Экспрессия и функции толл-лайк-рецепторов в эпителии кишечника человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Богунович, Милена Драголюбовна

• Богунович, Милена Драголюбовна
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Богунович, Милена Драголюбовна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биологические свойства ТЬЯ — структура, специфичность, внутриклеточный каскад, гены-мишени.

Глава 2. Вклад кишечного эпителия в естественноый иммунитет слизистой кишечника.

Глава 3. Экспрессия и функции ТИ1 в эпителии кишечника.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Клеточные культуры и реагенты для их культивирования.

4.2. Векторы эскспрессии и последовательности кДНК.

4.3. Гены-репортеры.

4.4. Транзиторная экспрессия генов в клеточных культурах, стимуляция клеток и анализ клеточной активации.

4.5. Бактериальные штаммы и их культивирование.

4.6. Бактериальная инфекция клеточных культур.

4.7. Метод коиммунопреципитации и Western blot.

4.8. Метод иммуногистохимии и иммунофлюоресции.

4.9. Метод обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR).

4.10. Определение уровня продукции цитокинов методом ELISA.

4.11. Статистическая обработка данных.

Глава 5. Результаты.

5.1. Экспрессия TLR в эпителии тонкого и толстого кишечника человека

5.1.1.Хубпопуляция.кишечного эпителия ко-экспрессирует TLR1, TLR2 и TLR4.

5.1.2. Клетки кишечного эпителия, экспрессирующие TLR1, TLR2 и TLR4, морфологически однородны и принадлежат к энтероэндокринной линии.

5.2. Функциональные взаимодействия между TLR1, TLR2 и TLR4.

5.2.1. Совместная экспрессия TLR1 и TLR2 ведет к физическому взаимодействию двух молекул.

5.2.2. Функциональная синергия между TLR1 и TLR2.

5.3. Биологическая роль TLR в кишечном эпителии.

5.3.1. Модель функцональных рецепторных комплексов TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD4 на основе клеточной линии эпителия кишечника человека САСО-2.

5.3.2. TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами.

5.3.3. TLR4/MD2 и TLR1/TLR2 обладают специфичностью к разным составляющим грам-отрицательных бактерий.

5.3.4. Кишечная микрофлора активирует TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2.

5.3.5. Стимуляция эпителиальных TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и

TLR4/MD2 ведет к продукции провоспалительных хемокинов.

ЧАСТЬ III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия и функции толл-лайк-рецепторов в эпителии кишечника человека»

Актуальность проблемы

Все многоклеточные организмы колонизированы множеством микробов, формирующих так называемую микрофлору. Более 1013 бактериальных микроорганизмов населяют кишечник, играя жизненно важную роль в физиологической деятельности желудочно-кишечного тракта и обеспечивая организм множеством незаменимых факторов. Установление взаимовыгодных отношений между организмом-хозяином и паразитирующим микробом ведет к формированию симбиотического равновесия [1]. Метаболизм питательных веществ и органических молекул, поддержание роста кишечного эпителия, индукция процесса васкуляризации, развитие лимфоидной ткани, а также препятствие колонизации патогенных бактерий являются только некоторыми примерами полезного эффекта, оказываемого кишечной микрофлорой [2].

Иммунная система в норме обладает свойством относительной толерантности к кишечной микрофлоре. После заселения тканей кишечника новорожденных нормальной бактериальной микрофлорой местная иммунная реакция ограничивается так называемым "физиологическим воспалением", проявляющимся в необратимой инфильтрации слизистой кишечника лейкоцитами, формировании лимфоидных фолликулов и создании эпителильного барьера в результате усиления межэпителиальных взаимодействий [3]. Вследствие установления биологического равновесия между бактерильной флорой и организмом хозяина жизнедеятельность кишечной микрофлоры ограничивается кишечным просветом.

В отличие от нормальной микрофлоры, большинство бактериальныхпатогенов,поражающихкишечный тракт, обладают способностью проникать в клетки кишечного эпителия, пересекать эпителиальный барьер и заселять подлежащие ткани, вызывая немедленную реакцию со стороны иммунной системы и развитие острого воспаления слизистой кишечника [4].

При наличии определенной генетической предрасположенности присутствие бактериальной микрофлоры играет критическую роль в инициации и развитии неспецифических воспалительных заболеваний кишечника, включающих болезнь Крона и неспецифический язвенный колит [5]. Данная группа заболеваний характеризуется формированием хронического воспаления кишечника, главной причиной которого считается неадекватный ответ иммунной системы к кишечной микрофлоре [6].

Понимание механизмов взаимодействия кишечной микрофлоры с иммуной системой хозяина представляет как высочайший научный, так и клинический интерес. Ключевые факторы, сдерживающие постоянный натиск бактериальной микрофлоры, но быстро реагирующие на инвазию бактериальных патогенов, остаются практически не изученными. Учитывая недавнее открытие семейства Толл-лайк Рецепторов (Toll-like Receptors - TLR), специализирующихся на распознавании бактериальных компонентов, целью исследования явилось изучение экспрессии и функций TLR на кишечном эпителии — клеточной популяции, первой вступающей в контакт с кишечными бактериями.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. охарактеризовать экспрессию ТЬЮ - ТЬК5 в эпителии кишечника человека;

2. базируясь на результатах экспрессии TLR в первичном эпителии, создать модель in vitro на основе клеточной линии эпителия кишечника, экспрессирующую функциональные TLR;

3. на базе созданной клеточной модели охарактеризовать специфичность эпителиальных TLR как к изолированным бактериальным компонентам, так и к интактным бактериальным энтеропатогенам.

4. на базе созданной клеточной модели оценить чувствительность эпителиальных TLR к кишечной микрофлоре;

5. определить потенциальные гены-мишени для эпителиальных TLR.

Научная новизна и практическая значимость

Дана характеристика экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4 в кишечном эпителии.

Впервые выявлена дифференцированная субпопуляця клеточного эпителия, коэкспрессирующая TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащая к энтероэндокринной линии.

Впервые показано, что функциональная синергия между TLR1 и TLR2 базируется на физическом взаимодействии двух молекул.

Впервые при помощи экспериментальной модели in vitro, созданой на базе клеточной линии эпителия кишечника человека, определена специфичность TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к грам-положительным и грам-отрицательным кишечным патогенам.

Впервые с использованием той же экспериментальной модели проведена оценка чувствительности TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к кишечной микрофлоре.

Впервые охарактеризованы гены-мишени для экспрессированных в клеточной линии эпителия человека TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2.

На основе полученных результатов была предложена новая концепция о роли эпителиальных TLR в иммунном ответе слизистых кишечника.

Благодарности

Данная работа выполнялась на базе Медицинского центра Mount Sinai, New York, США. Автор благодарит научных консультантов за оказаннуюв ходе .выполнения работы помощь: руководителя отдела интерферонов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи академика РАМН профессора Ершова Ф.И., заведующего центром иммунобиологии медицинского центра Mount Sinai профессора доктора L. Mayer, ассистента профессора медицинского центра Mount Sinai доктора S. Plevy.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Богунович, Милена Драголюбовна

выводы

1. Иммуногистохимический и иммунофлюоресцентный анализ гистологических срезов тканей тонкого и толстого кишечника человека выявил субпопуляцию кишечного эпителия, коэкспрессирующую TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащую к энтероэндокринной линии.

2. На основе клеточной модели 293Т было показано, что совместная экспрессия TLR1 и TLR2 ведет к физическому взаимодействию двух молекул с формированием рецепторной пары TLR1/TLR2.

3. Для изучения роли эпителиальных TLR в эпителиально-бактериальных взаимодействиях была создана модель функциональных рецепторных комплексов TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD4 на основе клеточной линии эпителия кишечника человека САСО-2 с использованием гена-репортера NF-кВ-зависимой люциферазы.

4. TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами. TLR1/TLR2 и TLR4/MD2 распознают грам-отрицательные Salmonella и Shigella, TLR2/TLR6 распознает грам-положительную Listeria. TLR4/MD2 обладает специфичностью к ЛПС, TLR1/TLR2 специфичен к другому, неизвестному, компоненту клеточной стенки грам-отрицательных бактерий. ПГН, выделенный из грам-положительных бактерий, активирует TLR2/TLR6.

5. Аналогично кишечным патогенам, кишечная микрофлора также способна активировать ТЬЮ/ТЬМ, ТЬЯ2ЛГЬК6 и ТЬЯ4/М02.

6 .-Стимуляция эпителиальных Т1Л11/Т1Л12, Т1Я2ГТи& и ТЬЯ4/М02 ведет к продукции провоспалительных хемокинов 1Ь-8, МСР-1 и 1Р-10.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Богунович, Милена Драголюбовна, 2005 год

1. Hooper, L.V. and J.I. Gordon, Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science, 2001. 292(5519): p. 1115-8.

2. Berg, R.D., Bacterial translocation from the gastrointestinal tract. Trends- Microbiol, 1995-3(4):p. 149-54. . ^ -—

3. Maaser^C. and M.F. Kagnoff, Role of the intestinal epithelium in orchestrating innate and adaptive mucosal immunity. Z Gastroenterol, 2002. 40(7): p. 525-9.

4. Sansonetti, P., Host-pathogen interactions: the seduction of molecular cross talk Gut, 2002. 50 Suppl 3: p. III2-8.

5. Podolsky, D.K., Inflammatory bowel disease. N Engl J Med, 2002. 347(6): p. 417-29.

6. Farrell, R.J. and J.T. LaMont, Microbial factors in inflammatory bowel disease. Gastroenterol Clin North Am, 2002. 31(1): p. 41-62.

7. Medzhitov, R. and C.A. Janeway, Jr., An ancient system of host defense. Curr Opin Immunol, 1998.10(1): p. 12-5.

8. Hoffmann, J.A., et al., Phylogeneticperspectives in innate immunity. Science, 1999. 284(5418): p. 1313-8.

9. Boehme, K.W. and T. Compton, Innate sensing of viruses by toll-like receptors. J Virol, 2004. 78(15): p. 7867-73.

10. Rock, F.L., et al., A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): p. 588-93.

11. Medzhitov, R., P. Preston-Hurlburt, and C.A. Janeway, Jr., A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 1997.388(6640): p. 394-7.

12. St Johnston, D. and C. Nusslein-Volhard, The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell, 1992. 68(2): p. 201-19.

13. Lemaitre, B., et al., The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toil/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell, 1996. 86(6): p. 973-83.

14. Yoshimura, A., et al., Cutting edge: recognition of Gram-positive bacterial cell wall components by the innate immune system occurs via Toll-like receptor 2. J Immunol, 1999.163(1): p. 1-5.

15. Ozinsky, A., et al., The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors In Process Citation. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(25): p. 13766-71.

16. Wyllie, D.H., et al., Evidence for an accessory protein function for Toll-like receptor 1 in anti-bacterial responses. J Immunol, 2000.165(12): p. 7125-32.

17. Zhang, F.X., et al., Bacterial lipopolysaccharide activates nuclear factor-kappaB through interleukin-1 signaling mediators in cultured human dermal endothelial cells and mononuclear phagocytes. J Biol Chem, 1999. 274(12): p. 7611-4.

18. Underhill, D.M., et al., The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens. Nature, 1999. 401(6755): p. 811-5.

19. Qureshi, S.T., et al., Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4) see comments. [published erratum appears in J Exp Med 1999 May3; 189(9)'.following 1518. J Exp Med, 1999.189(4): p. 615-25.

20. Brightbill, H.D., et al., Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science, 1999. 285(5428): p. 732-6.

21. Schwandner, R., et al., Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J Biol Chem, 1999. 274(25): p. 17406-9.

22. Qureshi, S.T. and R. Medzhitov, Toll-like receptors and their role in experimental models of microbial infection. Genes Immun, 2003. 4(2): p. 87-94.

23. Hajjar, A.M., et al., Cutting Edge: Functional Interactions Between Toll-Like Receptor (TLR) 2 and TLR1 or TLR6 in Response to Phenol-Soluble Modulin. J Immunol, 2001.166(1): p. 15-19.

24. Hayashi, F., et al., The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature, 2001. 410(6832): p. 1099-103.

25. Zhang, D., et al., A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. Science, 2004. 303(5663): p. 1522-6.

26. Pasare, C. and R. Medzhitov, Toll-like receptors: balancing host resistance with immune tolerance. Curr Opin Immunol, 2003.15(6): p. 677-82.

27. Haziot, A., et al., Resistance to endotoxin shock and reduced dissemination of gram- negative bacteria in CD14-deficient mice. Immunity, 1996. 4(4): p. 407-14.

28. Shimazu, R., et al., MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll- like receptor 4. J Exp Med, 1999.189(11): p. 1777-82.

29. Akashi, S., et al., Cutting edge: cell surface expression and lipopolysaccharide signaling via the toll-like receptor 4-MD-2 complex on mouse peritoneal macrophages. J Immunol, 2000.164(7): p. 3471-5.

30. Nomura, F., et al., Cutting edge: endotoxin tolerance in mouse peritoneal macrophages correlates with down-regulation of surface toll-like receptor 4 expression. J Immunol, 2000. 164(7): p. 3476-9.

31. Tapping, R.I., et al., Toll-like receptor 4, but not toll-like receptor 2, is a signaling receptorfor Escherichia and Salmonella lipopolysaccharides. J Immunol, 2000. 165(10): p. 5780-7.

32. O'Neill, L.A. and C. Greene, Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptorfamily: ancient signaling machinery in mammals, insects, and plants. J Leukoc Biol, 1998. 63(6): p. 650-7.

33. Akira, S. and K. Takeda, Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol, 2004. 4(7): p. 499-511.

34. Kopp, E. and R. Medzhitov, Recognition of microbial infection by Toll-like receptors. Curr Opin Immunol, 2003.15(4): p. 396-401.

35. Medzhitov, R., Toll-like receptors and innate immunity. Nat Rev Immunol, 2001. 1(2): p. 135-45.

36. Muzio, M., et al., Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression ofTLR3 in dendritic cells. J Immunol, 2000.164(11): p. 5998-6004.

37. Supajatura, V., et al., Differential responses of mast cell Toll-like receptors 2 and 4 in allergy and innate immunity, J Clin Invest, 2002.109(10): p. 1351 -9.

38. West, M.A., et al., Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science, 2004.305(5687): p. 1153-7.

39. Pasare, C. and R. Medzhitov, Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+ T cell-mediated suppression by dendritic cells. Science, 2003. 299(5609): p. 1033-6.

40. Dwinell, M.B., P.A. Johanesen, and J.M. Smith, Immunobiology of epithelial chemokines in the intestinal mucosa. Surgery, 2003. 133(6): p. 601-7.

41. Clark, M.A., B.H. Hirst, and M.A. Jepson, Inoculum composition and Salmonella pathogenicity island 1 regulate M-cell invasion and epithelial destruction by Salmonella typhimurium. Infect Immun, 1998. 66(2): p. 724-31.

42. Clark, M.A., et al., Invasion of murine intestinal M cells by Salmonella typhimurium inv mutants severely deficient for invasion of cultured cells. Infect Immun, 1996. 64(10): p. 4363-8.

43. Barthel, M., et al., Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infect Immun, 2003. 71(5): p. 2839-58.

44. Rescigno, M., et al., Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to sample bacteria. Nat Immunol, 2001. 2(4): p. 361-7.

45. Vazquez-Torres, A., et al., Extraintestinal dissemination of Salmonella by CD18-expressingphagocytes. Nature, 1999. 401(6755): p. 804-8.

46. Berkes, J., et al., Intestinal epithelial responses to enteric pathogens: effects on the tight junction barrier, ion transport, and inflammation. Gut, 2003. 52(3): p. 439-51.

47. Zhang, S., et al., Secreted effector proteins of Salmonella enterica serotype typhimurium elicit host-specific chemokine profiles in animal models of typhoid fever and enterocolitis. Infect Immun, 2003. 71(8): p. 4795-803.

48. Eckmann, L., M.F. Kagnoff, and J. Fierer, Epithelial cells secrete the chemokine interleukin-8 in response to bacterial entry. Infect Immun, 1993. 61(11): p. 456974.

49. Eckmann, L., et al., Differential cytokine expression by human intestinal epithelial cell lines: regulated expression of interleukin 8. Gastroenterology, 1993.105(6): p. 1689-97.

50. McCormick, B.A., et al., Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J Cell Biol, 1993.123(4): p. 895-907.

51. Yang, S.K., et al., Differential and regulated expression of C-X-C, C-C, and C-chemokines by human colon epithelial cells. Gastroenterology, 1997.113(4): p. 1214-23.

52. Eckmann, L., et al., Entamoeba histolytica trophozoites induce an inflammatory cytokine response by cultured human cells through the paracrine action of cytolytically released interleukin-1 alpha. J Clin Invest, 1995. 96(3): p. 1269-79.

53. Ribbons, K.A., et al., Potential role of nitric oxide in a model of chronic colitis in rhesus macaques. Gastroenterology, 1995. 108(3): p. 705-11.

54. Panja, A., et al., CD Id is involved in T cell-intestinal epithelial cell interactions. J Exp Med, 1993.178(3): p. 1115-9.

55. Reinecker, H.C. and D.K. Podolsky, Human intestinal epithelial cells express functional cytokine receptors sharing the common gamma c chain of the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(18): p. 8353-7.

56. Kelly, C.P., et al., Human colon cancer cells express ICAM-1 in vivo and support LFA-1-dependent lymphocyte adhesion in vitro. Am J Physiol, 1992. 263(6 Pt 1): p. G864-70.

57. Savidge, T.C., et al., Human intestinal development in a severe-combined immunodeficient xenograft model. Differentiation, 1995. 58(5): p. 361-71.

58. Galan, J.E., Salmonella interactions with host cells: type III secretion at work. Annu Rev Cell Dev Biol, 2001.17: p. 53-86.

59. Chamaillard, N1., et al., An essential role for NODI in host recognition of bacterialpeptidoglycan containing diaminopimelic acid. Nat Immunol, 2003. 4(7): p. 702-7.

60. Kim, J.G., S.J. Lee, and M.F. Kagnoff, Nodi is an essential signal transducer in intestinal epithelial cells infected with bacteria that avoid recognition by toll-like receptors. Infect Immun, 2004. 72(3): p. 1487-95.

61. Cario, E., et al., Lipopolysaccharide activates distinct signaling pathways in intestinal epithelial cell lines expressing toll-like receptors In Process Citation., J Immunol, 2000. 164(2): p. 966-72.

62. Melmed, G., et al., Human intestinal epithelial cells are broadly unresponsive to Toll-like receptor 2-dependent bacterial ligands: implications for host-microbial interactions in the gut. J Immunol, 2003.170(3): p. 1406-15.

63. Gewirtz, A.T., et al., Cutting edge: bacterialflagellin activates basolaterally expressed tlr5 to induce epithelial proinflammatory gene expression. J Immunol, 2001.167(4): p. 1882-5.

64. Ishihara, S., et al., Essential role ofMD-2 in TLR4-dependent signaling during Helicobacter pylori-associated gastritis. J Immunol, 2004.173(2): p. 1406-16.

65. Hornef, M.W., et al., Toll-like receptor 4 resides in the Golgi apparatus and colocalizes with internalized lipopolysaccharide in intestinal epithelial cells. J Exp Med, 2002. 195(5): p. 559-70.

66. Ortega-Cava, C.F., et al., Strategic compartmentalization of Toll-like receptor 4 in the mouse gut. J Immunol, 2003.170(8): p. 3977-85.

67. Hirschfeld, M., et al., Cutting edge: repuriflcation of lipopolysaccharide eliminates signaling through both human and murine toll-like receptor 2. J Immunol, 2000. 165(2): p. 618-22.

68. Sprong, T., et al., Contributions of Neisseria meningitidis LPS and non-LPS to proinflammatory cytokine response. J Leukoc Biol, 2001. 70(2): p. 283-8.

69. Zirk, N.M., S.F. Hashmi, and H.K. Ziegler, The polysaccharide portion of lipopolysaccharide regulates antigen- specific T-cell activation via effects on macrophage-mediated antigen processing. Infect Immun, 1999. 67(1): p. 319-26.

70. Sherris, D., W. Stohl, and L. Mayer, Characterization of lymphokines mediating B cell growth and differentiation from monoclonal anti-CD3 antibody-stimulated T cells. J Immunol, 1989.142(7): p. 2343-51.

71. Eckmann, L., et al., Differential cytokine expression by human intestinal epithelial cell lines: regulated expression of interleukin 8 comment. Gastroenterology, 1993.105(6): p. 1689-97.

72. Farthing, M.J., Enterotoxins and the enteric nervous system—a fatal attraction. Int J Med Microbiol, 2000. 290(4-5): p. 491-6.

73. Turvill, J.L., F.H. Mourad, and M.J. Farthing, Crucial role for 5-HT in cholera toxin but not Escherichia coli heat- labile enterotoxin-intestinal secretion in rats. Gastroenterology, 1998. 115(4): p. 883-90.

74. Kirschning, C.J., et al., Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharidc. J Exp Med, 1998. 188(11): p. 2091-7.

75. Yang, R.B., et al., Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling see comments. Nature, 1998. 395(6699): p. 284-8.

76. Lin, Y., et al., The lipopolysaccharide-activated toll-like receptor (TLR)-4 induces synthesis of the closely related receptor TLR-2 in adipocytes. J Biol Chem, 2000.z 275(32): p. 24255-63.------------------------

77. Muroi, M., et al., Lipopolysaccharide-mimetic activities of a Toll-like receptor 2-stimulatory substance(s) in enterobacterial lipopolysaccharide preparations. Infect Immun, 2003. 71(6): p. 3221-6.

78. Ozinsky, A., et al., Co-operative induction of pro-inflammatory signaling by Tolllike receptors. J Endotoxin Res, 2000. 6(5): p. 393-6.

79. Ozinsky, A., et al., The repertoire for pattern recognition ofpathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(25): p. 13766-71.

80. Sandor, F., et al., Importance of extra- and intracellular domains of TLR1 and TLR2 in NFkappa B signaling. J Cell Biol, 2003. 162(6): p. 1099-110.

81. Takeuchi, O., et al., Discrimination of bacterial lipoproteins by Toll-like receptor 6. Int Immunol, 2001.13(7): p. 933-40.

82. Zhang, H., et al., Integrin-nucleated Toll-like receptor (TLR) dimerization reveals subcellular targeting ofTLRs and distinct mechanisms ofTLR4 activation and signaling. FEBS Lett, 2002. 532(1-2): p. 171-6.

83. Mullen, G.E., et al., The role of disulfide bonds in the assembly andfunction of MD-2. Proc Natl Acad Sci USA, 2003.100(7): p. 3919-24.

84. Nagai, Y., et al., Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution. Nat Immunol, 2002. 3(7): p. 667-72.

85. Yang, R.B., et al., Signaling events induced by lipopolysaccharide-activated tolllike receptor 2. J Immunol, 1999. 163(2): p. 639-43.

86. Finlay, B.B. and P. Cossart, Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science, 1997. 276(5313): p. 718-25.

87. Steeghs, L., et al., Isolation and characterization of the Neisseria meningitidis IpxD-fabZ-lpxA gene cluster involved in lipid A biosynthesis. Gene, 1997.190(2): p. 263-70.

88. Steeghs, L., et al., Outer membrane composition of a lipopolysaccharide-deficient Neisseria meningitidis mutant. Embo J, 2001. 20(24): p. 6937-45.

89. Van Der Ley, P. and L. Steeghs, Lessons from an LPS-deJicient Neisseria meningitidis mutant. J Endotoxin Res, 2003. 9(2): p. 124-8.

90. Dunne, C., Adaptation of bacteria to the intestinal niche: probiotics and gut disorder. Inflamm Bowel Dis, 2001. 7(2): p. 136-45.

91. Chensue, S.W., Molecular machinations: chemokine signals in host-pathogen interactions. Clin Microbiol Rev, 2001.14(4): p. 821-35, table of contents.

92. Burns, K., F. Martinon, and J. Tschopp, New insights into the mechanism of IL-Ibeta maturation. Curr Opin Immunol, 2003. 15(1): p. 26-30.

93. Trinchieri, G., Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat Rev Immunol, 2003. 3(2): p. 133-46.

94. Hemmi, H., et al., Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway. Nat Immunol, 2002. 3(2): p. 196-200.

95. Cario, E., G. Gerken, and D.K. Podolsky, "For whom the bell tolls!" innate defense mechanisms and survival strategies of the intestinal epithelium against lumenalpathogens. Z Gastroenterol, 2002. 40(12): p. 983-90.

96. Backhed, F. and M. Hornef, Toll-like receptor 4-mediated signaling by epithelial surfaces: necessity or threat? Microbes Infect, 2003. 5(11): p. 951-9.

97. Naik, S., et al., Absence of Toll-like receptor 4 explains endotoxin hyporesponsiveness in human intestinal epithelium. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2001.32(4): p. 449-53.

98. Alcxopoulou, L., et al., Hyporesponsiveness to vaccination with Borrelia burgdorferi OspA in humans and in TLR1- and TLR2-deficient mice. Nat Med, 2002. 8(8): p. 878-84.

99. Takeda, K., O. Takeuchi, and S. Akira, Recognition oflipopeptides by Toll-like receptors. J Endotoxin Res, 2002. 8(6): p. 459-63.

100. Xu, Y., et al., Structural basis for signal transduction by the Toll/interleukin-1 receptor domains. Nature, 2000. 408(6808): p. 111-5.

101. Takeuchi, O., K. Hoshino, and S. Akira, Cutting edge: TLR2-deficient and MyD88-deficient mice are highly susceptible to Staphylococcus aureus infection. J Immunol, 2000.165(10): p. 5392-6.

102. Girardin, S.E., et al., Nodi detects a unique muropeptide from gram-negative bacterialpeptidoglycan. Science, 2003. 300(5625): p. 1584-7.

103. Aliprantis, A.O., et al., Release of Toll-like receptor-2-activating bacterial lipoproteins in Shigella flexneri culture supernatants. Infect Immun, 2001. 69(10): p. 6248-55.

104. Barton, G.M. and R. Medzhitov, Toll-like receptor signaling pathways. Science, 2003.300(5625): p. 1524-5.

105. Yamamoto, M., et al., Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science, 2003. 301(5633): p. 640-3.

106. Yamamoto, M., et al., TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway. Nat Immunol, 2003. 4(11): p. 1144*50.

107. Huang, D., et al., Chemokines and chemokine receptors in inflammation of the nervous system: manifold roles and exquisite regulation. Immunol Rev, 2000. 177: p. 52-67.

108. Roebuck, K.A., Regulation of interleukin-8 gene expression. J Interferon Cytokine Res, 1999.19(5): p. 429-38.

109. Plevy, S.E., et al., Multiple control elements mediate activation of the murine and human interleukin 12 p40promoters: evidence of functional synergy between C/EBP and Relproteins. Mol Cell Biol, 1997. 17(8): p. 4572-88.

110. Kobayasbi, M., ct al., Toll-like receptor-dependent production of IL-12p40 causes chronic enterocolitis in myeloid cell-specific Stat3-deficient mice. J Clin Invest, 2003.111(9): p. 1297-308.