Экспрессия генов раннего ответа и генов каспаз как возможный диагностический маркер при развитии рака шейки матки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Курмышкина, Ольга Вадимовна

• Курмышкина, Ольга Вадимовна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Курмышкина, Ольга Вадимовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гены раннего ответа и каспазы как компоненты молекулярно-генетического «портрета» РШМ

1.1. Геном ВПЧ и механизмы злокачественной трансформации

1.2. Молекулярно-генетический профиль ЦИН и РШМ: современные представления

1.3. Гены раннего ответа и каспазы - регуляторы ключевых программ клетки

1.4. Взаимодействие ВПЧ-онкогенов и генов раннего ответа при развитии РШМ

1.5. Действие онкогенов ВПЧ на механизм каспаз-зависимого апоптоза

2. Иммунный ответ организма при индукции и прогрессии РШМ

2.1. Механизмы ВПЧ-индуцированной иммуносупрессии

2.2. Локальные и системные нарушения показателей клеточного иммунитета при хронической ВПЧ-инфекции и развитии и нтраэ пителиальных неоплазий

шейки матки

2.3. Индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток как фактор прогрессии

РШМ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Характеристика пациентов и методов получения биоматериала

2. Описание молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования

2.1. ВПЧ-типирование

2.2. Проведение полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени» (ПЦР-РВ)

2.3. Анализ экспрессии белков с-Мус, с-Гоб и с^ип методом \Уе81егп-блоттинг

2.4. Определение активности каспаз

2.5. Иммунофенотипирование МНПК

2.6. Определение характера повреждений ДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Экспрессия генов раннего ответа в ткани при ЦИН 3 и РШМ

1.1. Определение относительного содержания мРНК методом ПЦР-РВ

1.2. Определение содержания белков с-Роб, с-Мус, с-1ип (\¥е51егп-блоттинг)

2. Экспрессия генов каспаз -3, -6 и -9 в ткани при ЦИН 3 и РШМ

2.1. Определение относительного содержания мРНК методом ПЦР-РВ

2.2. Определение протеолитической активности

3. Дестабилизация ДНК при развитии РШМ

4. Иммунофенотипирование МНПК больных ЦИН 3 и РШМ

5. Экспрессия каспаз в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ

6. Влияние иммуномодулирующей терапии на показатели клеточного иммунитета больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ

7. Экспрессия каспаз в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ 1А стадии после курса

терапии Аллокином-альфа

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Экспрессия генов раннего ответа при развитии РШМ

1.1. Экспрессия генов о/оу и с-]ип

1.2. Экспрессия с-тус

2. Экспрессия генов каспаз при развитии РШМ

3. Изменения иммунного статуса при развитии РШМ

3.1. Показатели клеточного иммунитета при развитии РШМ. Влияние иммуномодулирующей терапии

3.2. Показатели активности апоптоза в МНПК при развитии РШМ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия генов раннего ответа и генов каспаз как возможный диагностический маркер при развитии рака шейки матки»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Несмотря на значительные успехи современной медицины в разработке методов профилактики, ранней диагностики и терапии злокачественных новообразований, рак шейки матки (РШМ) по-прежнему остается одной из главных причин смертности женщин от онкологических заболеваний. Согласно статистическим отчетам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), каждый год РШМ диагностируется более чем у 500 тыс. женщин (в России - более чем у 14 тыс.) [4]. В подавляющем большинстве случаев (99%) развитие РШМ ассоциировано с хронической папилломавирусной инфекцией [77]. В течение двух последних десятилетий в России отмечается существенный прирост показателей инфицированное™ населения вирусом папилломы человека (ВПЧ) и числа заболевших РШМ, особенно среди женщин моложе 45 лет [4]. Развитие скрининговых программ способствует снижению смертности от РШМ, в первую очередь, за счет увеличения частоты выявления ранних, доклинических форм рака и дисплазий, которые легко устраняются стандартными хирургическими методами. Однако используемые подходы недостаточно эффективны, и причины сложившейся ситуации связаны не только с уровнем организации медицинской помощи, профилактических мероприятий или социально-экономическими факторами, но и с несовершенством методов диагностики. Применяемые сегодня в клинической практике критерии диагностики РШМ имеют ряд ограничений в отношении точности постановки диагноза, возможности прогнозирования течения заболевания и не позволяют учитывать индивидуальный статус пациентки. Для преодоления этих недостатков необходимы разработка и внедрение новых методов молекулярно-генетической и биохимической диагностики, основанной на анализе экспрессии тканевых биомаркеров, качественный и количественный состав которых изменяется в процессе развития заболевания [3]. Поэтому поиск и верификация биомаркеров РШМ, имеющих предиктивное и прогностическое значение, является одной из наиболее актуальных проблем онкогинекологии. Такой спектр биомаркеров будет в особенности востребован при диагностике наиболее ранних цервикальных заболеваний - дисплазий эпителия шейки матки, карциномы in situ и микроинвазивного РШМ.

Несмотря на то, что ВПЧ является главным этиологическим фактором РТТТМ именно иммунной системе организма-хозяина принадлежит роль ключевого пермиссивного фактора, определяющего окончательный результат инфекции [77]. В подавляющем большинстве случаев инфицирования иммунная система формирует эффективный противовирусный/противоопухолевый ответ. Неспособность иммунитета элиминировать инфекцию на ранних этапах и, следовательно, повышенная вероятность развития патологии шейки матки определяются иммунным статусом организма. Поэтому анализ текущего иммунного статуса женщин с выявленными дисплазиями или ранней формой РШМ может помочь в прогнозировании индивидуального риска прогрессии заболевания и в выборе тактики лечения. Процесс восстановления иммунного статуса может также характеризовать результат и эффективность терапии. В связи с этим, изучение маркеров, всесторонне характеризующих иммунный статус пациенток с ВПЧ-инфекцией, дисплазиями или РШМ, является важнейшим этапом терапевтических мероприятий.

Таким образом, актуальность темы диссертационного исследования обусловлена необходимостью разработки комплексного подхода к ранней диагностике РШМ, основанного на прецизионных методах анализа биомаркеров, отражающих индивидуальные особенности развития опухоли и состояния иммунной системы.

Степень разработанности темы. Данные о жизненном цикле ВПЧ и молекулярных механизмах, ведущих к злокачественной трансформации клеток цервикального эпителия, интенсивно накапливаются [121]. Также становятся известны механизмы ВПЧ-индуцируемой иммуносупрессии в очаге неоплазии [83]. Эти сведения создают основу для поиска и изучения биомаркеров РШМ. Кроме того, проводится полногеномное профилирование РШМ по спектру хромосомных аберраций, эпигенетических изменений, изменений транскриптома и протеома, результаты которого предлагают широкий спектр потенциальных маркерных генов и белков. Для большинства из них возможность использования в качестве диагностических биомаркеров еще не исследована. В клинической практике сегодня применяется только определение генотипа ВПЧ (онкогенных штаммов), его «ранних» и «поздних» белков, а также экспрессии регулятора клеточного цикла р16 и фактора пролиферации К167. Однако р16 и К167 обладают ограниченной специфичностью при дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных заболеваний шейки матки [76].

Для использования в качестве диагностических биомаркеров РШМ и предопухолевых состояний исследователями предлагаются различные факторы пролиферации и апоптоза, изменение экспрессии которых является одной из ключевых характеристик опухолевой клетки: компоненты репликативного аппарата (РСЫА, МСМ2, топоизомераза-2-альфа), рецепторы факторов роста, циклины, онкосупрессоры (р21, р53), ингибиторы апоптоза (Вс1-2), транскрипционные факторы [9, 36, 57, 139, 144]. Гены раннего пролиферативного ответа (с-тус, с-/о$, с-}ип) - это клеточные протоонкогены, экспрессия которых резко увеличивается в ответ на пролиферативные сигналы на самых ранних этапах трансформации клетки. Установлено, что жизненный цикл ВПЧ зависит от транскрипционных факторов, кодируемых данными генами, однако систематического изучения активности генов раннего ответа при дисплазиях и РШМ не проводилось. Каспазы - центральные медиаторы и эффекторы апоптоза, отвечающие за внутриклеточное распространение апоптотического сигнала и за конечную реализацию апоптотической программы [137]. По проблеме нарушения функций каспаз в раковых клетках накоплен большой экспериментальный материал для опухолей различных локализаций. Каспазы могут рассматриваться в качестве перспективных биомаркеров, и кроме того, они привлекательны как терапевтические мишени. Однако, ввиду полифункциональности этих ферментов, их диагностическое и терапевтическое применение требует детальных сведений об изменении их протеолитической активности в ходе развития неоплазии. При дисплазиях и раке шейки матки данный вопрос практически не разработан.

Активно исследуются иммунные отклонения, ассоциированные с развитием РШМ. Полученные данные указывают на ведущую роль Т-хелперов и регуляторных Т-клеток в прогрессии заболевания. Предполагается также, что одним из механизмов супрессорного воздействия опухоли на иммунитет является индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток [82]. Данные, подтверждающие это предположение, получены для разных типов рака, однако, в случае РШМ экспрессия маркеров апоптоза и возможность их использования в качестве показателей иммунного статуса не исследована.

Цель работы. Исследовать изменение уровней экспрессии генов раннего ответа и генов каспаз в эпителии шейки матки и лейкоцитах крови при церв икал ьных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки, проанализировать возможность их использования в качестве биомаркеров для диагностики данных заболеваний и оценки иммунного статуса.

Задачи исследования:

1) Изучить экспрессию генов раннего пролиферативного ответа (с-тус, c-fos, с-jun) на уровне мРНК и количества белка в клетках эпителия шейки матки больных с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями 3-ей степени (ЦИН 3) и РШМ I-IV стадий;

2) Изучить экспрессию генов каспаз -3,-6,-8,-9 на уровне мРНК и протеазной активности в клетках цервикального эпителия и лейкоцитах крови у больных с ЦИН 3 и РШМ;

3) Провести количественный анализ субпопуляций иммуно компетентных клеток крови (Т-хелперов, цитотоксических и регуляторных Т-клеток, В-лимфоцитов, натуральных килперных клеток) и оценить их предрасположенность к апоптозу при развитии и прогрессии РШМ;

4) Исследовать влияние комплексной терапии на показатели клеточного иммунитета и апоптоза пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ (стадия IA1).

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование профиля экспрессии генов раннего пролиферативного ответа с-тус, c-fos, c-jun в патологически измененных клетках шейки матки при интраэпителиальных поражениях (ЦИН 3) и инвазивном раке, в сравнении со здоровой эпителиальной тканью. Установлено соответствие транскрипционного и трансляционного уровней экспрессии данных генов. Показана гетерогенность ЦИН 3 и микрокарциномы шейки матки по содержанию мРНК генов раннего ответа, которая может отражать нелинейный характер зависимости их экспрессии от стадии заболевания и являться характеристикой определенного молекулярно-генетического профиля («портрета») опухоли, на основании которой возможна дальнейшая разработка дополнительных критериев молекулярной диагностики дисплазий и ранних форм РШМ. Выявлена специфическая активация генов c-fos и с-тус, сопровождающаяся подавлением гена c-jun, при развитии и прогрессии РШМ.

Впервые изучена активность апоптотических процессов и степень их подавления в опухолевых клетках цервикального эпителия на основании уровня экспрессии ключевых медиаторов апоптоза - инициаторных каспаз (-8, -9) и эффекторных каспаз (3, -6). Установлено, что начальные этапы развития РШМ могут сопровождаться активизацией апоптоза.

Впервые для ЦИН 3 и рака шейки матки получены доказательства индукции апоптоза иммунокомпетентных клеток крови, продемонстрировано дифференциальное распределение активности каспаз по мере прогрессии заболевания, выявлена ведущая роль «внешнего» пути передачи апоптотического сигнала. Впервые был проведен комплексный анализ иммунного статуса пациенток изучаемых групп с использованием показателей клеточного иммунитета и уровня апоптоза иммунных клеток крови.

Впервые исследовано влияние иммуномодулирующей терапии (препаратом Аллокин-альфа) на показатели иммунного статуса пациенток с ЦИН 3 и РШМ 1А стадии, выявлено специфическое действие препарата, направленное на нормализацию численности регуляторных Т-клеток, натуральных киллеров и В-лимфоцитов, получены данные об изменении экспрессии каспаз в лейкоцитах крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования расширяют представления о роли протоонкогенных транскрипционных факторов с-Мус, с-Боз и с-1ип в ВПЧ-индуцированном канцерогенезе на разных этапах естественного развития РШМ. Полученные данные также вносят вклад в понимание механизмов формирования резистентности клеток РШМ к проапоптотическим сигналам и, как следствие, их высокой злокачественности. Результаты работы подкрепляют гипотезу о существовании опухолевой «контратаки» (т.е. индукции клетками опухоли апоптоза иммунных клеток при одновременном формировании собственной устойчивости к цитотоксическим сигналам) и дополняют сведения о роли иммунной системы в патогенезе РШМ. По результатам исследования выявлены вероятные клеточные мишени действия аллоферонов и, таким образом, созданы предпосылки для более глубокого изучения молекулярного механизма действия этой группы биологически активных пептидов. Полученные данные могут быть полезны при разработке курсов лекций по онкологии и онкоиммунологии, молекулярной биологии и вирусологии в высших учебных заведениях биологического и медицинского профиля, для написания учебных и методических пособий, а также монографической литературы.

Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, могут являться основой для последующей разработки диагностических тест-систем, направленных на повышение специфичности, объективности и точности критериев диагностики интраэпителиальных неоплазий и ранних стадий рака шейки матки. Гены раннего ответа (с-тус, с-/оз, с-]ип) и каспаз могут быть использованы в качестве биомаркеров, характеризующих степень смещения баланса между процессами пролиферации и апоптоза, в составе данных тест-систем наравне с маркерами ангиогенеза, инвазии и другими. Изученные параметры иммунного статуса могут быть использованы для долгосрочного наблюдения пациенток после курса лечения в комплексе со стандартным клиническим обследованием, тестом на ВПЧ и цитологическим исследованием.

Методология и методы исследования. В исследовании приняли участие 156 пациенток с диагнозом цервикальная интарэпителиальная неоплазия 3-ей степени тяжести (ЦИН 3) (75 пациенток) или плоскоклеточный рак шейки матки 1-1У стадий (81 пациентка), проходившие лечение на базе ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер» Минздравсоцразвития РК в период с 2010 по 2012 год. Для изучения экспрессии генов раннего ответа и каспаз от каждой пациентки были получены образцы патологической и нормальной ткани, забор материала производился во время операции. В каждом случае первоначальный диагноз был верифицирован стандартным гистологическим методом; результаты молекулярно-биологического анализа сопоставлялись с данными кпшшко-морфологического исследования. Подходы к изучению экспрессии интересующих нас генов основывались на методах извлечения суммарной фракции РНК или белка из образцов эпителиальной/опухолевой ткани и количественном анализе содержания специфических транскриптов и соответствующих им белков (или ферментативной активности). Для количественного анализа были использованы методы ПЦР в режиме «реального времени», вестерн-блоттинга и спектрофотометрии. Исследование потенциальных биомаркеров производилось на двух молекулярных уровнях, ввиду представлений о возможной автономности механизмов их регуляции в клетках человека.

Для исследования иммунного статуса у каждой пациентки непосредственно перед операцией производился забор венозной крови, из которой была выделена фракция мононуклеарных клеток. Анализ субпопуляционного состава мононуклеарных клеток

периферической крови (МНПК) осуществлялся иммуноцитохимическим методом с использованием набора моноклональных антител к дифференцировочным антигенам CD3, CD4, CD8, CD25, CD 16, CD20, CD95. Изучение экспрессии каспаз в суммарной фракции МНПК проводилось, как описано выше. Результаты иммунофенотипирования и молекулярно-генетического анализа в каждой исследуемой группе пациенток сравнивались со значениями, полученными для группы здоровых доноров (контрольная группа №1).

Для изучения влияния иммуномодулирующей терапии на показатели клеточного иммунитета и экспрессию каспаз, у пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ производился повторный забор крови через 1 и 3 месяца после операции и курса лечения препаратом Аллокин-альфа. Группу сравнения составили пациентки, прошедшие стандартное хирургическое лечение и не получавшие препарат (контрольная группа №2).

Используемые в диссертации методы исследования были одобрены Комитетом по медицинской этике ПетрГУ и Минздравсоцразвития РК.

Положения, выносимые на защиту:

1. Различные этапы развития РШМ (ЦИН 3, микроинвазивный и инвазивный рак) характеризуются специфичным паттерном экспрессии генов раннего пролиферативного ответа (с-тус, c-fos, c-juri).

2. При прогрессии РШМ увеличивается степень подавления активности каспаз; опухолевые клетки приобретают апоптоз-резистентный фенотип.

3. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия 3-ей степени и микроинвазивный РШМ ассоциированы с множественными нарушениями иммунного статуса, которые усиливаются при прогрессии опухоли.

4. Развитие и дальнейшая прогрессия РШМ сопровождаются активацией CD95-зависимого пути апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови.

Степень достоверности и апробация результатов. Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном научном семинаре Лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета Петрозаводского государственного университета (ПетрГУ) и кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ 26 ноября 2012 года.

Основные положения диссертации были представлены и обсуждены на международных и всероссийских конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2012» (результаты отмечены дипломом I степени в секции «Фундаментальная медицина/Клинические исследования» в 2012 году) (Москва, 2010, 2012); III и IV Всероссийская научно-практическая конференция «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010, 2011); 14ая и 15ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 го века» (Москва, 2010, 2011); VII Международная конференция по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010) (Новосибирск, 2010); XVI Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010); XII и XIII Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2011, 2012); V Всероссийский Симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); II Международная научная интернет-конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011); II Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); III Съезд физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Ялта, 2011); I Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2011); XI Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011); I Международная научная интернет-конференция «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012); Всероссийский конгресс с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья» (Москва, 2012, 2013); II Всероссийская научная конференция молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); Международный конгресс «The 14th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society» (Vancouver, Canada, 2012); Международный конгресс «The 28th Congress of the new European Society for Comparative Physiology and Biochemistry ESCPB» (Bilbao, Spain, 2012); II Международный научно-образовательный форум «Хирургия и онкология - 2012» (Санкт-Петербург, 2012).

По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ: 18 - в рецензируемых изданиях, в том числе 16 - в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ, из них 6 статей и 10 тезисов докладов (2 - в зарубежных журналах, индексируемых системами Web of Science и Scopus), 19 публикаций - в сборниках материалов конференций (см. Приложение).

На основании результатов диссертационного исследования подана заявка в Роспатент на изобретете «Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки» (№ 2012157453 от 26.12.2012 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источника, из них 196 зарубежных и 7 отечественных, приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 18 рисунками.

Конкурсная поддержка и благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям д.б.н. Волковой Т.О. и д.м.н. Бахлаеву И.Е. за всестороннюю помощь в подготовке диссертационной работы, а также к.м.н., доц. кафедры лучевой диагностики и лучевой терапии, онкологии, урологии и фтизиатрии ПетрГУ Ковчуру П.И. за предоставление биоматериала для исследований, помощь в анализе клинических данных и обсуждение результатов, к.б.н., с.н.с. лаборатории генетики Института биологии КарНЦ РАН Топчиевой Л.В. и к.б.н., с.н.с. Коломейчуку С.Н. за помощь в освоении методов молекулярно-генетических исследований и важные рекомендации, к.б.н., с.н.с. лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН Лысенко Л.А. за ценные консультации. Отдельные слова признательности автор выражает директору Института биологии КарНЦ РАН, заведующей кафедрой молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, д.б.н., проф., чл.-корр. РАН Немовой H.H. за всестороннее содействие в выполнении диссертационного исследования.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Правительства РФ по постановлению №220 «О мерах по привлечению ведущих ученых в российские образовательные учреждения высшего профессионального образования» по договору № 11.G34.31.0052 между Минобрнауки РФ, ведущим ученым А.Н. Полтораком и ФГБОУ

ВПО «Петрозаводский государственный университет» по теме «Исследования рака. Апоптоз (программная смерть). Врожденный иммунитет. Воспаление. Ожирение и его контроль», Гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы по теме «Новые диагностические биомаркеры опухолей репродуктивной системы: целенаправленный поиск, изучение, внедрение в клиническую практику» (соглашение № 14.В37.21.0212; номер заявки в ИКС 2012-1.2.112-000-1014-027), Гранта Президента РФ по Программе поддержки ведущих научных школ НШ-3731.2010.4 и Программы стратегического развития ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» на 2012-2016 годы «Университетский комплекс ПетрГУ в научно-образовательном пространстве Европейского Севера: стратегия инновационного развития».

Заключение диссертации по теме «Онкология», Курмышкина, Ольга Вадимовна

ВЫВОДЫ

1. Цервикалъная интраэпителиальная неоплазия 3-ей степени, микроинвазивный и инвазнвный РШМ характеризуются специфичным паттерном активности генов раннего пролиферативного ответа с-тус, с-/Ья, с-]ип. При ЦИН 3 выявлена активация экспрессии мРНК с-]он (50% случаев) и с-тус/с-}ип (30% случаев). Прогрессия инвазивного РШМ (стадии 1А—»IV) ассоциирована с усилением экспрессии мРНК с-/о5 (100%) и с-тус (50% случаев), но не с-]ип. Наиболее существенное увеличение содержания белков с-Роб и с-Мус наблюдается при микроинвазивном РШМ, в то время для с-1ип характерен относительно постоянный уровень экспрессии на протяжении развития РШМ, сравнимый с таковым в нормальной эпителиальной ткани.

2. Прогрессия РШМ сопряжена с постепенным подавлением протеолитической активности инициаторной каспазы-9 и эффекторных каспаз -3 и -6 в опухолевых клетках, в то время как при ЦИН 3 может наблюдаться значительное повышение активности каспаз -3 и -6 относительно нормального эпителия. Уровень экспрессии мРНК каспаз -3, -6 и -9 в клетках ЦИН 3 и РШМ соответствует таковому в клетках нормального цервикального эпителия или увеличивается.

3. Развитие РШМ сопровождается снижением общей численности циркулирующих Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток и увеличением количества регуляторных Т-лимфоцитов. Содержание натуральных киллеров и В-лимфоцитов увеличивается относительно контрольных значений в ряду ЦИН 3 —> РШМ 1А стадии и уменьшается (до уровня контроля или ниже) в ряду РШМ II —> IV стадий. Достоверные отклонения изученных показателей иммунного статуса пациенток от контрольных значений фиксируются на ранних этапах индукции и развития РШМ - при ЦИН 3 и преинвазивном РШМ.

4. Развитие РШМ ассоциировано с увеличением экспрессии различных компонентов «внешнего» сигнального пути апоптоза в МНПК периферической крови больных, а именно с повышением мембранной экспресии Раз-рецептора, усилением активности РаБ-регулируемой инициаторной каспазы-8 и эффекторных каспаз -3 и -6.

5. После прохождения курса лечения (стандартного/комплексного) у пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ наблюдается нормализация численности анализируемых субпопуляций МНПК и уровня активности каспаз. Применение иммуномодулирующей терапии способствует более быстрому восстановлению количества регуляторных Т-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток и В-лимфоцитов в периферической крови больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ.

6. Результаты анализа экспрессии генов раннего ответа (в частности, с-/о$) и активности каспаз -3,-6,-9 в опухолевой ткани и каспаз -3,-6,-8 в МНПК позволяют рассматривать данные гены как перспективные биомаркеры при комплексной диагностике ЦИН 3 и ранних форм РШМ.

АПК

БЭ

ВОЗ

ВПЧ

ДАФИ

МНПКнк-пкс

ПЦР-РВ РШМцин-цтл

HSIL-LSIL-Tregs

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ антиген-презентирующие клетки бромистый этидий

Всемирная организация здравоохранения вирус папилломы человека 4, 6-диамидино-2-фенилиндол мононуклеарные клетки периферической крови натуральные киллеры программируемая клеточная смерть ПЦР в режиме «реального времени» рак шейки матки цервикальная интраэпителиальная неоплазия цитотоксические Т-лимфоциты high-grade squamous intraepithelial lesions (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени тяжести) low-grade squamous intraepithelial lesions (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени тяжести) регуляторные Т-лимфоциты

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленное диссертационное исследование является попыткой комплексного подхода к проблеме поиска диагностических биомаркеров ЦИН и РШМ, сочетающего анализ молекулярных изменений в очаге неоплазии и в иммунной системе пациентки. В качестве потенциальных тканевых маркеров были выбраны для исследования гены, экспрессия которых связана с ключевыми свойствами злокачественно трансформированной клетки - пролиферативной активностью (гены раннего пролиферативного ответа) и резистентностью к апоптозу (гены каспаз). Для исследования изменений иммунного статуса мы анализировали как численность популяций иммунокомпетентных клеток, так и изменение их функционального состояния (формирование предрасположенности к апоптозу). Основное внимание в работе было уделено возможности использования генов раннего ответа и генов каспаз в качестве тканевых и иммунологических биомаркеров ранних форм (преинвазивного, микроинвазивного) РШМ, для которых проблема объективной диагностики и связанная с ней проблема выбора вариантов лечения являются особенно актуальными.

На сегодняшний день выбор тактики лечения РШМ или предраковых, интраэпителиальных поражений фактически полностью определяется стадией заболевания (или степенью вовлеченности слоев цервикального эпителия в патологических процесс - при ЦИН). Уточняющая диагностика ЦИН и РШМ основывается на проведении гистологического исследования биопсийного материала шейки матки. Однако многими исследователями обсуждаются серьезные ограничения данного диагностического метода, особенно в отношении ранних форм РШМ и ЦИН. Главным ограничением является использование морфологических критериев оценки, которые, во-первых, не отражают индивидуальный молекулярный фенотип опухолевых клеток. Во-вторых, использование морфологических критериев неизбежно связано с высокой степенью субъективности оценки, что, в совокупности с вышеуказанными ограничениями, может приводить к ошибочному диагнозу, некорректному прогнозированию индивидуальных рисков (как в сторону завышения, так и в сторону занижения), неоправданно большому (или, наоборот, недостаточному) хирургическому вмешательству [197]. Таким образом, в сфере диагностики предопухолевой и опухолевой патологии шейки матки ощущается острая необходимость в разработке спектра релевантных молекулярных биомаркеров, который позволил бы значительно повысить точность постановки диагноза и определить схему лечения. Другое активно развивающееся направление - иммунотерапия ВПЧ-инфекции и вызванных ею ЦИН/РШМ, поиск ее мишеней и молекулярных показателей адекватности и эффективности ее применения.

Данные, полученные при выполнении диссертационного исследования, указывают на то, что протоонкогены с-тус, с-/о$, с-]ип и гены каспаз (-3,-6,-8,-9) занимают важное место в молекулярном «портрете» ЦИН 3 и РШМ и характеризуют процессы формирования основных фенотипических характеристик опухоли -пролиферативный потенциал и устойчивость к апоптоз-индуцирующим факторам. Анализ экспрессии генов раннего ответа выявил молекулярно-генетическую гетерогенность внутри группы ЦИН 3. Сопоставление результатов анализа с результатами гистологического исследования показало, что уровень экспрессии генов раннего ответа изменяется сложным образом при переходе от ЦИН 3 к микроинвазивному РШМ. Анализ активности каспаз также позволил достоверно дифференцировать ранние этапы развития РШМ (интраэпителиальный и микроинвазивный рак). Таким образом, полученные данные предоставляют основания для рассмотрения генов раннего ответа и генов каспаз в качестве перспективных биомаркеров в комплексной диагностике ЦИН и ранних форм РШМ (в сочетании с другими молекулярными маркерами вирусного и клеточного происхождения и с морфологическими критериями). Тем не менее, необходимо отметить, что для применения изученных показателей в клинической практике требуются дополнительные исследования (в частности, включение в анализ дисплазий легкой и средней степени тяжести).

Анализ экспрессии различных СО-маркеров и каспаз в лимфоцитах периферической крови больных позволил установить, что прогрессия РШМ сопровождается закономерной аккумуляцией разнонаправленных нарушений популяционной структуры и функционального состояния иммунокомпетентных клеток. При этом по изученным показателям выявлено достоверное различие между интраэпителиальными нарушениями и стадиями инвазивного РШМ. На этом основании мы можем полагать, данные показатели имеют перспективу использования при диагностике степени иммунных отклонений, определении необходимости и объема иммуномодулирующей терапии. Дополнительным подкреплением этого предположения является то, что, как показано в работе, проанализированные иммуномаркеры могут «отвечать» на иммуномодулирующую терапию и, следовательно, служить показателями ее адекватности и эффективности.

Кроме перспектив клинического применения, результаты диссертационной работы определяют возможные направления дальнейших фундаментальных исследований, в частности: изучение факторов и механизмов системной индукции апоптоз-ассоциированных процессов в иммунных клетках при ВПЧ-инфекции и ЦИН, роли процессов апоптоза в системной иммуносупрессии при развитии онкопатологии, механизмов регуляции активности каспаз и сложной динамики экспрессии протоонкогенов в неопластических клетках эпителия шейки матки. Потенциальным прикладным аспектом диссертационного исследования является возможность использования генов раннего ответа и каспаз в качестве новых терапевтических мишеней. Кроме того, результаты работы указывают на необходимость разработки комплексных подходов к терапии ЦИН и ранних форм РШМ, направленных на восстановление и стимулирование способности иммунной защиты организма самостоятельно распознавать и элиминировать вирус-инфицированные и трансформированные клетки.

Результаты диссертационного исследования планируется в дальнейшем развивать путем включения в анализ маркеров, характеризующих формирование инвазивного и про-ангиогенного фенотипа клеток ЦИН, расширения спектра анализируемых стадий заболевания (ЦИН 1-2) и детального изучения функциональных изменений в популяции натуральных киллеров.

В заключение, хотелось бы выразить надежду, что результаты, полученные в ходе работы, будут способствовать совершенствованию методов диагностики и терапии ЦИН/РШМ, реализации персонализированного подхода к пациентке и улучшению общих показателей борьбы с заболеваемостью и смертностью от РШМ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Курмышкина, Ольга Вадимовна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анисимов, А.Г., Болотников, И.А. Обработка синхронизированных клеток К562 тетрафторалюминатом не модулирует флуоресценцию бромистого этидия и 4', 6-диамидино-2-фенилиндола при связывании с нуклеоидной ДНК // Цитология. — 1999. - Т.41. - №8. - С.680-684.

2. Иванов, С.Д. Пострадиационные реакции ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови. Детектирование, закономерности, диагностическое и прогностическое значение: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.01 / Иванов Сергей Дмитриевич. — СПб., 1992. -40 с.

3. Имянитов, Е.Н. Молекулярные механизмы опухолевого роста // Вопросы онкологии. -2010. -Т.56. - №2. - С. 117-128.

4. Мерабишвили, В.М., Лалианци, Э.И., Субботина О.Ю. Рак шейки матки: заболеваемость, смертность (популяционное исследование) // Вопросы онкологии. — 2012. - Т.58. - №1. - С.41-44.

5. ПЦР «в реальном времени» / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.; под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 215 с.

6. TNM: Классификация злокачественных опухолей / Л.Х. Собин, М.К. Господарович, К. Виттекинд; пер. с анг. под ред. Н.Н. Блинова. — 6-е изд. — СПб.: Эскулап, 2003. -244 с.

7. Хаитов, P.M. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин, А. А. Ярилин. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 354 с.

8. Abd el All, Н., Rey, A., Duvillard, P. Expression of heat shock protein 70 and c-myc in cervical carcinoma // Anticancer Research. — 1998. — Vol. 18. — №3A. — P. 1533-1536.

9. Adamopoulou, M., Kalkani, E., Charvalos, E., et al. Comparison of cytology, colposcopy, HPV typing and biomarker analysis in cervical neoplasia // Anticancer Research. — 2009. - Vol.2. - №8. - P.3401-3409.

10. Aguilar-Lemarroy, A., Romero-Ramos, J.E., Olimon-Andalon, V., et al. Apoptosis induction in Jurkat cells and sCD95 levels in women's sera are related with the risk of developing cervical cancer // BMC Cancer. — 2008. — №8. — P.99.

11. Ali, K.S., Ali, H.Y., Jubrael, J.M. Concentration levels of IL-10 and TNFa cytokines in patients with human papilloma virus (HPV) DNA+ and DNA" cervical lesions // Journal of Immunotoxicology. - 2012. - Vol.9. - №2. - P. 168-172.

12. Andersson, S., Safari, H., Mints, M., et al. Type distribution, viral load and integration status of high-risk human papillomaviruses in pre-stages of cervical cancer (CIN) // British Journal of Cancer. - 2005. - Vol.92. - P.2195 - 2200.

13. Anedchenko, E., Oparina, N., Dmitriev, A., et al. Activation of the hTERT expression in squamous cell cervical carcinoma is not associated with gene amplification // Oncology Reports. - 2008. - Vol.20. - P.469-474.

14.Antinore, M.J., Birrer, M.J., Patel, D., et al. The human papillomavirus type 16 E7 gene product interacts with and trans-activates the API family of transcription factors // The EMBO Journal. - 1996. - Vol.15. - №8. - P. 1950-1960.

15. Aréchaga-Ocampo, E., Pereira-Suárez, A.L., del Moral-Hernández, O., et al. HPV+ cervical carcinomas and cell lines display altered expression of caspases // Gynecologic Oncology. - 2008. - Vol. 108. - P. 10-18.

16. Arreygue-Garcia, N.A., Daneri-Navarro, A., del Toro-Arreola, A., et al. Augmented serum level of major histocompatibility complex class I-related chain A (MICA) protein and reduced NKG2D expression on NK and T cells in patients with cervical cancer and precursor lesions // BMC Cancer. - 2008. - №8. - P. 16.

17. Arvanitis, D.A., Spandidos, D.A. Deregulation of the Gl/S phase transition in cancer and squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix: a case control study // Oncology Reports. - 2008. - Vol.20. - №4. - P.751-760.

18.Bae, S.M., Lee, C.H., Cho, Y.L., et al. Two-dimensional gel analysis of protein expression profile in squamous cervical cancer patients // Gynecologic Oncology. — 2005. — Vol.99. — №1. — P.26-35.

19.Bais, A.G., Beckmann, I., Lindemans, J., et al. A shift to a peripheral Th2-type cytokine pattern during the carcinogenesis of cervical cancer becomes manifest in CIN III lesions // Journal of Clinical Pathology. - 2005. - Vol.58. - №10. - P. 1096-1100.

20. Bhattacharjee, B., Sengupta, S. CpG methylation of HPV 16 LCR at E2 binding site proximal to P97 is associated with cervical cancer in presence of intact E2 // Virology. — 2006. - Vol.354. - P.280-285.

21. Bolpetti, A., Silva, J.S., Villa, L.L., et al. Interleukin-10 production by tumor infiltrating macrophages plays a role in Human Papillomavirus 16 tumor growth // BMC Immunology. -2010. -№11.-P.27.

22.Bontkes, H.J., de Gruijl, T.D., Walboomers, J.M.M., et al. Assessment of cytotoxic T-lymphocyte phenotype using the specific markers granzyme B and TIA-1 in cervical neoplastic lesions // British Journal of Cancer. - 1997. - Vol.76. - №10. - P. 1353-1360.

23.Bourhis, J., Le, M.G., Barrois, M., et al. Prognostic value of c-myc proto-oncogene overexpression in early invasive carcinoma of the cervix // Journal of Clinical Oncology. — 1990. - Vol.8. - №11. - P. 1789-1796.

24.Bozec, A., Ruffion, A., Decaussin, M., et al. Activation of caspases-3, -6, and -9 during finasteride treatment of benign prostatic hyperplasia // The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. - 2005. - Vol.90. -№1. - P. 17-25.

25. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. —1976. -Vol.72. -P.248-254.

26. Brenna, S.M., Zeferino, L.C., Pinto, G.A., et al. c-Myc protein expression is not an independent prognostic predictor in cervical squamous cell carcinoma // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2002. - Vol.35- №4. - P.425-430.

27. Brewer, C.A., Liao, S.Y., Wilczynski, S.P., et al. A study of biomarkers in cervical carcinoma and clinical correlation of the novel biomarker MN // Gynecologic Oncology. — 1996. - Vol.63. - №3. - P.337-344.

28. Brychtova, S., Brychta, T., Sedlakova, E., et al. Proto-oncogene c-myc in uterine cervix carcinogenesis // Neoplasma. — 2004. — Vol.51. — №2. — P.84-89.

29. van der Burg, S.H., Piersma, S.J., de Jong, A., et al. Association of cervical cancer with the presence of CD4+ regulatory T cells specific for human papillomavirus antigens // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2007. — Vol.104. — №29. — P. 12087-12092.

30. Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // Journal of Molecular Endocrinology. — 2000. — Vol.25. - P. 169-193.

31.Bustin, S.A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems I I Journal of Molecular Endocrinology. — 2002. — Vol.29. — P.23-39.

32.Cheriyan, V.T., Krishna, S.M., Kumar, A., et al. Signaling defects and functional impairment in T-cells from cervical cancer patients // Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. - 2009. - Vol.24. -№6. - P.667-674.

33.Chernysh, S., Kim, S.I., Bekker, G., et al. Antiviral and antitumor peptides from insects // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2002. — Vol.99. — №20. - P. 1262812632.

34. Cheung, T.H., Chung, T.K., Lo, K.W., et al. Apotosis-related proteins in cervical intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma of the cervix // Gynecologic Oncology. - 2002. - Vol.86. -№1. - P. 14-18.

35. Chiang, S. Y., Welch, J., Rauscher, F.J. 3rd, et al. Effects of minor groove binding drugs on the interaction of TATA box binding protein and TFIIA with DNA // Biochemistry. — 1994. - Vol.33. -№23. -P.7033-7040.

36. Conesa-Zamora, P., Trujillo-Santos, J., Orantes-Casado, F.J., et al. Analysis of performance characteristics of five cell cycle-related immunohistochemical markers and human papillomavirus genotyping in the diagnosis of cervical squamous cell carcinoma precursor lesions // Analytical and Quantitative Cytology and Histology. — 2012. — Vol.34. — №1. — P.49-55.

37.Contreras, D.N., Krammer, P.H., Potkul, R.K., et al. Cervical cancer cells induce apoptosis of cytotoxic T lymphocytes // Journal of Immunotherapy. — 2000. — Vol.23. — №1. — P.67-74.

38. Cook, P.R., Brazell, I. A. Spectofluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei // European Journal of Biochemistry. — 1978. — Vol.84. -P.465-477.

39. Couturier, J., Sastre-Garau, X., Schneider-Maunoury, S., et al. Integration of papillomavirus DNA near myc genes in genital carcinomas and its consequences for proto-oncogene expression // Journal of Virology. — 1991. — Vol.65. — №8. — P.4534-4538.

40. Cromme, F.V., Snijders, P.J., van den Brule, A.J., et al. MHC class I expression in HPV 16 positive cervical carcinomas is post-transcriptionally controlled and independent from c-myc overexpression // Oncogene. — 1993. — Vol.8. — №11. — P.2969-2975.

41. Crook, T., Almond, N., Murray, A., et al. Constitutive expression of c-myc oncogene confers hormone independence and enhanced growth-factor responsiveness on cells transformed by human papilloma virus type 16 // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1989. - Vol.86. - P.5713-5717.

42. Dang, C.V. MYC on the path to cancer // Cell. - 2012. - Vol. 149. - №1. - P.22-35.

43.Das, S., Karim, S., Datta, R.C., et al. Peripheral blood lymphocyte subpopulations in patients with cervical cancer // International Journal of Gynecology and Obstetrics. — 2007. - Vol.98. - №2. - P. 143-146.

44. Delias, A., Schultheiss, E., Holzgreve, W., et al. Investigation of the Bcl-2 and C-myc expression in relationship to the Ki-67 labelling index in cervical intraepithelial neoplasia // International Journal of Gynecological Pathology. — 1997. — Vol.16. —№3. — P.212-218.

45.Demeret, C., Garcia-Carranca, A., Thierry, F. Transcription-independent triggering of the extrinsic pathway of apoptosis by human papillomavirus 18 E2 protein // Oncogene. — 2003. - Vol.22. - №2. - P. 168-175.

46.Devictor, B., Bonnier, P., Piaña, L., et al. c-Myc protein and Ki-67 antigen immunodetection in patients with uterine cervix neoplasia: correlation of microcytophotometric analysis and histological data // Gynecologic Oncology. — 1993. — Vol.49. - №3. - P.284-290.

47. Doorbar, J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer // Clinical Science. - 2006. - Vol.110. - P.525-541.

48. Du, J., Chen, G.G., Vlantis, A.C., et al. Resistance to apoptosis of HPV 16-infected laryngeal cancer cells is associated with decreased Bak and increased Bcl-2 expression // Cancer Letters. - 2004. - Vol.205. -№1. -P.81-88.

49. Dueñas-González, A., Lizano, M., Candelaria, M., et al. Epigenetics of cervical cancer. An overview and therapeutic perspectives // Molecular Cancer. — 2005. — №4. — P.38.

50.Dworacki, G., Meidenbauer, N., Kuss, I., et al. Decreased zeta chain expression and apoptosis in CD3+ peripheral blood T lymphocytes of patients with melanoma // Clinical Cancer Research. - 2001. - Vol.7. -№3(Suppl). - P.947s-957s.

51.Eferl, R., Wagner, E.F. AP-1: A double-edged sword in tumorigenesis // Nature Reviews. Cancer. -2003. - Vol.3. -№11. -P.859-868.

52.Eilers, M., Eisenman, R.N. Myc's broad reach // Genes and Development. — 2008. — Vol.22. - P.2755-2766.

53.Ekonomopoulou, M.T., Babas, E., Mioglou-Kalouptsi, E., et al. Changes in activities of caspase-8 and caspase-9 in human cervical malignancy // Internatinal Journal of Gynecological Cancer. - 2011. - Vol.21. - №3. - P.435-438.

54.Fahey, L.M., Raff, A.B., Da Silva, D.M., et al. A major role for the minor capsid protein of human papillomavirus type 16 in immune escape // Journal of Immunology. — 2009. — Vol.183. -№10. -P.6151-6156.

55.Ferber, M.J., Thorland, E.C., Brink, A.A., et al. Preferential integration of human papillomavirus type 18 near the c-myc locus in cervical carcinoma // Oncogene. — 2003. — Vol.22. -P.7233-7242.

56. Frazer, I.H. Interaction of human papillomaviruses with the host immune system: A well evolved relationship // Virology. - 2009. - Vol.384. - P.410-414.

57.Gadducci, A., Guerrieri, M.E., Greco, C. Tissue biomarkers as prognostic variables of cervical cancer // Critical Reviews in Oncology/Hematology. — 2012. — pii: S1040-8428(12)00186-2. doi: 10.1016/j.critrevonc.2012.09.003.

58. Gandarillas, A., Watt, F.M. Changes in expression of members of the fos and jun families and myc network during terminal differentiation of human keratinocytes // Oncogene. — 1995. - Vol. 11. - №7. - P. 1403-1407.

59. Giannini, S.L., Hubert, P., Doyen, J., et al. Influence of the mucosal epithelium microenvironment on Langerhans cells: implications for the development of squamous intraepithelial lesions of the cervix // International Journal of Cancer. — 2002. — Vol.97. — P.654-659.

60. Gibb, E.A., Becker-Santos, D.D., Enfield, K.S., et al. Aberrant expression of long noncoding RNAs in cervical intraepithelial neoplasia // International Journal of Gynecological Cancer. - 2012. - Vol.22. - №9. - P. 1557-1563.

61.Gius, D., Funk, M.C., Chuang, E.Y., et al. Profiling microdissected epithelium and stroma to model genomic signatures for cervical carcinogenesis accommodating for covariates // Cancer Research. -2007. - Vol.67. -№15,-P.7113-7123.

62. Gross-Mesilaty, S., Reinstein, E., Bercovich, B., et al. Basal and human papillomavirus E6 oncoprotein-induced degradation of Myc proteins by the ubiquitin pathway // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1998. - Vol.95. - №14. - P.8058-8063.

63.Guijon, F.B., Greulich-Bode, K., Paraskevas, M., et al. Premalignant cervical lesions are characterized by dihydrofolate reductase gene amplification and c-Myc overexpression: possible biomarkers // Journal of Lower Genital Tract Disease. — 2007. — Vol. 11. — №4. — P.265-272.

64. Gupta, M.M., Jain, R., Parashari, A., et al. Circulating immune profile in patients with precancer and cancer of the cervix: a cross sectional study among Indian women // Bulletin du Cancer. - 1993. - Vol.80. -№10. -P.852-856.

65.Hammes, L.S., Tekmal, R.R., Naud, P., et al. Macrophages, inflammation and risk of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) progression -clinicopathological correlation // Gynecologic Oncology. - 2007. - Vol. 105. - №1. - P. 157-165.

66. Hansen, C.N., Ketabi, Z., Rosenstierne, M.W. Expression of CPEB, GAPDH and U6snRNA in cervical and ovarian tissue during cancer development // Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. — 2009. — Vol. 117. — №1. — P.53-59.

67.Heer, A., Alonso, L.G., de Prat-Gay, G. E6*, the 50 amino acid product of the most abundant spliced transcript of the E6 oncoprotein in high-risk human papillomavirus, is a promiscuous folder and binder // Biochemistry. — 2011. — Vol.50. — №8. — P. 1376-1383.

68. Helm, C.W., Shrestha, K., Thomas, S., et al. A unique c-myc-targeted triplex-forming oligonucleotide inhibits the growth of ovarian and cervical carcinomas in vitro // Gynecologic Oncology. - 1993. - Vol.49. -№3. - P.339-343.

69. Hernández-Montes, J., Rocha-Zavaleta, L., Monroy-Garcia, A., et al. Peripheral blood lymphocytes from low-grade squamous intraepithelial lesions patients recognize vaccine antigens in the presence of activated dendritic cells, and produced high levels of CD8 + IFNy + T cells and low levels of IL-2 when induced to proliferate // Infectious Agents and Cancer. - 2012. - №7. - P. 12.

70. Hess, J., Angel, P., Schorpp-Kistner, M. AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings // The Journal of Cell Science. - 2004. - Vol.117. - P.5965-5973.

71.Higareda-Almaraz, J.C., Enriquez-Gasca, M.R., Hernandez-Ortiz, M., et al. Proteomic patterns of cervical cancer cell lines, a network perspective // BMC Systems Biology. — 2011. — №5. — P.96.

72. Но, P.K., Hawkins, C.J. Mammalian initiator apoptotic caspases // FEBS Journal. — 2005. - Vol.272. - №21. - P.5436-5453.

73. Hoffmann, Т.К., Dworacki, G., Tsukihiro, Т., et al. Spontaneous apoptosis of circulating T lymphocytes in patients with head and neck cancer and its clinical importance // Clinical Cancer Research. - 2002. - Vol.8. - №8. - P.2553-2562.

74. Hoser, G., Wasilewska, D., Domagala-Kulawik, J. Expression of Fas receptor on peripheral blood lymphocytes from patients with non-small cell lung cancer // Folia Histochemica et Cytobiologica. - 2004. - Vol.42. - №4. - P.249-252.

75. Hughes, R.G., Neill, W.A., Norval, M. Papillomavirus and c-myc antigen expression in normal and neoplastic cervical epithelium // Journal of Clinical Pathology. — 1989. — Vol.42.-№1.-P.46-51.

76. Hwang, S.J., Shroyer, K.R. Biomarkers of cervical dysplasia and carcinoma // Journal of Oncology. -2012. doi: 10.1155/2012/507286.

77. Ibeanu, O.A. Molecular pathogenesis of cervical cancer // Cancer Biology and Therapy. — 2011. - Vol.11. -№3. -P.295-306.

78. Ibrahim, R., Frederickson, H., Parr, A., et al. Expression of FasL in squamous cell carcinomas of the cervix and cervical intraepithelial neoplasia and its role in tumor escape mechanism // Cancer. - 2006. - Vol. 106. - №5. - P. 1065-1077.

79.Isacson, C., Kessis, T.D., Hedrick, L., et al. Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirus type // Cancer Research. - 1996. - Vol.56. - №4. - P.669-674.

80. Iwasaka, Т., Yokoyama, M., Oh-uchida, M., et al. Detection of human papillomavirus genome and analysis of expression of c-myc and Ha-ras oncogenes in invasive cervical carcinomas // Gynecologic Oncology. - 1992. — Vol.46. - №3. — P.298-303.

81. Jain, R., Gupta, M.M., Parashari, A., et al. Peripheral blood lymphocyte subpopulations in Indian women with cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer - an immunocytochemical study using monoclonal antibodies // Cancer Letters. — 1990. — Vol.54. -№1-2. - P. 17-20.

82. Jäger, R., Zwacka, R.M. The enigmatic roles of caspases in tumor development 11 Cancers. -2010. - Vol.2. — №4. -R1952-1979.

83. Jayshree, R.S., Sreenivas, A., Tessy M., et al. Cell intrinsic and extrinsic factors in cervical carcinogenesis // Indian Journal of Medical Research. — 2009. — №130. — P.286-295.

84. de Jong, A., van Poelgeest, M.I.E., van der Hülst, J.M., et al. Human papillomavirus type 16-positive cervical cancer is associated with impaired CD4+ T-cell immunity against early antigens E2 and E6 // Cancer Research. - 2004. - Vol.64. - P.5449-5455.

85.Jonuleit, H., Schmitt, E., Schuler, G., et al. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells // Journal of Experimental Medicine. — 2000. — Vol.192. - №9. - P. 1213-1222.

86. Jordanova, E.S., Gorter, A., Ayachi O., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? // Clinical Cancer Research. — 2008. — Vol.14. — №7. — P.2028-2035.

87. Jurado, J., Fuentes-Almagro, C.A., Prieto-Alamo, M.J., et al. Alternative splicing of c-fos pre-mRNA: contribution of the rates of synthesis and degradation to the copy number of each transcript isoform and detection of a truncated c-Fos immunoreactive species // BMC Molecular Biology. - 2007. - №8. - P.83.

88. Kabsch, K., Alonso, A. The human papillomavirus type 16 E5 protein impairs TRAIL- and FasL-mediated apoptosis in HaCaT cells by different mechanisms // Journal of Virology. — 2002. - Vol.76. -№23. - P. 12162-12172.

89.Kanodia, S., Da Silva, D.M., Kast, W.M. Recent advances in strategies for immunotherapy of human papillomavirus-induced lesions // International Journal of Cancer. — 2008. — Vol.122.-P.247-259.

90.Kanodia, S., Fahey, L.M., Kast, W.M. Mechanisms used by human papillomaviruses to escape the host immune response // Current Cancer Drug Targets. — 2007. — №7. — P. 79-89.

91.Karim, R., Jordanova, E.S., Piersma S.J., et al. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma // Clinical Cancer Research. - 2009. - Vol. 15. - №20. - P.6341-6347.

92. Kim, H.H., Kuwano, Y., Srikantan, S., et al. HuR recruits let-7/RISC to repress c-Myc expression // Genes and Development. — 2009. - Vol.23. - №15. — P. 1743-1748.

93. Kim, J.W., Kim, S.J., Han, S.M., et al. Increased glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expression in human cervical cancers // Gynecologic Oncology. — 1998. - Vol.71. - №2. - P.266-269.

94. Kinoshita, T., Shirasawa, H., Shino, Y., et al. Transactivation of prothymosin alpha and c-myc promoters by human papillomavirus type 16 E6 protein // Virology. — 1997. — Vol.232. -№1. -P.53-61.

95.Kobayashi, A., Weinberg, V., Darragh, T., et al. Evolving immunosuppressive microenvironment during human cervical carcinogenesis // Mucosal Immunology. — 2008. -Vol.1. — №5. - P.412-420.

96.Kohler, M., Janz, I., Wintzer, H.O., et al. The expression of EGF receptors, EGF-like factors and c-myc in ovarian and cervical carcinomas and their potential clinical significance // Anticancer Research. — 1989. — Vol.9. — №6. — P. 1537-1547.

97. Kolomeichuk, S.N., Terrano, D.T., Lyle, C.S., et al. Distinct signaling pathways of microtubule inhibitors - vinblastine and Taxol induce JNK-dependent cell death but through AP-1-dependent and AP-1-independent mechanisms, respectively // FEBS Journal.

- 2008. - Vol.275. - №8. - P. 1889-1899.

98.Korzeniewski, N., Spardy, N., Duensing, A., et al. Genomic instability and cancer: lessons learned from human papillomaviruses // Cancer Letters. — 2011. — Vol.305. — №2. — P.113-122.

99. Kossenkov, A.V., Dawany, N., Evans, T.L., et al. Peripheral immune cell gene expression predicts survival of patients with non-small cell lung cancer // PLoS One. — 2012. — Vol.7.

— №3. — P.e34392.

100. Kossenkov, A.V., Vachani, A., Chang, C., et al. Resection of non-small cell lung cancers reverses tumor-induced gene expression changes in the peripheral immune system // Clinical Cancer Research. - 2011. - Vol.17. - P.5867-5877.

101. Kyo, S., Klumpp, D.J., Inoue M., et al. Expression of API during cellular differentiation determines human papillomavirus E6/E7 expression in stratified epithelial cells // Journal of General Virology. - 1997. - Vol.78. - P.401-411.

102. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol.227. - P.680-685.

103. Lagunas-Martínez, A., Madrid-Marina, V., Ganglio, P. Modulation of apoptosis by early human papillomavirus proteins in cervical cancer // Biochimica et Biophysica Acta. — 2010.-Vol.1805.-P.6-16.

104. Lakatosh, V.P., Lazarenko, L.M., Spivak ,M.I., et al. The determination of the cellular immunity indices in papillomavirus infection of the female genitalia // Lik Sprava. — 1999. — №4. — P.98-102.

105. Laurson, J., Khan, S., Chung, R., et al. Epigenetic repression of E-cadherin by human papillomavirus 16 E7 protein // Carcinogenesis. — 2010. — Vol.31. — №5. — P.918-926.

106. Lee, B.H., Roh, S., Kim, Y.I., et al. Difference of genome-wide copy number alterations between high-grade squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinomas of the uterine cervix // The Korean Journal of Pathology. — 2012. — №46. — P. 123-130.

107. Lee, J.S., Kim, H.S., Jung, J.J., et al. Angiogenesis, cell proliferation and apoptosis in progression of cervical neoplasia // Analytical and Quantitative Cytology and Histology. — 2002. - Vol.24. - №2. - P. 103-113.

108. Livak, K.J., Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. - 2001. - Vol. 25. -№4. - P.402-408.

109. Loddenkemper, C., Hoffmann, C., Stanke, J., et al. Regulatory (FOXP3+) T cells as target for immune therapy of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer // Cancer Science. - 2009. - Vol. 100. - №6. - P. 1112-1117.

110. Lomnytska, M.I., Becker, S., Hellman, K., et al. Diagnostic protein marker patterns in squamous cervical cancer // PROTEOMICS - Clinical Applications. — 2010. — Vol.4. — №1.-P. 17-31.

111. Longworth, M.S., Laimins, L.A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia // Microbiology and Molecular Biology Reviews. — 2004. — Vol. 68. -№2. - P. 362-372.

112. Ma, Y., Shurin, G.V., Peiyuan, Z., et al. Dendritic cells in the cancer microenvironment //Journal of Cancer. -2013. - Vol.4. -№1. - P.36-44.

113. Ma, Y.X., Ye, F., Chen, H.Z., et al. Study of apoptosis and Fas expression of peritoneal fluid and peripheral blood T lymphocytes in patients with epithelial ovarian cancer and their relationship with CA125 // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 2007. - Vol.87. - №11. -P.734-739.

114. Mahata, S., Bharti, A.C., Shukla, S., et al. Berberine modulates AP-1 activity to suppress HPV transcription and downstream signaling to induce growth arrest and apoptosis in cervical cancer cells // Molecular Cancer. — 2011. — Vol.15. —№10. — P.39.

115. Maritz, M.F., van der Watt, P.J., Holderness, N., et al. Inhibition of AP-1 suppresses cervical cancer cell proliferation and is associated with p21 expression // Biological Chemistry. -2011. - Vol.392. - №5. -P.439-448.

116. McMurray, H.R., McCance, D.J. Human papillomavirus type 16 E6 activates TERT gene transcription through induction of c-Myc and release of USF-mediated repression // Journal of Virology. - 2003. - Vol.77. -№18. - P.9852-9861.

117. Milde-Langosch, K. The Fos family of transcription factors and their role in tumourigenesis // European Journal of Cancer. — 2005. — Vol.41. — P.2449-2461.

118. Miura, S., Kawana, K., Schust, D.J., et al. CDld, a sentinel molecule bridging innate and adaptive immunity, is downregulated by the human papillomavirus (HPV) E5 protein: a possible mechanism for immune evasion by HPV // Journal of Virology. — 2010. — Vol.84. -№22. - P. 11614-11623.

119. Moiling, J.W., de Gruijl, T.D., Glim, J., et al. CD4(+)CD25high regulatory T-cell frequency correlates with persistence of human papillomavirus type 16 and T helper cell responses in patients with cervical intraepithelial neoplasia // International Journal of Cancer. - 2007. - Vol. 121. - №8. - P. 1749-1755.

120. Moody, C.A., Fradet-Turcotte, A., Archambault, J., et al. Human papillomaviruses activate caspases upon epithelial differentiation to induce viral genome amplification // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2007. — Vol.104. — №49. — P. 19541-19546.

121. Moody, C.A., Laimins, L.A. Human papillomavirus oncoproteins: pathways to transformation // Nature Reviews Cancer. — 2010. — Vol. 10. — №8. — P.550-560.

122. Moro-Rodríguez, E., Álvarez-Fernández, E. Losses of expression of the antigens A, Lea and Lex and over-expression of Ley in carcinomas and HG-SIL of the uterine cervix // Diagnostic Pathology. - 2008. - №3. - P.38.

123. Morosov, A., Phelps, W.C., Raychaudhuri, P. Activation of the c-fos gene by the HPV16 upon the CAMP-response element at -60 // The Journal of Biological Chemistry. — 1994. - Vol.269. - №28. - P. 18434-18440.

124. Mota, F., Rayment, N., Chong, S., et al. The antigen-presenting environment in normal and human papillomavirus (HPV)-related premalignant cervical epithelium // Clinical and Experimental Immunology. — 1999. — Vol. 116. — №1. - P.33-40.

125. Mrass, P., Rendí, M., Mildner, M., et al. Retinoic acid increases the expression of p53 and proapoptotic caspases and sensitizes keratinocytes to apoptosis: a possible explanation for tumor preventive action of retinoids // Cancer Research. — 2004. — Vol.64. — №18. — P.6542-6548.

126. Nair, S.A., Nair, M.B., Jayaprakash, P.G., et al. Ras and c-myc oncoproteins during tumor progression in the uterine cervix // Tumori. — 1998. — Vol.84. — №5. — P.583-588.

127. Nakamura, T., Shima, T., Saeki, A., et al. Expression of indoleamine 2, 3-dioxygenase and the recruitment of Foxp3-expressing regulatory T cells in the development and progression of uterine cervical cancer // Cancer Science. — 2007. — Vol.98. — №6. — P. 874-881.

128. Narayan, G., Murty, V.V. Integrative genomic approaches in cervical cancer: implications for molecular pathogenesis // Future Oncology. — 2010. — Vol.6. — №10. — P. 1643-1652.

129. Narayan, S., Choyce, A., Linedale, R., et al. Epithelial expression of human papillomavirus type 16 E7 protein results in peripheral CD8 T-cell suppression mediated by CD4+CD25+ T cells // European Journal of Immunology. - 2009. - Vol.39. - №2. -P.481-490.

130. Nead, M.A., Baglia, L.A., Antinore, M.J., et al. Rb binds c-Jun and activates transcription // The EMBO Journal. - 1998. - Vol. 17. - №8. - P.2342-2352.

131. Nees, M., Geoghegan, J.M., Hyman, T., et al. Papillomavirus type 16 oncogenes downregulate expression of interferon-responsive genes and upregulate proliferation-

associated and NF-kB-responsive genes in cervical keratinocytes // Journal of Virology. — 2001. - Vol.75. - №9. - P.4283-4296.

132. Ngan, H.Y., Liu, S.S., Yu, H., et al. Proto-oncogenes and p53 protein expression in normal cervical stratified squamous epithelium and cervical intra-epithelial neoplasia // European Journal of Cancer. - 1999. - Vol.35. - №10. - P. 1546-1550.

133. Nieland, J.D., Loviscek, K., Kono, K., et al. PBLs of early breast carcinoma patients with a high nuclear grade tumor unlike PBLs of cervical carcinoma patients do not show a decreased TCR zeta expression but are functionally impaired // Journal of Immunotherapy. - 1998.-Vol.21. - №4,-P.317-322.

134. Nirnberg, W., Artuc, M., Vorbrueggen, G., et al. Nuclear proto-oncogene products transactivate the human papillomavirus type 16 promoter // British Journal of Cancer. — 1995. - Vol.71.-P. 1018-1024.

135. Oh, E.K., Kim, Y.W., Kim, I.W., et al. Differential DNA copy number aberrations in the progression of cervical lesions to invasive cervical carcinoma // International Journal of Oncology. -2012. - Vol.41. -№6. - P.2038-2046.

136. O'Leary, J.J., Landers, R.J., Crowley, M., et al. Alterations in exon 1 of c-myc and expression of p62c-myc in cervical squamous cell carcinoma // Journal of Clinical Pathology. - 1997. - Vol.50. -№11. -P.896-903.

137. Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer // Cell Death and Differentiation. — 2011. -№18.-P. 1441-1449.

138. Peter, M., Rosty, C., Couturier, J., et al. MYC activation associated with the integration of HPV DNA at the MYC locus in genital tumors // Oncogene. — 2006. — Vol.25. — P.5985-5993.

139. Petera, J., Sirak, I., Beranek, M., et al. Molecular predictive factors of outcome of radiotherapy in cervical cancer // Neoplasma. — 2011. — Vol.58. — №6. — P.469-475.

140. Petrov, S.V., Mazurenko, N.N., Sukhova, N.M., et al. Cell oncogene expression in normal, metaplastic, dysplastic epithelium and squamous cell carcinoma of the uterine cervix // Archives of Pathology. - 1994. - Vol.56. - №4. - P.22-31.

141. Pfaffl, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucleic Acids Research. - 2001. - Vol.29. - №9. - P.e45.

142. Philchenkov, A., Zavelevich, M., Kroczak, T.J., et al. Caspases and cancer: mechanisms of inactivation and new treatment modalities // Experimental Oncology. — 2004. — Vol.26. — №2. — P. 82—97.

143. Pinion, S.B., Kennedy, J.H., Miller, R.W., et al. Oncogene expression in cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer of cervix // Lancet. — 1991. — Vol.337. — №8745. — P.819-820.

144. Pinto, A.P., Degen, M., Villa, L.L., et al. Immunomarkers in gynecologic cytology: the search for the ideal 'biomolecular Papanicolaou test' // Acta Cytologica. — 2012. — Vol.56. -№2. - P. 109-121.

145. Ponzielli, R., Katz, S., Barsyte-Lovejoy, D., et al. Cancer therapeutics: Targeting the dark side of Myc // European Journal of Cancer. - 2005. - Vol.41. - P.2485-2501.

146. Prusty, B.K., Das B.C. Constitutive activation of transcription factor AP-1 in cervical cancer and suppression of human papillomavirus (HPV) transcription and AP-1 activity in HeLa cells by curcumin // International Journal of Cancer. — 2005. — Vol.113. — P.951-960.

147. Rajkumar, T., Sabitha, K., Vijayalakshmi, N., et al. Identification and validation of genes involved in cervical tumourigenesis // BMC Cancer. — 2011. — №11. — P.80.

148. Rao, P.E., Petrone, A.L., Ponath, P.D. Differentiation and expansion of T cells with regulatory function from human peripheral lymphocytes by stimulation in the presence of TGF(3 // Journal of Immunology. - 2005. - Vol.174. - №3. - P. 1446-1455.

149. van Riggelen, J., Buchwalter, G., Soto, U., et al. Loss of net as repressor leads to constitutive increased c-fos transcription in cervical cancer cells // The Journal of Biological Chemistry. - 2005. - Vol.280. - №5. - 3286-3294.

150. Riou, G., Barrois, M., Le, M.G., et al. C-myc proto-oncogene expression and prognosis in early carcinoma of the uterine cervix // Lancet. — 1987. — Vol.1. — №8536. — P.761-763.

151. Rodriguez, A.C., Garcia-Pineres, A.J., Hildesheim, A., et al. Alterations of T-cell surface markers in older women with persistent human papillomavirus infection // International Journal of Cancer. - 2011. - Vol. 128. - №3. - P.597-607.

152. Rosl, F., Das, B.C., Lengert, M., et al. Antioxidant-induced changes of the AP-1 transcription complex are paralleled by a selective suppression of human papillomavirus transcription // Journal of Virology. - 1997. - Vol.71. -№1. - P.362-370.

153. Ruan, Y.H., Wei, W.L., Zhang, H.X., et al. Comparison and analysis of expression of c-myc and pl6 in cervical carcinoma // Ai Zheng. — 2003— Vol.22. — №6. — P.602-606.

154. Saavedra, K., Brebi, P., Roa, J.C. Epigenetic alterations in preneoplastic and neoplastic lesions of the cervix // Clinical Epigenetics. — 2012. — №4. — P.13.

155. Sagawa, Y., Nishi, H., Isaka, K., et al. The correlation of TERT expression with c-myc expression in cervical cancer // Cancer Letters. — 2001. — Vol. 168. — №1. — P.45-50.

156. Santin, A.D., Ravaggi, A., Bellone, S., et al. Tumor-infiltrating lymphocytes contain higher numbers of type 1 cytokine expressors and DR+ T cells compared with lymphocytes from tumor draining lymph nodes and peripheral blood in patients with cancer of the uterine cervix // Gynecologic Oncology. — 2001. — Vol.81. — №3. — P.424-432.

157. Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., et al. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways // The EMBO Journal. - 1998. - Vol. 17. - №6. - P. 1675-1687.

158. Schmitz, M., Driesch, C., Jansen, L., et al. Non-random integration of the HPV genome in cervical cancer // PLoS One. - 2012. - Vol.7. - №6. - P.e39632.

159. Selvaggi, L., Vicino, M., Loverro, G., et al. Lymphocyte subpopulations in patients with cervical cancer // European Journal of Gynaecological Oncology. — 1994. — Vol. 15. — №1. - P.46-49.

160. Seresini, S., Origoni, M., Caputo, L., et al. CD4+ T cells against human papillomavirus-18 E7 in patients with high-grade cervical lesions associate with the absence of the virus in the cervix // Immunology. - 2010. - Vol. 131. - №1. - P.89-98.

161. Shadeo, A., Chari, R., Vatcher, G., et al. Comprehensive serial analysis of gene expression of the cervical transcriptome // BMC Genomics. — 2007. — №8. — P. 142.

162. Shaulian, E. AP-1 — The Jun proteins: Oncogenes or tumor suppressors in disguise? // Cellular Signalling. - 2010. - Vol.22. - P.894-899.

163. Shen, Y., Li, Y., Ye, F., et al. Identification of suitable reference genes for measurement of gene expression in human cervical tissues // Analytical Biochemistry. — 2010. — Vol.405. -P.224-229.

164. Sheii, B.C., Lin, R.H., Lien, H.C., et al. Predominant Th2/Tc2 polarity of tumor-infiltrating lymphocytes in human cervical cancer // Journal of Immunology. — 2001. — Vol. 167. - №5. - P.2972-2978.

165. Shoji, Y., Saegusa, M., Takano, Y., et al. Correlation of apoptosis with tumour cell differentiation, progression, and HPV infection in cervical carcinoma // Journal of Clinical Pathology. - 1996. - Vol.49. - №2. - P. 134-138.

166. Sichero, L., Sobrinho, J.S., Villa, L.L. Identification of novel cellular transcription factors that regulate early promoters of human papillomavirus types 18 and 16 // The Journal of Infectious Diseases. - 2012. - Vol.206. - №6. - P.867-874.

167. Slagle, B.L., Kaufman, R.H., Reeves, W.C., et al. Expression of ras, c-myc, and p53 proteins in cervical intraepithelial neoplasia // Cancer. — 1998. — Vol.83. — №7. — P.1401-1408.

168. Sopov, I., Sorensen, T., Magbagbeolu, M., et al. Detection of cancer-related gene expression profiles in severe cervical neoplasia // International Journal of Cancer. — 2004. -Vol.112. — P.33-43.

169. Soto, U., Das, B.C., Lengert,M., et al. Conversion of HPV 18 positive non-tumorigenic HeLa-fibroblast hybrids to invasive growth involves loss of TNF-a mediated repression of viral transcription and modification of the AP-1 transcription complex // Oncogene. — 1999. - Vol. 18. - P.3187-3198.

170. Spivak, M.Y., Lakatosh, V.P., Lazarenko, L.M., et al. Interrelation of lymphocyte subpopulations in peripheral blood under cervical papillomavirus infection // Folia Microbiologica (Praha). - 1999. - Vol.44. - №6. - P.721-725.

171. Spotts, G.D., Patel, S.V., Xiao, Q., et al. Identification of downstream-initiated c-Myc proteins which are dominant-negative inhibitors of transactivation by full-length c-Myc proteins // Molecular and Cellular biology. - 1997. - Vol. 17. - №3. - P. 1459-1468.

172. Stanley, M.A. Immune responses to human papilloma viruses // Indian Journal of Medical Research. - 2009. - Vol.130. - P.266-276.

173. Steele, J.C., Mann, C.H., Rookes, S., et al. T-cell responses to human papillomavirus type 16 among women with different grades of cervical neoplasia // British Journal of Cancer. - 2005. -№93. -P.248-259.

174. Steinau, M., Rajeevan, M.S., Unger, E.R. DNA and RNA references for qRT-PCR assays in exfoliated cervical cells // The Journal of Molecular Diagnostics. — 2006. — Vol.8. -№1. - P. 113-118.

175. Subramanyam, D., Krishna, S. c-Myc substitutes for Notchl-CBFl functions in cooperative transformation with papillomavirus oncogenes // Virology. — 2006. — Vol.347. — №1. —P.191-198.

176. Tanimoto, H., Nagai, N., Fujimoto, H., et al. Molecular biological study on the overexpression of c-myc gene in uterine cervical carcinomas // Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. - 1992. - Vol.44. -№5. - P.566-570.

177. Thierry, F. Transcriptional regulation of the papillomavirus oncogenes by cellular and viral transcription factors in cervical carcinoma // Virology. — 2009. — Vol.384. — P. 375379.

178. Trimble, C.L., Peng, S., Thoburn, C., et al. Naturally occurring systemic immune responses to HPV antigens do not predict regression of CIN2/3 // Cancer Immunology, Immunotherapy. - 2010. - №59. - P.799-803.

179. Tungteakkhun, S.S., Filippova, M., Fodor, N., et al. The full-length isoform of human papillomavirus 16 E6 and its splice variant E6* bind to different sites on the procaspase 8 death effector domain // Journal of Virology. - 2010. - Vol.84. - №3. - P. 1453-1463.

180. Ueda, M., Ueki, M., Kitsuki, K., et al. Study on the management of dysplasia of the uterine cervix // Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. —1992. — Vol.44. — №9. — P. 1165-1172.

181. Velazquez, T.A., Gariglio, V.P. Possible role of transcription factor API in the tissue-specific regulation of human papillomavirus // Revista de Investigación Clinica. — 2002. — Vol.54. -№3. -P.23-42.

182. Veldman, T., Liu, X., Yuan, H., et al. Human papillomavirus E6 and Myc proteins associate in vivo and bind to and cooperatively activate the telomerase reverse transcriptase promoter // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2003. — Vol.100. — №14. -P.8211-8216.

183. Vervoorts, J., Luscher-Firzlaff, J., Luscher, B. The Ins and Outs of MYC regulation by posttranslational mechanisms // The Journal of Biological Chemistry. — 2006. — Vol.281. -№46. -P.34725-34729.

184. Vijayalakshmi, N., Selvaluxmi, G., Mahji, U., et al. C-myc oncoprotein expression and prognosis in patients with carcinoma of the cervix: an immunohistochemical study // European Journal of Gynaecological Oncology. — 2002. — Vol.23. — №2. — P. 135-138.

185. Visser, J., Nijman, H.W., Hoogenboom, B.N., et al. Frequencies and role of regulatory T cells in patients with (pre)malignant cervical neoplasia // Clinical and Experimental Immunology. - 2007. - Vol.150. - №2. - P. 199-209.

186. Vogt, P.K. Jun, the oncoprotein // Oncogene. - 2001. - Vol.20. - P.2365 -2377.

187. de Vos van Steenwijk, P.J., Heusinkveld, M., Ramwadhdoebe, T.H., et al. An unexpectedly large polyclonal repertoire of HPV-specific T cells is poised for action in patients with cervical cancer // Cancer Research. — 2010. — Vol.70. — №7. — P.2707-2717.

188. Wang, C., Tai, Y., Lisanti, M.P., et al. c-Myc induction of programmed cell death may contribute to carcinogenesis: A perspective inspired by several concepts of chemical carcinogenesis// Cancer Biology and Therapy. —2011. — Vol.11. —№7. —P.615-626.

189. Wang, W., Fang, Y., Sima, N., et al. Triggering of death receptor apoptotic signaling by human papillomavirus 16 E2 protein in cervical cancer cell lines is mediated by interaction with c-FLIP // Apoptosis. - 2011. - Vol. 16. - №1. - P.55-66.

190. Wang, X., Meyers, C., Wang, H.K., et al. Construction of a full transcription map of human papillomavirus type 18 during productive viral infection // Journal of Virology. — 2011. - Vol.85. - №?16. - P.8080-8092.

191. Welter, J.F., Eckert, R.L. Differential expression of the fos and jun family members c-fos, fosB, Fra-1, Fra-2, c-jun, junB and junD during human epidermal keratinocyte differentiation // Oncogene. - 1995. - Vol. 11. - P.2681-2687.

192. de Wilde, J., De-Castro, A.J., Snijders, P.J., et al. Alterations in AP-1 and AP-1 regulatory genes during HPV-induced carcinogenesis // Cellular Oncology. — 2008. — Vol.30. — №1. — P. 77-87.

193. Winter, R.N., Kramer, A., Borkowski, A., et al. Loss of caspase-1 and caspase-3 protein expression in human prostate cancer // Cancer Research. — 2001. — Vol.61. — №3. — P. 1227-1232.

194. Wong, Y.F., Rogers, M.S., Cheung, T.H., et al. C-myc mutation detected by polymerase chain reaction-heteroduplex in cervical cancer // Gynecologic and Obstetric Investigation.

- 1997. - Vol.44. - №2. - P. 136-140.

195. Wu, H.J. The expression of c-myc protein in uterine cervical cancer: a possible prognostic indicator // Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. — 1996. — Vol.48. — №7. — P.515-521.

196. Yamasaki, M., Maruo, T., Akahori, T., et al. Immunohistochemical studies on epidermal growth factor receptor and the myc oncogene product in squamous cell carcinoma of the uterine cervix // Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. — 1988. — Vol.40.

- №1. — P.51-58.

197. Yang, H.P., Zuna, R.E., Schiffman, M., et al. Clinical and pathological heterogeneity of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 // PLoS One. — 2012. — Vol.7. — №1. — P.e2905I.

198. Yoshikawa, T., Saito, H., Osaki, T., et al. Elevated Fas expression is related to increased apoptosis of circulating CD8+ T cell in patients with gastric cancer // The Journal of Surgical Research. - 2008. - Vol. 148. - №2. - P. 143-151.

199. Youde, S.J., Dunbar, P.R., Evans, E.M., et al. Use of fluorogenic histocompatibility leukocyte antigen-A*0201/HPV 16 E7 peptide complexes to isolate rare human cytotoxic T-lymphocyte-recognizing endogenous human papillomavirus antigens // Cancer Research.

- 2000. - Vol.60. - №2. - P.365-371.

200. Young, M.R., Farrell, L., Lambert, P., et al. Protection against human papillomavirus type 16-E7 oncogene-induced tumorigenesis by in vivo expression of dominant-negative c-jun // Molecular Carcinogenesis. — 2002. — Vol.34. — №2. — V.12-11.

201. Yuen, M.F., Hughes, R.D., Heneghan, M.A., et al. Expression of Fas antigen (CD95) in peripheral blood lymphocytes and in liver-infiltrating, cytotoxic lymphocytes in patients with hepatocellular carcinoma // Cancer. - 2001. — Vol.92. - №8. - P.2136-2141.

202. Zaatar, A.M., Lim, C.R., Bong, C.W., et al. Whole blood transcriptome correlates with treatment response in nasopharyngeal carcinoma // Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. - 2012. - Vol.31. - P.76.

203. Zheng, Z.-M., Wang, X. Regulation of cellular miRNA expression by human papillomaviruses // Biochimica et Biophysica Acta. — 2011. — Vol.1809. — №11-12. — P.668-677.

ПРИЛОЖЕНИЕ Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Курмышкина, О. В. Нанокомпозит на основе кристаллов кремния и фуллереновой фазы - новый фотосенсибилизатор с выраженным цитостатическим эффектом на опухолевые клетки / О. В. Курмышкина II Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». — Москва. -2010. -С.62.

2. Курмышкина, О. В. Апоптоз-индуцирующее действие производных N-оксида хинолина на опухолевые клетки / О.В. Курмышкина, У.С. Багина // Материалы 14ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». Секция «Физиология животных и биомедицина». — Пущино. — 2010. - Т.1. -С.150-151.

3. Volkova, Т.О. Cellular caspases: new targets for the action of pharmacological agents / Т.О. Volkova, О. V. Kurmyshkina, N.N. Nemova // Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Systems of Biology (BGRS/SB-2010). - Novosibirsk. - 2010.

4. Волкова, Т.О. Цитостатический и апоптоз-индуцирующий эффекты нанокомпозитов на основе кристаллов кремния и фуллереновой фазы на опухолевые клетки НТ-1080 / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, H.H. Немова // Цитология. - 2010. - Т.52. - №8. - С.650.

5. Волкова, Т.О. Функциональное перераспределение активностей каспаз в опухолевых клетках при обработке индукторами дифференцировки / Т.О. Волкова, И.Е. Малышева, О.В. Курмышкина, H.H. Немова // Цитология. — 2010. — Т.52. — №8. — С.651.

6. Волкова, Т.О. Оценка антипролиферативного и апоптоз-индуцирующего эффектов производных N-оксида хинолина на опухолевые клетки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, У.С. Багина, H.H. Немова // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». — Москва. — 2010, — С.27.

7. Курмышкина, О.В. Стирильные производные N-оксида хинолина - новая группа

перспективных антиопухолевых агентов / О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова // Медицинский академический журнал. — 2010. — Т. 10. — №5. — С.211-212.

8. Курмышкина, О.В. Гены раннего ответа в патогенезе рака шейки матки: обзор /

О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Опухоли женской репродуктивной системы (маммология/онкогинекология). — 2011.- №1. — С.96-105.

9. Курмышкина, О.В. Иммунный ответ организма при индукции и прогрессии рака шейки матки — возможные механизмы / О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Опухоли женской репродуктивной системы (маммология/онкогинекология). — 2011. — №3. — С.65-70.

Ю.Багина, У.С. Апоптоз-индуцирующее действие комбинаций системных кортикостероидов с цитозинарабинозидом на опухолевые клетки / У.С. Багина, О.В. Курмышкина II Материалы 15ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». Секция «Физиология животных и биомедицина». — Пущино. - 2011. - С. 190-191. П.Волкова, Т.О. Экспрессия каспаз в опухолевых клетках человека при обработке комбинациями цитостатиков с системными кортикостероидами / Т.О. Волкова, У.С. Багина, О.В. Курмышкина, H.H. Немова // Материалы V Всероссийского Симпозиума «Белки и пептиды». — Петрозаводск. — 2011. — С.239.

12. Волкова, Т.О. Оценка фенотипических изменений и активности апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с дисплазиями и раком шейки матки / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». — Москва. — 2011. — С.24-25.

13. Волкова, Т.О. Показатели клеточного иммунитета и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с тяжелыми дисплазиями и раком шейки матки / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Аллергология и иммунология . — 2011. — Т. 12. — №3. — С.283-284.

14. Волкова, Т.О. Экспрессия каспаз в лимфоцитах периферической крови и опухолевой ткани при индукции и прогрессии рака шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Материалы III Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». — Ялта. — 2011. — С.205-206.

15. Волкова, Т.О. Индукция апоптоза лимфоцитов периферической крови при развитии рака шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, У.С. Багина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Цитология. - 2011. - Т.53. - №9. - С.696-697.

16. Волкова, Т.О. Экспрессия генов раннего пролиферативного ответа в опухолевой ткани больных раком шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Цитология. - 2011. - Т.53. - №9. - С.697.

17. Волкова, Т.О. Экспрессия CD95 и каспаз в лимфоцитах периферической крови и опухолях женской репродуктивной системы (на примере рака шейки матки) / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, У.С. Багина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Российский аллергологический журнал. — 2011. — №4(Вып.1). — С.71-72.

18. Волкова, Т.О. Экспрессия генов раннего ответа в опухолевой ткани - важный диагностический маркер при развитии рака шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика». — Новосибирск. — 2011. — С.41.

19. Ковчур, П.И. Влияние иммуномодулирующей терапии на показатели клеточного иммунитета и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с интраэпителиальными неоплазиями и микроинвазивным раком шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва. — 2011. — С.322-323.

20. Ковчур, П.И. Показатели клеточного иммунитета и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с интраэпителиальными неоплазиями и микроинвазивным раком шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев,

О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва. — 2011. — С.323-324.

21. Курмышкина, О.В. Экспрессия каспаз в лейкоцитах периферической крови и опухолевой ткани у больных раком шейки матки / О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Материалы II Международной научной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». — Казань. -2011. - С. 169-171.

22. Бахлаев, И.Е. Рак шейки матки в Карелии / И.Е. Бахлаев, П.И. Ковчур, A.A. Михетько, О.В. Курмышкина, С.Е. Иильва // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. - 2011. - №1. - С.22—28.

23. Волкова, Т.О. Клеточный иммунитет и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови при интраэпителиальной неоплазии и микроинвазивном раке шейки матки. Иммуномодулирующая терапия / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, А.Н. Полторак // Российский аллергологический журнал. — 2012. — №1(Вып.1). — С.77-78.

24. Ковчур, П.И. Экспрессия генов раннего ответа при развитии цервикальных интраэ пите л иальных неоплазий и рака шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика -в эпицентре женского здоровья». — Москва. — 2012. — С.242-243.

25. Ковчур, П.И. Экспрессия каспаз в лейкоцитах периферической крови и опухолевой ткани у больных с интраэпителиальными неоплазиями и раком шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья». — Москва. — 2012. — С.243-245.

26. Ковчур, П.И. Использование экспрессии генов раннего ответа в опухолевой ткани как маркера развития рака шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Онкохирургия. — 2012. — Т.4. — №2, Приложение. — С. 16.

27. Ковчур, П.И. Экспрессия каспаз в лейкоцитах периферической крови и опухолевой ткани у больных с интраэпителиальными неоплазиями и раком шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Онкохирургия. — 2012. — Т.4. — №2, Приложение. — С. 16.

28. Ковчур, П.И. Влияние иммунотерапии на клеточный иммунитет и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с пре- и микроинвазивным раком шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Онкохирургия. — 2012. — Т.4. — №2, Приложение. — С. 18.

29. Волкова, Т.О. Системные колебания численности CD16+ клеток при интраэпителиальных неоплазиях и микроинвазивном раке шейки матки до и после лечения аллокином / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, А.Н. Полторак // Российский аллергологический журнал. — 2012. — №5(Вып.1). - С.51-52.

30.Kurmyshkina, O.V. The level of caspase expression as indicator of systemic immune stress resulted from HPV-induced cervical cancer development I O.V. Kurmyshkina, P.I. Kovchur, I.E. Bahlaev, Т.О. Volkova, A.N. Poltorak // Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology (CBA). — 2012. — Vol. 163A. — №l(suppl.). — P.40-41.

31. Kurmyshkina, O.V. Caspases as putative predictive biomarkers of cervical cancer development and progression I O.V. Kurmyshkina, P.I. Kovchur, I.E. Bakhlaev, A.N. Poltorak, Т.О. Volkova // International Journal of Gynecological Cancer. — 2012. — Vol.22. -№8(suppl.3). -P.E647.

32.Багина, У.С. Экспрессия CD95 и активность каспаз в лимфоцитах периферической крови при развитии рака молочной железы / У.С. Багина, К.С. Игнатьев, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, А.Н. Полторак, Т.О. Волкова // Медицинский академический журнал (приложение). — 2012. — С.189—191.

33. Ковчур, П.И. Маркеры оценки эффективности методов терапии цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) и микрокарциномы шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, И.Е. Бахлаев, Н.Н. Немова // Материалы

XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва. — 2012. — С.275-276.

34. Курмышкина, О.В. Перспективные маркеры для оценки эффективности методов терапии рака шейки матки / О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур // Материалы I Международной научной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы». — Казань. — 2012. — С. 135-137.

35. Курмышкина, О.В. Экспрессия каспаз - возможный предикторный маркер при раке шейки матки / О.В. Курмышкина II Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». — Москва. —2012.

36. Ковчур, П.И. Биомаркеры в тераностике предрака и микроинвазивного рака шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, А.Н. Полторак // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья». — Москва. -2013. - С. 194-197.

37. Ковчур, П.И. Колебания клеточного иммунитета и активности апоптоза лимфоцитов периферической крови при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и микрокарциноме шейки матки. Возможности иммуномодулирующей терапии / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, А.Н. Полторак // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья». — Москва. -2013. - С. 197-200.

38. Заявка на патент РФ «Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки» / Волкова Т.О., Курмышкина О.В., Бахлаев И.Е., Ковчур П.И., Полторак А.Н. - № 2012157453; Заяв. 26.12.2012.