259.

Rivera-Cancel G. u gp. Full-length structure of a monomelic histidine kinase reveals basis for sensory regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. T. 111, № 50. C. 17839-17844.

Gushchin I., Gordeliy V. Transmembrane Signal Transduction in Two-Component Systems: Piston, Scissoring, or Helical Rotation? // BioEssays. 2018. T. 40, № 2. C. 1-10.

Bhate M.P. u gp. Signal transduction in histidine kinases: insights from new structures // Structure. Elsevier Ltd, 2015. T. 23, № 6. C. 981-994.

Tomomori C., Al E. Solution structure of the homodimeric core domain of Escherichia coli histidine kinase EnvZ // Nat. Struct. Biol. 1999. T. 6, № 8. C. 729-734.

Marina A., Waldburger C.D., Hendrickson W.A. Structure of the entire cytoplasmic portion of a sensor histidine-kinase protein // EMBO J. 2005. T. 24, № 24. C. 4247-4259.

Dutta R., Inouye M. GHKL, an emergent ATPase/kinase superfamily // Trends Biochem. Sci. 2000. T. 25, № 1. C. 24-28.

Buschiazzo A., Trajtenberg F. Two-component sensing and regulation: how do histidine kinases talk with response regulators at the molecular level? // Annu. Rev. Microbiol. 2019. T. 73. C. 507-528.

Wuichet K., Cantwell B.J., Zhulin I.B. Evolution and phyletic distribution of two-component signal transduction systems // Curr. Opin. Microbiol. Elsevier Ltd, 2010. T. 13, № 2. C. 219-225.

Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. Two-component signal transduction // Annu. Rev. Biochem. 2000. T. 69, № 1. C. 183-215.

Fassler J.S., West A.H. Histidine phosphotransfer proteins in fungal two-component signal transduction pathways // Eukaryot. Cell. 2013. T. 12, № 8. C. 1052-1060.

Singh M. u gp. Computational learning reveals coiled coil-like motifs in histidine kinase linker domains // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. T. 95, № 6. C. 2738-2743.

Anantharaman V., Balaji S., Aravind L. The signaling helix: a common functional theme in diverse signaling proteins // Biol. Direct. 2006. T. 1, № 1. C. 25.

Wang C. u gp. Mechanistic Insights Revealed by the Crystal Structure of a Histidine Kinase with Signal Transducer and Sensor Domains // PLoS Biol. 2013. T. 11, № 2.

Stewart V., Chen L. The S helix mediates signal transmission as a HAMP domain coiled-coil extension in the NarX nitrate sensor from Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 2010. T. 192, № 3. C. 734-745.

Lesne E. u gp. Coiled-coil antagonism regulates activity of Venus flytrap-Domain-containing sensor kinases of the BvgS family // MBio. 2018. T. 9, № 1.

Albanesi D. u gp. Structural plasticity and catalysis regulation of a thermosensor histidine kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. T. 106, № 38. C. 16185-16190.

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

Schmidt N.W., Grigoryan G., DeGrado W.F. The accommodation index measures the perturbation associated with insertions and deletions in coiled-coils: Application to understand signaling in histidine kinases // Protein Sci. 2017. T. 26, № 3. C. 414-435.

Galperin M.Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains // Curr. Opin. Microbiol. Elsevier Ltd, 2010. T. 13, № 2. C. 150-159.

Hegemann P. Algal Sensory Photoreceptors // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. T. 59. C. 167-189.

Möglich A. h gp. Structure and Function of Plant Photoreceptors // Annu. Rev. Plant Biol. 2010. T. 61.

Christie J.M. h gp. Arabidopsis NPH1: a flavoprotein with the properties of a photoreceptor for phototropism // Science (80-. ). 1998. T. 282, № 5394. C. 1698-1701.

Conrad K.S., Manahan C.C., Crane B.R. Photochemistry of flavoprotein light sensors // Nat. Publ. GroupNature Chem. Biol. Nature Publishing Group, 2014. T. 10, № 10. C. 801-809.

Cegelski L. h gp. he biology and future prospects of antivirulence therapies // Nat. Rev. Microbiol. 2008. T. 6, № 1. C. 17-27.

Clatworthy A.E., Pierson E., Hung D.T. Targeting virulence: a new paradigm for antimicrobial therapy // Nat. Chem. Biol. 2007. T. 3, № 9. C. 541-548.

Hancock R.E.W. Collateral damage // Nat. Biotechnol. Nature Publishing Group, 2014. T. 32, № 1. C. 66-68.

Ng W., Bassler B.L. Bacterial quorum-sensing network architectures // Annu. Rev. Genet. 2009. T. 43. C. 197-222.

Defoirdt T. Quorum-sensing systems as targets for antivirulence therapy // Trends Microbiol. Elsevier Ltd, 2018. T. 26, № 4. C. 313-328.

Jakobsen T.H. h gp. A broad range quorum sensing inhibitor working through sRNA inhibition // Sci. Rep. Springer US, 2017. T. 7, № 1. C. 1-12.

Jakobsen T.H. h gp. Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing // Antimicrob. Agents Chemother. 2012. T. 56, № 5. C. 2314-2325.

Vikram A. h gp. Citrus limonoids interfere with Vibrio harveyi cell-cell signalling and biofilm formation by modulating the response regulator LuxO // Microbiology. 2011. T. 157, № 7. C. 99110.

Paczkowski J.E. h gp. Flavonoids suppress Pseudomonas aeruginosa virulence through allosteric inhibition of quorum-sensing receptors // J. Biol. Chem. 2017. T. 292, № 10. C. 4064-4076.

Yang Q. h gp. Indole signalling and (micro) algal auxins decrease the virulence of V ibrio campbellii, a major pathogen of aquatic organisms // Environ. Microbiol. 2017. T. 19, № 5. C. 1987-2004.

Vandeputte O.M. h gp. The flavanone naringenin reduces the production of quorum sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1 // Microbiology. 2011. T. 157, № 7. C. 2120-2132.

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

Yang Q. h gp. Specific quorum sensing-disrupting activity (A QSI) of thiophenones and their therapeutic potential // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. T. 5, № 1. C. 1-9.

Brackman G. h gp. Synthesis and evaluation of thiazolidinedione and dioxazaborocane analogues as inhibitors of AI-2 quorum sensing in Vibrio harveyi // Bioorg. Med. Chem. Elsevier Ltd, 2013. T. 21, № 3. C. 660-667.

Article E. h gp. Highly potent, chemically stable quorum sensing agonists for Vibrio cholerae // Chem. Sci. 2014. T. 5, № 1. C. 151-155.

Palliyil S. h gp. High-sensitivity monoclonal antibodies specific for homoserine lactones protect mice from lethal Pseudomonas aeruginosa infections // Appl. Environ. Microbiol. 2014. T. 80, № 2. C. 462-469.

Chu W. h gp. Quorum quenching bacteria Bacillus sp. QSI-1 protect zebrafish (Danio rerio) from Aeromonas hydrophila infection // Sci. Rep. 2014. T. 4, № 1. C. 1-6.

Koch G. h gp. Reducing virulence of the human pathogen Burkholderia by altering the substrate specificity of the quorum-quenching acylase PvdQ // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. T. 111, № 4. C. 1568-1573.

Welsh M.A. h gp. Small molecule disruption of quorum sensing cross-regulation in Pseudomonas aeruginosa causes major and unexpected alterations to virulence phenotypes // J. Am. Chem. Soc. 2015. T. 137, № 4. C. 1510-1519.

Caicedo J.C. h gp. Bacteria from the citrus phylloplane can disrupt cell-cell signalling in Xanthomonas citri and reduce citrus canker disease severity // Plant Pathol. 2016. T. 65, № 5. C. 782-791.

Newman K.L. h gp. Virulence of plant pathogenic bacteria attenuated by degradation of fatty acid cell-to-cell signaling factors // Mol. plant-microbe Interact. 2008. T. 21, № 3. C. 326-334.

Defoirdt T. h gp. Quorum sensing-disrupting brominated furanones protect the gnotobiotic brine shrimp Artemia franciscana from pathogenic Vibrio harveyi, Vibrio campbellii, and Vibrio parahaemolyticus isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2006. T. 72, № 9. C. 6419-6423.

Hentzer M. h gp. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors // EMBO J. 2003. T. 22, № 15. C. 3803-3815.

Pande G.S.J. h gp. Isolation of AHL-degrading bacteria from micro-algal cultures and their impact on algal growth and on virulence of Vibrio campbellii to prawn larvae // Appl. Microbiol. Biotechnol. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015. T. 99, № 24. C. 10805-10813.

Von Bodman S.B., Willey J.M., Diggle S.P. Cell-cell communication in bacteria: united we stand // J. Bacteriol. 2008. T. 190, № 13. C. 4377-4391.

Defoirdt T., Boon N., Bossier P. Can bacteria evolve resistance to quorum sensing disruption? // PLoS Pathog. 2010. T. 6, № 7. C. 2-7.

Maeda T. h gp. Quorum quenching quandary: resistance to antivirulence compounds // ISME J. 2012. T. 6, № 3. C. 493-501.

99.

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

Mellbye B., Schuster M. The sociomicrobiology of antivirulence drug resistance: a proof of concept // MBio. 2011. T. 2, № 5.

Lavis L.D., Raines R.T. Bright Ideas for Chemical Biology // ACS Chem. Biol. 2008. T. 3, № 3. C.142-155.

Wysocki L.M., Lavis L.D. Advances in the chemistry of small molecule fluorescent probes // Curr. Opin. Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2011. T. 15, № 6. C. 752-759.

Lavis L.D., Raines R.T. Bright Building Blocks for Chemical Biology // ACS Chem. Biol. 2014. T. 9, № 4. C. 855-866.

Grimm J.B. h gp. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy // Nat. Methods. 2015. T. 12, № 3. C. 244-250.

Lukinavicius G, Umezawa K, Olivier N, Honigmann A, Yang G, Plass T, Mueller V, Reymond L, Correa Jr IR, Luo ZG S.C. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins // Nat. Chem. 2013. T. 5, № 2. C. 132-139.

Lukinavicius G, Reymond L, D'este E, Masharina A, Göttfert F, Ta H, Güther A, Fournier M, Rizzo S, Waldmann H B.C. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton // Nat. Methods. 2014. T. 11, № 7. C. 731-733.

Lukinavicius G, Blaukopf C, Pershagen E, Schena A, Reymond L, Derivery E, Gonzalez-Gaitan M, D'Este E, Hell SW, Gerlich DW J.K. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy // Nat. Commun. 2015. T. 6, № 1. C. 1-7.

Grimm J.B. h gp. Carbofluoresceins and carborhodamines as scaffolds for high-contrast fluorogenic probes // ACS Chem. Biol. 2013. T. 8, № 6. C. 1303-1310.

Giepmans B.N. h gp. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function // Science (80-. ). 2006. T. 312, № 5771. C. 217-224.

Snapp E.L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide // Trends Cell Biol. 2009. T. 19, № 11. C. 649-655.

Chudakov D.M. h gp. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues // Physiol. Rev. 2010. T. 90, № 3. C. 1103-1163.

Shaner N.C. h gp. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum // Nat. Methods. Nature Publishing Group, 2013. T. 10, № 5. C. 407-409.

Bajar B.T. h gp. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2016. T. 6, № 1. C. 1-12.

Shemiakina I.I. h gp. A monomeric red fluorescent protein with low cytotoxicity // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2012. T. 3, № 1. C. 1-7.

Hense A. h gp. Monomeric Garnet, a far-red fluorescent protein for live-cell STED imaging // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. T. 5, № 1. C. 1-10.

Costantini L.M. h gp. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

environments // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2015. T. 6, № 1. C. 1-13.

Cranfill P.J. h gp. Quantitative assessment of fluorescent proteins // Nat. Methods. Nature Publishing Group, 2016. T. 13, № 7. C. 557-562.

Stadler C. h gp. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells // Nat. Methods. 2013. T. 10, № 4. C. 315.

Specht E.A., Braselmann E., Palmer A.E. A critical and comparative review of fluorescent tools for live-cell imaging // Annu. Rev. Physiol. 2017. T. 29. C. 93-117.

Giraldez T., Hughes T.E., Sigworth F.J. Generation of functional fluorescent BK channels by random insertion of GFP variants // J. Gen. Physiol. 2005. T. 126, № 5. C. 429-438.

Chen X., Zaro J.L., Shen W. Fusion protein linkers: property, design and functionality // Adv. Drug Deliv. Rev. Elsevier B.V., 2013. T. 65, № 10. C. 1357-1369.

Costantini L.M., Snapp E.L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions // DNA Cell Biol. 2013. T. 32, № 11. C. 622-627.

Pédelacq J.D. h gp. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein // Nat. Biotechnol. 2006. T. 24, № 1. C. 79-89.

Kamiyama D. h gp. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2016. T. 7, № 1. C. 1-9.

Knop M., Edgar B.A., Edgar B.A. Tracking protein turnover and degradation by microscopy: photo-switchable versus time-encoded fluorescent proteins // Open Biol. 2014. T. 4, № 4. C. 140002.

Pletnev S. h gp. Understanding blue-to-red conversion in monomeric fluorescent timers and hydrolytic degradation of their chromophores // J. Am. Chem. Soc. 2010. T. 132, № 7. C. 22432253.

Khmelinskii A. h gp. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics // Nat. Biotechnol. Nature Publishing Group, 2012. T. 30, № 7. C. 708.

Khmelinskii A. h gp. Incomplete proteasomal degradation of green fluorescent proteins in the context of tandem fluorescent protein timers // Mol. Biol. Cell. 2016. T. 27, № 2. C. 360-370.

Huala E. h gp. Arabidopsis NPH1: a protein kinase with a putative redox-sensing domain // Science (80-. ). 1997. T. 278, № 5346. C. 2120-2123.

Crosson S., Rajagopal S., Moffat K. The LOV domain family: photoresponsive signaling modules coupled to diverse output domains // Biochemistry. 2003. T. 42, № 1. C. 2-10.

Losi A. h gp. First evidence for phototropin-related blue-light receptors in prokaryotes // Biophys. J. 2002. T. 82, № 5. C. 2627-2634.

Gaidenko T.A. h gp. The blue-light receptor YtvA acts in the environmental stress signaling pathway of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 2006. T. 188, № 17. C. 6387-6395.

Akbar S. h gp. New Family of Regulators in the Environmental Signaling Pathway Which

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

Activates the General Stress Transcription Factor çB of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 2001. T. 183, № 4. C. 1329-1338.

Glantz S.T. h gp. Functional and topological diversity of LOV domain photoreceptors // Proc. Natl. Acad. Sci. 2016. T. 113, № 11. C. E1442-E1451.

Zoltowski B.D. h gp. Conformational switching in the fungal light sensor Vivid // Science. 2007. T. 16, № 5827. 1054-1057 c.

Roberts G.C. LOV Proteins: Photobiophysics. 2013.

Möglich A., Ayers R.A., Moffat K. Structure and Signaling Mechanism of Per-ARNT-Sim Domains // Structure. 2009. T. 17, № 10. C. 1282-1294.

Crosson S., Moffat K. Structure of a flavin-binding plant photoreceptor domain : Insights into light-mediated signal transduction // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. T. 98, № 6. C. 2995-3000.

Circolone F. h gp. Structural basis for the slow dark recovery of a full-length LOV protein from Pseudomonas putida // J. Mol. Biol. Elsevier Ltd, 2012. T. 417, № 4. C. 362-374.

Halavaty A.S., Moffat K. N-and C-terminal flanking regions modulate light-induced signal transduction in the LOV2 domain of the blue light sensor phototropin 1 from Avena sativa // Biochemistry. 2007. T. 46, № 49. C. 14001-14009.

Harper S.M., Neil L.C., Gardner K.H. Structural basis of a phototropin light switch // Science (80-. ). 2003. T. 301, № 5639. C. 1541-1544.

Zayner J.P., Antoniou C., Sosnick T.R. The Amino-Terminal Helix Modulates Light-Activated Conformational Changes in As LOV2 // J. Mol. Biol. Elsevier Ltd, 2012. T. 419, № 1-2. C. 6174.

Möglich A., Ayers R.A., Moffat K. Design and Signaling Mechanism of Light-Regulated Histidine Kinases // J. Mol. Biol. Elsevier B.V., 2009. T. 385, № 5. C. 1433-1444.

Finn R.D. h gp. Pfam: clans, web tools and services // Nucleic Acids Res. 2006. T. 34. C. D247-D251.

Rinaldi J. h gp. Crystallization and initial X-ray diffraction analysis of the multi-domain Brucella blue light-activated histidine kinase LOV-HK in its illuminated state // Biochem. Biophys. Reports. Elsevier B.V., 2018. T. 16, № September. C. 39-43.

Möglich A. Signal transduction in photoreceptor histidine kinases // Protein Sci. 2019. T. 28, № 11. C. 1923-1946.

Drepper T. h gp. Flavin mononucleotide-based fluorescent reporter proteins outperform green fluorescent protein-like proteins as quantitative in vivo real-time reporters // Appl. Environ. Microbiol. 2010. T. 76, № 17. C. 5990-5994.

Landete J.M. h gp. Anaerobic green fluorescent protein as a marker of Bifidobacterium strains // Int. J. Food Microbiol. Elsevier B.V., 2014. T. 175. C. 6-13.

Lobo L.A., Smith C.J., Rocha E.R. Flavin mononucleotide (FMN)-based fluorescent protein (FbFP) as reporter for gene expression in the anaerobe Bacteroides fragilis // FEMS Microbiol.

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

Lett. 2011. T. 317, № 1. C. 67-74.

Walter J. h gp. Flavin Mononucleotide-Based Fluorescent Proteins Function in Mammalian Cells without Oxygen Requirement // PLoS One. 2012. T. 7, № 9. C. e43921.

Clark I.C. h gp. Genetic dissection of chlorate respiration in P seudomonas stutzeri PDA reveals syntrophic (per) chlorate reduction // Environ. Microbiol. 2016. T. 18, № 10. C. 3342-3354.

Tielker D., Eichhof I., Ernst J.F. Flavin mononucleotide-based fluorescent protein as an oxygen-independent reporter in Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae // Eukaryot. Cell. 2009. T. 8, № 6. C. 913-915.

Gawthorne J.A. h gp. Express your LOV: an engineered flavoprotein as a reporter for protein expression and purification // PLoS One. 2012. T. 7, № 12. C. 1-6.

Scholz K.E. h gp. Fusion of a flavin-based fluorescent protein to hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana improves enzyme stability // Appl. Environ. Microbiol. 2013. T. 79, № 15. C. 4727-4733.

Seo S. h gp. Development of an oxygen-independent flavin mononucleotide-based fluorescent reporter system in Clostridium beijerinckii and its potential applications // J. Biotechnol. Elsevier B.V., 2018. T. 265. C. 119-126.

Landete J.M. h gp. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015. T. 99, № 16. C. 6865-6877.

Choi C.H., Deguzman J. V, Lamont R.J. Genetic Transformation of an Obligate Anaerobe , P . gingivalis for FMN-Green Fluorescent Protein Expression in Studying Host-Microbe Interaction // PLoS One. 2011. T. 6, № 4. C. e18499.

Elgamoudi B.A., Ketley J.M. Lighting up my life: a LOV-based fluorescent reporter for Campylobacter jejuni // Res. Microbiol. Elsevier Masson SAS, 2018. T. 169, № 2. C. 108-114.

Wang S.E. h gp. The fluorescent protein iLOV outperforms eGFP as a reporter gene in the microaerophilic protozoan Trichomonas vaginalis // Mol. Biochem. Parasitol. Elsevier, 2017. T. 216, № March. C. 1-4.

Krol J.E. h gp. Dual reporter system for in situ detection of plasmid transfer under aerobic and anaerobic conditions // Appl. Environ. Microbiol. 2010. T. 76, № 13. C. 4553-4556.

Lara A.R. h gp. Characterization of endogenous and reduced promoters for oxygen-limited processes using Escherichia coli // ACS Synth. Biol. 2017. T. 6, № 2. C. 344-356.

Immethun C.M. h gp. Oxygen-responsive genetic circuits constructed in Synechocystis sp. PCC 6803 // Biotechnol. Bioeng. 2016. T. 113, № 2. C. 433-442.

Teng L. h gp. Flavin mononucleotide (FMN)-based fluorescent protein (FbFP) as reporter for promoter screening in Clostridium cellulolyticum // J. Microbiol. Methods. Elsevier B.V., 2015. T.119. C. 37-43.

Buckley A.M. h gp. Lighting up Clostridium difficile: reporting gene expression using fluorescent Lov domains // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. T. 6, № 1. C. 1-11.

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

Chapman S. и др. The photoreversible fluorescent protein iLOV outperforms GFP as a reporter of plant virus infection // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. Т. 105, № 50. С. 20038-20043.

Gawthorne J.A. и др. Visualizing the translocation and localization of bacterial type III effector proteins by using a genetically encoded reporter system // Appl. Environ. Microbiol. 2016. Т. 82, № 9. С. 2700-2708.

Seago J. и др. An infectious recombinant foot-and-mouth disease virus expressing a fluorescent marker protein // J. Gen. Virol. 2013. Т. 94, № Pt 7. С. 1517-1527.

Mukherjee A. и др. Engineering and characterization of new LOV-based fluorescent proteins from Chlamydomonas reinhardtii and Vaucheria frigida // ACS Synth. Biol. 2014. Т. 4, № 4. С. 371-377.

Rupprecht A.C. и др. A novel FbFP-based biosensor toolbox for sensitive in vivo determination of intracellular pH // J. Biotechnol. Elsevier B.V., 2017. Т. 258. С. 25-32.

Liu X. и др. Significant expansion of fluorescent protein sensing ability through the genetic incorporation of superior photo-induced electron-transfer quenchers // J. Am. Chem. Soc. 2014. Т. 136, № 38. С. 13094-13097.

Mukherjee A. и др. Characterization of flavin-based fluorescent proteins: an emerging class of fluorescent reporters // PLoS One. 2013. Т. 8, № 5. С. e64753.

Davari M.D. и др. Photophysics of the LOV-based fluorescent protein variant iLOV-Q489K determined by simulation and experiment // J. Phys. Chem. B. 2016. Т. 120, № 13. С. 3344-3352.

Khrenova M.G., Nemukhin A. V, Domratcheva T. Theoretical characterization of the flavin-based fluorescent protein iLOV and its Q489K mutant // J. Phys. Chem. B. 2015. Т. 119, № 16. С. 5176-5183.

Meteleshko Y.I., Nemukhin A. V., Khrenova M.G. Novel flavin-based fluorescent proteins with red-shifted emission bands: a computational study // Photochem. Photobiol. Sci. Royal Society of Chemistry, 2019. Т. 18, № 1. С. 177-189.

Wu Y.I. и др. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells // Nature. 2009. Т. 461, № 7260. С. 104-108.

Strickland D., Moffat K., Sosnick T.R. Light-activated DNA binding in a designed allosteric protein // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. Т. 105, № 31. С. 10709-10714.

Wu Y.I. и др. Spatiotemporal control of small GTPases with light using the LOV domain // Methods Enzymol. 2011. Т. 497. С. 393-407.

Назаренко В.В. СТРУКТУРНЫЕ И БИОФИЗИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА LOV. 2018.

Pudasaini A., El-arab K.K., Zoltowski B.D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling // Front. Mol. Biosci. 2015. Т. 2, № May. С. 1-15.

Strickland D. и др. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology //

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

Nat. Methods. 2012. T. 9, № 4. C. 379-384.

Lungu O.I. h gp. Designing photoswitchable peptides using the AsLOV2 domain // Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2012. T. 19, № 4. C. 507-517.

Guntas G. h gp. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. 2015. T. 112, № 1. C. 112117.

Herrou J., Crosson S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2011. T. 9, № 10. C. 713-723.

Losi A., Gärtner W. Solving Blue Light Riddles: New Lessons from Flavin-binding LOV Photoreceptors // Photochem. Photobiol. 2017. T. 93, № 1. C. 141-158.

Hart J.E., Gardner K.H. Lighting the way: Recent insights into the structure and regulation of phototropin blue light receptors // J. Biol. Chem. Elsevier B.V, 2021. T. 296. C. 100594.

Röllen K. h gp. The molecular basis of spectral tuning in blue- and red-shifted fl avin-binding fl uorescent proteins // J. Biol. Chem. Elsevier B.V, 2021. T. 296. C. 100662.

Hanada S. h gp. Chloroflexus aggregans sp. nov., a filamentous phototrophic bacterium which forms dense cell aggregates by active gliding movement // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1995. T. 45, № 4. C. 676-681.

Gaisin V.A. h gp. Chloroflexus islandicus sp. nov., a thermophilic filamentous anoxygenic phototrophic bacterium from a geyser // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017. T. 67, № 5. C. 13811386.

Björn L.O. Photoactive proteins //Photobiology // Springer. 2015. C. 139-150.

Brettel K., Byrdin M. Reaction mechanisms of DNA photolyase // Curr. Opin. Struct. Biol. Elsevier Ltd, 2010. T. 20, № 6. C. 693-701.

Gabruk M., Mysliwa-Kurdziel B. Light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase: phylogeny, regulation and catalytic properties // Biochemistry. 2015. T. 54, № 34. C. 5255-5262.

Ho M. h gp. Light-dependent chlorophyll f synthase is a highly divergent paralog of PsbA of photosystem II // Science (80-. ). 2016. T. 353, № 6302.

Sorigue D. h gp. An algal photoenzyme converts fatty acids to hydrocarbons // Science (80-. ). 2017. T. 357, № 6354. C. 903-907.

Damien S. h gp. Microalgae synthesize hydrocarbons from long-chain fatty acids via a light-dependent pathway // Plant Physiol. 2016. T. 171, № 4. C. 2393-2405.

Heyes D.J. h gp. On the photochemical mechanism of light-driven fatty acid photodecarboxylase // ACS Catal. 2020. T. 10, № 12. C. 6691-6696.

Huijbers M.M. h gp. Light-driven enzymatic decarboxylation of fatty acids // Angew. Chemie Int. Ed. 2018. T. 57, № 41. C. 13648-13651.

Bruder S. h gp. Drop-in biofuel production using fatty acid photodecarboxylase from Chlorella

variabilis in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica // Biotechnol. Biofuels. BioMed Central, 2019. Т. 12, № 1. С. 202.

197. Moulin S. и др. Continuous photoproduction of hydrocarbon drop-in fuel by microbial cell factories // Sci. Rep. 2019. Т. 9, № 1. С. 1-8.

198. Xu J. и др. Light-Driven Kinetic Resolution of a-Functionalized Carboxylic Acids Enabled by an Engineered Fatty Acid Photodecarboxylase // Angew. Chemie. 2019. Т. 131, № 25. С. 85628566.

199. Zhang W. и др. Hydrocarbon Synthesis via Photoenzymatic Decarboxylation of Carboxylic Acids // Chem. Soc. 2019. Т. 141, № 7. С. 3116-3120.

200. Cha A.H. и др. Whole-cell photoenzymatic cascades to synthesize long-chain aliphatic amines and esters from renewable fatty acids // Angew. Chemie. 2020. Т. 132, № 18. С. 7090-7094.

201. Lakavath B. и др. Radical-based photoinactivation of fatty acid photodecarboxylases // Anal. Biochem. Elsevier, 2020. Т. 600, № April. С. 113749.

202. Хабибуллина Н.Ф. Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков // дис. - Московский государственный университет им. МВ Ломоносова (МГУ). Биологический факультет. 2012.

203. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. Т. 96, № 1. С. 23-28.

204. Kabsch W. XDS // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010. Т. 66. С. 125-132.

205. Evans P. Scaling and assessment of data quality // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2005. Т. 62. С. 72-82.

206. Vagin A. Molecular replacement with MOLREP // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2010. Т. 66, № 1. С. 22-25.

207. Emsley P., Lohkamp B. Features and development of Coot // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2010. Т. 66, № 4. С. 486-501.

208. Murshudov G.N., Nicholls R.A. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2011. Т. 67, № 4. С. 355-367.

209. Hughes G., Lewis J.C. Introduction: Biocatalysis in Industry // Chem. Rev. 2018. Т. 118, № 1. С. 1-3.