Экспериментальные подходы к регенерации и тканевой инженерии суставного хряща с использованием клеточно-инженерных конструкций тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.24, доктор наук Басок Юлия Борисовна

• Басок Юлия Борисовна
• доктор наук
• 2021

Оглавление диссертации доктор наук Басок Юлия Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОВРЕЖДЕННОГО ХРЯЩА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Актуальность, мировая потребность и обзор основных существующих технологий тканевой инженерии для регенерации хрящевой ткани

1.2 Источники клеток для создания клеточно-инженерных конструкций хрящевой ткани

1.3 Миметики внеклеточного матрикса

1.3.1 Биополимерные гидрогели

1.3.2 Тканеспецифические матриксы из децеллюляризованных тканей

1.4 Методы получения миметиков внеклеточного матрикса для тканевой инженерии хряща

1.4.1 Способы получения гидрогелей из полимеров природного происхождения

1.4.2 Физические, химические и биологические методы децеллюляризации хрящевой ткани

1.5 Биореакторы для создания тканевых эквивалентов хрящевой ткани

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы получения микродисперсного тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

2.2.1 Метод криопомола для получения микрочастиц свиного хряща

2.2.2 Обработка растворами поверхностно-активных веществ

2.2.3 Инкубация в гипо- и гипертоничных растворах поверхностно-активных веществ

2.2.4 Лиофилизация

2.2.5 Замораживание и оттаивание

2.2.6 Обработка в среде сверхкритического СO2

2.2.7 Обработка ультразвуком

2.2.8 Обработка ДНКазой

2.3 Метод лазерной дифракции

2.4 Сканирующая электронная микроскопия

2.5 Гистологическое исследование

2.6 Иммуногистохимическое исследование

2.7 Флуоресцентное окрашивание двуцепочечной ДНК для оценки полноты децеллюляризации

2.8 Биохимические методы анализа

2.8.1 ДНК

2.8.2 Гликозаминогликаны

2.8.3 Фибриллярный коллаген (коллаген I, II, III, V типов)

2.9 Методы исследования биологической безопасности микродисперсного тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

2.9.1 Цитотоксичность

2.9.2 Гемолиз, индуцированный поверхностью материала

2.9.3 Исследование местного действия in vivo

2.9.4 Исследование общетоксического действия

2.9.5 Генотоксичность

2.9.6 Репродуктивная/ эмбриональная токсичность

2.10 Оценка качества мезенхимальных стромальных клеток

2.11 Оценка действия мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека из различных источников на пролиферацию хондробластов человека

2.11.1 Культивирование хондробластов в кондиционированной среде

2.11.2 Непрямое сокультивирование хондробластов с мезенхимальными стромальными клетками

2.12 Сравнительное исследование матриксных и функциональных свойств инъекционных форм коллагенсодержащих клеточных носителей

2.12.1 Пролиферативная активность клеток при культивировании на инъекционных формах коллагенсодержащих клеточных носителей

2.12.2 Исследование жизнеспособности клеток методом флуоресцентной микроскопии

2.12.3 Формирование клеточно-инженерных конструкций хряща в статических условиях

2.12.4 Исследования функциональных свойств созданных клеточно-инженерных конструкций на экспериментальной модели остеоартроза in vivo

2.13 Формирование клеточно-инженерных конструкций хряща в динамических условиях

2.14 Статистические методы анализа результатов

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОДИСПЕРСНОГО ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО МАТРИКСА ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА СВИНЬИ

3.1 Микронизация суставного хряща свиньи

3.2 Разработка способа децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи с дополнительным включением этапов физических и биологических воздействий

3.2.1 Резкие изменения температуры с обработкой ДНКазой

3.2.2 Сверхкритический СО2 с обработкой ДНКазой

3.2.3 Ультразвук с обработкой ДНКазой

3.3 Определение оптимального способа децеллюляризации относительно сохранения состава

исходного внеклеточного матрикса

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРОДИСПЕРСНОГО ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО МАТРИКСА ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА СВИНЬИ

4.1 Биологическая безопасность экспериментальных образцов in vitro и in vivo

4.1.1 Цитотоксичность in vitro

4.1.2 Гемосовместимость in vitro

4.1.3 Местное действие (имплантационный тест 6 месяцев)

4.1.4 Общетоксическое действие (имплантационный тест 2 месяца)

4.1.5 Генотоксичность

4.1.6 Репродуктивная/эмбриональная токсичность

4.2 Матриксные свойства экспериментальных образцов in vitro

4.2.1 Исследование адгезии мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани и хондробластов человека на микродисперсном тканеспецифическом матриксе

4.2.2 Культивирование хондробластов человека на микродисперсном тканеспецифическом матриксе

4.2.3 Культивирование мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на

микродисперсном тканеспецифическом матриксе

ГЛАВА 5. ВЫБОР КЛЕТОЧНОЙ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ

5.1 Сравнительный анализ хондрогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из различных источников при культивировании в составе микросфер

5.2 Исследование влияния клеточного состава на формирование клеточно-инженерной конструкции хряща

5.3 Сравнительная характеристика стимулирующего действия мезенхимальных стромальных

клеток из различных источников на пролиферацию хондробластов человека

ГЛАВА 6. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ХРЯЩА НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩИХ БИОМИМЕТИКОВ IN VITRO И IN VIVO

6.1 Композитный матрикс из биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля и микрочастиц децеллюляризованного хряща

6.2 Пролиферативная активность мезенхимальных стромальных клеток человека при культивировании на гидрогелевом и тканеспецифическом матриксах

6.3 Хондрогенная дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека при культивировании на гидрогелевоми тканеспецифическом матриксах

6.4 Исследование влияния инъекционного введения клеточно-инженерной конструкции, включающей мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека и коллагенсодержащие биомиметики внеклеточного матрикса, на регенерацию хряща в

экспериментальной модели адьювантного артрита in vivo

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА МАЛОГАБАРИТНОГО ПЕРФУЗИОННОГО БИОРЕАКТОРА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТКАНЕВОГО ЭКВИВАЛЕНТА ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ НА ОСНОВЕ МИКРОДИСПЕРСНОГО ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО МАТРИКСА ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА СВИНЬИ

7.1 Выбор материала и размера пор подложки для культуральной камеры

7.2 Испытания перфузионного биореактора, заполненного модельным раствором

7.3 Создание тканевого эквивалента хряща в перфузионном биореакторе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А Протокол испытаний местного действия тканеспецифических

мелкодисперсных матриксов (имплантационный тест)

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Протокол испытаний общетоксического действия микродисперсного

тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

ПРИЛОЖЕНИЕ В Протокол испытаний генотоксичности микродисперсного

тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

ПРИЛОЖЕНИЕ Г Протокол испытаний репродуктивной токсичности микродисперсного тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальные подходы к регенерации и тканевой инженерии суставного хряща с использованием клеточно-инженерных конструкций»

Актуальность темы исследования

Важнейшими проблемами здравоохранения в индустриальном обществе являются повреждение и дегенерация периферических или центральных (позвоночных) суставов, что связано с ограниченными возможностями ткани к регенерации. Известно, что остеоартроз является одной из наиболее распространенных болезней опорно-двигательного аппарата и создает огромное бремя для систем здравоохранения и социального обеспечения во всем мире [S. Safiri et al., 2020, Mobasheri A. et al., 2015]. Остеоартроз занимает 5-е место по числу лет потери трудоспособности среди населения в странах с высоким уровнем дохода и 9-е место по числу лет потери трудоспособности в странах с низким и средним уровнем дохода [World Health Organization. Global Burden of Disease Report. Part 3, 2004]. Только в России им страдает 10-12% населения. Остеоартроз чаще всего встречается в возрасте старше 40 лет, однако признаки остеоартроза могут появиться и раньше, особенно после травм, затрагивающих суставы. Остеоартроз определяют при рентгенологическом исследовании у 50% людей в возрасте 55 лет и у 80% людей старше 75 лет. Люди, которые имеют избыточный вес или чья деятельность сопряжена с большой нагрузкой суставов, также подвержены повышенному риску развития остеоартроза [J. Midgley et al., 2021, T. Fang et al., 2021].

Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины рассматриваются как одно из наиболее перспективных терапевтических решений проблемы восстановления структуры и функций поврежденных хрящевых тканей [Н.В. Аргучинская, 2021]. Отметим, что метод аутохондротрансплантации имеет ряд недостатков, основные из которых травматичность биопсии здорового участка хряща, сложность экспансии и возможность дедифференцировки клеток [J.D. Harris et al., 2011].

Одним из многообещающих подходов к лечению дефектов хрящевой ткани представляется малоинвазивное внутрисуставное введение in situ мезенхимальных стромальных клеток, способных к дифференцировке в хондрогенном направлении и продуцирующих факторы, стимулирующие внутренние регенеративные процессы в суставном хряще [D. Primorac et al., 2021]. В ряде исследований показано, что хондрогенный потенциал также, как и терапевтический потенциал секретома мезенхимальных стромальных клеток, зависит от их источника [J. N. Fisher et al., 2017]. Выбор оптимального источника мезенхимальных стромальных клеток, несомненно, повысит эффективность клеточной терапии для стимуляции регенерации суставного хряща при остеоартрозе, что является одной из актуальнейших проблем биомедицинской науки.

Для доставки и удержания клеток в месте повреждения хряща, а также для обеспечения клеткам условий для их жизнедеятельности в течение времени, достаточного для запуска процессов восстановления хрящевой ткани, используют биосовместимые и биорезорбируемые матриксы [В.И. Севастьянов, 2014, Басок Ю.Б., 2016]. Наибольший, с нашей точки зрения, интерес представляют собой децеллюляризованные носители, получаемые путем удаления клеток и их фрагментов из ткани с максимальным сохранением структуры и состава естественного внеклеточного матрикса [P.M. Crapo et al., 2011]. Показано, что децеллюляризованный хрящ не только поддерживает адгезию и пролиферацию клеток, но и стимулирует дифференцировку МСК в функциональные хондроциты [Y. Sun, 2018]. Однако эффективное удаление клеточных элементов при децеллюляризации хрящевой ткани сопровождается изменением структуры и состава внеклеточного матрикса, проявляющегося, чаще всего, снижением содержания гликозаминогликанов [K.E. Benders et al., 2019]. Анализ литературы указывает на отсутствие сравнительных исследований способов децеллюляризации хряща, включающих ультразвук, резкие перепады температуры, обработку сверхкритическими флюидами, что затрудняет выбор оптимального подхода для получения матрикса, обеспечивающего наиболее благоприятный эффект. Отметим, что микронизация децеллюляризованного хряща предоставит возможность инъекционного введения и увеличит площадь эффективной поверхности для адгезии и пролиферации клеток, а также обеспечит возможность получения гидрогеля при растворении. Заметим, что описанные в литературе исследования децеллюляризованного хряща in vivo малоинформативны, ограничиваются лишь имплантацией подкожно, внутрибрюшинно и в дефект, созданный хирургически в здоровом хряще, что не позволяет сделать окончательный вывод о перспективности применении матрикса в регенеративной медицине. Исследование влияния децеллюляризованного хряща на поврежденный хрящ на наиболее подходящей экспериментальной модели остеоартроза позволит восполнить этот пробел.

Суммируя все вышесказанное, отметим, что обозначенная проблема весьма актуальна и социально значима, а ее решение позволит не только серьезно продвинуться в развитии технологий регенеративной терапии поврежденной хрящевой ткани при остеоартрозе, но и при разработке клеточно-инженерных конструкций в других областях тканевой инженерии.

Цель исследования

Разработка экспериментальных подходов к регенерации и тканевой инженерии суставного хряща.

Задачи исследования

1. Разработать технологию децеллюляризации суставного хряща свиньи для получения клеточного носителя - тканеспецифического матрикса максимальным сохранением архитектоники и состава внеклеточного матрикса.

2. Выбрать оптимальный источник мезенхимальных стромальных клеток человека с точки зрения его доступности, хондрогенного потенциала и секреторного влияния на пролиферативную активность первичных хондробластов человека при культивировании с тканеспецифическим микродисперсным матриксом.

3. Доказать биосовместимость разработанного тканеспецифического микродисперсного матрикса из децеллюляризованного суставного хряща в условиях in vitro и in vivo.

4. Провести оценку матриксных свойств коллагенсодержащих биомиметиков.

5. Исследовать функциональную эффективность клеточно-инженерных конструкций на основе коллагенсодержащих миметиков внеклеточного матрикса на экспериментальной модели остеоартроза.

6. Разработать малогабаритный перфузионный биореактор для «выращивания» клеточно-инженерных конструкций органов и тканей in vitro.

7. Доказать возможность создания тканевого эквивалента хрящевой ткани в перфузионном биореакторе.

Научная новизна

1 . Разработан протокол получения тканеспецифического микродисперсного матрикса из микронизированных фрагментов суставного хряща свиньи с сохранением архитектоники и максимально возможным содержанием фибриллярного коллагена и гликозаминогликанов.

2. Показана положительная роль гликозаминогликанов в децеллюляризованном хряще в поддержании жизнеспособности и хондрогенной дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани в составе клеточно-инженерных конструкций.

3 . Определен источник клеточной компоненты, наиболее подходящий для создания клеточно-инженерных конструкций на основе коллагенсодержащих миметиков внеклеточного матрикса.

4. В экспериментах in vitro и in vivo установлено, что разработанный протокол децеллюляризации позволяет получить тканеспецифический матрикс, ксеногенные свойства которого не влияют на его биосовместимость.

5. Доказано, что исследуемые коллагенсодержащие биомиметики внеклеточного матрикса способны эффективно поддерживать адгезию, пролиферацию и дифференцировку в хондрогенном направлении мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

6. Показано, что тканеспецифический микродисперсный матрикс из децеллюляризованного суставного хряща поддерживает пролиферацию хондробластов человека с последующей дифференцировкой в хондроциты и синтез коллагена и гликозаминагликанов.

7. На экспериментальной модели остеоартроза коленного сустава кролика показано преимущество гидрогелевого биомиметика внеклеточного матрикса для стимуляции регенерации поврежденного хряща в составе клеточно-инженерной конструкции по сравнению с тканеспецифическим биомиметиком.

8. Разработан малогабаритный перфузионный биореактор, позволяющий в стерильных условиях при контролируемой температуре, скорости потока и рН культуральной среды проводить длительные эксперименты по выращиванию тканевых эквивалентов.

9. Показана целесообразность применения тканеспецифического микродисперсного матрикса при создании тканевого эквивалента хрящевой ткани в статических условиях и в перфузионном биореакторе, по сравнению с биополимерным микрогетерогенным коллагенсодержащим гелем.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты исследований in vivo позволяют рекомендовать разработанный персонализированный подход, основанный на применении функционально активной клеточно -инженерной конструкции, включающей биополимерный микрогетерогенный коллагенсодержащий гидрогель и мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, к полноразмерным доклиническим испытаниям с целью определения возможности дальнейшего его использования в клинике в качестве стимуляции регенерации поврежденного суставного хряща.

Данные проведенных исследований указывают на возможность использования тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного хряща свиньи, полученного по разработанному протоколу, для создания тканевых эквивалентов хряща с мезенхимальными стромальными клетками человека и хондроцитами человека.

Анализ полученных в перфузионном биореакторе клеточно-инженерных конструкций, включающих тканеспецифический матрикс из децеллюляризованного хряща и мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, указывает на возможность их использования в качестве модели суставного хряща in vitro и целесообразность их тестирования in vivo для

замещения участков повреждения суставного хряща с целью определения возможности применения технологии в клинике.

Разработанный биореактор можно использовать для различных областей тканевой инженерии и регенеративной медицины при формировании клеточно-инженерных конструкций, исследовании биосовместимости различных материалов, а также для изучения влияния различных факторов на эти процессы.

Методология и методы исследования

В основе методологии диссертационного исследования лежали труды отечественных и зарубежных авторов в области тканевой инженерии и регенеративной медицины хряща. Для решения поставленных задач использован комплекс физико-химических, культуральных, гистологических, биохимических и биологических методов исследования с привлечением световой, флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии, лазерной дифракции, гистологического и иммуногистохимического окрашивания и тест-наборов для количественного определения содержания гликозаминогликанов, коллагена и ДНК. Оценку биологической безопасности микродисперсного тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи проводили методами in vitro и in vivo, рекомендованными серией межгосударственных стандартов ГОСТ ISO 10993 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий». Функциональную эффективность полученных образцов клеточно-инженерных конструкций изучали на экспериментальной модели остеоартроза коленных суставов кролика.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимальным протоколом децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи для изготовления тканеспецифического матрикса по содержанию ДНК, гликозаминогликанов и коллагена и способности поддерживать хондрогенную дифференцировку мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека является режим, включающий 30 минут воздействия ультразвуком в сутки при обработке поверхностно-активными веществами и инкубацию в растворе ДНКазы.

2. Отсутствие in vitro цитотоксичного действия, гемолитической активности и генотоксичности, а in vivo местного раздражающего и общетоксического действия, репродуктивной токсичности указывает на возможность использования тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного хряща свиньи для создания клеточно- и тканеинженерных конструкций хрящевой ткани человека.

3. Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека и микрочастицы тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи являются оптимальной системой для создания тканевого эквивалента хряща in vitro, обеспечивающей в клеточно-инженерной конструкции равномерность распределения жизнеспособных клеток, продуцирующих собственный внеклеточный матрикс, содержащий гликозаминогликаны и коллаген II типа.

4. Сохранение гликозамигликанов в составе тканеспецифического матрикса при децеллюляризации суставного хряща свиньи способствует процессам пролиферации и хондрогенной дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека при культивировании в хондрогенной дифференцировочной среде.

5. Внутрисуставное инъекционное введение мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека вместе с биополимерным микрогетерогенным коллагенсодержащим гидрогелем лабораторным животным с экспериментальной моделью остеоартроза обеспечивает стимуляцию регенерации суставного хряща.

6. Разработанный малогабаритный перфузионный биореактор позволяет длительно (до 25 суток) при сохранении стерильности культивировать клетки на носителях/матриксах различной формы и природы (гидрогели, губки, мелко- и микродисперсные частицы) в условиях контролируемого потока, мониторинга рН, содержания газов и основных метаболитов в культуральной среде.

7. Разработанный перфузионный биореактор дает возможность при контролируемых условиях выращивать тканевой биоэквивалент хряща из клеточно-инженерной конструкции, состоящей из микродисперсных частиц децеллюляризованного хряща свиньи, мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и хондрогенной дифференцировочной среды.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность и обоснованность полученных результатов обеспечивается четкой постановкой задач, достаточным объемом исследования, применением современных лабораторных методов исследования, корректной статистической обработкой данных и всесторонней оценкой полученных результатов в сравнении с данными научной литературы.

Апробация работы состоялась 6 августа 2021 года на совместной конференции научных и клинических подразделений Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Основные положения и результаты диссертации были доложены и обсуждены на III

Национальном Конгрессе «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 2-4 октября 2017 г.), 14th Sino-Russia symposium on advanced materials and technologies (Китай, Санья, 29 ноября -2 декабря 2017г.), Sechenov International Biomedical Summit (Москва, 21- 23 мая 2018 г.), IX Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 17-19 сентября 2018 г.), IV междисциплинарном научном форуме с международным участием «Новые материалы и перспективные технологии» (Москва, 27-30 ноября 2018 г.), Международной конференции "Инновационные исследования в области биомедицины" памяти В.Н. Ярыгина (г. Москва, 28 марта 2019 г.), Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society European Chapter Meeting (Греция, Родос, 27-31 мая 2019 г.), III Сеченовском международном биомедицинском саммите (SIBS-2019) (Москва, 20-21 мая 2019 г.); Х Научно-практической конференции с международным участием «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Ростов-на-Дону, 30 сентября-06 октября 2019 г.); IV Национальном конгрессе «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 7-9 октября 2019); IV Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 20-23 ноября 2019); Конгрессе Молодых ученых Европейского общества искусственных органов «Cloud-yESAO» (7-11 сентября, 2020 г.); IV Международном конгрессе ассоциации ревмоортопедов (Москва,

18-19 сентября 2020 г.); X Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 5-7 октября 2020 г.); VII Троицкой конференции с международным участием «Медицинская физика» (Троицк,

19-21 октября 2020 г.); Шестом междисциплинарном научном форуме с международным участием «Новые материалы и перспективные технологии» (Москва, 23-26 ноября 2020 г.); IV Сеченовском международном биомедицинском саммите (SIBS-2020) (Москва, 17-18 ноября 2020 г.), Х научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Новосибирск, 21-25 июня 2021 г.).

Связь работы с научными программами, планами, темами

Диссертационная работа выполнялась в рамках государственных заданий Министерства здравоохранения Российской Федерации на осуществление научных исследований и разработок по темам: «Разработка и экспериментальное исследование тканеспецифических матриксов для биомедицинских клеточных продуктов» (2015-2017 гг.), № государственной регистрации 115102010014; «Создание и экспериментальное исследование тканеинженерной конструкции печени с использованием аппаратного комплекса «биостанция - биореактор» (2015-2017 гг.), № государственной регистрации 115102010016; «Создание и экспериментальное исследование биомедицинских клеточно- и тканеинженерных продуктов печени и хряща на основе композитных тканеспецифических резорбируемых матриксов» (2018-2020 гг.), №

государственной регистрации АААА-А18-118012390460-3; грантов Российского фонда фундаментальных исследований № 16-29-07322 «Разработка информационно-аналитического метода оценки терапевтической эффективности тканеинженерных аналогов хряща для применения в регенеративной медицине» (2016-2019 гг.) и № 18-29-06012 «Сверхкритический диоксид углерода как инструмент повышения биосовместимых и функциональных свойств биополимерных и тканеспецифических матриксов для клеточно- и тканеинженерных конструкций» (2018-2021 гг.); гранта Российского научного фонда № 21-15-00251 «Разработка комплексного подхода к регенеративной терапии остеоартроза с использованием инъекционной формы биомиметика внеклеточного матрикса с клеточными сфероидами» (2021-н.в.).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практику отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России), лаборатории клеточной биологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», отделения прогноза эффективности консервативного лечения Московского научно-исследовательского онкологического института имени П.А. Герцена - филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России, испытательного лабораторного центра автономной некоммерческой организации «Институт медико-биологических исследований и технологий», лаборатории сверхкритических флюидных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей и неорганической химии имени Н.С. Курнакова Российской академии наук, а также в образовательный процесс кафедры трансплантологии и искусственных органов Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет).

Личный вклад автора

Автором сформулирована концепция, цели, задачи и методология, разработаны и отработаны протоколы децеллюляризации суставного хряща свиньи, проанализирована эффективность децеллюляризации ткани суставного хряща свиньи с применением флуоресцентного окрашивания, проведен лазерный дифракционный анализ распределения микрочастиц хряща по размерам, выполнены биохимические исследования. Автор принимала участие в разработке перфузионного биореактора, отработке режимов динамического 3D культивирования, культуральных работах, создании модели остеоартроза коленного сустава кролика, операциях по имплантации клеточно-инженерных конструкций в коленный сустав кролику. Автор провела статистическую обработку, анализ и обобщение полученных данных.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликованы 59 научных работ, в том числе 26 статей: из них 22 -в российских и зарубежных журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных изданий Центра, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. Получено 2 патента РФ на изобретение.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста и состоит из введения, семи глав, содержащих литературный обзор, описание используемых материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка используемой литературы. Указатель литературы содержит 40 отечественных и 309 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 112 рисунками, включает 2 формулы. Содержит 4 приложения.

Выражаю глубокую и искреннюю благодарность своему учителю и наставнику -заведующему отделом биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России д.б.н., профессору В.И. Севастьянову, а также сотрудникам отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России д.б.н. Е. А. Немецу, д.х.н. В. Н. Васильцу, к.б.н. А. М. Григорьеву, к.б.н. Л. А. Кирсановой, А. Д. Кирилловой, Г. Н. Бубенцовой за их неоценимую помощь и участие в проведении экспериментальных исследований.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОВРЕЖДЕННОГО ХРЯЩА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Актуальность, мировая потребность и обзор основных существующих технологий тканевой инженерии для регенерации хрящевой ткани

Нарушения опорно-двигательного аппарата представляют собой обширную группу заболеваний, которые затрагивают мышцы, кости, суставы и позвоночник. Они занимают первое место по количеству лет, проживаемых с инвалидностью [1]. В структуре общей заболеваемости населения РФ их доля составляет 5,4% [2]. Остеоартроз (ОА) занимает ведущее место среди болезней опорно-двигательного аппарата и является причиной больших социально-экономических проблем во всем мире [3-5]. ОА страдает 350 миллионов взрослых людей в мире, при этом ОА занимает 11-е место среди факторов инвалидности [6, 7].

Ожидается, что заболеваемость ОА будет расти параллельно с ростом населения и продолжительности жизни, а также распространением ожирения, одного из главных факторов риска появления ОА. По расчетам количество людей в мире с избыточным весом к 2030 году увеличится до 1,35 миллиарда, а число людей с ожирением возрастет до 573 миллионов [8]. При этом доля людей старше 60 лет увеличится к 2050 году более, чем в 2 раза, и составит более 20% населения земного шара [9]. Также, согласно данным Федеральной службы государственной статистики РФ, процент населения в возрасте от 65 лет и старше с 2010 года до 2030 возрастет на 6,6% и составит 19,5% [10].

ОА - это гетерогенная группа заболеваний различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими и клиническими проявлениями и исходом, в основе которых лежит поражение всех компонентов сустава, в первую очередь хряща, покрывающего суставные поверхности костей [11]. В зарубежной литературе вместо термина ОА в большинстве случаев используют термин остеоартрит, подчёркивая роль воспалительного компонента в развитии и прогрессировании заболевания. ОА может поражать одну или несколько частей тела, чаще всего руки, плечи, позвоночник, колени или бедра [12]. ОА классифицируется на первичный или идиопатический и вторичный, развивающийся вследствие травм, врожденных и метаболических патологий, инфекций, эндокринных заболеваний, а также интенсивной работы или занятий спортом [13].

ОА чаще всего встречается у людей в возрасте старше 40 лет, потому что хрящи в суставах естественным образом начинают истончаться с возрастом. Однако признаки ОА могут появиться и раньше, особенно после травм, затрагивающих суставы, таких как разрыв передней

крестообразной связки. Рентгенологические признаки ОА обнаруживают у 50% людей в возрасте 55 лет и у 80% людей старше 75 лет. ОА коленного сустава (гонартроз) чаще развивается у женщин, а тазобедренного сустава (коксартроз) - у мужчин [14]. Наследственность и низкую двигательную активность также относят к причинам развития ОА.

Основной клинический признак ОА - боль в области поражённого сустава (или суставов) не связана с поражением собственно хряща (он не имеет нервных окончаний), а вызвана повреждением костей, синовиальной оболочки и околосуставных тканей (связок, мышц). В тяжелых случаях ОА может снизить подвижность и способность выполнять ежедневные задачи, что влияет на качество жизни и увеличивает риск развития других патологий, таких как сердечно-сосудистые заболевания.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Басок Юлия Борисовна, 2021 год

Источник ткани

■ Видовая принадлежность (аллогенная или ксеногенная ткань)

■ Возраст животного

Эффективность

децеллюляризации

- г • Остаточное

содержание

клеточного

материала (ДНК,

митохондрии и

т.д.)

• Сохранение

компонентов

ВКМ (ГАГ,

факторы роста и

т.д.)

V

Обработка после

децеллюляризации ^Н

Г" • Физическая

форма

(фрагменты,

микрочастицы,

гель, губка)

• Химическая

сшивка

• Стерилизация

Рисунок 1 — Характеристики децеллюляризованных тканей, которые могут влиять на реакцию клеток

Аллогенные тканеспецифические матриксы получают из трупной ткани, что ограничивает возможность контроля возраста или состояния здоровья донора - факторов, которые могут влиять на свойства ВКМ [249]. Отметим, что потенциальный объем получения гиалинового хряща от каждого донора мал. При этом многочисленные исследования показывают, что ксеногенные децеллюляризованные ткани не вызывают неблагоприятной воспалительной реакции при имплантации человеку, что объясняется высокой межвидовой гомологией таких компонентов ВКМ, как коллагены, ГАГ, фибронектин и факторы роста [166]. Существенные различия в технологиях у различных групп ученых затрудняет оценку влияния видовой специфичности на децеллюляризацию [250].

Существующие методы децеллюляризации принято разделять на 3 группы: химические, физические и биологические.

Основным механизмом действия химических агентов является разрушение клеточных мембран за счет изменения структуры или растворения/диссоциации ее компонентов. Поскольку мембраны клеток значительно чувствительнее к такому роду воздействиям, чем межклеточное вещество, многие химические вещества способны эффективно элиминировать клеточные структуры, сохранив матрикс. Химические методы децеллюляризации, как правило, более разрушительны для ультраструктуры ВКМ и молекулярной целостности, чем физические методы. Однако их использование необходимо для достижения эффективного удаления клеточных фрагментов. Каждый химический агент обладает уникальным механизмом удаления клеток, и, соответственно, оказывает различное влияние на ВКМ. К возможным повреждениям ВКМ относят удаление факторов роста и ГАГ, повреждение коллагена и сшивание белков ВКМ. Ионные поверхностно-активные вещества (ПАВ), такие как додецилсульфат натрия (SDS) и дезоксихолат натрия, являются эффективными средствами децеллюляризации, но

снижают содержание ГАГ [251, 252]. Неионные детергенты, такие как Triton X-100 и цвиттерионные детергенты, такие как CHAPS, менее разрушительны, но также оказывают влияние на состав и молекулярную целостность. Кислоты и щелочи растворяют цитоплазматические компоненты клеток, разрушают нуклеиновые кислоты и денатурируют белки, но могут повреждать коллаген, ГАГ и факторы роста [253-255]. Гипо- и гипертонические растворы приводят к диссоциации комплексов ДНК-белок [256]. Гипотонические растворы также вызывают лизис клеток за счет осмотического эффекта с минимальными изменениями молекул и общего строения ВКМ [257]. Обычно инкубация хрящевой ткани в децеллюляризующих растворах сопровождается перемешиванием.

Биологические методы децеллюляризации, к которым относят обработку ферментами, как правило, комбинируют с ПАВ. Нуклеазы, ДНКазы и РНКазы, широко используются для деградации остаточной ДНК или РНК [258, 259]. Для децеллюляризации также применяют протеазы, такие как трипсин (разрыв пептидных связей, образованных остатками лизина и аргинина), диспазу (расщепление фибронектина, коллагена IV и I типов), эластазу (разрушение эластина). Однако их продолжительное воздействие может привести к нарушению ультраструктуры ВКМ и снизить содержание коллагена, ламинина, фибронектина и эластина [144]. Этилендиаминтетрауксусная кислота вносит свой вклад в децеллюляризацию хряща, связывая ионы металлов и тем самым нарушая связь клеток с ВКМ. Она неэффективна при использовании в одиночку, обычно ее используют с ферментами и ПАВ [194].

Поскольку хрящ представляет собой плотную и компактную соединительную ткань с низкой пористостью, для повышения эффективности химической децеллюляризации применяют ряд физических воздействий. К ним относят микронизацию, резкое изменение температуры, ультразвук (УЗ), электропорацию, высокое давление и обработку в атмосфере сверхкритических флюидов [144, 260, 261]. Измельчение хрящевой ткани на фрагменты позволяет увеличить площадь поверхности для адгезии клеток и облегчить проникновение химических агентов в объем хрящевой ткани [262, 263]. Последовательное замораживание и оттаивание хрящевой ткани приводит к разрушению клеточных мембран, но образовавшиеся кристаллы способны разрушить ВКМ. Многократное повторение цикла не приводит к значимой количественной потере белков, но отрицательно сказывается на механических свойствах матрикса [264]. Для децеллюляризации также используют электропорацию - нелинейный биофизический процесс, в котором применение импульсных электрических полей приводит к увеличению проницаемости клеток, предположительно за счет создания наноразмерных пор в липидном бислое [265]. Сверхкритические флюиды также обладают высоким потенциалом для получения тканеспецифических матриксов [266-268]. Сверхкритический CO2 (ск-CO^ в сочетании с ПАВ, например SDS, глубоко проникая вглубь ткани, позволяет извлекать ядра и

фрагменты мембран клеток [269]. Давление, оказываемое на ткани при воздействии сверхкритических флюидов, приводит к разрушению клеток.

Кроме того, ск-ТО2 может быть использован как способ мягкой стерилизации. Отметим, что это свойство является важным преимуществом использования ск-CO2 при децеллюляризации, так как другие способы могут негативно влиять на свойства тканеспецифического матрикса. Тепловые методы стерилизации не могут быть использованы, поскольку большинство белков ВКМ подвержены необратимой денатурации при температурах от 60 до 65°С [253]. Наиболее часто используемыми методами стерилизации децеллюляризованных тканей являются ионизирующее излучение и окись этилена. Отметим, что возможное сохранение следов вредных веществ после обработки окисью этилена может вызвать неблагоприятный иммунный ответ реципиента и снизить терапевтический эффект [166]. Показано, что низкие дозы гамма-облучения (<15 кГр) увеличивают прочность и жесткость матрикса, а высокие дозы снижают механические свойства дозозависимым образом [270, 271]. Гамма-облучение может индуцировать структурные и биохимические изменения в каркасе [271, 272]. Даже очень низкие дозы облучения могут влиять на сшивку коллагена, с возрастанием дозы увеличивается расщепление коллагеновых цепей [166, 273]. Гамма-облучение также может негативно влиять на адгезию клеток и индуцировать их гибель из-за перекисного окисления остаточных липидов [274, 275].

В настоящее время не существует стандартного метода децеллюляризации хряща. Снижение ГАГ, потеря коллагена, а также снижение биомеханических свойств ВКМ показали, что сам процесс децеллюляризации может влиять на архетектонику, механические свойства и состав матрикса [168, 276]. Благодаря этому, остается актуальной задача поиска оптимальных методов децеллюляризации, способных эффективно удалять клеточные компоненты с сохранением структуры ВКМ, его механических свойств и состава, включая не только коллаген, но и ГАГ, и факторы роста.

Таким образом, существуют два потенциально эффективных клеточных носителя на основе природного ВКМ, позволяющих ввести КИК в сустав наименее инвазивным инъекционным способом: микрочастицы тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного хряща и гидрогель на основе экстракта животных тканей. Несомненно, что сравнение способности КИК на основе двух различных биомеметиков ВКМ стимулировать регенерацию хряща будет способствовать достижению прогресса в области регенеративной терапии суставных дефектов хрящевой ткани.

1.5 Биореакторы для создания тканевых эквивалентов хрящевой ткани

Согласно представлениям тканевой инженерии для создания функционально активных КИК, основными элементами которых являются клетки и клеточные носители (матриксы, скаффолды), необходимо как можно точнее воспроизвести биохимические и биомеханические стимулы, обеспечивающие жизнедеятельность клеток в организме [277, 278]. Для имитации физических воздействий в условиях in vitro используют специальные устройства -биореакторы [279-286]. Биореакторы позволяют формировать КИК для временной или постоянной компенсации или замены функций поврежденных органов и тканей [287]. Одной из сфер применения полученных в биореакторе КИК также является создание in vitro моделей заболеваний для изучения патогенеза, механизмов и возможных способов терапии патологий [288, 289]. Потенциальные области применения биореакторов в тканевой инженерии представлены на рисунке 2.

• Создание КИК. включающих 3D матриксы • Рецеллюляризация децеллюляризованных тканей

Тканевая инженерия

In vitro имитация экспериментальной модели на животных • Исследования специфической активности лекарств

Биореакторы

• Клинические исследования

КИК. получаемых в

Клиника

биореакторе

• Широкое распространение -

будущее

Рисунок 2 — Области применения клеточно-инженерных конструкций, полученных в биореакторе [290]

Полученные модели имеют ряд преимуществ, к которым относят возможность независимого изменения критических клеточных и молекулярных факторов, способствующих заболеванию. Также при использовании клеток пациента КИК специфичны и отражают особенности его клеточного метаболизма [291]. Кроме того, модели на животных не всегда воспроизводят проявления болезней, наблюдаемые у людей. Например, исследования показали, что лежащие в основе сепсиса молекулярные механизмы сильно различаются у мышей и людей [292]. Неспособность эффективно имитировать болезнь человека становится очевидной во все большем

числе моделей на животных, и это, вероятно, является причиной того, что многие лекарства не показывают эффективности и безопасности при переходе от исследований на животных к клиническим испытаниям на людях [291]. По этой причине многие исследователи и фармацевтические компании уделяют больше внимания исследованиям с культивированными клетками человека. Отметим, что клетки, выращенные на культуральном пластике, не могут имитировать структуру и функции на уровне тканей и органов, которые являются центральными в этиологии заболевания. Таким образом, существует большая потребность в разработке альтернативных экспериментальных систем, содержащих живые клетки человека, которые воспроизводят патофизиологию на уровне тканей и органов in vitro.

Все органы подвергаются воздействию биомеханических сил, таких как направленное сжатие, растяжение, сила сдвига, гидростатическое давление, причем для каждого органа комплекс таких воздействий индивидуален [290]. Показано, что при обычной ходьбе, тазобедренный и коленный суставы испытывают нагрузку в среднем 0,5-7,7 МПа, а амплитуда среднего сжатия при этом составляет 13%. При поднятии по лестнице уровень нагрузки возрастает до 18 МПа. Даже во время полного отдыха окружающие связки оказывают на сустав небольшую нагрузку [47 293]. Механотрансдукция играет важную роль для формирования нормального фенотипа хондроцитов. Она связана с интегринами, которые передают сигнал от ВКМ к цитоскелетным нитям [294, 295]. Wang et al. подтвердили, что кадгерины участвуют в механотрансдукции благодаря тесному взаимодействию как с интегринами, так и с киназными рецепторами [296].

За последнее десятилетие в конструкции биореакторов были внесены значительные усовершенствования. Были разработаны системы, позволяющие поддерживать устойчивые и воспроизводимые условия культивирования, соответствующие физиологической клеточной нише in vivo. Отметим, что усложнение системы биореактора приводит к приближению условий к естественной физиологической среде, упрощение конструкции делает устройство более надежным в эксплуатации. В связи с этим актуальной выглядит задача поиска компромисса между простотой биореактора и функциональными параметрами желаемого конечного продукта [297]. Отметим, что для стабильной и эффективной работы желательно, чтобы биореактор соответствовал ряду требований (таблица 3).

Таблица 3 — Требования к биореакторам

Критерий Ключевые элементы Цель

Система Выбор материала культуральной камеры Биоинертность, антикоррозийность

Герметичность Предотвращение протечек и контаминации

Универсальный дизайн Совместимость с различными клеточными

культуральных камер носителями

Автоклавируемые/ Предотвращение контаминации

одноразовые трубки,

клапаны, коннекторы

Прочность конструкции Предотвращение изнашивания и разрывов

Малые габариты Экономия реактивов

Наличие независимо Исследование нескольких образцов или

управляемых параллельных параметров

систем культивирования

Режим потока Соответствующий уровень Увеличение массопереноса, стимуляция

напряжения сдвига клеток без смывания или повреждения, имитация физиологической нагрузки

Контроль Содержание газов, рН, Поддержание оптимальных условий роста

параметров температура клеток

Механическая Специфическая стимуляция, Увеличение массопереноса, контроль

стимуляция имитирующая условия в организме процесса дифференцировки клеток, имитация физиологической нагрузки

Датчики Уровень газов, рН, температуры, забор проб Поддержание оптимальных условий, понимание метаболических потребностей

среды и проверка стерильности

Заметим, что большой прогресс в области тканевой инженерии хряща был достигнут благодаря пониманию значения физических факторов окружающей среды, в которой хрящ развивается и функционирует. Смена концепции классического культивирования в статических условиях на технологии, учитывающие как биохимическую, так и физическую составляющую, позволили преодолеть плато и достигнуть роста качества тканевых эквивалентов хряща. Наиболее изученными физическими факторами являются рН, напряжение кислорода, гидростатическая сила, сжатие и сила сдвига [297, 298]. Вызываемые ими процессы связаны не только со структурными и химическими свойствами хрящевой ткани, но и влияют на ее функциональные особенности. Так показано, что большая часть наработанных в статических культурах ГАГ не удерживается в каркасе, а высвобождается в культуральную среду, а вокруг каркаса образуется внешняя волокнистая капсула [298].

рН среды, в которой находятся хондроциты, определяет метаболизм ВКМ. Ряд биореакторов способны одновременного контролировать несколько параметров микроокружения и показали, что даже тонкие колебания внеклеточного рН (и напряжения кислорода) влияют на метаболизм хондроцитов и экспрессию маркеров на уровне мРНК и белка [299].

Гипоксия также является контролируемым условием культивирования клеток. Низкое напряжение кислорода является естественной средой не только для МСК КМ, но и для взрослых хондроцитов [300-305]. Высокое напряжение кислорода, способствующее пролиферации хондроцитов, может быть использовано для стимуляции клеточного роста при заселении клеточных носителей [301]. Далее хондрогенная дифференцировка может быть простимулирована или хондрогенный фенотип может быть стабилизирован путем перехода к снижению напряженности кислорода [306].

Постоянное воздействие анизотонических условий через циклические изменения внеклеточной осмолярности во время ежедневной нагрузки на суставы приводит к набуханию или сжатию хондроцитов. Интересно, что Leijten et al. показали, что прерывистая циклическая нагрузка (0,5 МПа, 10 Н) при частоте 0,33 Гц и увеличение осмолярности среды до 380 мОсм/кг обуславливали повышение естественных ингибиторов гипертрофической дифференцировки МСК [307]. Субфизиологическая осмолярность (т. е. осмолярность плазмы около 280 мОсм/кг), по-видимому, стимулирует пролиферацию хондроцитов, ингибируя выработку ВКМ [308].

Описанные факты свидетельствуют, что рН, осмолярность и содержание газов следует относить к группе ключевых факторов в создании тканевого эквивалента хряща и необходимо контролировать в ходе культивирования КИК.

Большинство существующих биореакторов для создания КИК хряща основаны на имитации механических нагрузок in vivo. К ним относятся системы, основанные на действии силы сдвига, гидростатического давления, растяжения, сжатия, перфузии [309, 310]. Также созданы конструкции, в которых в качестве стимулов при культивировании КИК хрящевой ткани используют электрическое поле, УЗ и центробежную силу. Кроме того, можно выделить системы, основанные на комбинации вышеперечисленных воздействий. При этом выявлено, что механические и ультразвуковые воздействия приводят возрастанию наработки ГАГ, тогда как электрическая стимуляция приводит к общему увеличению ВКМ в КИК [47].

Thakurta et al. показали, что воздействие УЗ с частотой 5 МГц усиливает пролиферацию МСК КМ на клеточном носителе из полиуретана в биореакторе, сопровождающуюся увеличением синтеза ГАГ и экспрессией генов, участвующих в хондрогенезе [311].

Сила сдвига, связанная со сдавливанием синовиальной жидкости в суставе при движении, является одним из ведущих физиологических воздействий на хрящевую ткань. Интересно, что ответная реакция заключается в изменении формы при сохранении объема и отсутствии формирования градиента давления. При этом зона хряща, расположенная ближе к суставной щели, может смещаться в вертикальной плоскости до 15%, что сопровождается изменением формы тканеспецифических клеток в соответствии с направлением вектора силы.

Существуют различные способы создания силы сдвига в культуральных камерах биореактора. Наиболее легкий - закрепить чашку Петри на платформе орбитального шейкера [312]. Также используют вращающиеся сосуды и емкости с магнитным перемешивающим элементом [313, 314]. Отметим, что КИК, клетки в которых должны быть предварительно адгезированы на матриксе, необходимо закрепить внутри сосуда. Пористость матрикса ограничивает воздействие силы сдвига на клетки в толще матрикса.

Заметим, что перфузия культуральной среды через КИК в биореакторе обуславливает как силу сдвига, так и гидростатическое давление [315]. Перфузия с высоким сдвигом стимулирует выработку хрящевого ВКМ, но полученная ткань часто имеет волокнистую природу. Напротив, более медленный поток жидкости, по-видимому, оказывает стимулирующее влияние на синтез ВКМ при сохранении фенотипа хондроцитов [316]. При перфузии необходимо зафиксировать клетки для предотвращения их выхода из КИК в культуральную среду, что достигается культивированием на носителях и инкапсуляцией.

Chen et al. разработали биореактор, включающий три отделения. Верхнее включало трубку диаметром 1,25 мм, соединяющую резервуар с культуральной средой и шприцевой насос. Биореактор располагался внутри инкубатора и сообщался с атмосферой через стерильные фильтры. В центральном отделении высотой 2 мм находились хондроциты свиньи в агарозном геле. Нижнее отделение было заполнено агарозным гелем для фиксации КИК [317].

В [318] описан перфузионный биореактор, способный перемещать культуральную среду через камеру с КИК в двух направлениях. Для культивирования КИК, включающих пористые керамические клеточные носители или сетки, Wendt et al. сконструировали устройство с модулем для автоматизированного заселения матрикса МСК или хондроцитами [319]. Система включала пару стеклянных колонок, соединенных U-образным каналом. В каждой колонке находилась полисульфон-тефлоновая ячейка размером (8 х 4) мм. Изменение направления потока обеспечивали оптические датчики.

Замкнутые перфузионные системы являются наиболее распространенным типом биореакторов благодаря простоте обеспечения стерильности [320-322]. Непрерывная смена питательной среды обеспечивает наиболее эффективный массоперенос в сравнении с другими конструкциями, что обуславливает обеспечение клеток питательными веществами и газами, а также выведение от них продуктов метаболизма [323]. Отметим, что невысокая скорость перфузии обеспечивает близкое к физиологическому воздействие на клетки, вызываемое силой сдвига и гидростатическим давлением при движении синовиальной жидкости во время работы сустава.

Примером конструкции, основанной на воздействии сил растяжении, является система, представляющая собой модифицированный инкубатор. Монослой клеток переносили в пластиковую

емкость, соединенную с подвижным и фиксированным зажимами. Блок вращения, связанный с подвижным зажимом, обеспечивал воздействия различной интенсивности.

Преимуществом биореакторов, основанных на гидростатическом давлении, является простота системы. Известна конструкция, позволяющая культивировать клетки в пластиковой пробирке, связанной с барокамерой, способной оказывать давление на культуральную среду через газовую смесь в верхней части пробирки [293]. Непрочность основных компонентов системы, позволяющих выдерживать лишь небольшое давление, можно отнести к недостаткам данной системы.

Отличием другого биореактора является прямое воздействие давления на культуральную среду без включения газовой фазы. Так в биореакторе, описанном De Maria et al., возвратно-поступательные движения поршня в заполненной культуральной средой ячейке совершались в плоскости, перпендикулярной КИК [324]. Для воссоздания естественных условий в суставе при движении поршень создавал давление до 10 кПа.

В организме основной нагрузкой на суставной хрящ является сжатие в одном направлении.

Существует четыре вида систем, основанных на сжатии КИК: с постоянной компрессией, с изменяющейся компрессией, с изменяющейся сдвиговой деформацией и непрямой компрессией [47].

Ко второй группе относят конструкцию, позволяющую одновременно культивировать 12 КИК [293]. Сжатие каждой КИК обеспечивалась индивидуальной распоркой, обеспечивающей силу компрессии путем изменения расстояния между двумя поверхностями. Уровень компрессии внутри планшета определялся толщиной вкладыша из политетрафторэтилена. Davisson et al. добавили в конструкцию возможность автоматического управления для создания циклической нагрузки [325]. Устройство обеспечивало возможность контроля уровня деформации. Система была снабжена теплообмеником и модулем доставки стерильной газовой смеси к КИК. Биореактор позволял одновременно культивировать до 24 КИК, включающих хондроциты, культивированные на различных матриксах, или эксплантов.

В работах [326-328] описаны биореакторы, позволяющие использовать стандартные планшеты и обеспечивающие компрессионную нагрузку на КИК в каждой лунке. В отличие от предыдущей конструкции они должны помещаться в стандартный инкубатор. Démarteau предложили биореактор, позволяющий осуществлять длительные исследования с возможностью замены и перемешивания культуральной среды [329]. Интересна конструкция биореактора, имитирующая головку бедренной кости [330].

Отметим, что приспособления для сжатия в описанных конструкциях затрудняют поддержание стерильности. Обойти этот недостаток смогла система, предложенная Schulz et al., давление в ней обеспечивали магниты [331]. К сожалению, система не предусматривала возможности замены культуральной среды, что снижает качество КИК, негативно влияя на метаболические процессы, включая образование специфичного ВКМ.

В настоящее время для исследовательских работ коммерчески доступны биореакторы BioDynamic 3D Culture Pro (Biometic ADMET TA Instruments, США), TEB 1000, TC-3 mechanical stimulator bioreactor (Ebers Medical, Испания), Tissue Train Culture System, FX-5000 compression system (Flexcell International Corporation, США) и др. [254]. Они существенно различаются друг от друга конструкцией и обладают индивидуальными преимуществами и недостатками.

В основном к недостаткам существующих биореакторов относят большой расход дорогостоящих культуральных сред, невозможность "выращивания" одновременно нескольких тканевых структур и сложность мониторинга процессов внутри системы. Также, учитывая разнообразие скаффолдов желательно, чтобы биореактор обеспечивал образование КИК со всеми из них. Кроме того, для исследовательских работ важно проводить анализ динамики развития КИК, что возможно лишь при изъятии КИК, культивированных одновременно, из системы биореактора независимо в разное время. Отметим, что интересной задачей, до сих пор не решенной при динамическом культивировании КИК, является исследование непрямого сокультивирования тканевого эквивалента хряща с другими КИК.

Суммируя описанные литературные данные, можно заключить, что для создания качественных тканевых эквивалентов хряща, наиболее точно воспроизводящих морфологические и функциональные свойства естественной ткани, необходимо обеспечить питание и дыхание клеток в КИК, независимо от структуры клеточного носителя, и выведение от них продуктов метаболизма, а также создать механическую стимуляцию, соответствующую природной клеточной нише, при обеспечении стерильности и постоянном контроле параметров внутри культуральной камеры, таких как рН и содержание газов. При этом для детализованного анализа динамики развития КИК исследователю должна быть предоставлена возможность изъятия образцов на протяжении культивирования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования

Бедренные и коленные свиные суставы были получены на бойне (ООО "АПК "ПРОМАГРО", г. Старый Оскол) после забоя здоровых животных (вес свиньи около 120 кг) в соответствии с Европейской директивой 64/433/ЕЕС. Суставы перевозили при температуре 4°С. Собранный с суставных поверхностей костей хрящ измельчали для получения фрагментов размером 0,5х0,5х0,1 см. Полученные образцы хряща хранили при температуре - 20°С.

2.2 Методы получения микродисперсного тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

Набор и последовательность операций, входящих в протокол децеллюляризации для эффективного удаления клеток и клеточных элементов при максимальном сохранении ВКМ, зависят от таких характеристик ткани, как плотность, толщина и содержание липидов [166]. Высокая плотность и отсутствие пор в суставном хряще затрудняют проникновение ПАВ вглубь ткани, также, как и выведение компонентов разрушенных клеток. Это указывает на предпочтительность микронизации исходной ткани и обуславливает необходимость включения помимо обработки ПАВ в протокол децеллюляризации дополнительных физических и биологических методов, среди которых в настоящей работе были рассмотрены обработка гипо-и гипертоничными растворами ПАВ, резкие изменения температуры, атмосфера сверхкритических флюидов, ультразвук, лиофилизация и инкубация в растворе ДНКазы.

2.2.1 Метод криопомола для получения микрочастиц свиного хряща

Фрагменты суставного хряща свиньи размером 0,5х0,5х0,1 см криогенно измельчали с использованием мельницы CryoMill (Retch GmBH, Германия), позволяющей производить помол в условиях низких температур (-196°С). Для помола использовали размольный стакан объемом 25 мл с 4 размольными шарами, который непрерывно охлаждался жидким азотом до и во время измельчения.

Для выделения микрочастиц необходимого размера использовали сита с размером пор 500, 250 и 100 мкм.

2.2.2 Обработка растворами поверхностно-активных веществ

Микрочастицы хрящевой ткани обрабатывали при комнатной температуре и периодическом перемешивании на магнитной мешалке (3 раза в сутки, 1 час, 200 оборотов/минуту) в трех сменах фосфатно-солевого буферного раствора (ФБС) (138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, рН=7,4), содержащего SDS и повышающуюся концентрацию Triton Х-100:

A. ФБС, содержащего 1% Triton X-100 и 0,1% SDS, в течение 24 часов при комнатной температуре;

Б. ФБС, содержащего 2% Triton X-100 и 0,1% SDS, в течение 24 часов при комнатной температуре;

B. ФБС, содержащего 3% Triton X-100 и 0,1% SDS, в течение 24 часов при комнатной температуре [198].

Отмывка от децеллюляризирующих веществ заключалась в инкубации матрикса в бидистиллированной воде, содержащей антибиотик (ампицилин, 20 мкг/мл) и антимикотик (амфотерицин, 2,0 мкг/мл), на протяжение 90 часов [198]. Отмытые образцы стерилизовали у-облучением в дозе 1,5 Мрад.

2.2.3 Инкубация в гипо- и гипертоничныхрастворах поверхностно-активных веществ

Микрочастицы хряща свиньи при комнатной температуре обрабатывали последовательно дистиллированной водой, содержащей 0,1% SDS, (гипотоничный раствор) и в растворе 1М NaCl, содержащего 0,1% SDS (гипертоничный раствор) в течение выбранного интервала времени при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при скорости 200 об/мин [142].

2.2.4 Лиофилизация

Перед обработкой ПАВ микрочастицы суставного хряща свиньи замораживали в течение 15 часов при температуре - 40°С. Далее образцы высушивали в лиофильной сушке Labconco Free Zone при давлении 0,02-0,03 мБар в течение 2 суток.

2.2.5 Замораживание и оттаивание

Для увеличения проницаемости плотной хрящевой ткани для растворов SDS и Triton X-100 микрочастицы помещали в криопробирки и подвергали сухой заморозке в сосуде Дьюара при -196°С в течение одного часа, после чего производили оттаивание в термостате при 37°С в течение 1 часа [198]. При необходимости цикл замораживание/оттаивание повторяли от 1 до 10 раз [198].

2.2.6 Обработка в среде сверхкритического С02

Обработку сверхкритическими флюидами также используют для повышения эффективности децеллюляризации, основанной на действии растворов ПАВ [269]. Протокол децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи с использованием ск-СО2 разрабатывали совместно с ФГБУН «Институт общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова» РАН.

Для этого микрочастицы хрящевой ткани свиньи дополнительно после инкубации в растворах ПАВ (пункт 2.1.2.1) обрабатывались на установке Speed™ SFE (Applied Separations, США) в атмосфере ск-СО2 в следующих режимах:

Режим 1: обработка ск-СО2 при давлении 150 бар, температуре 35оС, скорости потока ск-СО2 2,5±0,5 мл/мин в течение 8 часов;

Режим 2: обработка ск-СО2 при давлении 300 бар, температуре 35оС, скорости потока ск-СО2 2,5±0,5 мл/мин в течение 8 часов;

Режим 3: обработка ск-СО2 при давлении 300 бар, температуре 35 оС, скорости потока ск-СО2 2,5±0,5 мл/мин в течение 24 часов;

Режим 4: обработка ск-СО2 с добавлением 10% C2H5OH при давлении 300 бар, температуре 35оС, скорости потока 2,5±0,5 мл/мин в течение 8 часов. Для удаления остатков этанола по окончании проводили дополнительную обработку чистым ск-СО2 в течение 2 часов;

Режим 5: обработка ск-СО2 с добавлением 10% C2H5OH при давлении 300 бар, температуре 35оС со скоростью потока 2,5±0,5 мл/мин в течение 24 часов. Для удаления остатков этанола по окончании проводили дополнительную обработку чистым ск-СО2 в течение 2 часов.

2.2.7 Обработка ультразвуком

Воздействие УЗ также относят к альтернативным физическим воздействиям, позволяющим облегчить освобождение ВКМ от клеток и клеточных элементов [186].

В настоящем исследовании удаление клеток из фрагментов суставного хряща свиньи с использованием УЗ проводили в 4 различных режимах. Мощность УЗ (Elma S 60H, Elma Hans Schmidbauer GmbH & Co KG, Германия) составляла 180 Вт, а частота 37 Гц. При воздействии УЗ фрагменты хряща свиньи помещали в 80 мл раствора ПАВ и обрабатывали по схеме, описанной в пункте 2. 2.2.

Режим 1 включал воздействие УЗ в течение 15 минут в сутки; режим 2 включал воздействие УЗ в течение 30 минут в сутки, режим 3 включал воздействие УЗ в течение 45 минут в сутки, режим 4 включал воздействие УЗ в течение 60 минут в сутки.

2.2.8 Обработка ДНКазой

Для удаления ДНК из микрочастиц хряща свиньи использовали ДНКазу I типа (New England Biolabs Inc., США). Пробу объемом 0,5 мл помещали в 1 мл 10 мМ Трис-HCl буферного раствора (pH 7,6), содержащего 2,5 мМ MgCl2, 0,5 мМоль CaCl2 и 50 Е/мл ДНКазы, на 48 часов при температуре 37°С [145].

2.3 Метод лазерной дифракции

Распределение микрочастиц хряща по размерам в суспензии определяли с помощью лазерного дифракционного анализатора SALD-7101 (Shimadzu, Япония) в соответствии с теорией Ми и путем моделирования частиц в виде идеальных однородных сфер [198]. Для определения диаметра эквивалентных микрочастицам децеллюляризованного хряща свиньи (ДХс) сфер многоэлементный детектор регистрировал сигнал рассеяния, полученный при их взаимодействии с коллимированным лазерным лучом, основываясь на прапорциональности угла светорассеяния и размера частиц. Длина волны лазера была равна 375 нм. Измеряемый образец представлял собой суспензию микрочастиц ДХс в глицерине. Анализ светорассеяния осуществлялся автоматически с использованием программного обеспечения WingSALD II6 Version 2.1.0 для пяти репрезентативных образцов.

2.4 Сканирующая электронная микроскопия

Морфологию поверхности и ближайшего подповерхностного слоя образцов изучали совместно с сотрудниками лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ «НИИ глазных болезней» методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с использованием лантаноидного контрастирования. Пробоподготовка водосодержащих образцов для СЭМ с напылением токопроводящего слоя требует их обезвоживания, что приводит не только к структурным изменениям таких объектов, но и плохой визуализации клеточных элементов [145]. Метод лантаноидного контрастирования позволяет наблюдать нефиксированные биологические образцы в режиме низкого вакуума после выдержки их в насыщенном растворе редкоземельного металла [145]. При этом сохраняется максимально нативное состояние исследуемого объекта, а изображение, полученное в режиме детекции обратно рассеянных электронов, несет расширенную информацию о клеточных структурах [332]. Протокол обработки включал первичную промывку, выдержку 45 минут в контрастирующем растворе BioREE (ООО «Глаукон», Россия) и финальную промывку дистиллированной водой. После контрастирования с поверхности образца удаляли избыток влаги воздушной кистью и размещали его на предметном столике микроскопа EVO LS10 (Zeiss, Германия) [145]. Наблюдения проводились в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па), при ускоряющем напряжении 20 кВ [145].

2.5 Гистологическое исследование

Образцы фиксировали в 10-процентном забуференном растворе формалина не менее 4 ч, промывали в течение 15 минут в проточной воде и обезвоживали в спиртах восходящих концентраций (в двух порциях 70%, 80%, 96% этанола; по 5 минут в каждой смене спиртового раствора), выдерживали по 5-7 минут в смеси этанола и хлороформа, затем в хлороформе и потом заливали в парафин [310]. Срезы толщиной 4-5 мкм, полученные с помощью микротома Leica RM3255, депарафинировали, регидратировали и окрашивали, следуя стандартным методикам, гематоксилином и эозином, альциановым синим для выявления мукополисахаридов и на соединительную ткань по методу Массона [310]. Анализ и фотосъемку полученных препаратов проводили, используя микроскоп Nikon Eclipse, оснащенный цифровой фотокамерой.

Окрашивание парафиновых срезов образцов гематоксилином и эозином

Срезы окрашивали гематоксилином Майера в течение 10 мин, промывали в проточной воде 3-5 минут, ополаскивали дистиллированной водой и окрашивали 1% раствором эозина 30-

50 секунд [310]. Ополаскивали дистиллированной водой, обезвоживали в этаноле с восходящими концентрациями (70%, 80%, 96%), просветляли в карбол-ксилоле, затем в ксилоле и заключали в бальзам [310].

Окрашивание парафиновых срезов альциановым синим

Для приготовления раствора альцианового синего (Sigma, США) 1 г красителя растворяли в 100 мл 3% уксусной кислоты, далее раствор фильтровали и наносили на депарафинированные и регидратированные срезы на 30 минут, после чего промывали в дистиллированной воде и докрашивали в течение 10 минут гематоксилином [310]. Стекла со срезами выдерживали в проточной воде 3-5 минут, обезвоживали в спиртах восходящих концентраций, затем в ксилоле и заключали в бальзам.

Окрашивание парафиновых срезов по методу Массона

Депарафинированные, регидратированные срезы окрашивали железным гематоксилином Вейгерта в течение 2 минут, промывали водопроводной водой 15 минут и окрашивали кислым фуксином 2 минуты [310]. После чего срезы быстро ополаскивали дистиллированной водой и помещали в 1 -процентный раствор фосфорновольфрамовой кислоты на 10 минут, далее раствор кислоты сливали, не ополаскивая срезы в воде, и помещали стекла в раствор анилинового синего на 1-2 минуты [310]. Затем срезы ополаскивали водопроводной водой и дифференцировали в 1 -процентном растворе уксусной кислоты в течение 10 минут. Проводили обезвоживание в спиртах восходящих концентраций, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. При этом соединительнотканные волокна окрашиваются в синий цвет, ядра клеток - в черный или темно-синий, цитоплазма клеток - в малиново-розовый или красный [310].

2.6 Иммуногистохимическое исследование

Для визуализации коллагена II типа использовали Novocastra™ Concentrated Peroxidase Detection System (RE7130-K, Leica Microsystems), следуя протоколу, рекомендованному производителем. Препараты подвергали процедуре ретривизации - нагретые срезы инкубировали при 37°С с теплым раствором трипсина в течение 30 минут [71].

После промывки срезов деионизированной водой, в течение 10 минут проводили нейтрализацию эндогенной пероксидазы, используя Novocastra™ Peroxidase Block (RE7101, Leica Microsystems) [71]. Затем применяли Novocastra™ Protein Block (RE7102, Leica Microsystems) для сокращения неспецифического связывания первичных и вторичных антител [71]. Впоследствии срезы инкубировали 1 час с оптимально разведенными первичными антителами к коллагену II типа (NCL-COLL-IIp, Novocastra™, Leica Microsystems) и 30 минут с Novocastra™ Concentrated Bionylated Secondary Antybodies (RE7108, Leica Microsystems) -

связанные с биотином вторичные антитела. Затем, срезы инкубировали 30 минут с Novocastra™ Concentrated Streptavidin-HRP (RE7109, Leica Microsystems) - стрептавидин-пероксидазное соединение, которое связывается с биотином, присутствующим на антителах [71]. В дальнейшем срезы инкубировали со свежим окрашивающим субстратом DAB (substrate/chromogen, 3,3' - diaminobenzidine), который готовили из Novocastra™ DAB Chromogen (RE7105, Leica Microsystems) и Novocastra™ Substrate Buffer (RE7106, Leica Microsystems), после инкубации с Novocastra™ Peroxidase Block, Novocastra™ Protein Block, первичными антителами, вторичными антителами и Novocastra™ Concentrated Streptavidin-HRP срезы каждый раз дважды промывали в течение 5 минут раствором трис-буфера 0,5 M pH=7,6 (Sigma, США) [71]. Затем срезы промывали дистиллированной водой, докрашивали Novocastra™ Hematoxylin (RE7107, Leica Microsystems), проводили по спиртам с восходящими концентрациями (70%, 80%, 90%, 96%, 100% этанола), инкубировали с ксилолом и заливали в канадский бальзам [71].

Анализ и фотосъемку полученных препаратов проводили, используя микроскоп Nikon Eclipse, оснащенный цифровой фотокамерой.

2.7 Флуоресцентное окрашивание двуцепочечной ДНК для оценки полноты

децеллюляризации

Степень децеллюляризации фрагментов суставного хряща свиньи оценивали с использованием модифицированного метода [186]. Для количественного определения полностью децеллюляризованных, частично децеллюляризованных и не децеллюляризованных микрочастиц проводили окрашивание в 24-луночном планшете раствором специфического для двуцепочечной ДНК флуоресцентного красителя 4',6-диамиидно-2-фенилиндол (DAPI) в концентрации 1 мкг/мл (6 мг хряща на 1 лунку) [198]. Длина волны возбуждения красителя составляет 358 нм, длина волны максимума излучения - 461 нм.

В каждом образце, с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Ti (Nikon Corporation, Япония), определяли количество микрочастиц матрикса (рисунок 3):

• недецюллюляризованных;

• децеллюляризованных, содержащих отдельные клетки;

• полностью децеллюляризованных [198].

Рисунок 3 — Микрочастицы хряща свиньи. Окраска 4,6-диамиидно-2-фенилиндолом: 1 — недецеллюляризованные микрочастицы; 2 — децеллюляризованные микрочастицы, содержащие отдельные клетки; 3 — полностью децеллюляризованные микрочастицы. Ув. х200

На дне лунки произвольным образом выбирали 15 полей зрения при увеличении х40. В каждом поле определяли количество частиц каждого типа. Результаты по всем полям суммировали, и количество фрагментов каждого типа в образце рассчитывали в процентах от общего количества частиц [198].

2.8 Биохимические методы анализа 2.8.1 ДНК

Одним из критериев успешной децеллюляризации является фрагментация и удаление ДНК из ткани, поскольку ДНК животных вызывает воспалительные реакции и содержит эндогенные ретровирусы, которые могут передаваться пациенту [165].

Экстракцию ДНК осуществляли в соответствии с инструкцией производителя при помощи набора реактивов DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Германия), действие которого основано на использовании диоксида кремния. Для исследования были использованы образцы после заморозки при температуре -20°C. Предварительно с поверхности децеллюляризованных образцов удаляли избыточную влагу с использованием бумажных фильтров и нейлоновых сеток с диаметром пор 10 мкм (Millipore, Ирландия). Образцы ДХс (n=3) массой 25 мг лизировали с использованием AL буфера и протеиназы К в течение 16 часов при +57°С. После

добавления AL буфера и 100% этанола пробирки с образцами центрифугировали в течение 1 минуты при 6000 g. Затем образцы последовательно обрабатывали промывочным раствором AW1, центрифугировали при 6000 g, промывали буфером AW2 и центруфугировали при 20 000 g для высушивания мембраны колонки. Для полноты выхода ДНК из образца проводили трехкратное элюирование с использованием АЕ буфера.

Для количественного определения ДНК использовали флуоресцентный краситель™ PicogreenQuant-iT (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя. Действие красителя активировалось излучением с длиной волны 480 нм, а полученная термоэлектронная эмиссия анализировалась на ридере для микропланшетов Spark 10М (TecanTrading AG, Швейцария) при длине волны 520 нм [142]. Для определения абсолютного количества ДНК использовали калибровочную кривую ДНК бактериофага X (Invitrogen, США) в диапазоне 0,0-1000 нг/мл [142].

2.8.2 Гликозаминогликаны

Для определения содержания ГАГ образцы ДХс и исходных микрочастиц хряща предварительно лиофилизировали и оценивали количество относительно сухого веса. КИК хряща не лиофилизовали и рассчитывали содержание ГАГ относительно одной КИК. Образцы лизировали в растворе папаина (125 мкг/мл папаина (Sigma-Aldrich, США) в ФБС, содержащем 5 мМ L-ацетилцистеина гидрохлорида (Sigma-Aldrich, США) и 5 мМ ЭДТА (Sigma-Aldrich, США)) в течение 12 часов [213]. Полученный лизат и образцы культуральной среды центрифугировали 10 минут при 10000 g.

Для количественного анализа ГАГ использовали тиазиновый краситель 1,9-диметилметиленовый синий (Sigma-Aldrich, США), который связывается с ГАГ в растворе, изменяя цвет. Для определения абсолютного количества ГАГ использовали калибровочную кривую хондроитина сульфата (Sigma-Aldrich, США) в диапазоне 0-50 мкг/мл. Анализ оптической плотности образцов определяли на ридере для микропланшетов Spark 10М (TecanTrading AG, Швейцария) при длине волны 570 нм. Измерение проводили для трех репрезентативных образцов.

2.8.3 Фибриллярный коллаген (коллаген I, II, III, Vтипов)

Содержание коллагена определяли с помощью набора Sircol™ Soluble COLLAGEN Assay (Biocolor, Великобритания) в лиофилизованных образцах микрочастиц исходной ткани и ДХс. Фибриллярный коллаген (типы I, II, III, V) включает альфа-цепи, состоящие из непрерывно повторяющейся последовательности трипептидов, содержащих глицин в каждом третьем аминокислотном остатке, [(gly-X-Y)n], именно с этой последовательностью связывается краситель сириус красный.

Для экстракции коллагена все образцы лизировали в 0,01 Н HCl, содержащей 1 мг/мл пепсина (Sigma-Aldrich, США) в течение 12 часов при комнатной температуре. Затем полученные лизаты обрабатывали реагентом-красителем Sircol (1 мл) 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность в каждом образце определяли при длине волны 555 нм на ридере для микропланшетов Spark 10М (TecanTrading AG, Швейцария). Для построения калибровочной кривой использовали стандарт коллагена I типа, поставляемый вместе с набором. Измерение проводили для трех репрезентативных образцов.

2.9 Методы исследования биологической безопасности микродисперсного тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи

2.9.1 Цитотоксичность

Исследование цитотоксичности было проведено в соответствие с ГОСТ ISO 10993-5-2011 [333]. Учитывая, что потенциальная область применения микрочастиц ДХс связана с внутрисуставным введением в комбинации с МСК, в качестве клеточной культуры для оценки цитотоксичности in vitro в настоящем исследовании были выбраны первичные МСК ЖТ человека (ч).

Образцы ЖТч массой 3-5 г (n=3) были получены с информированного согласия живых здоровых доноров в качестве отходов при трансплантации печени под общим наркозом. Исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами Хельсинской декларации и одобрено локальным этическим комитетом при ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В. И. Шумакова» Минздрава России (15 ноября 2019 г. № 151119- 1/1э). Источником МСК ЖТч была подкожная жировая клетчатка здорового донора, взятого у него при информированном добровольном согласии. Образец подкожной жировой ткани измельчали скальпелем, подвергали двукратной промывке холодным (+4...+6°С) раствором Хенкса, а затем инкубировали в 0,1% растворе коллагеназы I типа (Gibco, США) при 37°С в течение 20 минут

[145]. После чего полученную суспензию последовательно пропускали через клеточные сита диаметром пор 100 и 70 мкм.

Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в полной ростовой среде (ПРС) состава DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 2 мМ L-глютамина (Gibco, США) и культивировали до формирования монослоя, меняя среду 2 раза в неделю [145]. Перевод клеток в суспензию осуществляли путем обработки раствором Версена при 37°С в течение 1 минуты с последующим добавлением диссоциирующего агента TrypLe™ (Invitrogen, США). Для экспериментов брали клетки 3-го пассажа [145].

МСК ЖТч высевали в культуральные плоскодонные 6-луночные планшеты и инкубировали 24 часа при температуре 37°С в стандартных условиях во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 [198]. На поверхность образовавшегося 80% монослоя клеток помещали исследуемые образцы. Через 24 часа инкубации оценивали морфологию и лизис клеток с применением автоматизированной системы прижизненного наблюдения за клетками IncuCyte Zoom (Sartorius, США) [198]. Отрицательным контролем была эмбриональная телячья сыворотка, положительным контролем - стандартный раствор цинка в азотной кислоте (9,95 мг Zn в 1-2 вес. % HNO3, разведение 1:200 раствором 0,9% NaCl для инъекций).

Полученные результаты цитотоксической реакции культуры МСК ЖТч интерпретировали с использованием таблицы 4 [53].

Таблица 4 — Степень реакции клеток

Степень реакции Реакция Описание зоны реакционной зоны

0 Отсутствует Нет никакой реакции клеток вокруг образца и под ним

1 Незначительная Некоторые клетки под образцом имеют измененную морфологию или разрушены

2 Нерезкая Зона лизиса клеток ограничивается площадью под образцом

3 Умеренная Зона лизиса распространяется на 1 см вокруг образца

4 Резкая Зона лизиса распространяется больше, чем на 1 см вокруг образца

Отрицательный контроль должен иметь степень реактивности 0, положительный контроль - 3 или 4. Реактивность исследуемого экстракта не должна превышать степени 2.

2.9.2 Гемолиз, индуцированный поверхностью материала

Исследование гемолитической активности ДХс определяли совместно с АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» в соответствии с ГОСТ ISO 10993-4-2011 [334].

К образцам добавляли 0,9% раствор натрия хлорида в соотношении масса образца (г): экстрагирующая жидкость (мл) = 1:30 [198]. В качестве отрицательного контроля использовали 0,9% раствор натрия хлорида, а положительного контроля - дистиллированную воду [198].

Все пробирки с растворами инкубировали при температуре 37оС в течение 120 мин [198]. Затем в каждую пробирку добавляли цитратную кровь кролика, приготовленную на 3,8%-ном растворе цитрата натрия в соотношении 1:9, из расчета 200 мкл на 10 мл экстракта, перемешивали и вновь инкубировали в термостате при температуре 37оС в течение 1 часа [198]. После инкубации пробирки помещали в центрифугу для осаждения крови при ускорении 2000 об/мин в течение 20 минут. На биохимическом анализаторе «Стат факс 1904+» измеряли оптическую плотность супернатанта при длине волны 545 нм [198].

Количественным критерием метода служила относительная величина гемолиза (ah) в %, определяемая по формуле:

ah = E ~E -100%

E1 ПП

^100 ^е (1)

где: Е.; - оптическая плотность опытной пробы;

Еc - оптическая плотность контрольной пробы;

Еюо - оптическая плотность пробы со 100%-ным гемолизом [198].

Образец признается гемосовместимым по тесту на гемолиз, если аь < 2%.

2.9.3 Исследование местного действия in vivo

Определение местной реакции на имплантируемые внутримышечно образцы ДХс проводили совместно с АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» с использованием биологической тест-системы: половозрелых аутбредных крыс (самок) (n=18) согласно ГОСТ ISO 10993-6-2011 [335]. Масса имплантируемого образца ДХс составляла 10 мг. Контролем служили ложнооперированные крысы, которым проводили операцию, не закладывая имплантаты. Через 21 сутки, 3 и 6 месяцев животных подвергали эвтаназии методом декапитации (с предварительной анестезией). Результаты оценивали макроскопически и с помощью гистологических методов исследования.

Детально метод исследования изложен в Приложении А.

2.9.4Исследование общетоксического действия

Исследование общетоксического действия ДХс проводили совместно с АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» в соответствии с ГОСТ ISO 10993-11-2011

[336].

Исследование проводили на половозрелых аутбредных крысах (самки массой 200-220 г, n=32). Экспериментальные образцы имплантировали крысам в мышечную ткань бедра.

Токсическое влияние исследуемых образцов определяли по признакам и срокам развития клинических проявлений интоксикации, путем анализа показателей массы тела и внутренних органов, гематологических и биохимических показателей крови, анализа мочи, патоморфологического исследования, а также гистологического исследования тканей внутренних органов. Эвтаназию животных проводили через 2 месяца после имплантации тестируемых образцов.

Детально метод исследования изложен в Приложении Б.

2.9.5 Генотоксичность

Исследование генотоксического действия ДХс проводили совместно с АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» в соответствии с ГОСТ ISO 10993-3-2018

[337].

Мутационный тест на Salmonella typhimurium (тест Эймса) является бактериальной тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма.

Был использован набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы были полученные из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика».

Для метаболической активации использована фракция S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов Совол (300 мг/кг, однократно внутрибрюшинно).

В опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в ее присутствии (СМ+). В вариантах СМ- регистрировали действие прямых мутагенов, то есть веществ, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие непрямых мутагенов (промутагенов) - соединений, эффект которых связан с

образованием мутагенных метаболитов, было учтено при сравнении результатов, полученных в вариантах СМ- и СМ+.

В каждом контрольном и опытном вариантах эксперимента использовали по 3 чашки.

Детально метод исследования изложен в Приложении В.

2.9.6 Репродуктивная/эмбриональная токсичность

Исследование репродуктивной токсичности ДХс проводили совместно с АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» в соответствии с ГОСТ ISO 10993-3-2018 [337].

Исследование проводили на половозрелых аутбредных крысах (самцах (масса 310-360 г, n=12) и самках (масса 200-220 г, n=24)). Микродисперсные образцы из децеллюляризованных микронизированных фрагментов суставного хряща свиньи имплантировали крысам в мышечную ткань бедра. Через 14 суток после имплантации самцов и самок ссаживали на срок 14 суток.

Часть беременных самок подвергали эвтаназии на 20-е сутки беременности, плоды осматривали, взвешивали и измеряли кранио-каудальный размер. Подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантаций и количество живых и погибших плодов. Другую половину самок оставляли до родов для наблюдения за развитием потомства в течение 5 суток. По окончании исследования животных подвергали эвтаназии с дальнейшим изучение органов репродуктивной системы.

Детально метод исследования изложен в Приложении Г.

2.10 Оценка качества мезенхимальных стромальных клеток

В качестве источников МСК благодаря минимальной травматичности для пациента были выбраны МСК Вартонова студня пуповины, пульпы молочного зуба и жировой ткани человека. Описание выделения МСК ЖТч представлено в пункте 2.9.1. Первичные культуры клеток МСК пульпы молочного зуба и МСК Вартонова студня пуповины, а также хондробластасты реберного хряща человека, использованные в качестве положительного контроля, были получены из лабораторной коллекции клеточных культур лаборатории клеточной биологии ИБМХ.

Фенотип клеток полученных первичных культур МСК ЖТч исследовали методом проточной цитофлуориметрии в лаборатории клеточной биологии ИБМХ. Полученные культуры МСК ЖТч были изучены на предмет экспрессии поверхностных маркеров стволовых и прогениторных клеток CD29, CD34, CD44, CD45, CD49b, CD73, CD90 и HLA-DR [71]. Экспрессия маркеров гемопоэтических стволовых клеток CD34, CD45 и HLA-DR в изучаемых культурах не наблюдалась [71]. В то же время был отмечен высокий уровень экспрессии CD44 (рецептор ГК), CD73 (5'-нуклеотидаза), CD90 (антиген дифференцировки тимоцитов 1), а также CD49b и CD29 (alpha 2 и beta1 субъединицы интегрина VLA-2 соответственно) [71]. Большинство из этих макромолекул включены в список маркеров, рекомендуемых Международным обществом клеточной терапии для характеристики культур МСК [85]. Результаты свидетельствуют о высоком содержании мультипотентных клеток мезенхимального происхождения в культурах [71].

Для подтверждения наличия в культуре МСК ЖТч мультипотентных клеток были проведены эксперименты по ее разнонаправленной дифференцировке.

Хондрогенную дифференцировку клеток проводили в микросферах, полученных путем осаждения 2х105 клеток в 96-луночных планшетах с коническим дном, для чего планшет центрифугировали при 500 g в течение 5 минут [71]. Через 2 недели культивирования в хондрогенной культуральной среде (DMEM HG с добавкой GlutaMAX™ (Gibco, США), 10% ITS+ (Corning, США), 1% пируват натрия (Gibco, США), 0,25% аскорбат-2-фосфата (Sigma-Aldrich, США), 0,0001% дексаметазона (Sigma-Aldrich, США), 0,002% TGF-P1 (PeproTech, США) и 1% культурального антибиотика-антимикотика (Gibco, США)) [71]. Препараты фиксировали в забуференном растворе 10% формалина, заливали в парафин. Срезы депарафинировали, регидратировали и окрашивали альциановым синим.

Адипогенную дифференцировку изучаемых культур проводили в среде DMEM/F12, содержавшей 10% лошадиной сыворотки, 0,5 мМ изобутилметилксантина и 60 тМ индометацина в течение 7 дней, затем препараты фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали масляным красным.

Дифференцировку полученных культур в костную ткань проводили в бессывороточной среде DMEM/F12 с добавлением 0,2 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ b-глицерофосфата

у

кальция, 10-7 М дексаметазона (Sigma), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 2 мМ L-глютамина (Gibco). Клетки культивировали в течение 3 недель, меняя среду 2 раза в неделю. По окончании препараты фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали ализариновым красным.

Способность МСК ЖТч дифференцироваться в хондрогенном, адипогенном, остеогенном направлениях показана на рисунке 4.

Рисунок 4 — Дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в хондрогенном (А, окрашивание альциановым синим), адипогенном (Б, окрашивание масляным красным) и остеогенном (В, окрашивание ализариновым красным) направлениях. Ув. х200

Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч была подтверждена положительной окраской ГАГ альциановым синим (рисунок 4А), остеогенная - выявлением солей кальция при окрашивании ализариновым красным (рисунок 4Б), а адипогенная - окрашиванием жира масляным красным (рисунок 4В).

2.11 Оценка действия мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека из различных источников на пролиферацию хондробластов человека

2.11.1 Культивирование хондробластов в кондиционированной среде

МСК ЖТч, МСК пульпы молочного зуба, МСК Вартонова студня пуповины и хондробласты культивировали во флаконах 75 см2. Для эксперимента были использованы клетки 3 пассажа. Замену ПРС осуществляли раз в трое суток. Кондиционированную ПРС собирали на 10 сутки культивирования (достижение конфлюэнтности >70%) перед началом эксперимента и далее хранили при 4°С. Для оценки влияния кондиционированной среды хондробласты культивировали в 24-луночных планшетах. Кондиционированную среду от каждого типа МСК, разбавленную в соотношении 1:1 ПРС, вносили в 24 лунки с хондробластами (3000 клеток на лунку). Прижизненное наблюдение за клетками и фотосъемку выполняли с помощью системы IncuCyte Zoom (Sartorius, США). Контролем служила кондиционированная среда от хондробластов, разбавленная в соотношении 1:1 ПРС.

2.11.2 Непрямое сокультивирование хондробластов с мезенхимальными

стромальными клетками

Влияние МСК на пролиферацию хондроцитов человека изучали при непрямом сокультивировании в ростовой культуральной среде с использованием трансвеллов для 24-луночных планшетов с размером пор 3 мкм (SPL Lifesciences, с PC мембраной). На дно нижней камеры наносили 5х104 МСК. В верхнюю камеру помещали 5х10 хондробластов человека и 5 мг тканеспецифического матрикса из ДХс. Контролем служили трансвеллы, содержащие хондроциты в обеих камерах. Пролиферацию хондроцитов на 7 и 14 сутки оценивали путем флуоресцентного измерения количества ядерной ДНК (PicoGreen Assay) в верхней камере. Измерение проводили для трех репрезентативных образцов.

2.12 Сравнительное исследование матриксных и функциональных свойств инъекционных форм коллагенсодержащих клеточных носителей

2.12.1 Пролиферативная активность клеток при культивировании на инъекционных формах коллагенсодержащих клеточныгх носителей

Метаболическую активность клеток оценивали тестом с реактивом PrestoBlue™, согласно

инструкции производителя реактива. Метод основан на митохондриальной активности клеток,

превращающих резазурин в резоруфин, который возможно определить как

спектрофотометрически, так и флуориметрически. Спектрофотометрический анализ проб

проводили на планшетном ридере Тесап Spark10 (Австрия). Данные измерения поглощения

использовали для расчета коэффициента метаболической активности (К) по формуле:

117,216 * ЛЪ^п - 80,586 * ЛЪ8,т

К=---570---— *100 %, (2)

155,677* ЛЪ^0 -14,652* ЛЪ$Ь10

где АЬб570 - поглощение при длине волны 570 нм, АЬб600 - поглощение при длине волны 600 нм [145].

Количество живых метаболизирующих клеток в пробирке определяли, используя калибровочную кривую. Для этого в лунки 24-луночных планшетов вносили различные количества клеток: 25, 50, 75, 100, 150 и 200 тысяч клеток соответственно. После адгезии и распластывания клеток, но до начала активной пролиферации, проводили тест с реактивом PrestoBlue™ для оценки метаболической активности. По полученным данным строили калибровочную кривую, связывающую измеряемый коэффициент метаболической активности с количеством клеток.

2.12.2 Исследование жизнеспособности клеток методом флуоресцентной

микроскопии

Для определения живых и мертвых клеток образцы окрашивали комплексом флюоресцентных красителей Live/Dead. (Invitrogen, США). Данный комплекс состоит из двух компонентов:

- calcein AM дает зеленую флюоресценцию живых клеток, регистрируемую при длине волны 515 нм,

- ethidium homodimer-1, проникая через поврежденную мембрану клеток и связываясь с ДНК, дает красную флюоресценцию при 635 нм [310].

Красители отличаются очень низкими значениями фонового свечения и хорошей диффузией в гидрогель. Отметим, что красители можно использовать по отдельности. Необходимые количества красителей смешивали в стерильном фосфатном буфере DPBS, после чего добавляли в пробирку с образцами. Через 30 минут инкубирования при комнатной температуре, образец фотографировали с использованием флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TS100.

2.12.3 Формирование клеточно-инженерных конструкций хряща в статических

условиях

Для сравнения хондрогенного потенциала МСК и хондробласты культивировали в составе трехмерных микросфер с высокой плотностью клеток (пункт 2.11), что является стандартным методом исследования хондрогенеза [90, 71].

Во всех проводимых в статических условиях экспериментах с использованием клеточных носителей КИК хряща состояли из 5х105 клеток и 5 мг микрочастиц ДХс или 0,25 мл БМКГ. Матриксы заселяли клетками путем центрифугирования при 500 g в 96-луночных планшетах с коническим дном или при вращении в пробирках с культуральной средой на платформе шейкера типа «балерина» Multi Bio 3D (Biosan, Латвия) [198]. Первые 5 суток КИК культивировали в ростовой культуральной среде. Далее ПРС заменяли на дифференцировочную хондрогенную среду (пункт 2.10) [198]. Замену среды осуществляли на каждый третий день.

Для определения функциональной активности КИК хряща in vitro с использованием морфологических и биохимических методов исследовали способность микрочастиц матрикса и клеточной компоненты соединяться и образовывать тканевой эквивалент, клетки в составе которого продуцируют собственный ВКМ, включающий ГАГ и коллаген.

2.12.4 Исследования функциональных свойств созданных клеточно-инженерных конструкций на экспериментальной модели остеоартроза in vivo

В экспериментах использовали кроликов (самцы) Новозеландский белый, весом 3-4 кг (n=17), полученных из питомника лабораторных животных ООО «Кролинфо», Московская область.

Манипуляции не причиняли животным боли и проводились в соответствии с российским законодательством: ГОСТ 33215 -2014 (Руководство по размещению и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур) и ГОСТ 33216-2014 (Руководство по размещению и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами). Работа одобрена локальным этическим комитетом при ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В. И. Шумакова» Минздрава России (24 января 2020 г. № 240120-1/1э).

Для доказательства возможности стимуляции регенерации хрящевой ткани при внутрисуставном введении КИК, содержащих коллагенсодержащие носители и МСК, была выбрана экспериментальная модель адъювантного артрита [217-219], модифицированная добавлением скарификации во время внутрисуставной инъекции.

Протокол модели адъювантного артрита состоял из 3 этапов [ 217]:

1) подкожное введение (в основание хвоста) 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Thermo scientific) с метилированным бычьим сывороточным альбумином (м -БСА, Sigma) в концентрации 4 мг/мл;

2) подкожное введение 0,5 мл ПАФ с м -БСА в концентрации 4 мг/мл через 2 недели;

3) сопровождаемое скарификацией внутрисуставное введение 0,5 мл м-БСА в концентрации 2 мг/мл в 7,5% растворе глюкозы через 4 недели в оба коленных сустава задних конечностей кролика после первой подкожной инъекции.

Все животные были разбиты на 6 групп: 1 группа интактных кроликов (n=2) и 5 групп кроликов (n=15) были использованы для создания модели ОА. На 30 сутки после моделирования ОА кроликам опытных групп в коленный сустав задней правой лапы вводили 1х106 МСК ЖТч; 0,5 мл БМКГ отдельно или с 1x106 МСК ЖТч; 0,5 мл ПРС без сыворотки с 5 мг ДХс отдельно или с 1x106 МСК ЖТч (клетки смешивали с носителем за 3 часа до введения). Правый коленный сустав служил положительным контролем (модель ОА). Для сравнительного анализа были использованы интактные кролики - 1 группа (2 головы, 4 сустава).

Перед внутрисуставным введением образцов кроликов опытных групп однократно иммуносупрессировали Сандиммуном (содержание активного вещества циклоспорина 50

мг/мл) в дозе 5 мг/кг [217]. Для обезболивания при внутрисуставном введении образцов использовали лидокаин-спрей. Продолжительность наблюдения за животными после внутрисуставного введения образцов составляла около 2 месяцев. Общая продолжительность эксперимента —110 суток. Для подтверждения развития артрита и его перехода в артроз были проведены клинические, гематологические, рентгенологические и гистологические методы исследования [ 217].

Температуру измеряли локально на обоих коленных суставах кроликов с помощью бесконтактного термометра. Окружность коленных суставов определяли с помощью сантиметровой ленты. Для подтверждения наличия артрита у кроликов в крови определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и количество лейкоцитов. Забор крови производили из краевой вены уха после 18 часов голодания [217]. Рентгенологические исследования были выполнены на аппарате Mobilett Mira Max (Siemens, Германия) в двух стандартных взаимно перпендикулярных проекциях (прямой и боковой).

Через 2 месяца после введения тестируемых образцов была проведена эвтаназия всех животных методом введения инъекции золетила с рометаром.

Материалом для исследования служили отпрепарированные коленные суставы подопытных кроликов. Перед приготовлением гистологических препаратов суставные поверхности были оценены макроскопически (форма, контур, цвет).

Суставной блок (фрагменты костей бедра и голени вместе со структурами коленного сустава) фиксировали в 10% нейтральном формалине не менее 7 суток, декальцинировали, обезвоживали и уплотняли по общепринятой методике. Далее были изготовлены парафиновые блоки. Материал при заливке в парафин был ориентирован строго горизонтально для получения фронтальных срезов суставов. Из парафиновых блоков были приготовлены срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

2.13 Формирование клеточно-инженерных конструкций хряща в динамических

условиях

Для проведения долговременных экспериментов по «выращиванию» КИК в условиях потока нами была разработана культуральная камера для биореактора, схема которой представлена на рисунке 5. На пористую подложку нижней части держателя помещали мембраны из поликарбоната или нейлона с размером пор 5 и 10 мкм («МПНроге», Ирландия), которые удерживали носитель с клетками [247].

Рисунок 5 — Система циркуляции биореактора: 1 — резервуар с культуральной средой; 2 — культуральная камера; 3 — стерильный фильтр; 4 — перистальтический насос; 5 —коннектор; 6 — соединение коннекторов; 7 — оксигенатор; 8 — баллон с газовой смесью; 9 — датчик давления; 10 — датчик кислорода; 11 — датчик углекислого газа; 12 — датчик рН; 13 — блок отбора проб; 14 — внутреннее пространство культуральной камеры; 15 - мембрана культуральной камеры

Биореактор включал в себя две системы циркуляции [247]. К резервуару с культуральной средой 1 параллельно были подключены по две культуральные камеры 2 в каждой из двух частей (магистралей, рукавов) системы циркуляции. Резервуар с культуральной средой сообщался с атмосферой через стерильный фильтр 3 [247]. Для переноса культуральной среды применяли шланги, способные поддерживать скорость потока от 0,018 до 18 мл/мин [247]. Постоянную циркуляцию среды с заданной скоростью обеспечивали два перистальтических

насоса 4 [247]. Культуральные камеры подсоединялись к системе циркуляции при помощи коннектора 5 сверху и соединения коннекторов 6, связанного с нижней частью культуральной камеры через шланг. Культуральные камеры и резервуар со средой помещали в инкубатор, где поддерживали температуру 37°С, относительную влажность 90-100%, состав газовой смеси CO2 - 5% и О2 - 20% [247]. Емкость с культуральной средой через стерильные фильтры сообщалась с атмосферой в инкубаторе [247].

За узлом, соединяющим две культуральные камеры, по направлению течения среды, в одной из частей системы циркуляции был расположен оксигенатор 7 Hemofilter D150 (MedicaS.p.A., Италия), сообщающийся с баллоном с газовой смесью 8 и атмосферой через стерильные фильтры. На параллельной магистрали (в другой части системы циркуляции) за узлом, соединяющим две культуральные камеры, по направлению течения среды установлены последовательно датчик давления 9 PendoTECH Pressure Sensor Polycarbonate («PendoTECH», США), датчик кислорода 10 optical oxygen (O2) sensor (Polestar Technologies, Inc., США), датчик углекислого газа 11 optical carbondioxide (CO2) sensor (Polestar Technologies, Inc., США), датчик рН 12 (optical pH sensor (PolestarTechnologies, Inc., США) и блок отбора проб 13.

Датчики давления, связанные с компьютером, непрерывно регистрировали давление в системе. Содержание кислорода, углекислого газа и рН регистрируют соответствующими датчиками в постоянном режиме. Блок отбора проб позволяет не только исследовать образцы культуральной среды, но и заменять культуральную среду в условиях стерильности. Для упорядоченного размещения элементов биореактора в инкубаторе и облегчения доступа к культуральным камерам и резервуарам с культуральной средой нами был разработан штатив для крепления культуральных камер.

Цитотоксичность и матриксные свойства (способность поддерживать прикрепление, адгезию и пролиферацию клеток) мембран из поликарбоната и нейлона, используемых в качестве подложек для каркаса при проведении долговременных проточных экспериментов в биореакторе, исследовали на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 (получены из коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН») [247]. Для оценки плотности клеток образцы окрашивали 0,1%-ным раствором красителя трипанового синего [247].

Выбор оптимального размера пор в мембране, служащей подложкой для КИК был сделан по величине создаваемого давления в описываемой системе, заполненной модельным раствором [247]. Для этого в схему биореактора перед культуральной камерой устанавливали подключенный к контроллеру датчик давления с сенсором PendoTECH Pressure Sensor Polycarbonate («PendoTECH», США) [247].

Культивируемые в биореакторе КИК хряща включали 5х105 МСК ЖТч и 5 мг ДХс или 2х106 МСК ЖТч и 1 мл БМКГ.

Для определения количества клеток на единицу площади клеточного носителя в КИК, полученных в статических и динамических условиях при культивировании МСК ЖТч на микрочастицах ДХс, на микрофотографиях гистологических препаратов КИК подсчитывали количество окрашенных гематоксилином ядер и с использованием программного обеспечения для анализа изображений ImageJ (National Institutes of Health, USA) измеряли площадь скаффолда. Для расчета использовали 5 репрезентативных микрофотографий при увеличении х200.

2.14 Статистические методы анализа результатов

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel (2016).

Вычисляли показатели описательной статистики: число наблюдений, среднее арифметическое, медиану, стандартное отклонение, межквартильный разброс. Для определения статистической достоверности различий средних между выборками с нормальным распределением (согласно критерию Колмогорова-Смирнова) применяли параметрические методы (t-критерий Стьюдента), в противном случае использовали ранговые методы (U-критерий Манна-Уитни). Различия считали статистически достоверными в том случае, если уровень значимости p не превышал порогового значения 0,05.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОДИСПЕРСНОГО ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО МАТРИКСА ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА СВИНЬИ

3.1 Микронизация суставного хряща свиньи

Размер частиц носителя является важным фактором, влияющим на адгезию и рост клеток. Предыдущие исследования показали значительное снижение роста клеток на сферических носителях диаметром менее 50-70 мкм, причем больший размер частиц также имеет недостатки, такие как большое диффузное расстояние и более высокое напряжение сдвига на внешней поверхности [205]. Признано, что оптимизированный размер микроносителей для клеточной культуры колеблется от 100 до 400 мкм [54]. Причем исследования показали, что диаметр частиц ВКМ от 100 до 400 мкм является экзогенным фактором роста, стимулирующим хондрогенез МСК [205]. В связи с этим были отработаны режимы получения мелкодисперсных фрагментов хрящевой ткани свиньи методом криопомола при сверхнизкой температуре с выделением фракции 100-400 мкм.

Помол предварительно измельченных фрагментов хряща производился с использованием криомельницы в камере, охлаждаемой жидким азотом (-196°С). Размер фрагментов хряща при предварительном измельчении оказывал значительное влияние на конечный результат. Оптимальным для получения гомогенного порошка был признан размер фрагментов, не превышающий 5х5х1 мм. Для выделения фракции требуемого размера использовали последовательное пропускание суспензии микрочастиц в дистиллированной воде через сита с размером пор 500, 250 и 100 мкм. Было изучено влияние количества циклов встряхивания размольного стакана на изменение характера распределения частиц хряща по размерам (таблица 5).

Таблица 5 — Влияние режима помола на размер частиц

Режим помола Описание

5 циклов 25 Гц по 2 минуты, между циклами охлаждение 1 минута 5 Гц в помоле преобладают частицы, проходящие через сито с диаметром пор 100 мкм

4 цикла 25 Гц по 2 минуты, между циклами охлаждение 1 минута 5 Гц в помоле преобладают частицы, проходящие через сито с диаметром пор 100 мкм

3 цикла 25 Гц по 2 минуты, между циклами охлаждение 1 минута 5 Гц в помоле преобладают частицы, проходящие через сито с диаметром пор 100 мкм

2 цикла 25 Гц по 2 минуты, между циклами охлаждение 1 минута 5 Гц в помоле преобладают частицы, проходящие через сито с диаметром пор 250 мкм и задерживающиеся на сите с диаметром пор 100 мкм

1 цикл 25 Гц по 2 минуты в помоле преобладают частицы, проходящие через сито с диаметром пор 500 мкм и задерживающиеся на сите с диаметром пор 250 мкм

Фракцию микрочастиц с требуемыми размерами можно выделить в зависимости от выбора режима помола. Для работы был выбран режим, включающий 2 цикла 25 Гц по 2 минуты с охлаждением между циклами в течение 1 минуты (таблица 5).

Лазерный дифракционный анализ показал, что среднемассовый диаметр частиц хряща не превышал 220 мкм, при этом преобладали частицы с размером 161±11 мкм, что указывает на возможность инъекционного введения матрикса (рисунок 6А). Внешний вид микрочастиц

суставного хряща свиньи после помола представлен на рисунке 6Б. Яз(%)

10 50 100 500

Рагис1е 01ате1ег (цт)

А Б

Рисунок 6 — Микрочастицы суставного хряща свиньи: А — распределение микрочастиц суставного хряща свиньи по размерам в суспензии; Б — внешний вид микрочастиц суставного хряща свиньи

Как видно из рисунка 7, микрочастицы хряща имели угловатую форму с криволинейными поверхностями, плоскими гранями и острыми углами. Отметим, что максимальная длина ряда микрочастиц при исследовании СЭМ превышала среднемассовый диаметр 220 мкм и доходила до 600 мкм, что нужно учитывать при выборе иглы для внутрисуставного введения.

Рисунок 7 — Микрофотография структуры поверхности микрочастиц суставного хряща свиньи. Сканирующая электронная микроскопия в режиме BSD с использованием лантаноидного контрастирования BioREE. Размер масштабной линейки 100 мкм: 1 — пустые лакуны

Отметим, что значительная часть лакун на поверхности частиц была освобождена от клеток в результате интенсивного механического и температурного воздействия при помоле и инкубации в дистиллированной воде при фильтровании через набор сит.

3.2 Разработка способа децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи с дополнительным включением этапов физических и биологических воздействий

В ходе исследования был разработан протокол эффективной децеллюляризации фрагментов паренхиматозных органов размером (2x2x2 мм), основанный на действии буферного раствора, содержащего SDS и повышающуюся концентрацию Тритона Х-100, при перемешивании на магнитной мешалке [199]. Полученный тканеспецифический матрикс из децеллюляризованной печени свиньи сохранял волокнистую структуру ВКМ, при этом содержание ДНК в ткани снижалось до 10,3±1,5 нг/ мг ткани, что составляло лишь 0,7% от исходного количества [200]. Однако применение разработанного для паренхиматозных органов протокола к плотной хрящевой ткани не обеспечило эффективной децеллюляризации

(рисунок 8). Как видно на рисунке 8Б в образце обнаруживались клетки, хотя в отличие от исходных микрочастиц (рисунок 8А) в некоторых фрагментах наблюдали выход сохранных клеток из лакун. Применение протокола, разработанного для поджелудочной железы, включающего обработку децеллюляризующими растворами низкой и высокой ионной силы (осмотический шок) в сочетании с ПАВ также не обеспечило полноты децеллюляризации, что выражалось присутствием клеток в образце (рисунок 8В) [142]. Учитывая высокую интенсивность выбранного режима химического воздействия на ткань с использованием ПАВ, для увеличения эффективности децеллюляризации были рассмотрены варианты включения в протокол различных физических воздействий: предварительная лиофилизация, резкое изменение температуры, обработка в ск-СО2, УЗ.

В Г

Рисунок 8 — Гистологическая картина микрочастиц суставного хряща свиньи без обработки (А), с обработкой поверхностно-активными веществами (Б), децеллюляризующими растворами низкой и высокой ионной силы (осмотический шок) в сочетании с поверхностно-активными веществами (В), поверхностно-активными веществами с предварительной лиофилизацией (Г). Окрашивание гематоксилином и эозином: 1 — ядерный материал, 2 — нарушение структуры матрикса. Ув. х100

Была выдвинута гипотеза, что удаление воды из ДХс вследствие лиофилизации до начала обработки растворами ПАВ может способствовать ускорению и повышению эффективности децеллюляризации за счет снятия диффузных затруднений для проникновения активных ингредиентов в объем матрикса. Как видно на рисунке 8Г предварительная лиофилизация микрочастиц хряща перед обработкой ПАВ привела к освобождению значительного числа микрочастиц от клеток. Однако в микрочастицах, лишенных клеток, визуализировали разволокнение ВКМ. Полученный результат стал причиной отказа от включения лиофилизации в протокол децеллюляризации перед обработкой ПАВ.

3.2.1 Резкие изменения температуры с обработкой ДНКазой

На рисунке 9 продемонстрированы результаты определения количества децеллюляризованных и недецеллюляризованных микрочастиц ДХс в образцах, полученных при сочетании разного количества циклов замораживания/оттаивания с инкубацией в ПАВ.

■ недецеллюляризованные микрочастицы ■ децеллюляризованные микрочастицы

■ полностью децеллюляризованные микрочастицы

Рисунок 9 — Влияние количества циклов замораживание/оттаивание и последующей обработки поверхностно-активными веществами на полноту децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи

Как видно из рисунка 9, количество недецеллюляризованных микрочастиц значимо уменьшалось после использования 2 циклов замораживание/оттаивание в комбинации с ПАВ (64±4%) по сравнению с отдельным действием ПАВ (78±10%). Отметим, что минимальное количество частиц, содержащих многочисленные клетки, выявляли при комбинации 10 циклов замораживание/оттаивание с воздействием ПАВ (8±2%). При этом количество полностью децеллюляризованных микрочастиц возрастала с увеличением циклов замораживание/оттаивание и достигало максимума (88±9%) к 10 циклам. При этом значения для режимов с 8, 9 и 10 циклами значимо не различались.

Заметим, что доля микрочастиц, содержащих отдельные клетки, вносила минимальный вклад при всех изученных режимах. присутствовало при 6 и 7 циклах замораживание/оттаивание, а минимальное их количество обнаружили в образцах, чья обработка включала 10 циклов замораживание/оттаивание 5±1%.

Из полученных результатов следует, что комбинированный метод децеллюляризации хряща свиньи, включающий 10 циклов замораживание/ оттаивание с последующей обработкой ПАВ приводит к снижению количества недецеллюляризированных частиц в 7 раз и возрастанию доли децеллюляризованных частиц в 6,8 раз по сравнению с действием ПАВ в отдельности.

На рисунке 10 приведены результаты децеллюляризации микрочастиц хряща под действием 10 циклов замораживание/оттаивание с последующей обработкой растворами ПАВ.

Рисунок 10 — Децеллюляризованный хрящ свиньи, полученный с использованием последовательной обработки микрочастиц суставного хряща свиньи 10 циклами замораживание/оттаивание и растворами поверхностно-активных веществ. Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. х200

Как видно из рисунка 10, в большинстве частиц, обработанных с применением комбинированного метода, клетки не обнаруживаются. Однако, следует отметить, что среди

полностью децеллюляризованных микрочастиц все же визуализировали немногочисленные фрагменты, содержащие сохранный ядерный материал.

Для окончательной децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи, полученных с применением комбинированного метода (замораживание/оттаивание и воздействие ПАВ), нами было предложено использовать обработку частиц раствором ДНКазы, применяющуюся для удаления остаточных количеств сохранившейся ДНК [144].

В образцах, полученных при последовательной обработке хряща растворами ПАВ и раствором ДНКазы, количество децеллюляризованных фрагментов составило 71±12%. В случае использования комбинации замораживание/оттаивание и обработки ПАВ с инкубацией микрочастиц хряща в растворе ДНКазы, уже начиная с применения 3 циклов замораживание/оттаивание фрагментов, содержащих клетки, в образцах не определяли. Отметим, что уменьшение циклов замораживание/оттаивание приводило к появлению одиночных центров флуоресценции. Основываясь на полученных данных, в качестве оптимального протокола децеллюляризации выбрали сочетание 3 циклов замораживание/оттаивание и последовательной инкубации микрочастиц хрящевой ткани в растворах ПАВ и в растворе ДНКазы.

Количественный анализ показал, что матрикс децеллюляризованного суставного хряща свиньи был в значительной степени ф <0,05) очищен от ДНК: содержание ДНК снизилось с 366,9±53,0 нг/мг ткани до 9,1±1,1 нг/мг ткани (Рисунок 11).

450

я

я

«

и н

Ь 400

"и а

Н

£ 350

О Н

н и й>

р зоо

Я 15

о

Рисунок 11 — Анализ количества ДНК в нативной (1) и децеллюляризованной ткани (2) суставного хряща свиньи (децеллюляризация включала 3 цикла замораживание/оттаивание и последовательную инкубацию в растворах поверхностно-активных веществ и ДНКазы)

Заметим, что при использовании разработанного протокола децеллюляризации в ткани сохранилось лишь около 2,5 % ДНК, что свидетельствует о хорошей децеллюляризации и, соответственно, низкой иммуногенности полученного матрикса [144].

Полнота децеллюляризации также подтверждается окрашиванием гистологических срезов флуоресцентным красителем БАР! (рисунок 12).

А Б

Рисунок 12 — Нативный суставной хрящ свиньи (А) и микрочастицы суставного хряща свиньи после децеллюляризации (Б), включающей 3 цикла замораживание/оттаивание и последовательную инкубацию в растворах поверхностно-активных веществ и ДНКазы (Б). Окрашивание 4,6-диамиидно-2-фенилиндолом: 1— ядерный материал, 2 — пустые лакуны. Ув. х100

Как видно на рисунке 12, в нативном суставном хряще, определялась характерная флуоресценция ядер (рисунок 12А). При этом в микрочастицах децеллюляризованного матрикса ДНК не визуализировали (рисунок 12Б).

3.2.2 Сверхкритический СО2 с обработкой ДНКазой

Лиофилизованные микрочастицы хрящевой ткани свиньи под действием обработки ск-СО2 плотно соединялись в крупные конгломераты, и в процессе регидротации их не удалось перевести в мелкодисперсное состояние. В связи с этим, для обработки ск-СО2 использовали образцы без предварительной лиофилизации.

Влияние различных режимов обработки ск-СО2 на децеллюляризацию с использованием ПАВ представлены на рисунке 13.

■ недецеллюлярюованные микрочастицы ■ децеллюлярвзовавные микрочастицы

■ полностью де и ел л юля рнзованные микрочастицы

Рисунок 13 — Влияние режима обработки в среде сверхкритического СО2 на полноту децеллюляризации микрочастиц суставного хряща свиньи после обработки поверхностно-активными веществами: 1 — без обработки сверхкритическим СО2; 2 — сверхкритическим СО2 150 Бар, 8 часов; 3 — сверхкритическим СО2 300 Бар, 8 часов; 4 — сверхкритическим СО2 300 Бар, 24 часа; 5 — сверхкритическим СО2 300 Бар, 8 часов + 10% этанола; 6 — сверхкритическим СО2 300 Бар, 24 часа +10% этанола

При обработке ск-СО2 при давлении 150 Бар в течение 8 часов количество недецеллюляризованных микрочастиц значимо не изменялось, также, как и содержание частично децеллюляризованных микрочастиц. При этом количество полностью децеллюляризованных микрочастиц возрастало с 9±2% до 26±6%. Повышение давления до 300 Бар и дальнейшее увеличение продолжительности времени воздействия до 24 часов не привели к существенному изменению результатов. После 24 часов обработки заметные признаки децеллюляризации наблюдали в значительной части фрагментов. Однако даже в последнем случае эффективность децеллюляризации следует признать недостаточной, чтобы рекомендовать комбинацию из обработки ск-СО2 и ПАВ в качестве метода комплексной обработки хрящевой ткани с целью получения децеллюляризованного тканеспецифического матрикса.

Отметим, что диоксид углерода - неполярное соединение, и для повышения эффективности удаления полярных молекул, таких как фосфолипиды клеточных мембран, обработку ткани в среде ск-СО2 проводят в комбинации с гидрофильным агентом, как правило,

этанолом [338]. Показано, что присутствие этанола при обработке ск-СО2 положительно влияло на сохранение компонентов ВКМ, таких как коллаген, ГАГ, фибронектин и ламинин, при децеллюляризации сердца [268]. Кроме того, ранее использование ск-СО2 с этанолом приводило к успешной децеллюляризации аорты, роговицы, пищевода и жировой ткани [187]. Введение этанола в состав сверхкритического флюида привело к значительному увеличению количества полностью децеллюляризованных микрочастиц и снижению не децеллюляризованных микрочастиц. Причем существенной разницы при увеличении продолжительности времени воздействия не наблюдали, количество недецеллюляризованных микрочастиц составило 26±7% и 30±8%, а полностью децеллюляризованных составило 68±8% и 63±9% для режимов, включающих 8 часов и 24 часа, соответственно (рисунок 13).

На рисунке 14 приведены результаты децеллюляризации микрочастиц хряща под действием растворов ПАВ и ск-СО2 (300 Бар 8 часов + 10% этанола).

Рисунок 14 — Децеллюляризованный хрящ свиньи, полученный с использованием последовательной обработки микрочастиц суставного хряща свиньи растворами поверхностно-активных веществ и сверхкритическим СО2 (300 Бар 8 часов + 10% этанола). Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. х200

На рисунке 14 видно, что целых клеток в образце не сохранилось. При этом в части лакун наблюдали ядерный материал, окрашенный гематоксилином.

В литературе описаны два протокола децеллюляризации суставного хряща с использованием ск-СО2. В каждый из них, кроме использования растворов ПАВ и ск-СО2, включены дополнительные этапы. Antons et al. для успешной децеллюляризации предварительно обрабатывали ткань 6 циклами замораживание/оттаивание (37°С/-80°С), раствором трипсина (24 часа) и осмотическим шоком в течение 24 часов (гипертонический

раствор 1,5 M NaCl в 10 mM Tris-HCL (pH 8) и гипотонический раствор 10 mM Tris-HCL, pH 7,6) [187]. Chen et al. сочетали ск-СО2 с последовательной инкубацией в уксусной кислоте (1%) и NaOH (0,1 Н) [266]. Отметим, что выбранные авторами дополнительные к обработке растворами ПАВ и ск-СО2 техники децеллюляризации оказывают негативное влияние на состав ткани, так как трипсин разрушает белки, а NaOH способствует удалению ГАГ [144, 339]. В связи с этим, для достижения эффективной децеллюляризации в качестве альтернативы обработке ткани трипсином, уксусной кислотой и NaOH нами была выбрана инкубация образцов в растворе ДНКазы. Нашему выбору также способствовала гистологическая картина лучшего образца, полученного с использованием ск-СО2 (рисунок 14), указывающая на сохранение в лакунах лишь ядерного материала.

Для определения оптимальной комбинации воздействий были опробованы два протокола. Первый включал обработку ДНКазой после инкубации в растворе ПАВ, но до ск-СО2, а второй предполагал воздействие ДНКазой на заключительном этапе. Результаты существенно отличались от контроля, нативной ткани (рисунок 15А), и различались между собой: в первом случае центров флуоресценции в образцах не наблюдали (рисунок 15Б), во втором случае обработка ДНКазой не оказала влияние на полноту децеллюляризации, количество не децеллюляризованных частиц составило - 25±4%, децеллюляризованных -4±1%, а полностью децеллюляризованных - 71±11%. Можно предположить, что обработка микрочастиц хряща в среде ск-СО2 с 10% этанола делает ВКМ менее проницаемым для ДНКазы.

Ж

t

;

> / »

£ I

А

Б

Рисунок 15 — Нативный суставной хрящ свиньи (А) и микрочастицы суставного хряща свиньи после децеллюляризации (Б), включающей последовательную инкубацию в растворах поверхностно-активных веществ и ДНКазы и последующую обработку в среде сверхкритическим СО2 с введением 10% этанола (давление 300 бар, время обработки 8 часов) (Б). Окрашивание 4,6-диамиидно-2-фенилиндолом: 1— ядерный материал, 2 — пустые лакуны. Ув. х100

Эффективность децеллюляризации была подтверждена количественно по содержанию ДНК (рисунок 16).

450 -|

В

а

«

а н

Ui 400 -

и к

1 2

Рисунок 16 — Анализ количества ДНК в нативной (1) и децеллюляризованной (2) ткани суставного хряща свиньи (децеллюляризация включала последовательную инкубацию в растворах поверхностно-активных веществ и ДНКазы и последующую обработку в среде сверхкритического СО2 с введением 10% этанола (давление 300 бар, время обработки 8 часов))

После выбранного протокола обработки ткань сохраняла только 18 нг/мг ткани, что составило 4,5% от исходной величины (рисунок 16).

3.2.3 Ультразвук с обработкой ДНКазой