Экспериментальные подходы к обнаружению опухолеспецифичных молекул в крови онкологических больных с использованием ДНК-аптамеров: на примере рака легкого человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Замай, Галина Сергеевна

• Замай, Галина Сергеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Замай, Галина Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современные представления о канцерогенезе

1.2. Циркулирующие опухолевые клетки и микроэмболы

1.3. Рак легкого

1.3.1. Причины развития и основные методы диагностики рака легкого человека

1.3.2. Гистологические типы рака легкого человека

1.3.3. Белковые биомаркеры рака легкого человека

1.4. Аптамеры

1.4.1. Характеристика аптамеров

1.4.2. Селекция аптамеров

1.5. Применение аптамеров в онкологии

1.5.1. Потенциальные возможности терапии онкозаболеваний с помощью аптамеров

1.5.2. Выявление опухолей с помощью аптамеров

1.5.3. Применение аптамеров для диагностики рака легкого человека

2. Материалы и методы

2.1. Объект исследований

2.2 Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека

2.3 Контроль селекции аптамеров с помощью электрофореза

2.4. Оценка специфичности связывания пулов аптамеров с опухолевой тканью

легкого человека методом флуоресцентной микроскопии

2.5 Оценка специфичности связывания пулов аптамеров с опухолевыми клетками легкого человека методом проточной цитометрии

2.6. Клонирование аптамеров

2.7. Секвенирование и синтез аптамеров

2.8. Выбор аптамеров, наиболее аффинных к опухолевым клеткам легкого человека

2.9 Определение специфичности связывания аптамеров с нормальной тканью легкого человека

2.10 Определение специфичности связывания аптамеров с лимфоцитами

2.11 Оценка кажущейся константы диссоциации наиболее аффиного аптамера с клетками аденокарциномы легкого

2.12 Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, связавшихся с аптамерами и антителами к цитокератинам

2.13 Выявление молекулярных мишеней, специфичных для полученных аптамеров, в периферической крови методом проточной цитометрии

2.14 Выявление молекулярных мишеней, специфичных для полученных аптамеров, в периферической крови методами конфокальной и флуоресцентной микроскопии

2.15 Анализ гистологических срезов с помощью аптамеров

2.16 Выявление потенциальных биомаркеров аденокарциномы легкого человека

2.17 Статистический анализ результатов масс-спектрометрии

3. Результаты и обсуждения

3.1 Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека и контроль селекции аптамеров с помощью электрофореза

3.2 Оценка аффинности связывания пула аптамеров с опухолевой тканью легкого человека методом проточной цитометрии

3.3 Оценка специфичности связывания пулов аптамеров с опухолевыми клетками легкого человека

3.4 Клонирование аптамеров

3.5 Секвенирование и синтез аптамеров

3.6 Выбор аптамеров, обладающих наибольшей аффинностью к опухолевым клеткам легкого человека

3.7 Определение специфичности связывания аптамеров с нормальными клетками легкого человека

3.8 Определение специфичности связывания аптамеров с лимфоцитами

3.9 Оценка кажущейся константы диссоциации наиболее аффинного клона аптамеров

3.10 Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, связавшихся с аптамерами и антителами к цитокератинам

3.11 Выявление опухолевых элементов в крови больных раком легкого человека

3.12 Анализ гистологических срезов с помощью аптамеров

3.13 Выявление мишеней аптамеров - потенциальных биомаркеров рака легкого

4. Заключение

5. Выводы

6. Благодарности

7. Библиографический список

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

PJI - рак легкого

MPJI - мелкоклеточный рак легкого

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

ЦОК - циркулирующие опухолевые клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота

dNTP - дезокситрифосфаты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

Kd - константа диссоциации

PBS - фосфатный буфер

SELEX - Системная Эволюция Лигандов Экспоненциальным Обогащением

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальные подходы к обнаружению опухолеспецифичных молекул в крови онкологических больных с использованием ДНК-аптамеров: на примере рака легкого человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Среди всех видов онкозаболеваний рак легкого (PJT) является наиболее распространенной формой злокачественных новообразований (Пономарева A.A., 2011). Он затрагивает более миллиона людей по всему миру (Артамонова Е.В., 2011) и составляет около 25 % всех смертей от рака (Arya S.K., 2011; Sung H.J., 2008). Относительная пятилетняя выживаемость пациентов при раке легкого очень низка, она составляет 13-15% для развитых стран (Fiorentino F.P., 2011) и 9% для развивающихся (Шевченко В.Е., 2007).

Для клинической диагностики рака легкого в настоящее время применяют такие традиционные методы, как профилактическая флюорография компьютерная, магнитно-резонансная и позитронно-эмиссионная томографии, фибробронхоскопия, флюоресцентная эндоскопия и медиастиноскопия (Трахтенберг А.Х, 2008).

Однако, несмотря на разнообразие существующих методов диагностики, основная масса больных выявляется в IV стадии заболевания, когда исход лечения уже является неблагоприятным (Chen H.W., 2008; Hoffman P.C., 2000; Mulshine J.L., 2005; Spiro S., 2005). На сегодняшний день выявляемость больных с I-II стадиями составляет 26,5%, а больных с III-IV стадиями - около 66,4% (Левченко Е.В., 2006; Чиссов В.И., 2009). При этом 5-летняя выживаемость после лечения I стадии PJI соответствует 70%, а IV стадии - менее 5% (Левченко Е.В., 2006).

Перспективным направлением для диагностики и мониторинга терапии онкологических заболеваний является оценка уровня опухолевых клеток, микроэмбол и апоптотических телец в крови пациентов (Punnoose Е. А., 2012). Основными маркерами циркулирующих опухолевых клеток являются цитокератины (белки промежуточных филаментов цитоскелета) и молекулы клеточной адгезии (ЕрСАМ) (Joosse S. А., 2012). Однако цитокератин и ЕрСАМ

относятся к эпителиальным антигенам, в результате чего специфичные для них антитела связываются с эпителиальными клетками неопухолевой природы, которые могут попадать в кровоток в результате воспалительных процессов или после хирургических вмешательств. В ходе развития злокачественной опухоли, трансформированные клетки претерпевают ряд преобразований, в которые входит потеря клетками эпителиальных антигенов, в результате чего часть клеток не выявляется (Paterlini-Brechot Р., 2007). Вследствие этого использование антител к цитокератинам и молекулам клеточной адгезии может снизить точность диагностики онкологических заболеваний.

Для выявления опухолеспецифичных мишеней могут использоваться аптамеры - одноцепочечные ДНК- или РНК-олигонуклеотиды, которые, благодаря уникальным конформациям и пространственному расположению зарядов, имеют высокую специфичность и сродство к заданным мишеням (Кульбачинский А.В., 2006). Аптамеры получают из ДНК- или РНК-библиотек путем технологии селекции (SELEX) (Ellington A.D., 1990), позволяющей осуществлять направленный отбор олигонуклеотидов к большому спектру биологических мишеней - от вирусных частиц до целых клеток. Благодаря высокой чувствительности аптамеров (Iliuk А., 2011) можно с их помощью определять наличие циркулирующих раковых клеток или продуктов распада опухоли в крови больных онкологическими заболеваниями.

Аптамеры, специфичные для опухолей различных типов, обычно подбираются к целым раковым клеткам или рекомбинантным опухолевым белкам. В литературе описана селекция аптамеров к клеточным культурам некоторых гистологических типов PJÏ и показана потенциальная возможность их применения для детекции раковых клеток легкого (Zhao Z., 2009; Chen H. W., 2008; Kunii T., 2011). Однако аптамеры, подобранные к целым раковым клеткам, являются специфичными только к поверхностным белкам, находящимся на клеточной мембране.

В крови больных онкологическими заболеваниями присутствуют не только

циркулирующие опухолевые клетки, но и некротические клетки, экзосомы, мембран-высвобожденные микрочастицы, апоптотические тельца, микроэмболы, продукты распада опухоли, содержащие большое количество внутриклеточных молекул-мишеней. Возможность детекции в крови больных большего спектра молекулярных мишеней с помощью аффинного и специфичного к ним пула аптамеров существенно расширяет диагностические возможности и создает предпосылки для разработки более чувствительных методов выявления ранних стадий онкологических заболеваний.

Цель работы - получение аптамеров на основе одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов к тканям аденокарциномы легкого человека' и экспериментальное обоснование возможности их использования для выявления опухолеспецифичных молекул в образцах периферической крови больных. Задачи:

1. С помощью технологии 8ЕУЕХ провести селекцию одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов к опухолевой ткани легкого человека и выбрать наиболее специфичный и аффинный пул аптамеров.

2. Разделить пул аптамеров на отдельные клоны с помощью бактериального клонирования, произвести секвенирование отдельных клонов аптамеров и на его основе осуществить синтез искусственных аптамеров.

3. Изучить свойства синтетических ДНК-аптамеров и выделить из них аптамеры, наиболее аффинные и специфичные к опухолевой ткани легкого человека.

4. Показать принципиальную возможность выявления циркулирующих опухолевых клеток и продуктов распада опухолевой ткани в образцах периферической крови с помощью аптамеров.

5. Определить белковые биомаркеры рака легкого методом аффинного обогащения с помощью аптамеров.

Научная новизна исследования

1. Впервые проведена селекция аптамеров к тканям послеоперационного

материала рака легкого человека (адеиокарцинома легкого) с применением негативной селекции к условно здоровым тканям легкого и цельной крови здорового человека.

2. Получен уникальный пул аптамеров с высокой аффинностью и специфичностью к ткани аденокарциномы легкого человека.

3. Разработана новая методика выявления циркулирующих опухолевых клеток, циркулирующих опухолевых микроэмбол и апоптотических телец в периферической крови больных раком легкого человека.

4. Впервые методом аффинного обогащения с помощью аптамеров определены новые молекулы-кандидаты в биомаркеры аденокарциномы легкого.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представление о возможности использования аптамеров для диагностики онкологических заболеваний.

Разработанный алгоритм селекции аптамеров и определения их специфичности к белкам-биомаркерам опухолевых клеток может быть применен для разработки диагностических тест-систем на основе аптамеров. Модификация стандартной технологии селекции аптамеров к опухолевым тканям легкого, описанная в работе, может быть применена для получения аптамеров для диагностики других раковых опухолей.

Практическая значимость работы заключается в том, что на основе полученных уникальных последовательностей ДНК аптамеров к опухолевым тканям легкого может быть разработан метод ранней диагностики рака легкого человека.

Положения, выносимые на защиту

1. С помощью модифицированной технологии се11-8ЕЬЕХ получены высокоаффинные и специфичные ДНК-аптамеры к тканям аденокарциномы легкого человека.

2. Пул ДНК-аптамеров 10-го раунда селекции является наиболее аффинным и специфичным к опухолевым клеткам аденокарциномы.

3. ДНК-аптамеры клона 18_80 обладают высоким сродством к своей мишени. Кажущаяся константа диссоциации аптамера 18_80 лежит в наномолярном диапазоне.

4. Синтетические ДНК-аптамеры с флуоресцентной меткой позволяют идентифицировать циркулирующие опухолевые клетки, их апоптотические тельца и микроэмболы в образцах периферической крови больных раком легкого.

5. Потенциальным биомаркером аденокарциномы является белок катепсин D, являющийся мишенью для аптамеров клона 183_80.

Степень достоверности результатов

Результаты получены на современном оборудовании с использованием стандартизированных методик и программ.

Внедрение результатов исследования

Методический материал по селекции аптамеров включен в курс лекций по биотехнологии для студентов 5 курса фармацевтического факультета КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Полученные аптамеры и методики используются в научно-исследовательской работе лаборатории на базе НИИ Молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Апробация результатов исследования

Результаты исследования были представлены на международном научном семинаре с молодежной школой "Биотехнология новых материалов и окружающая среда" (2011); на конференции молодых ученых в ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» (2012); на всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (2012); семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (2012-2013); на международной конференции в Тайвани «13th Tetrahedron Symposium» (2012); на международной

конференции в Италии «9nt Annual Meeting of the Oligonucleatide Therapeutics Society» (2013); на международной конференции в Англии «1st International Symposium and Exibition Aptamers 2014» (2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе, 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в зарубежном журнале.

Объем и структура работы

Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирован 36 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, глав: обзор литературы; материалы и методы; результаты собственных исследований; обсуждения; выводов; списка литературы. Список литературы состоит из 162 источников, из которых 32 российских и 130 зарубежных.

Личный вклад автора

Автором было принято непосредственное участие в планировании экспериментов, самостоятельно сформулирована научная гипотеза, лично проведены исследования и анализ полученных результатов. Публикации по результатам исследований были написаны совместно с коллегами творческого коллектива лаборатории. Все главы диссертации были написаны автором самостоятельно.

Масс-спектрометрические исследования были проведены ассистентом кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Глазыриным Ю.Е.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственный контракт № 16.512.11.2090).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления о канцерогенезе

Канцерогенез представляет собой сложный многостадийный процесс с участием экзогенных (окружающая среда, образ жизни) и эндогенных (генетических, гормональных, иммунологических) факторов и их сочетаний с изменением генетического материала клеток организма и нарушениями в системе иммунитета (Никитин Ю.П., 2012).

Современные представления о канцерогенезе базируются на взаимосвязи молекулярно-генетической и тканевой теории канцерогенеза (Дзасохов A.C., 2012). Согласно молекулярно-генетической теории, причиной трансформации клетки в злокачественную, является активация протоонкогенов - нормальных генов клеток, участвующих в регуляции процессов их роста и дифференцировки, под действием химических, биологических и физических факторов (Дзасохов A.C., 2012). Активация протоонкогенов и их превращение в клеточные онкогены (гены клеток, продукты которых участвуют в опухолевой трансформации клеток) происходит при опухолевом росте и в ходе эмбриогенеза. Некоторые протоонкогены активируются также при пролиферации или дифференцировке клеток в очагах репаративной регенерации (Коган Е.А., 2002). Одним из факторов возникновения канцерогенеза может являться и потеря клеткой антионкогенов или генов-супрессоров рака - генов клеток, тормозящих пролиферацию клеток и обладающих антионкогенным действием (Коган Е.А., 2002). Активация протоонкогенов или инактивация антионкогенов происходит под действием различных канцерогенных агентов, которые вызывают повреждения генома клеток и приводят к развитию канцерогенеза (Коган Е.А., 2002).

Вторым необходимым условием канцерогенеза, помимо изменения свойств самой клетки, является нарушение тканевого гомеостаза (Дзасохов A.C., 2012). Одной из предпосылок к возникновению тканевой теории канцерогенеза стало то, что рак может возникать только на тканевом уровне биологической организации

(Soto А. M., 2011). Теория тканевого канцерогенеза, в отличие от молекулярно-клеточной теории, говорит о том, что злокачественная трансформация является обратимым процессом (Дзасохов A.C., 2012), при котором взаимодействие нормальных тканей с неопластическими может привести к их нормализации (Soto А. М., 2011; Sonnenschein С., 2008). Для своего роста опухоль требует снабжения кислородом и питательными веществами, что достигается путем создания микроциркуляции (Абелев Г.И., 2008). В результате деструкции гидродинамического звена сосудисто-тканевого обмена на уровне микроциркуляции возникают нарушения тканевого гомеостаза организма (Дзасохов A.C., 2012).

Возникновению опухоли способствует и нарушение клеточного цикла, которое приводит к самодостаточности в пролиферативных сигналах, в результате чего происходит индукция и преимущественная пролиферации клеток-предшественников определенных опухолей (Абелев Г.И., 2008). В результате мутаций, активирующих протоонкогены, возникают генетические изменения вызывающие перманентную стимуляцию сигнальных путей, активирующих образование комплексов циклинов D с Cdk4 или Cdk6 (в зависимости от типа клеток), что приводит к переходу клетки из состояния покоя G0 в фазу подготовки к синтезу ДНК Gl (Копнин Б.П., 2002).

Одной из предпосылок к развитию канцерогенеза являются и мутационные изменения, которые могут возникать вследствие канцерогенного влияния курения и воздействия на организм некоторых веществ, связанных с профессиональной деятельностью (Vineis Р., 2010). Мутации могут являться и следствием воздействия на организм вирусов, таких как, например, вирус папилломы человека, вызывающий рак шейки матки и вирус гепатита, ассоциированный с раком печени (Sell S., 2010).

Приводить к изменению функции генов и злокачественной трансформации клетки может также нарушение эпигенетических процессов (Sharma S., 2010). Эпигенетическая модель возникновения рака предполагает, что развитию болезни

могут способствовать, в том числе, наследственные изменения, влияющие на экспрессию генов, но не вызванные мутациями в ДНК (Baker S. G., 2010). Некоторые факторы риска развития рака (режим питания, ожирение, гормоны, резистентность к инсулину) могут действовать на организм не через структурные изменения в ДНК, а через функциональные и эпигенетические изменения (Vineis Р., 2010). В эпигенетические изменения, происходящие при канцерогенезе, входят метилирование ДНК, модификация гистонов, нуклеосомное позиционирование, специфическая экспрессия микроРНК и др. (Sharma S., 2010).

Таким образом, различные генетические и эпигенетические мутации приводят к изменению антигенов, экспрессируемых опухолью в динамике опухолевой прогрессии.

1.2 Циркулирующие опухолевые клетки и микроэмболы

Циркулирующие опухолевые клетки являются эпителиальными клетками карцином, попадающими в кровоток в ходе развития злокачественного новообразования.

Клетки карцином характеризуются прогрессирующим снижением межклеточной адгезии и повышением миграционных способностей, вследствие чего инициированная клетка уже на самых ранних стадиях канцерогенеза может разрушить базальную мембрану и проникнуть в кровоток (Ковалев A.A., 2012).

В нормальных условиях эпителиальные ткани, поддерживающиеся сильными межклеточными взаимодействиями, характеризуются высокой структурной целостностью - внешний эпителий выполняет. роль защитного барьера от окружающей среды, а внутренний эпителий создает определенные, физиологически управляемые субдомены внутри организма (Radisky D. С., 2005).

На стадии развития опухоли после активации протоонкогенов (Src, Ras) запускаются скрытые эмбриональные программы, в результате которых клетка теряет набор эпителиальных антигенов и приобретает мезенхимальные (Ковалев

A.A., 2012). Мезенхимальные клетки имеют меньшую структурную организацию во внеклеточном матриксе (Thiery J. P., 2009; Paterlini-Brechot P., 2007) и более низкий уровень взаимодействий друг с другом, поэтому могут обладать подвижностью (Paterlini-Brechot Р., 2007).

Во многих первичных опухолях с агрессивными свойствами межклеточная адгезия часто уменьшена из-за потери Е-кадгерина, прямого посредника взаимодействий межклеточной адгезии (цитоплазматический домен Е-кадгерина соединен через а-катенин и ß-катенин с актином цитоскелета; одно из свойств актина состоит в том, чтобы поддержать соединения клетки) (Chiang A.C., 2008). Состояние, при котором опухолевые клетки теряют свои эпителиальные антигены, приобретая свойства мезенхимальных клеток, называется эпителиально-мезенхимальным переходом (Paterlini-Brechot Р., 2007).

Эпителиально-мезенхимальный переход представляет собой ряд событий, в ходе которых изменяются взаимодействия клеток друг с другом и внеклеточным матриксом, в результате чего эпителиальная клетка реорганизует свой цитоскелет, приобретая способность двигаться через внеклеточный матрикс и высвобождаться из окружающей ткани. Для поддержания мезенхимального фенотипа в клетке запускается новая транскрипционную программа (Radisky D. С., 2005). Эпителиально-мезенхимальный переход, благодаря которому осуществляются быстрые морфогенетические изменения при эмбриогенезе и инвазии опухолевых клеток, индуцируется транскрипционным фактором «Twist» (Yang J., 2006). «Twist» может активировать антиапоптотическую программу, что позволяет эпителиальным клеткам приобретать свойства мезенхимальных, избегая при этом аноикоз (форму апоптоза, вызванную разрывом межклеточных взаимодействий и взаимодействий клеток с матриксом) (Yang J., 2006).

Экспериментальным путем было установлено, что один грамм опухолевой ткани может высвобождать в кровь около миллиона клеток в сутки (Chang Y.S., 2000). Однако большая часть (85%) опухолевых клеток, попавших в кровоток, погибает, превращаясь в апоптотические тельца в течение 5 минут после

интравазации (Ковалев A.A., 2012). Выжившие в кровотоке устойчивые к аноикозу клетки меняют свои гемодинамические и метаболические свойства и могут обнаруживаться в крови в виде единичных циркулирующих опухолевых клеток, а также в виде циркулирующих опухолевых микроэмбол (Ковалев A.A., 2012). На 100 миллионов лимфоцитов и 50 биллионов эритроцитов (в 10 мл крови онкологического больного) может приходиться очень малое (порядка 10) количество циркулирующих опухолевых клеток и микроэмбол (Paterlini-Brechot Р., 2007).

При распаде апоптотических телец, а также при распаде и метаболизме опухолевых очагов и (микро)метастаз могут образовываться мембранные частицы: микровезикулы, экзосомы, протеасомы и нуклеосомы, в составе которых могут находиться циркулирующие опухолевые ДНК или микроРНК (Kosaka N., 2008; Taenzer А., 2012).

Было показано, что микроРНК, присутствующие в периферической крови, плазме и мокроте людей больных онкологическими заболеваниями и здоровых людей могут являться потенциальными опухолевыми маркерами (Kosaka N., 2008). Циркулирующие микроРНК чаще всего включены в состав липидных и липопротеиновых комплексов, таких как апоптотические тельца, а также: в микровезикулы, экзосомы и протеасомы, вследствие чего являются достаточно стабильными (Kosaka N., 2008).

Циркулирующие опухолевые ДНК могут находиться в составе апоптотических телец, мембранных пузырьков (микровезикул и экзосом) (Lee Т. Н., 2011; Kahlert С., 2013) и нуклеосом (Alix-Panabieres С., 2012). В биологических жидкостях больных онкологическими заболеваниями концентрация свободно циркулирующей опухолевой ДНК повышается по сравнению со здоровыми людьми (Alix-Panabieres С., 2012).

Ниже представлена таблица по сравнительной характеристике известных на настоящий момент опухолевых маркеров клеточного происхождения, а также мембранных частиц, протеасом и нуклеасом.

Таблица 1. Сравнительная характеристика известных на настоящий момент опухолевых маркеров клеточного происхождения, а также мембранных частиц,

протеасом и нуклеасом.

Компоне нты опухолев ых клеток Происхожд ение Размер, Jim Структура Опухоле-специфичные молекулы

Маркеры клеточного происхождения

Микроэм болы Интравазаци я из трансформир ованной ткани в сосудистое русло (ВгесЬсЛ Р., 2007) 20-130 (Krebs G, 2012) Три или более опухолевых клеток (Krebs G., 2012), циркулирующих в крови, объединенных вместе, и имеющих пролиферативный потенциал (Paterlini— Brechot Р., 2007). Опухолевая микроэмбола может вкючать до 45 клеточных ядер (Krebs G., 2012) Цитокератины (Ковалев A.A., 2012), HER-2, металлопротеиназы, EGFR, uPAR, а-фетопротеин (Paterlini-Brechot Р., 2007), ЕрСАМ (Sieuwerts А. М., 2009)

Циркули рующие опухолев ые клетки Интравазаци я из трансформир ованной ткани в сосудистое русло (ВгесЬо! Р., 2007) >10 (Krebs G., 2012) Клетки с измененным размером и формой, наблюдается плеоморфизм клеток и ядер, гиперхромазия и гиперплоидность, увеличенная митотическая активность (Ковалев A.A., 2012).

Апоптот Погибшие в 0,5 -2 Содержат цитозоль,

ические тельца

сосудистом русле

циркулирую щие

опухолевые клетки

(Kosaka N.. 2008)

деградированные белки и ДНК, органеллы, внутриклеточные мембранные структуры и фрагменты ядра, которые могут выходить во внеклеточное пространство (Nunez R., 2010)

Мембранные частицы, протеасомы и нуклеасомы

0,1-1 Мембранные

(Kosaka пузырьки,

N., 2008) медиаторы

межклеточных

взаимодействий

(Yuan А., 2009),

могут содержать

циркулирующие

опухолевые РЕК

(Kosaka N., 2008) и

ДНК (Lee Т. Н.,

2011)

1010J - Мембранные

100-10"3 пузырьки

(Nobuyos эндоцитарного

hi Kosaka, происхождения,

2008) могут содержать

циркулирующие

опухолевые ДНК и

РНК (Kahlert С.,

2013)

50-10"3 - Высокомолекулярны

500-10"3 й белковый

Микрове зикулы

Экзосом ы

Могут

появляться

из

апоптотиче ских телец, первичной опухоли или

(микро)мета стаз

(Таепгег А., 2012), находятся в плазме или сыворотке крови, цельной крови, (КоБака К, 2008)

Протеасо

Циркулирующая опухолевая ДНК-(Alix-Panabieres С., 2012):

Метилированная ДНК, которая может кодировать белки семейства Ras (RASSF1A)

RASSF1A, RAR-P2, ESR1

Циркулирующая опухолевая РНК (Kosaka N., 2008):

miR-155, miR-210 and miR-21(лимфoмa) B-cell lymphoma,

miR-141

(предстательная

мы (Kosaka N., 2008) комплекс, служащий для направленной деградации белков в эукариотических клетках (Бачева A.B., 2009), может содержать циркулирующую опухолевую РНК (Kosaka N., 2008) железа), miR-21, -92, -93, -126 and -29а(НМРЛ), miR-92a (лейкемия), miR-195, miR-155 (мол.жел), miR-17-5p, miR-21, miR-106a, and miR-106b (желудок), miR-210 (поджел желез), miR-184(МРЛ) miR-17-Зр and miR-92(колоректальный), miR-500 (гепатоцелюлярная карцинома), miRT21, miR-210, miR-155, and miR-196a (аденокарциномы протоков поджелудочной железы)

Нуклеасо мы ll-lO-3 (Catherine Alix-Panabiere s, 2012) Комплекс, состоящий из двухцепочечной ДНК длиной около двухсот пар оснований и набора молекул гистонов, вокруг которого дважды обвита эта ДНК (Ленинджер А., 1985), может являться транспортной единицей циркулирующей опухолевой ДНК в периферической крови (Catherine Alix-Panabieres, 2012)

Единичные циркулирующие опухолевые клетки в крови находятся в состоянии покоя и не делятся. Такие клетки могут проникать в различные органы (экстравазация) и некоторое время оставаться там, в виде одиночных, «спящих» клеток (дессиминированных опухолевых клеток) или подвергаться пролиферации, превращаясь в микрометастазы (Ра1егНт-Вгес1ю1 Р., 2007). При этом происходит

мезенхимально-эпителиальной переход клеток с восстановлением их эпителиальных свойств, за которым следует ангиогенез (Paterlini-Brechot Р., 2007).

Циркулирующие опухолевые микроэмболы, представляющие собой «коллективно мигрирующие» опухолевые клетки, являются апоптотически устойчивыми и имеют высокий пролиферативный потенциал (Ковалев A.A., 2012; Paterlini-Brechot Р., 2007). Они не способны к экстравазации, но могут закупоривать сосуды, разрывая стенки капилляров и давая новые метастазы (Paterlini-Brechot Р., 2007). Приобретение трансформированными клетками способности к метастазированию приводит примерно к 90% всех смертей пациентов с онкологическими заболеваниями (Wittekind С., 2005; Paterlini-Brechot Р., 2007).

Поскольку инвазия может возникать на ранних стадиях развития опухоли, специфическая и чувствительная детекция циркулирующих опухолевых клеток и микроэмбол в крови является важным методом в диагностике онкологических заболеваний (Paterlini-Brechot Р., 2007).

Основными маркерами циркулирующих опухолевых клеток и микроэмбол в крови являются цитокератины (белки промежуточных филаментов цитоскелета) и эпителиальные молекулы клеточной адгезии (ЕрСАМ) (Joosse S. А., 2012). Однако в некоторых типах опухолей экспрессия этих молекулярных маркеров может быть снижена, что затрудняет детекцию опухолевых клеток в крови (Paterlini-Brechot Р., 2007).

Существуют косвенные и прямые методы детекции опухолевых клеток в крови.

Косвенные методы используют идентификацию опухолевых клеток с помощью различных антител. Это могут быть методы детекции эпителиальных клеток с помощью антител к таким эпителиальным антигенам как ЕрСАМ, ВегЕР4, цитокератин. Для уменьшения количества ложно-положительных результатов в таких методах может использоваться идентификация лимфоцитов в образцах крови с помощью антител к CD45. В нормальном контроле количество

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Замай, Галина Сергеевна, 2014 год

7 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Абелев, Г. И. На пути к пониманию природы рака / Г.И. Абелев, Т. JL Эрайзер // Биохимия. - 2008. - Т. 73. - № 5. - С. 605 - 618

Акопов, А. Современные подходы к классификации рака легкого / А. Акопов// Врач. - 2011.- № 12.- С.7-12

Артамонова, Е.В. Основные достижения в биологии, скрининге, диагностике и лечении немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) / Е.В. Артамонова // Практическая онкология. - 2011. - Т. 12. - № 1. - С. 26-35

Бачева, А. А. Анализ фрагментации основного белка миелина под действием протеасомы / А. А. Бачева, А. В. Белогуров, Н. А. Пономаренко,

B. Д. Кнорре, В. М. Говорун, М. В. Серебрякова, А. Г. Габибов // Acta naturae. - 2009. - № 1. - С. 84-87

Бережнов A.B. Применение флуоресцентной микроскопии в исследованиях динамики Са2+ в клетках / A.B. Бережнов, В.П. Зинченко, Е.И. Федотова, В.А. Яшин // Учебно-методический центр Пущинского научного центра. Учебный центр Института биофизики клетки РАН, - 2007.

Дзасохов, A.C.. Патогенетические аспекты опухолевого роста в свете тканевой теории канцерогенеза (краткий литературный обзор) / A.C. Дзасохов // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. - Т. 19. - № 1. -

C.179-181

Ковалев, A.A. Гетерогенность циркулирующих опуолевых клеток / A.A. Ковалев, Т.В. Грудинская, Т.П. Кузнецова, К.А. Ковалев // Онкология. -2012.- Т. 14.- № 2. - С.126-129

Коган, Е.А. Молекулярно-генетические основы развития канцерогенеза / Е.А. Коган // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - Т.12. - № 3. - С. 32-36

Константинова, М.М. Саркоматоидная карцинома тимуса. / М.М. Константинова А.Г. Куницын, Д.М. Коновалов, Д.В. Рогожин, Р.Ф. Савкова,

М.А. Андреева, Д.А. Самойлов // Архив патологии - 2010. - № 2. - С. 3435

Копнин, Б.П. Неопластическая клетка: основные свойства и механизмы их возникновения. / Б.П. Копнин // Практическая онкология. -2002. - Т.З. - № 4. - С. 229-235

Кузьмин И.В. Онкология легких. - М.: Медицина, 2005. - 186 с. Кульбачинский, A.B. Методы отбора к белковым мишеням / A.B. Кульбачинский // Успехи биологической химии. - 2006. - № 46. — С. 193224

Левченко, Е.В. Скрининг рака легкого / Е.В. Левченко // Практическая онкология. - 2010. - Т. 11. - №2. - С. 88-95

Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. - Москва: Мир, 1985.-320 с.

Моисеенко, Ф.В. Новое в лекарственном лечении опухолей / В.Ф. Моисеенко // Практическая онкология. - 2012. - Т. 13. -№ 1. - С. 32-38

Никитин, Ю.П. Метаболический синдром и его компоненты как возможные модифицируемые факторы риска рака (литературный обзор) / Ю.П. Никитин, Т.Г. Опенко, Г.И. Симонова // Сибирский онкологический журнал. - 2012. - Т.50. - № 2. - С. 68-72

Полоцкий, Б. Е. Пресс-релиз. Таргетная терапия немелкоклеточного рака легкого: настоящее и будущее / Б.Е. Полоцкий. Современная онкология. - 2009. - Т. 11. -№ 1. - С. 5

Полякова, Н.В.. Флуоресцентная диагностика предопухолевых изменений в культе резецированного бронха у больных раком легкого после комбинированного лечение / Н.В. Полякова, В.А. Евтушенко, H.H. Булгакова, О.В. Черемисина // Сибирский онкологический журнал. - 2010. — №2.-С. 39-40

Пономарева А. А.. Молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака легкого / А. А. Пономарева, Е. Ю. Рыкова, Н. В. Чердынцева, Е. Л.

Чойнзонов, П. П. Лактионов, В. В. Власов // Молекулярная биология - 2011. -Т. 45.-№2.-С. 203-217

Радько, С.П. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики / С.П. Радько, С.Ю. Рахметова, Н.В. Бодоев, А.И. Арчаков // Биомедицинская химия. 2007. - Т.53. - № 1. - С. 5-24

Семиглазов, В.Ф. Таргетная терапия рака молочной железы (новые направления) / В.Ф. Семиглазов, Г.А. Дашян, В.В. Семиглазов, P.M. Палтуев, А.Г. Манихас, A.A. Бессонов, A.M. Ермаченкова, Д.Е. Щедрин, Т.Т. Табагуа, И.А. Гречухина, П.В. Криворотько, Р.В. Донских, Т.Ю.Семиглазова, В.В. Коларькова // Фарматека. - 2011. - № 7. - С. 14-20

Сергеева, Н.С. Общие представления о серологических биомаркерах и их месте в онкологии / Н.С. Сергеева, Н.В. Маршутина // Практическая онкология.-2011.-Т. 12.-№4. -С. 147-154

Синицын, В.Е. Современная магнитно-резонансная томография /,В.Е. Синицын, С.П. Морозов // Справочник поликлинического врача. — 2006 - Т. 4.-№4.

Снеговой, A.B. Значение биомарекеров для определения тактики лечения и прогноза злокачественных опухолей / A.B. Снеговой, Л.В. Манзюк// Практическая онкология.-2011.-Т. 12.-№4.-С. 166-170

Тер-Ованесов, М.Д. Карциноидные опухоли торакальной локализации - современное состояние проблемы / М.Д. Тер-Ованесов, Б.Е. Полоцкий // Практическая онкология. - 2005. - Т. 6. - № 4. _ с. 220-226

Трахтенберг А.Х, Рак легкого / А.Х. Трахтенберг, К.И. Колбанов // Атмосфера. Пульмонология и аллергология. - 2008. - № 4. - С. 3-9

Тюляндин, С.А. Перспективные подходы лекарственной терапии немелкоклеточного рака легкого / С.А. Тюляндин // - Москва: Новое в терапии рака легкого (терапия рака легкого начала XXI века). 2003. Под ред. Переводчиковой Н.И. М.: РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, 118-128

Черных, А. В. Современные механизмы лечения немелкоклеточного рака легкого / А. В. Черных // Вестник Санкт-Петербургского университета. -2009.-Т. 11. - № 2. - С. 150-163

Чиссов, В.И. Состояние онкологической помощи населению России в 2009 году / В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. - Москва: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2010.-196 с.

Шевченко, В.Е. Профилирование низкомолекулярного протеома плазмы крови для обнаружения потенциальных маркеров рака легкого / В.Е. Шевченко, Н.Е. Арноцкая, О.П. Трифонова, А.С. Дашкевич, В.А. Юрченко, Д.Г. Заридзе // Масс-спектрометрия. - 2007 - Т. 4. - №4. - С. 245-253.

Штейн Г. И. Конфокальная микроскопия: мифы и реальность / Г.И. Штейн // Школа-семинар «Конфокальная микроскопия в биологии и медицине». Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург. - 2005.

Щербина, О.В. Позитронная эмиссионная томография: роль в онкологии / О.В. Щербина, А.И. Москалец // Украинский медицинский альманах. - 2009.- Т. 12.- № 1.- С. 203-206

Aberle, D.R. The National Lung Cancer Trial: overview and study design / D.R. Aberle, C.D. Berg, W.C. Black, T.R. Church, R.M. Fagerstrom, B. Galen, I.F. Gareen, C. Gatsonis, J. Goldin, J.K. Gohagan, B. Hillman, C. Jaffe, B.S. Kramer, D. Lynch, P.M. Marcus, M. Schnall, D.C. Sullivan, D. Sullivan, C.J. Zylak // Radiology. - 2011. - V. 258. - № 1. - P.243-253.

Alix-Panabieres, C. Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA / C. Alix-Panabieres, H. Schwarzenbach, K. Pantel // Annual review of medicine. — 2012.- V. 63.-P. 199-215

Allard, W.J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases / W.J. Allard, J. Matera, M.C. Miller, M. Repollet, M.C. Connelly, C. Rao, A.G. Tibbe, J.W. Uhr, L.W. Terstappen // Clinical cancer research. - 2004. - № 10. -P. 6897-6904

Arya, S.K. Lung Cancer and Its Early Detection Using Biomarker-Based Biosensors / S.K. Arya, S. Bhansali // Chemical Reviews. - 2011. - № 111. -P.6783-6809

Authier, F. Proteolysis of glucagon within hepatic endosomes by membrane-associated cathepsin B and cathepsin D / F. Authier, J.S. Mort, A.W. Bell, B. I. Posner, J. J. M. Bergeron // The journal of biological chemistry. - 1995. -№270.-P. 15798-15807.

B. Soontornworajit, Y. Wang. Nucleic acid aptamers for clinical diagnosis: cell detection and molecular imaging / B. Soontornworajit, Y. Wang // Analytical and bioanalytical chemistry. - 2011. - №399. - P. 1591-1599

Baker, S. G. Research on Early-Stage Carcinogenesis: Are We Approaching Paradigm Instability? / S. G. Baker, A. Cappuccio, J. D. Potter, F. Hutchinson // Journal of clinical oncology. - 2010. - V. 28 - № 20 - P. 3215- 3218

Barbas, A. S. Aptamer applications for targeted cancer therapy / A. S. Barbas, J. Mi, B. M. Clary, R. R White // Future Oncology. - 2010. - V. 6. - № 7.-P. 1117-1126

Barrett A. J. Cathepsin D and other carboxyl proteinases. Proteinases in Mammalian Cells and Tissues. - 1977. - P. 209-248

Berezovski, M.V. Nonequilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures: A Universal Tool for Development of Aptamers / M.V. Berezovski, A. Drabovich, S.M. Krylova, M. Musheev, V. Okhonin, A. Petrov, S.N. Krylov // Journal of the American chemical society. - 2005. - № 127. - P. 3165-3171

Berezovski, M.V. Aptamer-facilitated biomarker discovery (AptaBID) / M.V. Berezovski, V. Lechmann, M.U. Musheev. T.W. Mak, S. N. Krylov // Journal of American chemical society. - 2008 - № 130. - P. 9137-9143.

Bidere, N. Cathepsin D triggers Bax activation, resulting in a selective apoptosis-inducing factor in T-lymphocytes entering in the early compartment phase of apoptosis / N. Bidere, H.K.Lorenzo, S. Carmona // Journal of biological chemistry. - 2003. - V. 278. - № 33. - P. 3140-3144.

Bohunicky, B. Biosensors: the new wave in cancer diagnosis / B. Bohunicky, S. A. Mousa //Nanotechnology, Science and Applications . - 2011. -№ 4. - P. 1-10

Cerchia, L. Neutralizing aptamers from whole-cell SELEX inhibit the ret receptor tyrosine kinase / L. Cerchia, F. Duconge, C. Pestourie // PLoS Biology. -2005. - V. 3 - № 4. - 697-704

Chang, A. E. In Oncology: An Evidence-Based approach / A. E. Chang, P. A.Ganz, D. F. Hayes, T. J. Kinsella, H. I. Pass, J. H. Schiller, R. M. Stone, V. J. Strecher. - Eds.; Springer: New York, 2006. - 2005 P.

Chang, Y.S. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood / Y.S. Chang, E. di Tomaso, D.M. McDonald, R. Jones, R.K. Jain, L.L. Munn // Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. - 2000. -№ 97. - P. 14608-14613.

Chen, H. W.. Molecular Recognition of Small-Cell Lung Cancer Cells Using Aptamers / H. W. Chen, C. D. Medley, K. Sefah, D. Shangguan, Z. Tang, L. Meng, J. E. Smith, W. Tan. ChemMedChem. - 2008. -№ 3. -P. 991 - 1001

Chen, X. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases / X. Chen, Y. Ba, L. Ma, X. Cai, Y. Yin, K. Wang, J. Guol, Y. Zhang, J. Chen, X. Guo, Q. Li, X. Li, W. Wang, Y. Zhang, J.Wang, X. Jiang, Y. Xiang, C. Xu, P. Zheng, J. Zhang, R. Li, H. Zhang, X. Shang, T. Gong, G. Ning, J. Wang, K. Zen, J. Zhang, C.Y. Zhang // Cell research. - 2008.- V. 18.-P. 997-1006.

Chiang, A. C. Molecular Basis of Metastasis / A. C. Chiang, J. Massague, New England Journal of Medicine. - 2008. - № 359. - P. 2814-2823

Conrad, D. H. Proteomics as a Method for Early Detection of Cancer: A Review of Proteomics, Exhaled Breath Condensate, and Lung Cancer Screening / D. H. Conrad, J. Goyette, P. S. Thomas // Journal of general internal medicine. — 2008.-V. 23.-№ l.-P. 78-84

Cox, J. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized ppb-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification / J. Cox, M. Mann // Nature biotechnology. - 2008. - V. 26. - P. 1367-1372

Da Pieve, C., Williams, P., Haddleton, D.M., Palmer, R.M.J. Missailidis, S. Modification of thiol functionalized aptamers by conjugation of synthetic polymers / C. Da Pieve, P. Williams, D.M.Haddleton, R.M.J. Palmer, S. Missailidis // Bioconjugate Chemistiy. - 2010. - № 2. - P. 169-174

Daniels, D. A. Tenascin-C Aptamer Identified by Tumor Cell SELEX: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment / D. A. Daniels, H.Chen, B. J.Hicke, K. M. Swiderek, L. A. Gold, Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. - 2003. - № 100. -P. 15416-15421.

Deiss, L.P. Cathepsin D protease mediates programmed cell death induced by interferon-gamma, Fas/APO-1 and TNF-alpha / L.P. Deiss, H. Galika, H.Berissi, O. Cohen, A. Kimchi // The EMBO journal. - 1996. - V. 15. - № 15. - P. 3861-70.

Donovan, M. J. Aptamer-Drug Conjugation for Targeted Tumor Cell Therapy. / M. J. Donovan, L. Meng, T. Chen, Y. Zhang, K. Sefah, W. Tan. Therapeutic Oligonucleotides // Methods in Molecular Biology. - 2011. - № 764. -P.141-152

Dunn A.D., Crutchfield H.E., Dunn J.T. Proteolytic processing of thyreoglobulin by extracts of thyroid lysosomes / A.D. Dunn, H.E. Crutchfield, J.T. Dunn//Endocrinology. - 1991.- V. 128. -№ 6.- P. 3073-3080.

El-Hefnawy, T. Characterization of amplifiable, circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics / T. El-Hefnawy, S. Rajal, L. Kelly, W. L. Bigbee, J. M. Kirkwood, J. D. Luketich, T. E. Godfrey // Clinical chemistry. - 2004. - V. 50. - № 3. - P. 564-573.

Ellington, A.D. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands / A.D. Ellington, J.W. Szostak // Nature. - 1990 - № 346 - P. 818-822

Ellington, A.D. Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures / A.D. Ellington, J.W. Szostak // Nature. - 1992. - № 355. - P. 850-852

Etgar, L-N. Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery / L-N Etgar, A. F. Radovic-Moreno, A. Z. Wang, R. Langerand, O. C. Farokhzad // Trends in Biotechnology. - 2008. - V. 26. - № 8. - P. 442-449

Fang, X. Aptamers Generated from Cell-SELEX for Molecular Medicine: A Chemical Biology Approach / X. Fang, W. Tan // Accounts of chemical research. - 2010. - V. 43. - № 1. - P.48-57

Fehm, T. Methods for isolating circulating epithelial cells and criteria for their classification as carcinoma cells / T. Fehm, E.F. Solomayer, S. Meng, T. Tucker, N. Lane, J.Wang, G. Gebauer // Cytotherapy. - 2005. - № 7. - P. 171185

Ferreira, C.S. DNA aptamers that bind to MUC1 tumour marker: design and characterization of MUC1-binding single-stranded DNA aptamers / C.S. Ferreira, C.S. Matthews, S. Missailidis. Tumour Biology. - 2006. - V. 27 - № 6. - 289-301 Ferreira, C.S. Phototoxic aptamers selectively enter and kill epithelial cancer cells / C.S. Ferreira, M.C. Cheung, S. Missailidis, S. Bisland, J. Gariepy // Nucleic Acids Research. - 2009. - V. 37. - № 3. - P. 866-876

Florentino, F. P. CTCF and BORIS Regulate Rb2/pl30 Gene Transcription: A Novel Mechanism and a New Paradigm for Understanding the Biology of Lung Cancer / F. P. Florentino, M. Macaluso, F. Miranda, M.Montanari, A. Russo, L. Bagella, A. Giordano // Molecular cancer research. - 2011. - № 9. - P. 225-233

Gaetano, L. Cathepsin D expression levels in nongynecological solid tumors: Clinical and therapeutic implications / L. Gaetano F. M. Tumminello, M. Crescimanno, C. Flandina, N. Gebbia // Clinical & Experimental Metastasis. -2004.-№21.-P. 91-106

Gold, L. Diversity of oligonucleotide functions / L. Gold, B. Polisky, O. Uhlenbeck, M. Yarus, // Annual review of biochemistry. - 1995. - № 64. - 763797

Gopinath, S. C. B. An RNA Aptamer That Discriminates Bovine Factor IX from Human Factor IX / S. C. B. Gopinath, D. Balasundaresan, J. Akitomi, H. Mizuno // Nucleic Acids Res. - 2008. - V. 36. -№ 21. - P. 6739-6751

Greenberg, A.K. and Lee, M.S. Biomarkers for lung cancer: clinical uses / A.K. Greenberg, M.S. Lee // Current opinion in pulmonary medicine. - 2007. -№ 13. - P. 249-255

Guo, K-T. CELL-SELEX: Novel Perspectives of Aptamer-Based Therapeutics / K-T. Guo, A. Paul, C. Schichor, G. Ziemer, H. P. Wendel // International Journal of Molecular Sciences. - 2008. - № 9. - P. 668-678

Half, E. HER-2 receptor expression, localization, and activation in colorectal cancer cell lines and human tumors / E. Half, R. Broaddus, K.D. Danenberg, P.V. Danenberg, G.D. Ayers, F.A. Sinicrope // International journal of cancer. -2004. -№ 108. - P. 540-548

Hampton, R., Walker, M., Marshall, J. Juhl, H. Differential expression of carcinoembryonic antigen (CEA) splice variants in whole blood of colon cancer patients, and healthy volunteers: implication for the detection of circulating colon cancer cells / R. Hampton, M. Walker, J. Marshall, H. Juhl // Oncogene. - 2002. -№21-P. 7817-7823

Hicke, B. J. Tumor targeting by an aptamer / B J. Hicke, A.W. Stephens, Gould T // The journal of nuclear medicine. - 2006. - V. 47. - № 4. - P. 668-678 Hoffman, P. C. Lung cancer / P. C. Hoffman, A. M. Mauer, E. E. Vokes // Lancet. - 2000. - № 355. - P.479^185.

Hosokawa, M. Size-Selective Microcavity Array for Rapid and Efficient Detection of Circulating Tumor Cells / M. Hosokawa, T. Hayata, Y. Fukuda, A. Arakaki, T. Yoshino, T. Tanaka, T. Matsunaga // Analytical chemistry 2010. - V. 82.-№ 15.-6629-6635

Huang, Y. Cancer cell targeting using multiple aptamers conjugated on nanorods / Y. Huang, H. Chang, W. Tan // Analytical chemistry. - 2008. - № 80. - P. 567-572

Huang, Y. F. Molecular Assembly of an Aptamer-Drug Conjugate for Targeted Drug Delivery to Tumor Cells / Y. F. Huang, D. Shangguan, H. Liu, J. A. Phillips, X. Zhang, Y. Chen and W. Tan. Chembiochem. - 2009. - № 10. -P. 862-868.

Hybarger, G. A microfluidic SELEX prototype / G. Hybarger, J. Bynum, R.F. Williams, J.J. Valdes, J.P. Chambers Analytical and Bioanalytical Chemistry. -2006. - V.l. -№ 384. - P. 191-198

Iliuk, A. B. Aptamer in Bioanalytical Applications / A. B. Iliuk, L. Hu, W. A. Tao. Analytical chemistry. - 2011. -V. 12. - № 83. - P. 4440-4452

Ireson, C. R. Discovery and Development of Anticancer Aptamers / C. R. Ireson, L. R. Kelland // Molecular Cancer Therapy. - 2006. - № 5. - P. 2957-2962.

Joosse S. A. Biologic Challenges in the Detection of Circulating Tumor Cells / S. A. Joosse, K. Pantel // Cancer Research. - 2012. - V. 73. - № 1. - P. 8-11

Joseph, L. Circulating Tumor Cells and Nucleic Acids for Tumor Diagnosis / L. Joseph. Molecular Pathology of Neoplastic Gastrointestinal Diseases. Molecular Pathology Library. - 2013. - V. 7. - № 229-247

Kahlert, C. Exosomes in tumor microenvironment influence cancer progression and metastasis / C. Kahlert, R. Kalluri // Journal of molecular medicine.-2013.- V. 91.-P. 431-437

Kalender, W. A. Computed tomography.Fundamentals, system technology, Image quality, applacations. 3d edition. / W. A. Kalender. - Publicis Erlangen, Zweigniederlassung der PWW GmbH, 2011 - 371 P.

Kang, W.J. Multiplex imaging of single tumor cells using quantum-dot-conjugated aptamers / W.J. Kang, J.R. Chae, Y.L. Cho, J.D. Lee, S. Kim // Small. - 2009. - № 5. - P. 2519-2522

Kang, W.J. Multiplex imaging of single tumor cells using quantum-dot-conjugated aptamers / W.J. Kang, J.R. Chae, Y.L. Cho, J. Lee, S. Kim // Small. — 2009. - № 22. - P. 2519-2522

Kosaka, N. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis / N. Kosaka, H. Iguchi, T. Ochiya // Cancer science.-2010.-V. 101. -№ 10. -P. 2087-2092

Krebs, M. G. Analysis of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer using epithelial marker-dependent and-independent approaches / M. G. Krebs, J. M. Hou, R. Sloane, L. Lancashire, L. Priest, D. Nonaka, T. H. Ward, A. Backen, G. Clack, A. Hughes, M. Ranson, F. H. Blackhall, C. Dive // Journal of Thoracic Oncology. - 2012. - V. 7. - № 2. - P. 306-315

Krebs, M. G. Evaluation and prognostic significance of circulating tUmor cells in patients with non-small-cell lung cancer / M. G. Krebs, R. Sloane, L. Priest, L. Lancashire, J.M. Hou, A. Greystoke, T. H. Ward, R. Ferraldeschi, A. Hughes, G. Clack, M. Ranson, C. Dive, F. H. Blackhall // Journal of clinical oncology.- 201 l.-V. 29. -№ 12.-P. 1556-1563.

Krylov, S.N., Non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures—appreciation of kinetics in capillary electrophoresis / S.N. Krylov, M. Berezovski Analyst. -2003. - № 128. - P. 571-575

Kunii, T. Selection of DNA aptamers recognizing small cell lung cancer using living cell-SELEX / T. Kunii, S. Ogura, M. Mie, E. Kobatake // Analyst. -2011.-№ 136.-P. 1310-1312

Lee, T. H. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer—the emerging science of cellular 'debris' / T. H. Lee E. D'Asti, N. Magnus, K. Al-Nedawi, B. Meehan, J. R. Semin // Immunopathology. - 2011. -V. 33. - P. 455-467

Li, N. Directed evolution of gold nanoparticle delivery to cells / N. Li, T. Larson, H.H. Nguyen, K.V. Sokolov, A.D. Ellington // Chemical Communications. - 2010. - V. V. 46. - № 3. - 392-394

Liu, G. Aptamer Nanoparticle Strip Biosensor for Sensitive Detection of Cancer Cells. / G. Liu, X. Mao, J. A. Phillips, H. Xu, W. Tan, L. Zeng. //Analytical chemistry. - 2009. - № 81. - P. 10013-10018

Liu, J. Functional Nucleic Acid Sensors /J. Liu, Z. Cao, Y. Lu // Chemical Reviews - 2009. - V. 109. - № 5. - P.1948-1998

Lupoid, S. E. Identification and Characterization of Nuclease-Stabilized RNA Molecules that Bind Human Prostate Cancer Cells via the Prostate-Specific Membrane Antigen / S. E. Lupoid, B. J. Hicke, Y. Lin, D. S. Coffey // Cancer Researh. - 2002. - № 62. - P. 4029-4033.

Marcy, T.W. Genetic Testing for Lung Cancer Risk / T.W. Marcy, M. Stefanek, K.M. Thompson // Journal of General Internal Medicine. - 2002. -V.17. -№ 12-P. 946-951

Marrinucci, D. Fluid biopsy in patients with metastatic prostate, pancreatic and breast cancers / D. Marrinucci, K. Bethel, A. Kolatkar, M. S. Luttgen, M. Malchiodi, F. Baehring, K. Voigt, D. Lazar, J. Nieva, L. Bazhenova, A. H. Ко, M. Korn, E. Schräm, M. Coward, X. Yang, T. Metzner, R. Lamy, M. Honnatti, C. Yoshioka, J. Kunken, Y. Petrova, D. Sok, D. Nelson, P. Kuhn // Physical biology. - 2012. - №9. - P. 1-9

McBride, L.J. An investigation of several deoxynucleoside phosphoramidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides / L.J. McBride, M.H. Caruthers // Tetrahedron letters. - 1983. - V. 24. - № 3. - P. 245-248

Medley, C. D. Aptamer-Conjugated Nanoparticles for Cancer ' Cell Detection / C. D. Medley, S. Bamrungsap, W. Tan, J. E. Smith // Analytical chemistry. - 2011. - № 83. - P. 727-734

Medley, C.D. Gold nanoparticle-based colorimetric assay for the direct detection of cancerous cells / C.D. Medley, J.E. Smith, Z. Tang, Y. Wu, S.

Bamrungsap, W. Tan // Analytical chemistry. - 2008. - V. 80. - № 4. - P. 1067-1072

Metaye, T. Begon Expression localization and thyrotropin regulation of cathepsin D in human thyroid tissues / T. Metaye, J.L. Kraimpis, J.M. Goujon, B. Fernandez, N. Quellard, P. Ingrand, J. Barbier, F. Begon // The journal of clinical endocrinology & metabolism. - 1997. - V. 82. - № 10. - P. 3383-3388.

Mi, J. In vivo selection of tumor-targeting RNA motifs / J. Mi, Y.M. Liu, Z.N. Rabbani, Z.G. Yang, J.H. Urban, B.A. Sullenger, B.M. Clary // Nature chemical biology. - 2010. - № 6. - P. 22-24

Molina, R. Pro-gastrin-relea-sing peptide (proGRP) in patients with benign, and malignant diseases: comparison with CEA, SCC, CYFRA 21-1, and NSE in patients with lung cancer / R. Molina, J.M. Auge, X. Filella, N. Vinolas, J.Alicarte, J.M. Domingo, A.M. Ballesta // Anticancer Research. - 2005. - № 25.-P. 1773-1778.

Mulshine J. L. Clinical practice. Lung cancer screening. / J. L. Mulshine, D. C. Sullivan, N. Engl. // J. Med. - 2005. - № 352. - P. 2714-2720.

Nunez R. Apoptotic volume decrease as a geometric determinant for cell dismantling into apoptotic bodies / R. Nunez, S. M. Sancho-Martinez, J. M. L. Novoa, F. J. Lopez-Hernandez // Cell Death and Differentiation. - 2010. - V. 17. - 1665-1671

Ohuchi, S.P. Selection of RNA aptamers against recombinant transforming growth factor-b type III receptor displayed on cell surface / S.P. Ohuchi, T. Ohtsu, Y. Nakamura // Biochimie. - 2006. - V. 88. - № 7. - P. 897-904

Ollinger, K. Inhibition of cathepsin D prevents free-radical induced apoptosis in rat cardiomyocites / K. Ollinger // Archives of biochemistry and biophysics. - 2000. - V. 373. -№ 2. - 346-351.

Paterlini-Brechot, P. Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions / P. Paterlini-Brechot, N. L. Benali // Cancer Letters. -2007.-№253.- P. 180-204

Petersen, I. Core classification of lung cancer: Correlating nuclear size and mitoses with ploidy and clinicopathological parameters / I. Petersen, W.F.M. Kotb, K.H. Friedrich, K. Schluns, A. Bockingc, M. Dietel // Lung cancer. - 2009. -№65.-P. 312-318

Planchard, D. Small cell lung cancer: new clinical recommendations and current status of biomarker assessment / D. Planchard, C. Le Pechoux // European Journal of Cancer. -2011. - Vol.47. -№ 3. - P.S272-283.

Porschevski, P. Using Aptamers as Capture Reagents in Bead-Based Assay Systems for Diagnostics and Hit Identification / P. Porschevski, M.A.M. Grattinger, K. Klenzke, A. Erpenbach, M. R. Blind, F Schafer. Journal of Biomolecular Screening. - 2006. - V. 7 -№ 11. - P. 773-781

Punnoose, E. A. Endpoints in a Phase II Clinical Trial of Pertuzumab and Erlotinib Small Cell Lung Cancer: Association with Clinical — in Non Evaluation of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA / E. A. Punnoose // Clinical Cancer Research. -2012. -№ 18. - P. 2391-2401

Radisky, D. C. Epithelial-mesenchymal transition / D. C. Radisky. Journal of Cell Science.- 2005.- V. 118.-№19.-P. 4325-4326

Risch A. Lung cancer epigenetic and genetics / A. Risch, C. Plass // International Journal of Cancer. - 2008. - № 123. - P. 1-7.

Roberg, K. Microinjection of cathepsin D induces caspase-dependent apoptosis in fibroblast / K. Roberg, K. Kagedal, K. Ollinger // The American journal of pathology. - 2002. - V. 161. - № 1. - P. 89-96

Robertson, D. L. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. / D. L. Robertson, G. F. Joyce // Nature. - 1990 -№. 344-P. 467-468

Rosenberg, R. Comparison of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood / Rosenberg, R. Gertler, J. Friederichs, K. Fuehrer, M. Dahm, R. Phelps, S. Thorban, H. Nekarda, J.R. Siewert // Cytometry. - 2002. - V. 49. - № 12. - P. 150-158.

Rusch, V. Surgery for bronchioloalveolar carcinoma and «very early» adenocarcinoma: an evolving standard of care? / V. Rusch, R.Tsuchiya, M. Tsuboi, H. Pass, D. Grunenwald, P. Goldstraw // Journal of Thoracic Oncology. -2006.-V.l -№ 9. - P. 27-31

Sasakia, T. In Vitro Assessment of Factors Affecting the Apparent Diffusion Coefficient of Ramos Cells Using Bio-phantoms / T. Sasakia, M. Kurodab, K. Katashimac, M. Ashidac, H. Matsuzakic, J. Asaumic, J. Murakamic, S. Ohnod, H. Katob, S. Kanazawa // Acta Medica Okayama. - 2012. - V. 66. - № 3.-P. 263-270

Scher, H.I. Circulating tumour cells as prognostic markers in progressive, castration-resistant prostate cancer: a reanalysis of IMMC38 trial data / H.I. Scher, X. Jia, J.S. de Bono, M. Fleisher, K.J. Pienta, D. Raghavan, G. Heller// The lancet oncology. - 2009. - № 10. - P. 233-239

Sefah, K. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX / K. Sefah, D. Shangguan, X. Xiong, M. B O'Donoghue, W. Tan // Nature protocols. - 2010. -V. 5.-№6.-P. 1169-1185

Sell, S. On the Stem Cell Origin of Cancer / S. Sell // The American Journal of Pathology. - 2010 - V. 176. - №. 6. - P. 2584-2594

Shao, H. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy / H. Shao, J. Chung, L. Balaj, A. Charest, D. D. Bigner, B. S. Carter, F. H. Hochberg, X. O. Breakefield, R. Weissleder, H. Lee //Nature medicine.-2012.-V. 18.-P. 1835-1840

Sharma, S. Epigenetics in cancer / S. Sharma, T. K. Kelly, P. A. Jones // Carcinogenesis. - 2010. - V. 31. - № 1. - P. 27-36

Shepherd, F. A. The International Association for the Study of Lung Cancer lung cancer staging project: proposals regarding the clinical staging of small cell lung cancer in the forthcoming (seventh) edition of the tumor, node, metastasis classification for lung cancer / F. A. Shepherd, J. Crowley, P. Van

Houtte, P.E. Postmus, D. Carney, K. Chansky, Z. Shaikh, P. Goldstraw // Journal of Thoracic Oncology. - 2007. - № 2. -P. 1067-1077

Shibata, M. Participation of cathepsin B and D in apoptosis of PC 12 cells following serum deprivation / M. Shibata, S. Kanamori, K. Isahara, Y. Ohsawaa, A. Konishia, S. Kametakaa, T. Watanabea, S. Ebisub, K. Ishidoc, E. Kominamic, Y. Uchiyama. // Biochemical and biophysical research communications. - 1998. - V 251. - № 1.- P. 199-203.

Sieuwerts, A. M. Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and the detection of circulating normal-like breast tumor cells A. M. Sieuwerts, J. Kraan, J. Bolt, P. van der Spoel, F. Elstrodt, M. Schutte, J. W. Martens, J. W. Gratama, S. Sle ijfer, J. A. Foekens, Journal of the national cancer institute. - 2009. — V. 101. -№ 1.- P. 61-66.

Simon, D. I. The fibrin(ogen)olytic properties of cathepsin D / D. I. Simon, Ezratty A.M., Loscalzo J. // Biochemistry. - 1994. - V. 33. - № 21. - P. 65556563

Simon, E. Biological and chemical sensors for cancer diagnosis / E. Simon // Measurement Science and Technology. - 2010. - № 21. - P. 1-25

Smith, J.E. Aptamer-conjugated nanoparticles for the collection and detection of multiple cancer cells / J. E. Smith, C. D. Medley, Z. Tang, D. Shangguan, C. Lofton, W. Tan // Analytical Chemistry. - 2007. - № 79. - 30753082

Sonnenschein, C. Theories of carcinogenesis: an emerging perspective. / C. Sonnenschein, A.M. Soto // Seminars in Cancer Biology/ - 2008. - № 18. - P. 372-377

Soto, A. M. The tissue organization field theory of cancer: a testable replacement for the somatic mutation theory / A. M. Soto, C. Sonnenschein. // Bioassays. - 2011 - № 33 - P.332-340

Soundararajan, S. Plasma Membrane Nucleolin Is a Receptor for the Anticancer Aptamer AS1411 in MV4-11 Leukemia Cells / S. Soundararajan, L.

Wang, V. Sridharan, W. Chen, N. Courtenay-Luck, D. Jones, E. K. Spicer, D. J. Fernandes // Molecular Pharmacology. - 2009. - № 76. - P. 984-991

Spiro, S.G. One hundred years of lung cancer / S.G. Spiro, G.A. Silvestri // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. - 2005. - V.172. -№ 5. - P. 523-529.

Sung, H. J. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics. H. J. Sung, J. Y. Cho // BMB reports. - 2008. - № 41. - P.615-625.

Sutedja, T. G. Fluorescence bronchoscopy for early detection of lung cancer: a clinical perspective / T. G. Sutedja, B. J.Venmans, E. F. Smit, P. E. Postmus // Lung Cancer. - 2001. -№ 34. - P. 157-168

Taenzer, A. Circulating tumor-derived biomarkers in lung cancer / A. Taenzer, C. Alix-Panabières, H. Wikman, K. Pantel // Journal of thoracic disease. -2012.- V. 4. - № 5. - P. 448-449

Takuma, K. Roles of cathepsins in riperfusion-induced apoptosis in cultured astrocytes / Takuma K., Kiriu M., Mori K. E. Leeb, R. Enomotob, A. Babac, T. Matsudad // Neurochemistry International. - 2003. - V. 42. - № 2. - P. 153-159 Tanaka, F. Circulating tumor cell as a diagnostic marker in primary lung cancer / F. Tanaka, K. Yoneda., N. Kondo, M. Hashimoto, T. Takuwa, S. Matsumoto, Y. Okumura, S. Rahman, N. Tsubota, T. Tsujimura, K. Kuribayashi, K. Fukuoka, T. Nakano, S. Hasegawa // Clinical cancer research. - 2009. - № 15.-P. 6980-6986.

Teresa, M. Aptamers: molecular tools for analytical applications / M. Teresa, V. C. Özalp, P. L. Sánchez, M. Mir, I. Katakis, C. K. O'Sullivan // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2008. - V. 390. - № 4. - P. 989-1007

Thiery, J. P. Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease / J. P. Thiery, H. Acloque, Y.J. Ruby, M. Huang, A. Nieto // Cell 139. -2009. - V. 139. - №5. - P. 871-890

Travis, W. D. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. / W. D. Travis. - World Health Organization, International

Agency for Research on Cancer, International Association for the Study of Lung Cancer, International Academy of Pathology (Eds), IARC Press, Oxford University Press, Lyon Oxford, 2004. - 341 P.

Tuerk, C. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase / C. Tuerk, L. Gold, // Science. -1990.- №249.-P. 505-510

UniProt, Protein database http://www.uniprot.org

Van der Stappen J.W.J. Activation of cathepsin B by a colorectal cancer cell line requires low pH and is mediated by cathepsin D / J.W.J. Van der Stappen, A.C. Williams, R.A. Maciewcz, C. Paraskeva // International journal of cancer. -1996.- V. 67. - P. 547-554

Vetvicka, V. Activation of peripheral blood neutrophils and lymphocytes by human procathepsin D and insulin-like growth factor II / V. Vetvicka, M. Fusek // Cellular immunology. - 1994. - V. 156. - №2. - 332-341

Vetvicka, V. Cathepsin D - Many functions of one aspartic protease / V. Vetvicka. P. Benes, M. Fusek // Critical Reviews in Oncology. Hematology. -2008.-№68.-P. 12-28

Vetvicka, V. Participation of the propeptide on procathepsin D activation of human peripheral lymphocytes / V. Vetvicka, J. Vetvickova, M. Fusek//Archives of biochemistry and biophysics.- 1995.- V. 322.- № 1.- 295-298

Vineis, P. Models of carcinogenesis: an overview / P. Vineis, A. Schatzkin, J.D. Potter //Carcinogenesis.- 2010. -V. 31.- № 10.-P. 1703-1709

Wilson D. S. In vitro selection of functional nucleic acids / Wilson D. S., Szostak J. W. // Annual review of biochemistry. - 1999. - № 68. - P. 611-647 Wittekind, C. Cancer invasion and metastasis / C. Wittekind, M. Neid // Oncology. -2005. -V. 69. - №1. - P. 14-16

Wu, X. Second-generation aptamer-conjugated PsMA-targeted delivery system for prostate cancer therapy. / X. Wu, B. Ding, J. Gao, H. Wang, W. Fan,

/

@ f?

X. Wang, W. Zhang, X. Wang, L. Ye, M. Zhang, X. Ding, J. Liu, Q. Zhu, S. Gao // International Journal of Nanomedicine. - 2011. - № 6 - P. 1747-1756

Xu, W. Label-Free Fluorescent Aptamer Sensor Based on Regulation of Malachite Green Fluorescence / W. Xu, Y. Lu // Analytical Chemistry. - 2010. -V. 2 - № 82. - P. 574-578

Y. Alex, E. L. Färber, A. L. Rapoport, D. Tejada, R. Deniskin, N. B. Akhmedov, D. B. Färber. Transfer of MicroRNAs by Embryonic Stem Cell Microvesicles / Y. Alex, E. L. Färber, A. L. Rapoport, D. Tejada, R. Deniskin, N. B. Akhmedov, D. B. Färber // Plos one. - 2009. - V. 4. - № 3. - P. 1-8

Yang, J. Exploring a new twist on tumor metastasis / J. Yang, S.A. Mani, R.

A. Weinberg // Cancer Research. - 2006. - № 66. - P. 4549-4552

Zhang, Y. Aptamers selected by cell-SELEX for application in cancer studies / Y. Zhang, Y. Chen, D. Han, I. Ocsoy, W. Tan. Bioanalysis. - 2010. -V. 2. - №5.- P. 907-918

Zhao, Z. Recognition of subtype non-small cell lung cancer by DNA aptamers selected from living cells / Z. Zhao, L. Xu, X. Shi, W. Tan, X. Fang, D. Shangguan// Analyst. - 2009.- № 134.-P. 1808-1814

Zhou, J. Temperature-Responsive Antibody-Like Nanostructure / J. Zhou,

B. Soontornworajit, Y. A. Wang // Biomacromolecules. - 2010. - № 11. - P. 2087-2093

Zhu, G. Tan Nucleic Acid Aptamers: an Emerging Frontier in Cancer Therapy / G. Zhu, M. Ye, M. J. Donovan, E. Song, Z. Zhao, W. Tan // Chemical Communications. - 2012.- №48.-P. 10472-10480